Способ мониторинга активности единичных молекул фермента Российский патент 2024 года по МПК C12M1/00 C12M1/34 C12Q1/25 

Изобретение относится к области энзимологии единичных молекул и может быть использовано для исследований ферментативных активностей единичных молекул фермента с применением нанотехнологии, а также процессов денатурации единичных молекул ферментов.

Имеются работы по использованию нанопоры как метода детекции единичных молекул ДНК и белков. Так в работе [J. J. Kasianowicz, E. Brandin, D. Branton, D. W. Deamer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 13770] рассматривается регистрация альфа-гемолизина через природную нанопору, образованную белковым каналом, этот белок был выделен из Staphylococcus aureus. В этом методе ДНК электрофоретический проходит через альфа-гемолизиновую пору, которая встраивалась в липидный бислой, который в свою очередь покрывал отверстие между двумя резервуарами (цис- и транс-). Между этими резервуарами подавалось напряжение, под действием которого в жидкости происходило движение отрицательно заряженной молекулы ДНК через нанопору из цис-камеры в транс-камеру. При этом регистрировался электрический ток, проходящий через эту пору, которая менялась в зависимости от нуклеотидной последовательности ДНК. Имеется способ детекции последовательности ДНК с помощью такого метода, который приводится в патенте Oxford nanopore [US8673556B2]. Однако этот метод обладает недостатком: невозможность изменять размер поры искусственным путем под требуемые задачи, а также механическая и химическая нестабильность поры [C. Dekker, Nat. Nanotechnol. 2007, 2, 209; J. Li, D. Stein, C. McMullan, D. Branton, M. J. Aziz, J. A. Golovchenko, Nature 2001, 412, 166; A. J. Storm, J. H. Chen, X. S. Ling, H. W. Zandbergen, C. Dekker, Nat. Mater. 2003, 2, 537].

Имеются и другие биологические нанопоры, организованные белковыми структурами, которые имеют несколько отличающиеся по размеру апертуры, однако эти изменения не очень значительны для регистрации белковых молекул, так как они, как правило, не позволяют встраивать в эту пору единичную молекулу фермента, например, такие поры как нанопоры MspA из Micobacterium smegmatis [E. A. Manrao, I. M. Derrington, A. H. Laszlo, K. W. Langford, M. K. Hopper, N. Gillgren, M. Pavlenok, M. Niederweis, J. H. Gundlach, Nat. Biotechnol. 2012, 30, 349.]. Размер данных пор в узкой части 1нм, а в широкой - порядка 4 нм.

Имеются описания нанопоры, сформированной в бислойной мембране, в которую иммобилизован нанопоровый объект, состоящий из белка типа бактериального амилоид-секретирующего канала (CsgC), этот канал использован в разработке секвенатора компании «Oxford Nanopore» и с 2016 года содержит в качестве нанопоры модифицированный CsgC [Баркова Дарья Валерьевна, Андрианова Мария Сергеевна, Комарова Наталья Владимировна, Кузнецов Александр Евгеньевич. Канальные и моторные белки для транслокации нуклеиновых кислот в технологии нанопорового секвенирования // Вестник Московского университета. Серия 2. Химия. 2020. №3]. Канал имеет большой размер около 4-5 нм во входной части, однако этот диаметр недостаточен для работы с белковыми структурами, размеры которых превышают 5 нм.

Имеются также поры на базе phi29 моторного белка, диаметр которых 3-6 нм. Однако этот размер недостаточен для работы с широким диапазоном белковых структур, размеры которых могут превышать размеры этих нанопор.

Имеются также белковые поры, размеры которых гораздо больше, порядка 40 нм, например, нанопоры, образованные из Streptolysin, однако их размеры были очень большими, порядка 30 нм, что намного больше размера белков, и белок может проскакивать через эти поры, не иммобилизуясь на нанопоре.

Для преодоления этих недостатков можно использовать твердотельную нанопору. Твердотельная нанопора использовалась для исследования пептидов [Karmi A, Sakala GP, Rotem D, Reches M, Porath D. Durable, Stable, and Functional Nanopores Decorated by Self-Assembled Dipeptides. ACS Appl Mater Interfaces. 2020 Mar 25;12(12):14563-14568. doi: 10.1021/acsami.0c00062. Epub 2020 Mar 16. PMID: 32129065; PMCID: PMC7467542]. Эти твердотельные нанопоры были также использованы для анализа первичной структуры белка (секвенирования), например, в работе [Kolmogorov M, Kennedy E, Dong Z, Timp G, Pevzner PA. Single-molecule protein identification by sub-nanopore sensors. PLoS Comput Biol. 2017 May 9;13(5):e1005356. doi: 10.1371/journal.pcbi.1005356. PMID: 28486472; PMCID: PMC5423552].

