БИОЛОГИЧЕСКОЕ КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕПТИДОГЛИКАНОВ Российский патент 2019 года по МПК G01N33/50 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к количественному определению пептидогликанов в образце, в частности, в образце полимеров глюкозы.

Предпосылки изобретения

Эпизоды асептического воспаления представляют собой главные осложнения, наблюдаемые в ходе различных видов лечения с применением промышленных изделий, предназначенных для терапевтических целей (например, перитонеального диализа, парентерального питания, внутривенной инъекции). Несмотря на то, что некоторые из таких эпизодов воспаления связаны с проблемой химической природы (случайное присутствие химических загрязнителей или неправильные дозировки некоторых соединений), большинство эпизодов имеет место в результате присутствия загрязнителей микробного происхождения, высвобождаемых во время производственных процессов. В настоящее время точно установлено, что липополисахариды (LPS) и пептидогликаны (PGN) представляют собой основные загрязнители с высокой степенью риска инициации таких эпизодов воспаления, когда они присутствуют в следовых количествах в промышленных изделиях.

LAL-тест (с применением лизата амебоцитов Limulus) обычно применяют во многих лабораториях контроля качества для обнаружения и количественного определения загрязнения LPS. Данная тест-система основана на распознавании эндотоксинов чувствительным комплексом, извлекаемым из гемолимфы Limulus (мечехвоста).

В настоящее время предлагаются другие тест-системы, также на основе реактивности вытяжек гемолимфы беспозвоночных, для обнаружения PGN в продуктах для терапевтического применения (SLP-Wako, Immunetics). Однако такие тест-системы имеют недостаток, который заключается в том, что они не являются очень специфичными, поскольку они также реагируют с другими молекулами микробного происхождения, такими как β-глюканы. Более того, для таких способов требуется приобретение специального оборудования для данного применения, что в значительной степени увеличивает затраты, и вследствие этого ограничивает доступность таких способов количественного определения.

Кроме того, LPS и PGN имеют переменные структуры в зависимости от их бактериального происхождения, которые отвечают за значительные различия воспалительной реактивности. Поэтому существует другая необходимость, заключающаяся в выражении результатов количественных определений в эквивалентных единицах стандартных молекул (например, LPS из Е. coli в LAL-тесте).

Более того, такие молекулы зачастую присутствуют в форме высокомолекулярных комплексов, что влияет на их растворимость и их воспалительный потенциал. Например, PGN очень разнятся по размеру и часто агрегируются с другими молекулами бактериальной клеточной стенки, такими как липотейхоевые кислоты и липопептиды.

Таким образом, были разработаны "биологические" способы исключительно для того, чтобы учесть воспалительную нагрузку, связанную с такими молекулами. Эффекторные клетки воспалительного ответа обладают специальными сенсорами для распознавания молекулярных структур, специфически продуцируемых возбудителями инфекции. Такие молекулы, называемые РАМР для патоген-ассоциированных молекулярных паттернов, по сути, распознаются TLR (Toll-подобными рецепторами) и NLR (Nod-подобными рецепторами), чья специфичность связана с молекулярной структурой различных классов воспалительных молекул. В отличие от LPS (который представляет собой лиганд, распознаваемый рецепторами типа TLR4), PGN представляет собой лиганд, распознаваемый рецепторами типа TLR2.

На протяжении последних лет для замены животных моделей воспалительного ответа были разработаны тест-системы с использованием клеток in vitro. Большая часть таких тест-систем основана на инкубации моноцитарных клеток в присутствии загрязненных продуктов и на обратном титровании продуцирования воспалительных цитокинов (TNF-α, IL-1β IL-6, IL-8, RANTES). Однако, тест-системы с использованием первичных клеток, выделенных из крови, подвержены существенной межиндивидуальной вариабельности между донорами, которая может привести к экспериментальной систематической ошибке.

Напротив, линии моноцитарных клеток дают постоянные ответы, что объясняет почему они, как правило, являются предпочтительными по отношению к первичным клеткам. Однако, такие линии тоже не являются полностью удовлетворительными. Например, выбор цитокинов часто подвергается критике, поскольку большая часть экспрессируется временно, и их концентрация в культуральной среде не всегда отображает реальную нагрузку воспалительных молекул. Поскольку все моноцитарные клетки экспрессируют большую часть TLR/NLR, тест-системы на основе их использования не являются избирательными в отношении одного типа загрязнителя, но будут давать совокупный воспалительный ответ.

Более того, главная проблема возникает в результате различий чувствительности клеток в отношении различных воспалительных молекул. Таким образом, лиганды PGN, TLR2, являются намного менее реакционно-способными, нежели LPS, что делает их сложными для выявления при помощи таких подходов. Действительно, LPS индуцируют значительный ответ для концентраций порядка нг/мл, при этом для достижения подобного ответа необходимы концентрации PGN в 100 раз выше (отношение вес/вес).

