2-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-2,6-дисульфо-4-боро-3а,4а-диаза-s-индацен-8-ил)-бензойная кислота и ее производные, способ их получения и их применение для флуоресцентного мечения белковых молекул Российский патент 2019 года по МПК C07F5/02 G01N21/64 G01N33/533 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области органической химии, в частности сульфированным производным бордипиррометена, способам их получения, к указанным соединениям для применения в качестве флуоресцентных меток белковых молекул, в том числе при производстве меченых антител, применяемых в иммунофлуоресцентном анализе для диагностики инфекционных заболеваний.

Уровень техники

В литературе имеется описание производных бордипиррометена [1] и способов их получения.

Известен способ получения различных производных бордипиррометена формулы (I) реакцией замещенных пирролов с ацилхлоридами или ангидридами. Вначале проводят конденсацию замещенных пирролов с ацилхлоридом или ангидридом в органическом растворителе, затем, не выделяя получившийся продукт, обрабатывают этиламином и комплексом трифторида бора с диэтиловым эфиром [1], после чего выделяют продукт в виде молекулярных кристаллических или аморфных соединений, имеющих в своем составе один атом бора и являющихся цвиттер-ионами (положительно заряженный атом азота и отрицательно заряженный атом бора) (I).

I R₁- R₈ - H, алкильные, арильные и иные заместители

Известен способ получения производных бордипиррометена формулы (I) реакцией замещенных пирролов с альдегидами. Вначале проводят конденсацию замещенных пирролов с альдегидом в органическом растворителе, затем обрабатывают смесь окислителем, после чего, не выделяя получившийся продукт, обрабатывают этиламином и комплексом трифторида бора с диэтиловым эфиром [1]. Продукт выделяют в виде молекулярных кристаллических или аморфных соединений, имеющих в своем составе один атом бора и являющихся цвиттер-ионами (положительно заряженный атом бора и отрицательно заряженный атом азота) (I).

Известен способ получения дисульфопроизводных бордипиррометена (II) сульфированием соединений формулы (I), где R₂, R₆=H, при том что в состав соединения (I) входит не более 1 атома бора, хлорсульфоновой кислотой и последующей нейтрализацией реакционной смеси основанием [2-9].

II

Известный способ сульфирования соединений формулы (I) не позволяет получать соединения (III) или его солей щелочных металлов по сульфогруппам, если R является гидроксильной группой (IIIa)

III

IIIa, 2-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-2,6-дисульфо-4-боро-3a,4a-диаза-s-индацен-8-ил)-бензойная кислота

Известен патент на химически реакционноспособные соединения формулы I, где R - Н, Hal, алкил, арил, циклоалкил, алкиларил, ацил и сульфогруппа [10]. Патент не упоминает соединение IIIa или IIIa, кроме того формула изобретения патента описывает в качестве заместителя в 8-м положении иные заместители кроме H. Таким образом, патент [10] не описывает соединение IIIa или его предшественник IV, не имеющий в своем составе сульфогрупп.

Пункт 2 формулы патента [10] упоминает карбоксильную группу, как одну из активных групп, способных формировать химическую связь с лигандом, а пункт 1 формулы патента [10] упоминает, что любая из активных групп по зависимым пунктам формулы должна получаться химической модификацией красителей из п. 1 формулы патента [10], уже имеющих готовое бордипиррометеновое ядро.

Предлагаемый способ получения красителя вводит карбоксильную группу в состав вещества сразу на стадии синтеза бордипиррометенового ядра в положение 8, таким образом патент [10] не описывает способ получения соединения IIIa.

Известен способ получения соединения формулы IV, где карбоксильная группа вводится в состав вещества на стадии синтеза бордипиррометенового ядра [11]. Сульфирование получаемого известным способом соединения IV не позволяет получать соединение IIIa.

IV

Реальных веществ, синтезированных с сульфогруппами в положении 2 и 6 невелико [1]; это указывает на тот факт, что далеко не каждый продукт с сульфозаместителями в положении 2 и 6 может быть получен сульфированием бордпиррометенов. Таким образом известное по патенту [10] применение веществ, несущих активированных группы, где R=SO₃H, во флуоресцентных приложениях не включает в себя автоматически применение соединения IIIa с активированной группой, о достоверном существовании которого к моменту подачи патента не было известно.