Наиболее перспективным направлением в нанопоровой технологии для исследования активности фермента является технология, на базе использования Solid-state nanopore с диаметром поры порядка и более 5 нм [Li, J.; Stein, D.; McMullan, C.; Branton, D.; Aziz, M.J.; Golovchenko, J.A. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature 2001, 412, 166–169.].

Solid-state nanopore может быть сконструирована с помощью различных методов, таких как сфокусированный ионный пучок [Li, J.; Stein, D.; McMullan, C.; Branton, D.; Aziz, M.J.; Golovchenko, J.A. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature 2001, 412, 166–169.], облучением тяжелыми ионами, которые образуют треки в полимерных мембранах [Apel, P. Yu.; Blonskaya, I. V.; Dmitriev, S. N.; Orelovich, O. L.; Sartowska, B. A. Ion track symmetric and asymmetric nanopores in polyethylene terephthalate foils for versatile applications // Nuclear Inst. and Methods in Physics Research, B, Volume 365, p. 409-413. Pub Date: December 2015 DOI: 10.1016/j.nimb.2015.07.016; Sun H, Yao C, You K, Chen C, Liu S, Xu Z. Nanopore single-molecule biosensor in protein denaturation analysis. Anal Chim Acta. 2023 Feb 22;1243:340830. doi: 10.1016/j.aca.2023.340830. Epub 2023 Jan 12. PMID: 36697181], а также методом electron-beam drilling (EBD) [Nam, S.W.; Rooks, M.J.; Kim, K.B.; Rossnagel, S.M. Ionic field effect transistors with sub-10 nm multiple nanopores. Nano Lett. 2009, 9, 2044–2048].

Однако сфокусированный ионный пучок не позволяет сделать качественную нанопору размером порядком 5 нм. В то же время метод облучением тяжелыми ионами, образующими треки, является более близким к цели изготовления нанопоры – для исследования функциональной активности ферментов [Sun H, Yao C, You K, Chen C, Liu S, Xu Z. Nanopore single-molecule biosensor in protein denaturation analysis. Anal Chim Acta. 2023 Feb 22;1243:340830. doi: 10.1016/j.aca.2023.340830. Epub 2023 Jan 12. PMID: 36697181], но он требует очень аккуратного манипулирования с одиночными треками и может не давать точные результаты по изготовлению нанопоры необходимого размера. С этой точки зрения наиболее подходящим методом является метод изготовления нанопоры с использованием electron-beam drilling (EBD). В качестве материалов для изготовления такой нанопоры используется, как правило, Si3N4 или, в общем случае, Six-Ny.

Прототипом настоящего изобретения является способ регистрации активности единичных молекул с помощью биологической нанопоры. Эти биологические нанопоры, несмотря на их недостатки, использовались во время работ для изучения активности ферментов в следующих работах:

1.Pham B. et al. A nanopore approach for analysis of caspase-7 activity in cell lysates //Biophysical journal. – 2019. – Т. 117. – №. 5. – С. 844-855.

2. Wang L. et al. Real-time label-free measurement of HIV-1 protease activity by nanopore analysis //Biosensors and Bioelectronics. – 2014. – Т. 62. – С. 158-162.

3.L. Wang, Y. Han, et al., X. Guan Real-time label-free measurement of HIV-1 protease activity by nanopore analysis Biosens. Bioelectron, 62 (2014), pp. 158-162.

4.S. Zhou, L. Wang, et al., X. Guan Label-free nanopore single-molecule measurement of trypsin activity ACS Sens, 1 (2016), pp. 607-613; M. Kukwikila, S. Howorka Nanopore-based electrical and label-free sensing of enzyme activity in blood serum Anal. Chem, 87 (2015), pp. 9149-9154].

В этих работах исследовалась функционирование единичной молекулы фермента, иммобилизованной вблизи биологической нанопоры, при этом анализировался ионный ток, возникающий при функционировании фермента, который располагался непосредственно вблизи нанопоры. Однако к недостаткам таких нанопор относится их нестабильность во времени, невозможность изменять размер поры искусственным путем под требуемые задачи, а также их механическая и химическая нестабильность [Lee K, Park KB, Kim HJ, Yu JS, Chae H, Kim HM, Kim KB. Recent Progress in Solid-State Nanopores. Adv Mater. 2018 Oct;30(42):e1704680. doi: 10.1002/adma.201704680. Epub 2018 Sep 10. PMID: 30260506].