В течение нескольких лет предлагались линии трансфицированных клеток с целью замены вышеуказанных моделей в биологических тест-системах для обнаружения и количественной оценки реактивности воспалительных соединений. Такие невоспалительные линии (например, НЕК-293) являются стабильно трансфицированными геном, кодирующим специфический рецептор класса воспалительных агонистов. Они также содержат вектор экспрессии для репортерного гена, кодирующего фермент (например, люциферазу или щелочную фосфатазу), синтез которого зависит от активации воспалительного рецептора. Таким образом, распознавание загрязнителя клетками, экспрессирующими соответствующий рецептор, будет запускать синтез фермента, после продуцирования которого будет следовать превращение его субстрата в окрашенный или люминесцентный продукт. Поскольку данный продукт легко поддается количественной оценке, данный способ обеспечивает быстрое количественное определение воспалительного ответа, связанного с типом загрязнителя.

Такие клеточные модели обладают множеством преимуществ: замена количественных определений цитокинов с применением ELISA ферментными тест-системами, высокая воспроизводимость при количественных определениях вследствие стабильного характера линий, целенаправленное воздействие на некоторые классы воспалительных молекул в зависимости от экспрессированного рецептора, обнаружение загрязнителей при очень низких пороговых величинах.

Такие клеточные модели следовательно могут заменить тест-системы на основе цитокинового ответа in vitro, поскольку они позволяют специфически целенаправленно воздействовать на воспалительные факторы, которые представляют собой агонисты данных TLR или NLR, а также количественно оценивать воспалительный ответ, связанный с данным агонистом. Например, клетки, специфически экспрессирующие TLR2 и TLR4, уже были использованы для обнаружения загрязнителей в пищевых продуктах (работы Clett Erridge of the Department of Cardiovascular Sciences of Leicester University -UK в British Journal of Nutrition, Vol 105 /issue 01/ Jan 2011, pp 15-23).

К тому же, компании, такие как InvivoGen, сегодня предоставляют на рынке широкий ассортимент клеток линии НЕК-293 (HEK-Blue™), трансфицированных различными рецепторами TLR или NRL. Такие клетки содержат в качестве репортера ген, кодирующий секретируемую форму щелочной фосфатазы (SEAP: секретируемую эмбриональную щелочную фосфатазу), которая обеспечивает быстрое и легкое колориметрическое определение ответа в отношении воспалительных агонистов.

Такие клетки HEK-Blue™ уже успешно использовали для обнаружения присутствия загрязнителей в концентрированных растворах полимера глюкозы и их синергического эффекта (WO 2012/143647). Поскольку указанной целью в данной заявке является лишь обнаружение загрязнителей, которые находятся в форме, проявляющей воспалительную активность, способы, описанные в данной патентной заявке, не подходят для измерения общего количества PGN, содержащегося в образце. Действительно, растворимые PGN (ММ≈120 кДа) представляют собой таковые, которые индуцируют воспалительный ответ посредством рецептора TLR2. Таким образом, PGN, не имеющие подходящего размера для того, чтобы быть воспалительными или агрегированными с другими молекулами, не подлежат обнаружению с помощью способа, описанного в данной заявке.

Таким образом, существует постоянная необходимость в разработке альтернативных способов количественного определения общего содержания PGN в образце, в частности, образце полимеров глюкозы.

Краткое описание изобретения

Следовательно настоящее изобретение относится к биологическому способу количественного определения пептидогликанов в образце, в частности, в образце полимеров глюкозы.

В частности, настоящее изобретение относится к способу количественного определения пептидогликанов (PGN) в образце полимера глюкозы, включающему:

a) обработку образца полимера глюкозы посредством обработки ультразвуком, нагревания и/или ощелачивания;

b) приведение обработанного образца или его разведения в контакт с рекомбинантной клеткой, экспрессирующей экзогенный рецептор TLR2 (Toll-подобный рецептор 2) и репортерный ген при прямой зависимости от сигнального пути, связанного с рецептором TLR2, причем указанный репортерный ген кодирует окрашенный или флуоресцирующий белок или белок, активность которого может быть измерена с субстратом или без него;

c) измерение сигнала репортерного гена и

d) определение количества PGN в образце с применением калибровочной кривой на основе зависимости количества PGN от интенсивности сигнала репортерного гена.

Предпочтительно обработка образца посредством обработки ультразвуком, нагревания и/или ощелачивания позволяет фрагментировать и разрушать PGN, содержащиеся в образце, в частности, для того, чтобы сделать их способными активировать рецептор TLR2. В частности, обработка образца обеспечивает образование PGN преимущественно с размером приблизительно 120 кДа.

Предпочтительно репортерный ген представляет собой ген, кодирующий секретируемую щелочную фосфатазу. В предпочтительном варианте осуществления клетка представляет собой клетку линии HEK-Blue™hTLR2.

Предпочтительно калибровочную кривую на основе зависимости количества PGN от интенсивности сигнала репортерного гена строили с использованием PGN, полученных из бактерии, выбранной из Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis и Alicyclobacillus acidocaldarius, предпочтительно из Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus и Alicyclobacillus acidocaldarius. В частности, способ может включать предварительную стадию построения калибровочной кривой с применением PGN, полученных из бактерии, выбранной из Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis и Alicyclobacillus acidocaldarius, предпочтительно из Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus и Alicyclobacillus acidocaldarius.