Раскрытие сущности изобретения

Задачей изобретения является получение 2-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-2,6-дисульфо-4-боро-3a,4a-диаза-s-индацен-8-ил)-бензойной кислоты (соединение IIIa), а также ее производных с N-оксисукцимидильными группами, отличающимися возможностью применения для флуоресцентного мечения белков (канал флуоресцеина, 490-520 нм), отличающимися растворимостью в воде, более высоким квантовым выходом, более высоким коэффициентом экстинкции, по сравнению с флуоресцеином и с известными красителями формулы (I), например BODIPY FL, используемых для канала флуоресцеина.

Техническим результатом является возможность получения водорастворимого флуоресцентного красителя IIIa с более высоким выходом и чистотой, чем это возможно с использованием приемов, известных из уровня техники, достижение у данного флуоресцентного красителя лучшей растворимости в воде, более высокого квантового выхода, и более высокого коэффициента экстинкции по сравнению с аналогами, а также применение его производных с N-оксисукцимидильными группами как более ярких, чем известно из уровня техники, а стало быть требующих меньшего расхода, флуоресцентых меток белковых молекул.

Особенностью получения сульфированных производных бордипиррометена из хлорсульфоновой кислоты и исходного бордипиррометена является то, что, по сравнению с большим объемом литературы по производным бордипиррометена, таких реакций немного. В [1] отмечается, что число подобных реакций невелико. То есть, способ получения сульфированных производных бордипиррометена известен из уровня техники, однако имеются лишь немногочисленные данные о производных бордипиррометена, которые действительно успешно поддаются сульфированию, поэтому изобретательскую задачу представляет собой как подбор последовательностей реакций, приводящих к продукту реакции, так и подбор исходного соединения, которое в принципе успешно поддается сульфированию. Для каждого конкретного производного бордипиррометена нет возможности предсказать, какие условия будут оптимальными для сульфирования, и приведет ли оно к целевому продукту.

Предлагаются новые соединения формулы III, предпочтительно R означает гидроксил (соединение IIIa) или N-оксисуцинмидил или .

Предлагаются соли щелочных металлов соединения формулы III по сульфогруппам, щелочные металлы предпочтительно Na и K.

Предлагается способ получения соединения формулы IIIa и его солей щелочных металлов, отличающийся тем, что в качестве исходного соединения для сульфирования применяется 2-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-боро-3a,4a-диаза-s-индацен-8-ил)-бензоилокситрифторборат, триэтиламмониевая соль - соединение формулы (V).

V

Предлагается применение соединений формулы III как флуоресцентных красителей с растворимостью в воде, квантовым выходом, и коэффициентом экстинкции более высокими, чем это известно из уровня техники, - для использования в качестве флуоресцентных меток белковых молекул.

Сущность способа получения соединения формулы IIIa в том, что на первой стадии из о-фталевого ангидрида, 2,4-диметилпиррола, триэтиламина и эфирата трифторида бора получают ионное соединение формулы V.

В известном способе синтеза сульфированных бордипиррметенов [2-9] в реакцию сульфирования вводят хлорсульфоновую кислоту и соединения, которые являются молекулярными кристаллическими или аморфными веществами, имеющими в своем составе один атом бора и являющихся цвиттер-ионами. В предлагаемом способе в реакцию сульфирования вводят ионное соединение формулы V (соль с триэтиламином), содержащее в своем составе два атома бора.

Преимуществом описанного способа является то, что сульфирование хлорсульфоновой кислотой, по аналогии с описанными в литературе способами сульфирования, приводит к осмолению продукта.