Техническим результатом предлагаемого в настоящем изобретении способа мониторинга активности единичных молекул фермента с помощью нанопоры является расширение арсенала технических средств осуществления способа мониторинга активности единичных молекул.

Для достижения заявленного технического результата предлагается способ мониторинга активности единичных молекул фермента класса оксидоредуктаз на примере пероксидазы хрена и класса гидролаз на примере аспарагиназы с использованием нанопорового детектора, содержащего кювету с цис- и транс-камерами, между которыми вставлена нанопора в форме конуса, изготовленная методом electron-beamdrilling (EBD) в Six-Ny, включающий, введение в цис-камеру кюветы нанопорового детектора раствор буфера, содержащего фермент, а в транс-камеру раствор буфера без фермента, подачу напряжения тока между цис- и транс-камерами, с помощью которого в нанопору вводят единичную молекулу фермента с последующей ее иммобилизацией и контролем процесса иммобилизации ее в нанопоре по величине изменения электрического тока, протекающего через нанопору, промывание цис-камеры от не иммобилизованных молекул фермента, добавление в цис-камеру буферного раствора субстрата, вызывающего активность фермента и последующее осуществление по изменению тока, протекающего через нанопору, мониторинга активности фермента при взаимодействии его молекулы с молекулой введенного буферного раствора субстрата.

Нанопору изготавливают с помощью метода electron-beam drilling (EBD) в Six-Ny в форме конуса, верхняя часть которого соответствует размеру молекулы фермента, а нижняя часть меньше ее размера, и встраивается в кювету, имеющую цис- и транс-часть, между которыми прикладывается напряжение, которое позволяет доставлять молекулу субстрата в фермент, иммобилизованный в нанопоре. Быстродействие функционирования нанопоры определяется быстродействием работы фермента.

Новизна предлагаемого способа заключается в том, что способ мониторинга активности единичных молекул фермента c помощью нанопоры в форме конуса по изменению силы тока, протекающего через нее, реализуется впервые с использованием в качестве примера единичных молекул ферментов пероксидазы и аспарагиназы, иммобилизованных в нанопоре.

Особенностью и существенными признаками предлагаемого способа как необходимого условия проведения мониторинга активности единичной молекулы фермента при ферментативной реакции является:

изготовление искусственной конической нанопоры размера, соответствующего размеру молекулы фермента необходимого для иммобилизации фермента в нанопоре;

иммобилизация молекулы фермента в нанопору;

контроль иммобилизации фермента в нанопоре по измерению силы тока, протекающего через нанопору;

мониторинг при вызове активности единичной молекулы фермента, иммобилизованной в нанопоре, путем измерения силы тока в реальном времени проведения ферментативной реакции введением в цис-камеру кюветы молекулы субстрата или необходимых компонентов для увеличения активности фермента.

Проведенный анализ уровня техники показал, что в современных системах мониторинга активности единичных молекул ферментов не использованы технические решения с использованием ферментов, относящихся к классу оксидоредуктаз и к классу гидролаз на примере пероксидазе и аспарагиназе, таким образом, предлагаемое техническое решение, соответствует критерию «новизна».

Пероксидаза, относящаяся к классу ферментов оксидоредуктаз, проводит каталическое окисление различных субстратов с помощью перекиси водорода (H2O2) или органических перекисей. Пероксидазы выделяются из различных источников, но наиболее изучена растительная пероксидаза (из корней хрена; молярная масса 44100).

Аспарагиназа, относящаяся к ферменту класса гидролаз, катализирует гидролиз преимущественно L-аспарагина. В настоящем изобретении применяется L-аспарагиназа II типа из продуцента Erwinia carotovora. Она переводит в результате каталитического цикла L-аспарагин в L-аспарагиновую кислоту и ионы аммония. Ее молекулярная масса составляет около 144 kDa и представляет из себя 4 субъединицы массой 36 kDa. Активность сайта этого фермента образована на интерфейсе между субъединицами этого олигомера.

При анализе известных аналогов не обнаружены предложения, включающих совокупность существенных признаков, изложенных в формуле изобретения, из чего следует, что для специалистов, занимающихся энзимологией единичных молекул и мониторингом активности фермента, оно явным образом не следует из уровня техники и, следовательно, соответствует критерию «изобретательский уровень».