Предпочтительно образец разводят, при необходимости, таким образом, чтобы получать сигнал репортерного гена, соответствующий линейной части калибровочной кривой.

Предпочтительно образец представляет собой образец раствора икодекстрина.

Предпочтительно калибровочную кривую на основе зависимости количества PGN от интенсивности сигнала репортерного гена стандартизируют или калибруют с применением внутреннего стандарта, который представляет собой агонист TLR2, предпочтительно липопептид, в частности, трихлоргидрат PAM₃Cys-Ser-(Lys)4.

В альтернативном варианте осуществления калибровочную кривую на основе зависимости количества PGN от интенсивности сигнала репортерного гена строили с использованием внутреннего стандарта, который представляет собой агонист TLR2, предпочтительно липопептид, в частности, трихлоргидрат PAM₃Cys-Ser-(Lys)4. В частности, способ может включать предварительную стадию построения калибровочной кривой с использованием внутреннего стандарта, который представляет собой агонист TLR2, предпочтительно липопептид, в частности, трихлоргидрат PAM₃Cys-Ser-(Lys)4.

Настоящее изобретение дополнительно относится к набору для количественного определения пептидогликанов (PGN) в образце полимеров глюкозы, содержащий

- рекомбинантную клетку, экспрессирующую экзогенный рецептор TLR2 (Toll-подобный рецептор 2) и репортерный ген при прямой зависимости от сигнального пути, связанного с рецептором TLR2, причем указанный репортерный ген кодирует окрашенный или флуоресцирующий белок или белок, активность которого может быть измерена с субстратом или без него; и

- либо калибровочную кривую на основе зависимости количества PGN от интенсивности сигнала репортерного гена, либо стандарт PGN, предпочтительно полученный из бактерии, выбранной из Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis и Alicyclobacillus acidocaldarius, предпочтительно из Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus и Alicyclobacillus acidocaldarius, либо внутренний стандарт, который представляет собой агонист TLR2, предпочтительно липопептид, в частности, трихлоргидрат PAM3Cys-Ser-(Lys)4;

- необязательно инструкции по применению и/или раствор для предварительной обработки образца.

Предпочтительно набор дополнительно содержит внутренний стандарт, который представляет собой агонист TLR2, предпочтительно липопептид, в частности, трихлоргидрат PAM₃Cys-Ser-(Lys)4.

Подробное описание изобретения

Следовательно настоящее изобретение относится к биологическому способу количественного определения пептидогликанов в образце, в частности, в образце полимеров глюкозы.

В частности, настоящее изобретение относится к способу количественного определения пептидогликанов (PGN) в образце полимера глюкозы, включающему:

a) обработку образца полимера глюкозы посредством обработки ультразвуком, нагревания и/или ощелачивания;

b) приведение обработанного образца или его разведения в контакт с рекомбинантной клеткой, экспрессирующей экзогенный рецептор TLR2 (Toll-подобный рецептор 2) и репортерный ген при прямой зависимости от сигнального пути, связанного с рецептором TLR2, причем указанный репортерный ген кодирует окрашенный или флуоресцирующий белок или белок, активность которого может быть измерена с субстратом или без него;

c) измерение сигнала репортерного гена и

d) определение количества PGN в образце с применением калибровочной кривой на основе зависимости количества PGN от интенсивности сигнала репортерного гена.

Предпочтительно полимеры глюкозы предназначены для перитонеального диализа, энтерального и парентерального питания, а также кормления новорожденных. В предпочтительном варианте осуществления полимеры глюкозы, которые будут испытывать, представляют собой икодекстрин или мальтодекстрины. В частности, они могут быть предназначены для препаратов для перитонеального диализа. Их можно испытывать на одной или нескольких стадиях их получения, и, в особенности на уровне сырьевого материала на любой стадии способа их получения и/или на уровне конечного продукта способа. Также их можно испытывать в качестве образца раствора для перитонеального диализа.

На первой стадии способа образец полимера глюкозы обрабатывают посредством обработки ультразвуком, нагревания и/или ощелачивания. Целью данный обработки является фрагментация PGN и/или разрушение PGN, содержащихся или уловленных в агрегатах, при этом целью является образование PGN, способных к взаимодействию с рецепторами TLR2 и их активации. Как указано выше, данная обработка должна обеспечить разрушение PGN, содержащихся или уловленных в агрегатах, а также фрагментацию PGN, которые являются слишком большими, а именно образование растворимых PGN с размерами от 30 до 5000 кДа, в особенности приблизительно 120 кДа. Однако обработка не должна влиять на способность PGN взаимодействовать с рецепторами TLR2. Предпочтительно оптимизировать максимальное высвобождение PGN, способных к взаимодействию с TLR2 и активации рецептора, а также сохранение максимального количества PGN, уже активных в отношении TLR2.

В первом варианте осуществления обработка образца предусматривает по меньшей мере одну стадию обработки ультразвуком. Необязательно обработка ультразвуком может занимать от 30 секунд до 5 минут с применением мощности от 20 до 40 кГц и/или может предусматривать один или несколько циклов обработки ультразвуком, например, от 1 до 5 циклов. В предпочтительном варианте осуществления образец будут обрабатывать посредством обработки ультразвуком в течение 1 минуты при 35 кГц за один цикл. Необязательно обработку посредством обработки ультразвуком можно объединять с обработкой посредством нагревания и/или посредством ощелачивания.