Осуществление изобретения

Соединение V

Ацетонитрил продували аргоном в течение 10 минут в круглодонной колбе, затем в атмосфере аргона добавляли 2,4-диметилпиррол (3,8 г; 40 ммоль), фталевый ангидрид (2,96 г; 20 ммоль) и эфират трифторида бора (6,3 г; 44 ммоль). Смесь перемешивали в атмосфере аргона в течение 6 часов, затем охлаждали до 0^оС и добавляли эфират трифторида бора (22,7 г; 160 ммоль). Смесь перемешивали в течение 10 минут при данной температуре, затем добавляли триэтиламин (22 г; 220 ммоль) и смесь при постоянном перемешивании оставляли при комнатной температуре на ночь. Затем смесь выливали в воду (400 мл), перемешивали в течение 2 часов и разбавляли дихлорметаном (200 мл). Органическую фазу отделяли и воду экстрагировали дихлорметаном (3×50 мл). Органическую фазу высушивали над сульфатом натрия, растворители выпаривали в вакууме. Продукт очищали колоночной хроматографией (элюент дихлорметан-этилацетат-триэтиламин 300:100:1), получая на выходе темное масло, которое кристаллизовалось при перемешивании в смеси этилацетата (3 мл) и метил-трет-бутилового эфира (5 мл). Выход продукта в виде оранжевого порошка составил 1,6 г (15%). Структура продукта (рисунок 1) подтверждена методом ЯМР-спектроскопии, рентгеноструктурного анализа.

Рисунок 1

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Данные о кристаллическом строении и детализация структуры соединения V:

Кристаллические данные для соединения V, C₂₆H₃₄B₂F₅N₃O₂, (M=537,18): моноклинная, пространственная группа P2₁/n. Размеры элементарной ячейки: a=10,8302(8) Å, b=38,269(3) Å, c=13,8846(11) Å, β=108,844(2), V (Объем)=5446,1(7) ų, Z=8, T (температура)=120 K, μ(MoKα) (коэффициент поглощения)=0,105 мм^-1, Dcalc (вычисленная плотность)=1,310 г/см³, Собранные/единственные отражения: 53766/11398, диапазон угла тэта для сбора данных: 2,128 ≤ 2Θ ≤ 52,744.. Конечные показатели R: R₁=0,0541 (I>2σ(I)), wR₂=0,1053.

Спектр ЯМР ¹H соединения V (d6-DMSO, δ, м.д., J, Гц): 1,24 (9H, т, CH3CH2); 1,45 (6H, с, 1,7-CH3); 2,48 (6H, с, 3,5-CH3); 3,05 (6H, CH3CH2NH+); 6,11 (2H, 2,6-CH=), 7,44-8,02 (4H, м, -CH- бензольного кольца)

Синтез соединения IIIa, натриевая соль

Раствор соединения V (0,2 г; 0,426 ммоль) в дихлорметане (3 мл) охлаждали до -50°C. Затем в течение 1 минуты добавляли раствор хлорсульфокислоты в дихлорметане, смесь перемешивали при данной температуре в течение 20 минут и давали смеси нагреться до комнатной температуры в течение 2 часов. При этом образовывался осадок. Жидкость с осадка удаляли декантацией, осадок промывали дихлорметаном (2×3 мл), затем добавляли гидрокарбонат натрия (1 г; 11,3 ммоль), с последующим добавлением воды (5 мл). Смесь перемешивали в течение 20 минут и выпаривали досуха; перед выпариванием добавляли этанол и толуол, чтобы избежать образования пены. При этом получался оранжевый остаток, который хроматографировали на колонке с силикагелем, используя в качестве элюента смесь дихлорметан - метанол (1:1); остаток растворяли в элюенте и органические соли отфильтровывали. Целевой продукт высушивали, получая в результате оранжевый порошок. Вещество перемешивали со смесью тетрагидрофурана и этилацетата в соотношении 1:1 объемом 3 мл. Выход составил 115 мг (47%). Структура продукта подтверждена методом ЯМР-спектроскопии.

Спектр ЯМР ¹H соединения II (d6-DMSO, δ, м.д., J, Гц): 1,52 (6H, с, 1,7-CH3); 2,65 (6H, с, 3,5-CH3); 7,2-8,1 (4H, м, -CH- бензольного кольца)

Полученное соединение IIIa, натриевая соль обладает следующими свойствами:

- соединение является флуоресцентным красителем.

- соединение характеризуется водорастворимостью 27 мг/мл. Данная характеристика имеет высокое значение для применения, учитывая, что соединение I как флуоресцентный краситель предназначается для мечения белковых объектов в водной среде.

- спектр флуоресценции соединения находится в том же диапазоне, что и спектр широко используемого в лабораторной практике флуоресцеина, благодаря чему с веществом можно работать на приборах, имеющих фиксированные длины волн возбуждения/излучения, рассчитанные на флуоресцеиновые красители (рисунки 2 и 3).