Ниже представлен способ осуществления мониторинга активности единичных молекул фермента на примере двух типов ферментов: пероксидазы и аспарагиназы с помощью нанопорового детектора, содержащего кювету с цис- и транс-камерами, которые разделены нанопорой конической формы; электронный блок для преобразования тока, протекающего через нанопору и компьютер, записывающий измеренный ток в текущем реальном времени.

В примерах 1 и 2 осуществления предлагаемого в настоящем изобретении способе мониторинга активности единичной молекулы фермента использовались две различные по размеру поры для иллюстрации различия функционирования активности единичных молекул пероксидазы хрена (HRP) с учетом гетерогенности фермента HRP.

ПРИМЕР 1.

Способ мониторинга активности единичных молекул фермента пероксидазы хрена осуществляют поэтапно следующим образом:

1. Для подготовки нанопорового детектора изготавливают методом electron-beamdrilling (EBD) в Six-Ny нанопору конической формы с размером порядка размера молекулы пероксидазы хрена, узкая часть конуса которой меньше размера молекулы пероксидазы хрена.

2. Затем для целей определения иммобилизации в нанопоре молекулы фермента, в цис-камеру кюветы нанопорового детектора вводят раствор буфера молекулы фермента, при этом в транс-камере находится раствор буфера без фермента. После этого между цист- и транс-камерами кюветы подают напряжение тока I, тянущее из цист-камеры в транс-камеру молекулу пероксидазы хрена для введения ее в нанопору. При этом регистрируют изменение силы тока, протекающего через нанопору, для контроля иммобилизации молекулы фермента в нанопоре.

3. После иммобилизации молекулы пероксидазы хрена в нанопоре цис-камеру промывают для удаления неиммобилизованных молекул и затем для вызова активности молекулы фермента, иммобилизованной в нанопоре, в цис-камеру вводят субстрат ABTS [2,2-азино-бис (3-этилбензти-азолин-6-сульфонат) аммония] и раствор перекиси водорода.

4. Во время проявления ферментативной реакции мониторинг активности фермента определяют по изменению силы тока I, протекающего через нанопору из цис- в транс-камеру.

Электрические измерения осуществляют с помощью системы сбора и сохранения данных на основе аналого-цифрового преобразователя.

Результаты способа мониторинга активности единичных молекул фермента пероксидазы хрена при использовании нанопоры размером порядка размера молекулы пероксидазы хрена иллюстрируются на кривой рис. 1, где участок 1 на кривой рис.1 показывает изменение силы тока нанопоры при добавлении HRP (пероксидазы хрена) с концентрацией С = [10]^(-8)М; участок 2 – изменение силы тока нанопоры при добавлении ABTS; участок 3– изменение силы тока, полученного при добавлении Н_2 О_2.

Начальный уровень значения тока-I при включении нанопоры в отсутствии пероксидазы хрена был порядка -100 пикоампер (пА). Как видно на участке 1 кривой рис. 1 при добавлении HRP концентрации [10]^(-8) М наблюдается уменьшение силы тока I до порядка -50 пА, на участке 2 при добавлении субстрата ABTS, а затем Н_2 О_2 (учаастки 2-3 кривой рис. 1) наблюдается флуктуации изменения силы тока на протяжении реального временного порядка t -5000 сек, связанные с активностью единичной молекулы фермента.

В контрольных измерениях в отсутствии иммобилизованной молекулы HRP в нанопоре существенного изменения тока не наблюдалось.

Пример 2.

Способ мониторинга активности единичных молекул фермента пероксидазы хрена поэтапно осуществляют следующим образом:

1. Для подготовки нанопорового детектора изготавливают как в Примере 1 нанопору конической формы с размером порядка размера молекулы пероксидазы хрена, узкая часть конуса которой меньше размера молекулы пероксидазы хрена.

2. Затем для целей определения иммобилизации в нанопоре молекулы фермента, как в Примере 1, в цис-камеру кюветы нанопорового детектора вводят раствор буфера молекулы фермента, в то время как в транс-камере находится раствор буфера без фермента. После этого между цис- и транс-камерами кюветы подают напряжение тока I, тянущее из цис-камеры в транс-камеру молекулу пероксидазы хрена для введения ее в нанопору. При этом регистрируют изменение силы тока, протекающего через нанопору для контроля иммобилизации молекулы фермента в нанопоре.