Во втором варианте осуществления обработка образца предусматривает по меньшей мере одну стадию ощелачивания. Предпочтительно ощелачивающим средством является NaOH, особенно при концентрации от 0,1 до 1 М. Необязательно продолжительность стадии ощелачивания может составлять от 5 минут до 60 минут. Необязательно стадию ощелачивания могут осуществлять при повышенной температуре, а именно при температуре от 20°С до 80°С, например при температуре 20, 40, 60 или 80°С. Необязательно обработку посредством ощелачивания можно объединять с обработкой посредством обработки ультразвуком.

Во втором варианте осуществления обработка образца предусматривает по меньшей мере одну стадию нагревания. Необязательно продолжительность стадии нагревания может составлять от 5 минут до 60 минут. Необязательно стадию нагревания можно осуществлять при повышенной температуре, а именно при температуре от 20°С до 80°С, например при температуре 20, 40, 60 или 80°С. Необязательно термическую обработку можно объединять с обработкой посредством обработки ультразвуком и/или посредством ощелачивания.

Способы обработки образцов не предусматривают стадий ферментативной обработки, в частности, мутанолизином.

На последующей стадии образец и/или его разведения приводят в контакт с рекомбинантными клетками, экспрессирующими рецептор TLR2. Клетки относятся к рекомбинантным, поскольку они представляют собой клетки, которые были модифицированы посредством введения нуклеиновой кислоты, кодирующей рецептор TLR2, предпочтительно рецептор TLR2 человека, при этом исходная клетка не экспрессирует TLR2.

Активность рецептора TLR2 определяют с применением репортерного гена, который находится в прямой зависимости от сигнального пути, связанного с указанным рецептором. Предпочтительно данный репортерный ген кодирует окрашенный или флуоресцирующий белок или белок, активность которого может быть измерена с субстратом или без него. В частности, репортерный ген кодирует щелочную фосфатазу. А именно репортерный ген может продуцировать секретируемую форму щелочной фосфатазы (SEAP: секретируемую эмбриональную щелочную фосфатазу), синтез которой находится в прямой зависимости от сигнального пути, связанного с TLR2.

В предпочтительном варианте осуществления применяемая клеточная линия представляет собой линию НЕК-10 Blue™ (поставляемую на рынок компанией InvivoGen), модифицированную посредством стабильной трансфекции векторами, кодирующими TLR2 человека, линию HEK-Blue™hTLR2. Однако следует отметить, что специалист в данной области техники также может применять другие коммерчески доступные линии (Imgenex) или может получить их.

Если клетка представляет собой HEK-Blue™hTLR2, то клетку предпочтительно применяют при плотности приблизительно 50000 клеток/лунку для 96-луночного планшета.

В определенном варианте осуществления образец полимеров глюкозы или его разведение имеют концентрацию полимеров глюкозы от 5 до 50 мг/мл, предпочтительно от 5 до 10, 20, 30 или 40 мг/мЛ. В предпочтительном варианте осуществления образец полимеров глюкозы или его разведение имеют концентрацию полимеров глюкозы приблизительно 37,5 мг/мл.

В дополнительном определенном варианте осуществления образец полимеров глюкозы или его разведение имеют максимальную концентрацию полимера глюкозы 3,75% (вес/объем), предпочтительно 3%.

Например, образцы получают таким образом, чтобы они имели концентрацию полимера глюкозы 3,75% (вес/объем), предпочтительно 3%, и образцы подвергают способу количественного определения согласно настоящему изобретению с испытанием образца, а также разведений 1/10, 1/100 и 1/1000.

Предпочтительно приведение образца полимеров глюкозы или его разведения в контакт с клетками занимает от приблизительно 5 до 48 ч., предпочтительно от 10 до 36 ч., более предпочтительно от 16 до 24 ч.

Далее способ включает измерение сигнала репортерного гена.

В предпочтительном варианте осуществления с применением линии HEK-Blue™hTLR2 сигнал представляет собой меру активности щелочной фосфатазы. Предпочтительно ферментативную реакцию проводят с применением соотношения 1:3 среды, подлежащей испытанию, к SEAP-реагенту (например, 50 мкл среды и 150 мкл SEAP-реагента). Более того, предпочтительным будет время реакции, составляющее по меньшей мере 60 минуты.

Наконец, определяют количество PGN в образце с применением калибровочной кривой на основе зависимости количества PGN от интенсивности сигнала репортерного гена.

Данную кривую предпочтительно получают с применением тех же клеток, в тех же условиях с увеличением доз PGN, в частности, стандартов PGN.