- соединение имеет высокий квантовый выход в воде (0,96), что позволяет надежно отсекать фоновый сигнал возбуждающего излучения. Данное значение выше, чем квантовые выходы для известных соединений наиболее близких по составу и функциональности, максимальное значение квантового выхода в любом растворителе для которых составляет, 0,73 для соединения IV [11], 0,49 для соединения VI [9].

Рисунок 2

Рисунок 3

VI

- коэффициент экстинкции вещества в воде составил 8,6×10⁴ л×моль^-1×см^-1, что примерно на 7% выше коэффициента экстинкции соединений IV и VI, известных из уровня техники [9, 11]. Таким образом, характеристики соединения IIIa исключительно точно соответствуют потребностям исследований в области биохимии и молекулярной биологии.

Пример

Применение соединения III

в качестве флуоресцентной метки белковых молекул

Вещество IIIa превращали посредством реакции с O-(N-сукцинимидил)-1,1,3,3-тетраметилуроний тетрафторборатом в N-гидроксисукцинимидное производное VII и это производное вводили в реакцию с бычьим альбумином.

VII

Спектр ЯМР ¹H соединения VII (d6-DMSO, δ, м.д., J, Гц): 1,42 (6H, с, 1,7-CH3); 2,51 (6H, с, 3,5-CH3); 2,83 (4H, т, -CH2-CH2-), 7,62-8,41 (4H, м, -CH- бензольного кольца)

Белки содержат аминогруппы, соответственно их модификация часто проводится посредством активированных эфиров. Скорость и полнота протекания реакции активированных эфиров с аминогруппами существенно зависит от pH среды. При низких значениях pH происходит протонирование аминогрупп, в результате чего и термодинамика, и кинетика реакции неудовлетворительны. При высоких значениях на реакцию влияет уже процесс гидролиза активированного эфира. Поэтому оптимальное значение pH в данном случае 8.3-8.5.

В качестве растворителя для модификации бычьего альбумина использовали воду в смеси с диметилсульфоксидом (ДМСО).

Активированный эфир для модификации брали в 8-кратном избытке по отношению к модифицируемым аминогруппам. Это экспериментально подобранное число для достижения мечения в среднем по одной группе на макромолекулу.

Концентрация белка при мечении составляла 1 мг на мл. Активированный эфир растворяли в чистом ДМСО (1/10 объема реакционной смеси).

Бычий альбумин растворяли в буфере pH 8.3 (объем - 9/10 реакционной смеси). Для изготовления буфера использовали 0.1 М раствор бикарбоната натрия (NaHCO₃).

Раствор активированного эфира в ДМСО прибавляли к раствору белка в буфере и тщательно перемешивали, после чего держали реакционную смесь при 0°С в течение 4 часов. Конъюгаты очищали с помощью переосаждения ацетоном.

Эффективность конъюгации красителей с бычьим альбумином оценивалась следующим образом. Поскольку в белке присутствует большое количество аминогрупп, то конъюгация протекает случайным образом, и выделить индивидуальное вещество после конъюгации не представляется возможным. Поэтому эффективность конъюгации оценивают, сравнивая поглощение красителя при 500 нм (длина волны поглощения сдвинулась по сравнению с красителем до конъюгации) и белка при 280 нм, учитывая, что коэффициенты экстинкции белка и красителя на данной длине волны известны (около 8,6×10⁴ л × моль^-1×см^-1 и 4,3×10⁴ л × моль^-1×см^-1 соответственно). Пример такого спектра приведен на рисунке 4. Анализ спектров для красителей показал, что эффективность модификации составила 1-1,2 молекулы красителя в среднем на молекулу белка.

Список литературы

1. Loudet A., Burgess K. Chem. Rev. 2007, 107, 4891-4932

2. Shah, M.; Thangaraj, K.; Soong, M.-L.; Wolford, L. T.; Boyer, J. H.; Politzer, I. R.; Pavlopoulos, T. G. Heteroat. Chem. 1990, 1, 389.

3. Wories, H. J.; Koek, J. H.; Lodder, G.; Lugtenburg, J.; Fokkens, R.; Driessen, O.; Mohn, G. R. Recl. TraV. Chim. Pays-Bas 1985, 104, 288.