3. После иммобилизации молекулы пероксидазы хрена в нанопоре цис-камеру промывают для удаления неиммобилизованных молекул и затем для вызова активности молекулы фермента, иммобилизованной в нанопоре, в цис-камеру вводят субстрат ABTS [2,2-азино-бис (3-этилбензти-азолин-6-сульфонат) аммония] и раствор перекиси водорода.

4. Во время проявления ферментативной реакции мониторинг активности фермента определяют по изменению силы тока I, протекающего через нанопору из цис- в транс-камеру.

Электрические измерения, как и в Пример 1, осуществляют с помощью системы сбора и сохранения данных на основе аналого-цифрового преобразователя.

Результаты способа мониторинга активности единичных молекул фермента пероксидазы хрена при использовании нанопоры размером порядка размера молекулы пероксидазы хрена иллюстрируются кривой рис. 2, где участок 1 кривой рис. 2 показывает изменение силы тока нанопоры при добавлении HRP (пероксидазы хрена) с концентрацией С =[10]^(-6) М; участок 2 – изменение силы тока нанопоры при добавлении ABTS; участок 3– изменение силы тока нанопоры, полученного при добавлении Н_2 О_2.

Начальный уровень значения тока при включении нанопоры в отсутствии пероксидазы хрена был порядка ~100 пикоампер (пА). Как видно на участке 1 кривой рис. 2 при добавлении HRP концентрации [10]^(-6) М наблюдается сила тока I порядка -200 пА. На участке 2 кривой рис.2 при добавлении субстрата ABTS не наблюдается существенного изменения силы тока, который находился на уровне примерно -200 пА. После дальнейшего добавления перекиси водорода на участке 3 кривой рис.2 наблюдаются флуктуации изменения силы тока на протяжении реального временного порядка t-1500 сек, которые связаны с проявляемой активностью единичной молекулы фермента при ферментативной реакции.

В контрольных измерениях в отсутствии иммобилизованной HRP нанопоре не наблюдалось существенного изменения электрического тока, проходящего через нанопору.

Пример 3.

Способ мониторинга активности единичных молекул агрегата аспарагиназы поэтапно осуществляют следующим образом:

1. Для подготовки нанопорового детектора изготавливают нанопору конической формы с размером порядка размера олигомера аспарагиназы, узкая часть конуса которой меньше, чем размера олигомера аспарагиназы.

2. Затем, как в Примерах 1 и 2, для целей определения иммобилизации в нанопоре молекулы фермента в цис-камеру кюветы нанопорового детектора вводят раствор буфера молекулы фермента, при этом в транс-камере находится раствор буфера без фермента. После этого между цис- и транс-камерами кюветы подают напряжение тока I, тянущее из цис-камеры в транс-камеру аспарагиназу для введения ее в нанопору. Далее регистрируют изменение силы тока, протекающего через нанопору для контроля иммобилизации молекулы фермента в нанопоре.

3. После иммобилизации аспарагиназы в нанопоре, цис-камеру промывают для удаления неиммобилизованных молекул и затем для вызова активности молекулы фермента, иммобилизованной в нанопоре, в цис-камеру кюветы нанопорового детектора добавляют раствор аспарагина.

4. Во время проявления ферментативной реакции мониторинг активности фермента определяют по изменению силы тока I, протекающего через нанопору из цис- в транс-камеру.

Электрические измерения, как в Примерах 1 и 2, проводят с помощью системы сбора и сохранения данных на основе аналого-цифрового преобразователя.

Результаты предлагаемого способа мониторинга активности единичных молекул агрегата аспарагиназы при использовании нанопоры иллюстрируются кривой рис.3, где участок 1 кривой рис.3 показывает изменение силы тока- I нанопоры при добавлении аспарагиназы с концентрацией С =[10]^(-8) М; участок 2 - изменение силы тока нанопоры при введении аспарагиназы с концентрацией С =[10]^(-7) М; участок 3 кривой рис.3 – изменение силы тока нанопоры при добавлении аспарагина.

Начальный уровень значения тока при включении нанопоры в отсутствии аспарагиназы был порядка 100 пикоампер (пА). Как видно на участке 1 кривой рис. 3 при добавлении аспарагиназы концентрации [10]^(-8) М наблюдается постепенное уменьшение силы тока с -60 пА до – 80 пА, на участке 2 кривой рис.3 при введении аспарагиназы большей концентрации наблюдается изменение силы тока практически до нуля, то есть нанопора перекрывается полностью. После добавления раствора субстрата аспарагина наблюдается ферментативная реакция, приводящая к открытию нанопоры (участок 3 кривой рис.3).