Стандарт PGN может представлять собой любой PGN бактериального происхождения. Например, PGN могут быть получены из следующих микроорганизмов: Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Escherichia coli, Bacillus subtilis и Alicyclobacillus acidocaldarius. В частности, применяемые стандарты представляют собой очищенные и частично расщепленные PGN. Такие стандарты являются коммерчески доступными (Invitrogen, № по каталогу tlrl-pgnec или tlrl-pgnek из Е coli; № по каталогу tlrl-pgnb2 из В subtilis; №по каталогу tlrl-pgnsa из S aureus) (Wako Pure Chemical, № по каталогу 162-18101 из Мluteus).

Стандарт PGN предпочтительно калибруют с применением внутреннего стандарта, который представляет собой агонист TLR2, таким образом, чтобы выразить результаты в эквивалентных единицах активного PGN. Внутренний стандарт может представлять собой липопептид, предпочтительно синтетический, в частности, трихлоргидрат PAM₃Cys-Ser-(Lys)4 (Pam3(cys), РАМ или Pam означает пальмитиновую кислоту) (см. фиг. 5). Таким образом, калибровочную кривую на основе зависимости количества PGN от интенсивности сигнала репортерного гена предпочтительно стандартизируют или калибруют с использованием внутреннего стандарта, который представляет собой агонист TLR2, предпочтительно липопептид, в частности, трихлоргидрат PAM₃Cys-Ser-(Lys)4. Данный внутренний стандарт предпочтительно является синтетическим или с точно определенной структурой/составом. Калибровку или стандартизацию проводят путем сравнения значений тангенса угла наклона линейных частей каждой кривой доза-ответ и расчета поправочного коэффициента, обеспечивающего совмещение кривой, построенной с использованием калибровочного стандарта, и таковой на основе стандарта PGN.

Например, калибровочная кривая может быть построена с использованием концентраций PGN от 0,001 до 1000 нг/мл, а именно от 0,01 до 100 нг/мл.

Данная калибровочная кривая может быть построена либо с использованием только PGN, либо с применением раствора полимера глюкозы, в который были добавлены определенные количества PGN. А именно, применяемый раствор полимера глюкозы может содержать 3,75% (вес/объем) полимера глюкозы, предпочтительно 3%.

Данную кривую на основе зависимости количества PGN от интенсивности сигнала репортерного гена также можно получить с применением внутреннего стандарта, который представляет собой агонист TLR2, предпочтительно липопептид, в частности, трихлоргидрат PAM₃Cys-Ser-(Lys)4, а именно с применением тех же клеток, в тех же условиях с увеличением доз внутреннего стандарта на основе агониста TLR2. Данный внутренний стандарт предпочтительно является синтетическим или с точно определенной структурой/составом. Точно так же, как для PGN ее можно получить при отсутствии или предпочтительно в присутствии полимера глюкозы.

Как правило, калибровочная кривая представляет собой классическую кривую клеточного ответа S-образного типа (фиг. 1).

- Часть (А) соответствует ответам, полученным для низких концентраций PGN ниже таковых, приводящих к эффективной активации TLR2. Вследствие этого данный криволинейный участок соответствует пределу обнаружения способа. Таким образом, чтобы включить вариабельность способа, считается, что данная пороговая величина обнаружения в три раза больше величины фонового шума (ответ, полученный при отсутствии стимулирующего воздействия).

- Часть (В) представляет наибольший интерес, поскольку наблюдается линейный ответ. Данный участок с эффективным ответом позволяет определять непосредственную связь между клеточным ответом и уровнем PGN. Поэтому данный участок представляет собой участок количественного определения.

- Часть (С) соответствует насыщению для клеточного ответа в присутствии избыточных концентраций PGN. Действительно имеет место насыщение рецепторов TLR2.

Рассматривают линейную часть калибровочной кривой; данная часть соответствует участку (часть В), на котором количество PGN прямо пропорционально сигналу репортерного гена.

В случае образцов, которые могут быть в значительной степени загрязнены PGN, будет необходимо проведение нескольких серий разведений таким образом, чтобы все еще находится в участке с линейной зависимостью. Иначе для низких концентраций PGN требуется стадия концентрирования образца, если необходимо повысить чувствительность количественного определения.

Необязательно способ дополнительно включает количественное определение с применением контрольной клетки, которая не экспрессирует TLR2, в более общем смысле, не экспрессирует рецептор врожденного иммунитета. Например, может применяться линия HEK-Blue™ Null2. Данная линия представляет собой контрольную линию, применение которой является целесообразным для подтверждения того, что образец полимеров глюкозы не индуцирует продуцирование фермента посредством собственного механизма.

Настоящее изобретение также относится к набору для количественного определения пептидогликанов (PGN) в образце полимеров глюкозы, причем указанный набор содержит

- рекомбинантную клетку, экспрессирующую экзогенный рецептор TLR2 (Toll-подобный рецептор 2) и репортерный ген при прямой зависимости от сигнального пути, связанного с рецептором TLR2, причем указанный репортерный ген кодирует окрашенный или флуоресцирующий белок или белок, активность которого может быть измерена с субстратом или без него; в частности, предпочтительно клеткой является клетка линии HEK-Blue™hTLR2; в качестве отрицательного контроля набор может также содержать клетку, которая не экспрессирует рецептор врожденного иммунитета, например, линии HEK-Blue™Null2;