4. Morgan, L. R.; Boyer, J. H. Boron difluoride compounds useful in photodynamic therapy and production of laser light. U.S. Patent 5446157, 1995.

5. Morgan, L. R.; Boyer, J. H. Heterocyclic compounds and their use in photodynamic therapy. WO Patent 9419355, February 18, 1994.

6. Urano, T.; Nagasaka, H.; Tsuchiyama, M.; Ide, H. Photopolymerizable composition. U.S. Patent 5498641, April 7, 1994.

7. Boyer, J. H.; Morgan, L. R. Preparation of difluoroboradiaza-s-indacene compounds and methods for using them. U.S. Patent 5189029, 1993.

8. Boyer, J. H.; Morgan, L. R. Fluorescent chemical compositions useful as laser dyes and photodynamic therapy agents, and methods for their use. U.S. Patent 361936, 1990

9. Li L., Han J., Nguyen B., and Burgess K. J. Org. Chem. 2008, 73, 1963-1970

10. Haugland R.P., Kang H.C., Chemically reactive dipyrrometheneboron difluoride dyes, US Patent 4774339 A, 1988

11. Wang D., Fan J., Gao X., Wang B., Sun S., Peng X., J. Org. Chem. 2009, 74, 7675–7683

Таблица 1. Дробные атомные координаты (×10⁴) and эквивалентные изотропные параметры атомного смещения (Ų×10³) для соединения V, U_eq, определяемые как 1/3 от следа ортогонализованного тензора U_IJ. Атом x y z U(eq) F1 5030,5(15) 4658,9(4) 4325,1(11) 30,3(4) F2 4358,0(15) 4101,0(4) 3944,1(12) 30,0(4) F4 9768,1(15) 5442,0(4) 3205,1(12) 32,2(4) F7 8570,4(18) 5667,7(4) 1681,1(13) 44,4(5) F10 10702,2(18) 5524,6(5) 1976,3(14) 51,4(5) O1 9220,1(18) 5079,2(5) 1736,3(14) 27,8(5) O2 7534,6(17) 4993,8(5) 2321,0(14) 24,7(5) N1 4514(2) 4472,0(5) 2579,7(17) 20,8(5) N2 6505(2) 4259,9(5) 3912,8(16) 20,3(5) C1 7049(3) 4155,4(8) 5777(2) 32,2(8) C2 3297(3) 4590,3(7) 2088(2) 25,8(7) C3 3148(3) 4637,5(7) 1057(2) 27,6(7) C4 4298(3) 4545,0(7) 896(2) 22,1(7) C5 5175(3) 4442,5(7) 1863(2) 19,9(6) C6 6471(3) 4336,7(6) 2167(2) 18,4(6) C7 7139(3) 4243,3(6) 3176(2) 18,1(6) C8 8428(3) 4122,5(7) 3658(2) 22,2(7) C9 8548(3) 4070,7(7) 4668(2) 24,9(7) C10 7366(3) 4156,9(7) 4812(2) 24,9(7) C12 2318(3) 4654,9(8) 2616(2) 38,3(8) C13 4525(3) 4552,6(7) -113(2) 26,4(7) C14 7150(3) 4308,0(7) 1388(2) 19,4(6) C15 7992(3) 4566,0(7) 1234(2) 19,3(7) C16 8566(3) 4515,3(7) 483(2) 27,2(7) C17 8334(3) 4217,6(8) -109(2) 32,4(8) C18 7514(3) 3962,1(8) 48(2) 30,4(8) C19 6936(3) 4008,3(7) 792(2) 24,3(7) C20 8224(3) 4901,7(7) 1818(2) 19,9(7) C21 9486(3) 4052,5(8) 3204(2) 32,3(8) B1 5079(3) 4372,7(8) 3717(3) 23,2(8) B2 9568(4) 5438,4(9) 2167(3) 28,3(9) N3 7191(2) 5516,7(6) 3662,2(17) 21,7(6) C23 7338(3) 5892,6(7) 3394(2) 27,5(7) C24 6991(3) 6154,8(7) 4084(2) 40,1(9) C25 5816(3) 5414,5(8) 3573(2) 28,1(7) C26 4859(3) 5470,4(8) 2526(2) 33,2(8) C27 8129(3) 5428,4(7) 4701(2) 27,2(7) C28 8235(3) 5039,4(7) 4911(2) 34,8(8)

