ОПТИМИЗИРОВАННАЯ ЭКСПРЕССИОННАЯ КАССЕТА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ПОЛИПЕПТИДА С ВЫСОКИМ ВЫХОДОМ Российский патент 2019 года по МПК C12N15/85 C12N5/10 C07K16/00 C12P21/02 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение, среди прочего, относится к экспрессионной кассете, подходящей для экспрессии представляющего интерес полипептида, причем указанная экспрессионная кассета содержит комбинацию определенной 5'-UTR и секреторной лидерной последовательности hCD33. Было найдено, что эта определенная комбинация генетических элементов неожиданно приводит к значительному увеличению уровня экспрессии представляющего интерес полипептида по сравнению с комбинациями других 5'-UTR с другими секреторными лидерными последовательностями. Поэтому, применение этой экспрессионной кассеты является предпочтительным для получения представляющего интерес полипептида с высоким выходом.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Возможность клонировать и экспрессировать в большом количестве представляющий интерес полипептид становится все более важной. Возможность продуцировать и очищать большое количество белков в особенности важна в области фармацевтики и биотехнологии для человека и, например, для получения белковых фармацевтических препаратов, а также в научно-исследовательской области, например, для кристаллизации белков, позволяющей определить их трехмерную структуру. Белки, которые иным образом трудно получить в большом количестве, могут быть сверхэкспрессированы в клетках-хозяевах, а затем выделены и очищены.

Выбор системы экспрессии для получения рекомбинантных белков зависит от многих факторов, включая характеристики роста клеток, уровень экспрессии, внутриклеточную и внеклеточную экспрессию, пост-трансляционные модификации и биологическую активность представляющего интерес белка, а также нормативно-правовое регулирование и экономические соображения при производстве терапевтических белков. Ключевыми преимуществами клеток млекопитающих по сравнению с другими экспрессионными системами, такими как бактериальная или дрожжевая, являются возможность осуществления правильного сворачивания белка, сложного N-гликозилирования и аутентичного O-гликозилирования, а также широкого спектра других посттрансляционных модификаций. Вследствие описанных преимуществ, эукариотические и, в частности, клетки млекопитающих в настоящее время являются предпочтительной экспрессионной системой для получения сложных терапевтических белков, таких как моноклональные антитела.

Наиболее распространенным подходом для получения клеток-хозяев с высоким уровнем экспрессии (также называемых суперпродуцентами) является получение соответствующего экспрессионного вектора для экспрессии представляющего интерес продукта в качестве первого шага. Экспрессионный вектор запускает экспрессию полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес продукт, в клетке-хозяине и обычно содержит по меньшей мере один селективный маркер для создания рекомбинантной клеточной линии. Экспрессионные векторы, используемые для экспрессии полипептида в клетке-хозяине, обычно включают в себя, помимо полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес белок, элементы регуляции транскрипции, подходящие для запуска транскрипции, такие как, например, промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, сигналы паузы или терминации транскрипции, в качестве элементов экспрессионной кассеты. Кроме того, обычно включены подходящие элементы контроля трансляции и функционально связаны с полинуклеотидами, подлежащими экспрессии, такие как, например, соответствующие 5'-UTR и 3'-UTR.

Для повышения эффективности такой системы экспрессии, различные элементы оптимизируют, в особенности, последовательности ДНК, которые вносят вклад в эффективность транскрипции и трансляции, синтез белка, правильное сворачивание в эндоплазматическом ретикулуме и секрецию белка. Системы экспрессии с высоким выходом без оптимизированных компонентов трансляции и секреции потенциально могут привести к нестабильности мРНК, недостаточной секреции белка и накоплению неправильно свернутого (неактивного) белка в цитозоле клетки или в мембране. Поэтому, системы экспрессии, позволяющие стабильную и последовательную трансляцию и секрецию корректно свернутых белков в клеточную культуральную среду, представляют особый интерес. Такие секреторные системы предлагают преимущества стабильной и эффективной трансляции мРНК, правильной укладки белка и эффективной секреции, простых и быстрых процедур очистки продукта, а также повышенного выхода по сравнению с цитозольными системами. Однако выход продукта для большинства имеющихся секреторных систем еще полностью не оптимизирован. Для повышения производительности и эффективности секреции, одной целью является оптимизация секреторных сигналов (также называемых в данном документе сигнальным пептидом или секреторной лидерной последовательностью), а также их комбинация с различными 5'-UTR последовательностями, с целью получения комбинации генетических элементов, которая приводит к желаемому высокому уровню экспрессии.