- либо калибровочную кривую на основе зависимости количества PGN от интенсивности сигнала репортерного гена, либо калиброванный стандарт PGN, предпочтительно полученный из бактерии, выбранной из Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Escherichia coli и Alicyclobacillus acidocaldarius, предпочтительно Staphylococcus aureus, либо внутренний стандарт, который представляет собой агонист TLR2, предпочтительно липопептид, в частности, трихлоргидрат PAM3Cys-Ser-(Lys)4; необязательно, набор может содержать и то, и другое, то есть калибровочную кривую, а также калиброванный стандарт PGN, полученный из микроорганизма, аналогичного таковому, который применяли для построения данной калибровочной кривой;

- необязательно инструкции по применению, раствор для предварительной обработки образца, реагенты, подлежащие применению для измерения ответа репортерного гена, микропланшеты и так далее.

Предпочтительно набор дополнительно содержит внутренний стандарт, который представляет собой агонист TLR2, предпочтительно липопептид, в частности, трихлоргидрат PAM₃Cys-Ser-(Lys)4.

Описание графических материалов

Фиг. 1: теоретическая кривая клеточного ответа как функция повышения концентраций PGN.

Фиг. 2: калибровочная кривая клеточного ответа как функция уровня PGN из S. aureus, полученного с применением клеток HEK-Blue™-hTLR2.

Фиг. 3: ответ клеток HEK-BIue™-hTLR2 как функция повышения концентраций PGN из различных видов бактерий.

Фиг. 4: ответ клеток HEK-Blue™-hTLR2 как функция повышения концентраций PGN из S. aureus, полученного из различных партий.

Фиг. 5: структура трихлоргидрата РАМ₃Суs-Ser-(Lys)4 (PAM3(cys)).

Фиг. 6: сравнение ответов, индуцируемых PGN из S. aureus и PAM3(cys) в клетках HEK-Blue™-hTLR2.

Фиг. 7: ответ клеток HEK-Blue™-hTLR2 как функция скорректированных концентраций PGN.

Фиг. 8: калибровочная кривая ответа клеток HEK-Blue™-hTLR2 как функция скорректированных концентраций активного PGN.

Примеры

Количественное определение основано на специфическом распознавании PGN линиями, экспрессирующими рецептор TLR2, а также на продуцировании ферментативной активности, измеряемой посредством активации сигнального пути, связанного с TLR2.

Клеточный материал

Для экспериментов, связанных с данным количественным определением, используют две линии:

- линию HEK-Blue™ hTLR2 (HEK-TLR2): специфический ответ в отношении лигандов TLR2 при сильной реактивности в отношении растворимых PGN;

- линию HEK-Blue™ Null2 (HEK-Null): неспецифический ответ, связанный с цитотоксическим эффектом образца.

Клетки культивируют согласно рекомендациям поставщика (InvivoGen). При 75% конфлюэнтности клетки ресуспендируют при плотности 0,28×10⁶ клеток/мл. Перед стимуляцией в лунки для культивирования (96-луночный планшет) распределяют 180 мкл клеточной суспензии или 50000 клеток/лунку. Затем клетки стимулируют в течение 24 ч. посредством добавления 20 мкл образцов полимера глюкозы при 37,5% (вес/объем) (то есть при конечном разведении образцов 3,75%). Через 24 ч. стимуляции измеряют клеточный ответ посредством количественной оценки продуцируемой ферментативной активности.

1 - Построение кривой доза-ответ

Кривую доза-ответ строили посредством разведения различных количеств стандарта PGN из S. aureus (фиг. 2) в растворе на основе незагрязненного икодекстрина, полученном при 37,5% (вес/объем) (фиг. 2).

Результат представляет собой классическую кривую клеточного ответа S-образного типа.

- Часть (А) соответствует ответам, полученным для низких концентраций PGN ниже таковых, приводящих к эффективной активации TLR2. Вследствие этого данный криволинейный участок соответствует пределу обнаружения способа.

- Часть (В) представляет наибольший интерес, поскольку наблюдается линейный ответ. Данный участок эффективного ответа позволяет определять непосредственную связь между клеточным ответом и уровнем PGN. Поэтому данный участок представляет собой участок количественного определения.

- Часть (С) соответствует насыщению для клеточного ответа в присутствии избыточных концентраций PGN. Действительно имеет место насыщение рецепторов TLR2.

Стандартная кривая ответа клеток HEK-TLR2 на PGN из S. aureus имеет участок линейной зависимости для концентраций от 0,07 до 10 нг/мл (то есть от 2 до 267 нг/г икодекстрина).

2 - Установление калибровочной кривой для биологического количественного определения PGN с использованием внутреннего стандарта

Кривые доза-ответ строили посредством разведения PGN из различных видов бактерий в растворе на основе незагрязненного мальтодекстрина (обозначенный Р-11.11), полученном при 37,5% (вес/объем). PGN для испытания представляют собой таковые, извлеченные из Staphylococcus aureus (Sigma, номер по каталогу 77140), Micrococcus luteus (Sigma, номер по каталогу 53243), Bacillus subtilis (InvivoGen, № tlrl-pgnb2) и Alicyclobacillus acidocaldarius (индивидуальное получение).