Таблица 2. Параметры анизотропного смещения (Ų×10³) для соединения V. Формула для фактора анизотропного смещения выглядит следующим образом: -2π²[h²a*²U₁₁+2hka*b*U₁₂+…]. Атом U₁₁ U₂₂ U₃₃ U₂₃ U₁₃ U₁₂ F1 37,7(11) 28,9(10) 25,7(10) -3,2(8) 12,3(8) 2,1(8) F2 29,3(10) 27,7(9) 36,7(10) 4,3(8) 15,8(8) -3,9(8) F4 34,4(10) 35,4(10) 24,4(10) 0,3(8) 6,1(8) -3,4(8) F7 59,9(13) 23,1(10) 38,1(11) 6,3(8) -0,8(10) 1,2(9) F10 56,6(13) 50,6(12) 59,1(13) -15(1) 35,6(11) -29,2(10) O1 26,6(12) 23,6(11) 37,6(13) -2,6(10) 16,5(10) -5,4(10) O2 27,8(12) 23,1(11) 26,5(12) -3,4(9) 13,2(10) -1,3(9) N1 19,9(13) 21,5(13) 22,5(14) 1,3(11) 9,2(11) 0,7(11) N2 24,3(14) 19,4(13) 16,8(13) 1,4(10) 6,0(12) -2,0(11) C1 37,0(19) 36,9(19) 23,4(18) 5,4(15) 10,8(16) -0,8(16) C2 24,2(18) 23,4(17) 30,1(19) 0,4(14) 9,3(15) 2,1(14) C3 24,7(18) 26,5(17) 28,2(19) 5,4(14) 3,9(15) 2,3(14) C4 24,7(17) 14,9(15) 26,1(18) -0,7(13) 7,5(14) -2,2(13) C5 23,7(17) 18,6(15) 17,5(16) -2,6(13) 6,9(14) -2,3(13) C6 25,4(17) 9,4(14) 20,1(17) -4,2(12) 7,0(14) -6,3(13) C7 22,0(16) 15,0(15) 16,0(16) -0,7(12) 4,4(14) -2,8(13) C8 22,3(17) 17,0(15) 27,0(18) 0,4(13) 7,7(14) -4,2(13) C9 22,4(17) 22,2(16) 24,9(18) 5,8(13) 0,2(14) -0,7(14) C10 30,0(18) 21,8(17) 20,9(18) 2,0(13) 5,5(15) -5,8(14) C12 31,9(19) 46(2) 40(2) 3,6(17) 16,5(17) 6,7(16) C13 27,8(18) 31,2(18) 18,0(17) 0,6(14) 4,5(14) 0,8(14) C14 19,6(16) 18,9(15) 18,0(16) 2,0(13) 3,5(13) 4,1(13) C15 19,6(16) 19,1(15) 19,1(16) 2,1(13) 6,2(13) 4,0(13) C16 31,6(19) 22,1(17) 31,5(19) 3,3(14) 15,5(16) 1,2(14) C17 42(2) 32,2(19) 31(2) -3,3(15) 22,8(17) 4,4(16) C18 40(2) 26,6(18) 25,3(18) -5,0(14) 12,0(16) 0,5(15) C19 27,2(17) 23,4(17) 22,1(17) -1,1(13) 7,9(14) -2,1(14) C20 21,9(17) 19,3(16) 17,3(17) 5,7(13) 4,5(14) 2,9(13) C21 25,4(18) 36,6(19) 31,6(19) 3,3(15) 4,8(15) 4,3(15) B1 30(2) 19,2(18) 23(2) 2,2(15) 11,4(17) 0,2(16) B2 36(2) 23(2) 29(2) 0,3(17) 13,7(19) -7,6(18) N3 27,1(15) 18,9(13) 20,1(14) 0,4(11) 9,1(12) -0,5(11) C23 35,2(19) 17,7(16) 29,5(18) 3,7(14) 10,1(15) -3,0(14) C24 61(2) 23,0(18) 32(2) -2,5(15) 9,2(18) 3,7(17) C25 27,1(18) 29,5(18) 27,9(18) 1,0(14) 9,2(15) -4,1(14) C26 31,2(19) 32,8(19) 33(2) 0,9(15) 6,9(16) -0,5(15) C27 30,6(18) 28,9(17) 19,4(17) 3,5(14) 4,4(14) -0,5(15) C28 40(2) 27,1(18) 31(2) 6,6(15) 3,9(16) 6,1(16)