В контрольных измерениях в отсутствии иммобилизованной аспарагиназы в нанопоре не наблюдалось существенного изменения силы тока.

В предлагаемом в настоящем изобретении способе мониторинга активности единичной молекулы фермента вместо искусственной нанопоры может быть использована природная нанопора, а введение растворов буфера и субстрата можно осуществлять в обратном порядке из транс-камеры кюветы нанопорового детектора в цис-камеру.

Для обеспечения большей активности фермента при ферментативной реакции могут при необходимости вводиться в буферный раствор субстрата дополнительные компоненты.

Приведенные примеры реализации предлагаемого в настоящем изобретении способа мониторинга единичной молекулы фермента и полученные результате их осуществления подтверждают обеспечение надежности работы, изготовленной и использованной в предлагаемом способе нанопоры в течение времени ее жизни при функционировании активности фермента в реальном времени.

Изобретение относится к области энзимологии единичных молекул и может быть использовано для исследований ферментативных активностей единичных молекул фермента с применением нанотехнологии, а также процессов денатурации единичных молекул ферментов. Способ мониторинга активности единичных молекул фермента класса оксидоредуктаз на примере пероксидазы хрена и класса гидролаз на примере аспарагиназы осуществляется с использованием нанопорового детектора. Нанопоровый детектор содержит кювету с цис- и транс-камерами, между которыми вставлена нанопора в форме конуса, изготовленная методом electron-beamdrilling (EBD) в Six-Ny. Способ включает введение в цис-камеру кюветы раствора буфера, содержащего фермент, а в транс-камеру раствора буфера без фермента. Подают напряжение тока между цис- и транс-камерами, с помощью которого в нанопору вводят единичную молекулу фермента с последующей ее иммобилизацией. Контроль процесса иммобилизации осуществляют по величине изменения электрического тока, протекающего через нанопору. Промывают цис-камеру от не иммобилизованных молекул фермента. Добавляют в цис-камеру буферный раствор субстрата, вызывающий активность фермента. По изменению тока, протекающего через нанопору, осуществляют мониторинг активности фермента при взаимодействии его молекулы с молекулой введенного буферного раствора субстрата. Группа изобретений обеспечивает расширение арсенала технических средств осуществления способа мониторинга активности единичных молекул. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 пр.

1. Способ мониторинга активности единичных молекул фермента класса оксидоредуктаз на примере пероксидазы хрена и класса гидролаз на примере аспарагиназы с использованием нанопорового детектора, содержащего кювету с цис- и транс-камерами, между которыми вставлена нанопора в форме конуса, изготовленная методом electron-beamdrilling (EBD) в Six-Ny, включающий введение в цис-камеру кюветы нанопорового детектора раствора буфера, содержащего фермент, а в транс-камеру раствора буфера без фермента, подачу напряжения тока между цис- и транс-камерами, с помощью которого в нанопору вводят единичную молекулу фермента с последующей ее иммобилизацией и контролем процесса иммобилизации ее в нанопоре по величине изменения электрического тока, протекающего через нанопору, промывание цис-камеры от не иммобилизованных молекул фермента, добавление в цис-камеру буферного раствора субстрата, вызывающего активность фермента, и последующее осуществление по изменению тока, протекающего через нанопору, мониторинга активности фермента при взаимодействии его молекулы с молекулой введенного буферного раствора субстрата.

2. Способ по п.1, в котором в качестве субстрата для мониторинга единичной молекулы пероксидазы хрена используют раствор перекиси водорода и субстрат [2,2-азино-бис(3-этилбензти-азолин-6-сульфонат) аммония].

3. Способ по п.1, в котором в качестве субстрата для мониторинга единичной молекулы аспарагиназы используют раствор аспарагина.

4. Нанопоровый детектор для мониторинга активности фермента, содержащий кювету с цис- и транс-камерами, между которыми подают напряжение тока, помещенную между цис- и транс-камерами нанопору, изготовленную методом electron-beamdrilling (EBD) в Six-Ny в форме конуса, верхняя часть которого соответствует размеру молекулы фермента, а нижняя часть меньше размера молекулы фермента, электронный блок, снимающий изменение силы тока, протекающего через нанопору, и компьютер, записывающий изменение тока.