Полученные кривые представляют собой классические кривые ответов, наблюдаемых при количественных определениях, осуществляемых с применением клеточного материала (биологическом анализе) (фиг.3). Значения оптической плотности ниже 0,2 представляют собой наглядное подтверждение концентраций PGN, которые являются слишком низкими для индукции клеточного ответа, при этом значения выше 2 демонстрируют эффект плато, связанный с насыщением рецепторов TLR2. Следовательно, только участок между такими двумя предельными значениями оптической плотности обеспечивает корреляцию продуцирования SEAP с количеством PGN, присутствующим в образцах.

Наблюдаемые ответы демонстрируют значительную вариабельность в отношении клеточной реактивности, связанной с каждым типом PGN. Действительно, концентрации, приводящие к ответу, равному 50% от максимального ответа (ЕС50), составляют ~ 20 нг/мл для PGN из S. aureus и В. subtilis, 1500 нг/мл для М. luteus и более чем 2000 нг/мл для таковых, извлекаемых из A. acidocaldarius и Е. coli К12.

Однако такие различия были ожидаемы, поскольку PGN имеют различные структуры в зависимости от их бактериального происхождения, которые отвечают за значительные колебания в отношении воспалительной реактивности. Такие наблюдения подчеркивают важность определения внутреннего стандарта таким образом, чтобы обеспечить выражение результатов в эквивалентных единицах PGN.

Другой фактор, который может изменять ответ клеток HEK-TLR2, представляет собой размер PGN, который будет влиять на их растворимость и реактивность в отношении TLR2. Таким образом, процедура очистки таких макромолекул может иметь существенное влияние на ответ клеток, поскольку условия извлечения могут изменять размер PGN или даже вызвать частичное разложение. Для проверки данной гипотезы испытание воспроизводили с 3 отдельными партиями PGN, извлеченных из S. aureus: 2 партии Sigma (номер по каталогу 77140: партия 1, 0001442777; партия 2, BCBH7886V) и 1 партия InvivoGen (№ tlrl-pgnsa).

Результаты продемонстрировали вариабельность реактивности между тремя партиями (фиг. 4). Действительно, значения ЕС50 составляют 4, 20 и 400 нг/мл, соответственно, для трех партий. Такие данные указывают на то, что имеет место риск того, что PGN, извлеченные из одних и тех же видов бактерий, могут демонстрировать различия в отношении реактивности, даже если партии были получены от одного и того же поставщика и предварительно были извлечены посредством одной и той же процедуры. Вследствие этого, вероятно, что необходимо введение внутреннего стандарта для калибровочной кривой, таким образом, чтобы избежать ошибок, связанных с вариабельностью PGN, а также для выражения результатов в виде количества "активного" PGN.

Трихлоргидрат PAM₃Cys-Ser-(Lys)4 (PAM3(cys); фиг. 5) представляет собой триацильный синтетический липопептид, который имитирует структуру бактериальных липопептидов и выступает в качестве сильного агониста TLR2. Будучи гомогенным по структуре, его часто используют в качестве положительного контроля для калибровки ответов клеток, экспрессирующих рецептор TLR2.

Вследствие этого эксперименты воспроизводили с заменой PGN на PAM3(cys) в опытах. Как ожидалось, клетки HEK-TLR2 продемонстрировали сильную реактивность в отношении данного соединения. Более того, форма кривой доза-ответ подобна таковой, полученной в присутствии PGN при ЕС50, рассчитанном при 10 нг/мл (фиг. 6). Такие результаты указывают на то, что PAM3(cys) индуцирует ответы, эквивалентные таковым для большинства реактивных PGN, но в отличие от последних не проявляет структурную вариабельность. Следовательно, данный синтетический липопептид может применяться для калибровки партий PGN, а также для построения стандартизированной калибровочной кривой, которая позволит выразить результаты в количествах "активного" PGN, то есть в количествах PGN, приводящих к ответам TLR2, идентичным таковым, полученным с такими же количествами PAM3(cys).

Каждую партию PGN калибруют относительно PAM3(cys) посредством сравнения значений тангенса угла наклона линейных частей каждой кривой доза-ответ и расчета поправочного коэффициента для кривых для PGN, накладываемых на таковые для PAM3(cys). В примере, представленном на фиг.6, поправочные коэффициенты рассчитывали при 0,4, 2 и 40 для партий 1, 2 и 3, соответственно. Это означает, что требуется в 2,5 раза меньше PGN из партии 1 для получения ответов, идентичных таковым, индуцируемым PAM3(cys), но в 2 раза больше PGN из партии 2 и в 40 раз больше PGN из партии 3. После корректировки грубых значений количества PGN, можно видеть, что все точки лежат на одной и той же кривой, которая может быть наложена на таковую, полученную с применением PAM3(cys) (фиг. 7). Следовательно, применение внутреннего стандарта позволяет получить скорректированные концентрации для всех партий PGN и построить кривую доза-ответ, калиброванную для активного PGN.

При применении данного способа стандартная кривая ответа клеток HEK-TLR2 имеет участок линейной зависимости для концентраций активного PGN от 0,5 до 200 нг/мл (фиг. 8) или от 13 до 5400 нг/г полимеров глюкозы.