Таблица 3. Длины связей в соединении V Атом Атом Длина/Å F1 B1 1,394(3) F2 B1 1,396(3) F4 B2 1,386(4) F7 B2 1,387(4) F10 B2 1,377(4) O1 C20 1,310(3) O1 B2 1,498(4) O2 C20 1,227(3) N1 C2 1,352(3) N1 C5 1,406(3) N1 B1 1,545(4) N2 C7 1,405(3) N2 C10 1,353(3) N2 B1 1,541(4) C1 C10 1,487(4) C2 C3 1,400(4) C2 C12 1,492(4) C3 C4 1,381(4) C4 C5 1,427(4) C4 C13 1,498(4) C5 C6 1,389(4) C6 C7 1,399(3) C6 C14 1,495(4) C7 C8 1,417(4) C8 C9 1,381(4) C8 C21 1,500(4) C9 C10 1,396(4) C14 C15 1,407(4) C14 C19 1,389(4) C15 C16 1,390(4) C15 C20 1,497(4) C16 C17 1,379(4) C17 C18 1,385(4) C18 C19 1,381(4)

Таблица 4. Валентные углы в соединении V Атом Атом Атом Угол C20 O1 B2 123,3(2) C2 N1 C5 107,8(2) C2 N1 B1 126,7(2) C5 N1 B1 125,4(2) C7 N2 B1 125,6(2) C10 N2 C7 107,7(2) C10 N2 B1 126,7(2) N1 C2 C3 109,3(2) N1 C2 C12 122,7(3) C3 C2 C12 128,0(3) C4 C3 C2 108,7(3) C3 C4 C5 106,2(2) C3 C4 C13 125,1(3) C5 C4 C13 128,6(3) N1 C5 C4 107,9(2) C6 C5 N1 120,2(2) C6 C5 C4 131,8(3) C5 C6 C7 121,6(2) C5 C6 C14 119,1(2) C7 C6 C14 119,3(2) N2 C7 C8 108,0(2) C6 C7 N2 120,1(2) C6 C7 C8 131,9(3) C7 C8 C21 129,1(3) C9 C8 C7 106,3(2) C9 C8 C21 124,6(3) C8 C9 C10 108,7(2) N2 C10 C1 122,7(3) N2 C10 C9 109,1(2) C9 C10 C1 128,1(3) C15 C14 C6 123,6(2) C19 C14 C6 117,7(2) C19 C14 C15 118,7(3) C14 C15 C20 121,6(2) C16 C15 C14 119,1(2) C16 C15 C20 119,3(2) C17 C16 C15 121,5(3) C16 C17 C18 119,5(3) C19 C18 C17 119,7(3) C18 C19 C14 121,5(3) O1 C20 C15 113,4(2) O2 C20 O1 124,7(2) O2 C20 C15 121,9(2) F1 B1 F2 108,4(2) F1 B1 N1 110,2(2) F1 B1 N2 110,2(2) F2 B1 N1 110,4(2) F2 B1 N2 110,7(2) N2 B1 N1 107,0(2) F4 B2 F7 109,6(3) F4 B2 O1 111,0(2) F7 B2 O1 109,3(3) F10 B2 F4 110,4(3) F10 B2 F7 111,0(3) F10 B2 O1 105,5(2)