Изобретение относится к способу количественного определения пептидогликанов (PGN) в образце полимера глюкозы. Способ включает a) обработку образца полимера глюкозы посредством ультразвука, нагревания и/или ощелачивания для фрагментации и разрушения содержащихся в образце PGN и для образования растворимых PGN с размерами между 30 и 5000 кДа; b) приведение обработанного образца в контакт с рекомбинантной клеткой, экспрессирующей экзогенный рецептор TLR2 (Toll-подобный рецептор 2) и репортерный ген при прямой зависимости от сигнального пути, связанного с рецептором TLR2, причем указанный репортерный ген кодирует секретируемую щелочную фосфатазу; c) измерение сигнала репортерного гена и d) определение количества PGN в образце с применением калибровочной кривой на основе зависимости количества PGN от интенсивности сигнала репортерного гена, где калибровочную кривую зависимости количества PGN от интенсивности сигнала репортерного гена стандартизируют или калибруют с использованием трихлоргидрата PAM₃Cys-Ser-(Lys)4. Предложен также набор для количественного определения пептидогликанов (PGN) в образце полимеров глюкозы. Набор содержит трихлоргидрат PAM3Cys-Ser-(Lys)4; рекомбинантную клетку, экспрессирующую экзогенный рецептор TLR2 и репортерный ген при прямой зависимости от сигнального пути, связанного с рецептором TLR2, причем указанный репортерный ген кодирует секретируемую щелочную фосфатазу; и либо калибровочную кривую на основе зависимости количества PGN от интенсивности сигнала репортерного гена, либо стандарт PGN, предпочтительно полученный из бактерии, выбранной из Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis и Alicyclobacillus acidocaldarius, предпочтительно из Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus и Alicyclobacillus acidocaldarius; необязательно инструкции по применению и раствор для предварительной обработки образца. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 8 ил.

1. Способ количественного определения пептидогликанов (PGN) в образце полимера глюкозы, включающий:

a) обработку образца полимера глюкозы посредством ультразвука, нагревания и/или ощелачивания для фрагментации и разрушения содержащихся в образце PGN и для образования растворимых PGN с размерами между 30 и 5000 кДа;

b) приведение обработанного образца в контакт с рекомбинантной клеткой, экспрессирующей экзогенный рецептор TLR2 (Toll-подобный рецептор 2) и репортерный ген при прямой зависимости от сигнального пути, связанного с рецептором TLR2, причем указанный репортерный ген кодирует секретируемую щелочную фосфатазу;

c) измерение сигнала репортерного гена и

d) определение количества PGN в образце с применением калибровочной кривой на основе зависимости количества PGN от интенсивности сигнала репортерного гена, где калибровочную кривую зависимости количества PGN от интенсивности сигнала репортерного гена стандартизируют или калибруют с использованием трихлоргидрата PAM₃Cys-Ser-(Lys)4.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработка образца делает возможным образование PGN преимущественно с размером приблизительно 120 кДа.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетка представляет собой клетку линии HEK-Blue™ hTLR2.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что калибровочная кривая на основе зависимости количества PGN от интенсивности сигнала репортерного гена была построена с применением PGN, полученных из бактерии, выбранной из Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis и Alicyclobacillus acidocaldarius, предпочтительно из Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus и Alicyclobacillus acidocaldarius.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что способ включает предварительную стадию построения калибровочной кривой с применением PGN, полученных из бактерии, выбранной из Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis и Alicyclobacillus acidocaldarius.

6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что калибровочная кривая на основе зависимости количества PGN от интенсивности сигнала репортерного гена была получена с применением внутреннего стандарта, который представляет собой агонист TLR2, предпочтительно липопептид, в частности, трихлоргидрат PAM₃Cys-Ser-(Lys)4.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что способ включает предварительную стадию построения калибровочной кривой с применением внутреннего стандарта, который представляет собой агонист TLR2, предпочтительно липопептид, в частности, трихлоргидрат PAM₃Cys-Ser-(Lys)4.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что образец разводят, при необходимости, таким образом, чтобы получать сигнал репортерного гена, соответствующий линейной части калибровочной кривой.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что образец представляет собой образец раствора икодекстрина.

10. Набор для количественного определения пептидогликанов (PGN) в образце полимеров глюкозы, содержащий:

- рекомбинантную клетку, экспрессирующую экзогенный рецептор TLR2 (Toll-подобный рецептор 2) и репортерный ген при прямой зависимости от сигнального пути, связанного с рецептором TLR2, причем указанный репортерный ген кодирует секретируемую щелочную фосфатазу; и

- либо калибровочную кривую на основе зависимости количества PGN от интенсивности сигнала репортерного гена, либо стандарт PGN, предпочтительно полученный из бактерии, выбранной из Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis и Alicyclobacillus acidocaldarius, предпочтительно из Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus и Alicyclobacillus acidocaldarius;

- необязательно инструкции по применению и раствор для предварительной обработки образца,

указанный набор также содержит трихлоргидрат PAM₃Cys-Ser-(Lys)4.