Таблица 5. Торсионные углы для соединения V A B C D Угол˚ N1 C2 C3 C4 0,3(3) N1 C5 C6 C7 2,6(4) N1 C5 C6 C14 -179,9(2) N2 C7 C8 C9 -0,3(3) N2 C7 C8 C21 178,5(3) C2 N1 C5 C4 -0,7(3) C2 N1 C5 C6 177,9(2) C2 N1 B1 F1 -59,2(4) C2 N1 B1 F2 60,5(4) C2 N1 B1 N2 -179,0(2) C2 C3 C4 C5 -0,7(3) C2 C3 C4 C13 178,8(3) C3 C4 C5 N1 0,8(3) C3 C4 C5 C6 -177,5(3) C4 C5 C6 C7 -179,3(3) C4 C5 C6 C14 -1,8(4) C5 N1 C2 C3 0,3(3) C5 N1 C2 C12 -179,7(3) C5 N1 B1 F1 123,2(3) C5 N1 B1 F2 -117,1(3) C5 N1 B1 N2 3,4(4) C5 C6 C7 N2 -0,9(4) C5 C6 C7 C8 178,5(3) C5 C6 C14 C15 99,6(3) C5 C6 C14 C19 -80,8(3) C6 C7 C8 C9 -179,8(3) C6 C7 C8 C21 -0,9(5) C6 C14 C15 C16 -179,5(3) C6 C14 C15 C20 -2,9(4) C6 C14 C19 C18 179,4(3) C7 N2 C10 C1 177,4(2) C7 N2 C10 C9 -0,5(3) C7 N2 B1 F1 -121,5(3) C7 N2 B1 F2 118,7(3) C7 N2 B1 N1 -1,6(3) C7 C6 C14 C15 -82,9(3) C7 C6 C14 C19 96,7(3) C7 C8 C9 C10 0,0(3) C8 C9 C10 N2 0,3(3) C8 C9 C10 C1 -177,5(3) C10 N2 C7 C6 -179,9(2) C10 N2 C7 C8 0,5(3) C10 N2 B1 F1 59,1(3) C10 N2 B1 F2 -60,7(4) C10 N2 B1 N1 179,0(2) C12 C2 C3 C4 -179,8(3) C13 C4 C5 N1 -178,7(2) C13 C4 C5 C6 3,0(5) C14 C6 C7 N2 -178,3(2) C14 C6 C7 C8 1,1(4) C14 C15 C16 C17 -0,3(4) C14 C15 C20 O1 166,9(2) C14 C15 C20 O2 -12,9(4) C15 C14 C19 C18 -1,0(4) C15 C16 C17 C18 -0,2(4) C16 C15 C20 O1 -16,5(4) C16 C15 C20 O2 163,7(3) C16 C17 C18 C19 0,1(4) C17 C18 C19 C14 0,5(4) C19 C14 C15 C16 0,9(4) C19 C14 C15 C20 177,5(2) C20 O1 B2 F4 56,9(4) C20 O1 B2 F7 -64,1(3) C20 O1 B2 F10 176,5(2) C20 C15 C16 C17 -177,0(3) C21 C8 C9 C10 -178,9(3) B1 N1 C2 C3 -177,7(2) B1 N1 C2 C12 2,4(4) B1 N1 C5 C4 177,3(2) B1 N1 C5 C6 -4,2(4) B1 N2 C7 C6 0,5(4) B1 N2 C7 C8 -179,0(2) B1 N2 C10 C1 -3,1(4) B1 N2 C10 C9 179,0(2) B2 O1 C20 O2 -6,3(4) B2 O1 C20 C15 173,9(2)

Изобретение относится к солям соединения формулы I с щелочными металлами, замещающими атомы водорода в обеих сульфогруппах , где R означает N-оксисукцинимидильную группу Также предложены способ получения солей и их применение. Соли соединения формулы I являются флуоресцентными красителями с лучшими чем у аналогов характеристиками - растворимостью в воде, квантовым выходом и коэффициентом экстинкции, и могут быть использованы в качестве флуоресцентных меток белковых молекул. 3 н.п. ф-лы, 4 ил., 5 табл., 1 пр.

1. Соли соединения формулы I с щелочными металлами, замещающими атомы водорода в обеих сульфогруппах

,

где R означает N-оксисукцинимидильную группу

2. Способ получения солей по п. 1, включающий получение (из о-фталевого ангидрида, 2,4-диметилпиррола, триэтиламина и эфирата трифторида бора) 2-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-боро-3а,4а-диаза-s-индацен-8-ил)-бензоилокситрифторборат, триэтиламмониевой соли, которую затем вводят в реакцию сульфирования с последующим добавлением гидрокарбоната щелочного металла, после чего проводят реакцию с O-(N-сукцинимидил)-1,1,3,3-тетраметилуроний тетрафторборатом.

3. Применение солей по п. 1 для флуоресцентного мечения белковых молекул.