Большинство секретируемых и мембраносвязанных белков как из прокариотических, так и из эукариотических организмов, имеют аминоконцевой лидерный пептид (также называемый секреторной лидерной последовательностью или сигнальным пептидом), который отщепляется от растущего полипептидного предшественника в процессе биосинтеза. Секреторные лидерные пептиды обычно имеют длину от 5 до 60 аминокислот. Эта последовательность является необходимой и достаточной для секреции. Анализ большого числа этих секреторных лидерных пептидов показал присутствие общего структурного мотива в отсутствие значительной гомологии по аминокислотной последовательности [Von Heijne, 1981; Perlman et al, 1983]. В общем, секреторная лидерная последовательность состоит из положительно заряженного аминоконца (n), гидрофобного ядра (h) и более полярного карбоксильного конца (с), который определяет сайт расщепления сигнальной пептидазой. «n»-область секреторного лидерного пептида имеет длину от 5 до 8 аминокислот и характеризуется наличием основных остатков. «h»-область содержит от 8 до 12 неполярных аминокислот, которые состоят в среднем из 37% остатков лейцина, 15% остатков аланина, 10% остатков валина, 10% остатков фенилаланина, 7% остатков изолейцина и 21% остатков гидрофобных аминокислот, таких как глицин, метионин, пролин или триптофан. Эта область имеет сильную склонность к образованию альфа-спирали, конформации, которая может облегчить взаимодействие с внутренней частью липидного бислоя. Исследования структурных особенностей секреторных лидерных пептидов, в первую очередь основанные на бактериальных белках, позволили предположить, что «h»-область имеет решающее значение для функции сигнальной последовательности [Gierasch, 1990]. Разрушение h-области путем удаления или путем замены гидрофобных остатков гидрофильными или заряженными аминокислотами приводит к потере сигнальной функции, тогда как изменения в «n»-области оказывают небольшой эффект [Bird et al, 1990]. Карбоксильный конец или область расщепления, как правило, составляет в длину около 6 аминокислот. Эта область участвует в распознавании и расщеплении сигнальной пептидазой, что обычно необходимо для достижения окончательного сворачивания и секреции белка.

5'-UTR (5'-нетранслируемая область) является частью последовательности ДНК, которая транскрибируется в мРНК, но не в белок. Она обычно начинается с точки инициации транскрипции и заканчивается за один нуклеотид перед старт-кодоном. 5'-UTR может содержать последовательности, которые регулируют эффективность трансляции или стабильность мРНК, сайты связывания белков, регуляторных элементов и последовательностей, которые способствуют инициации трансляции. Последовательности 5'-UTR могут варьировать в длину и могут содержать от нескольких десятков нуклеотидов до нескольких сотен или даже нескольких тысяч нуклеотидов. У эукариот медианная длина 5'-UTR составляет примерно от 100 до 200 нуклеотидов. Конкретная роль 5'-UTR и ее элементов полностью еще не выяснена, частично потому, что ее последовательность не транслируется в функциональный белок. Однако известно, что комбинация определенной 5'-UTR и определенной секреторной лидерной последовательности может сильно улучшить эффективность трансляции и секреции продуцирующей системы и, таким образом, может увеличить выход экспрессии. Однако поскольку доступны множество 5'-UTR и секреторных лидерных последовательностей, проблемой является получение эффективной комбинации, которая действительно улучшает экспрессию. Поэтому, несмотря на множество доступных экспрессионных кассет и векторов экспрессии, достижение надежной продукции полипептида/белка с высоким выходом в эукариотических клетках по-прежнему является сложной задачей.

Поэтому, целью настоящего изобретения является создание экспрессионной кассеты, которая дает возможность секреции представляющего интерес полипептида с высоким выходом при введении экспрессионной кассеты в клетку-хозяина. Кроме того, целью настоящего изобретения является создание экспрессионного вектора, который позволяет экспрессию представляющего интерес полипептида с высоким выходом. Кроме того, целью настоящего изобретения является создание способа, пригодного для экспрессии представляющего интерес полипептида с высоким выходом.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на обнаружении того, что комбинация определенной полинуклеотидной последовательности 5'-UTR (см. SEQ ID NO 1, которая также содержится в SEQ ID NO: 2, 3 и 4, а также 5, 6 и 7) и секреторной лидерной последовательности CD33 человека в экспрессионной кассете приводит к удивительно высокой экспрессии представляющего интерес полипептида, который кодируется указанной экспрессионной кассетой. В некоторых примерах было показано, что экспрессионная кассета по настоящему изобретению превосходит экспрессионные кассеты, известные в данной области на сегодняшний день, поскольку выход экспрессии может быть увеличен до 4 раз. Превосходные характеристики экспрессионной кассеты по настоящему изобретению были подтверждены в многочисленных экспериментах, в которых различные представляющие интерес полипептиды были проэкспрессированы с использованием указанной экспрессионной кассеты. Таким образом, экспрессионная кассета по настоящему изобретению особенно предпочтительна для получения представляющего интерес полипептида с высоким выходом. Дополнительно было обнаружено, что может быть улучшен корректный процессинг лидерной последовательности. Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает ценный вклад в данную область техники, поскольку эта новая конструкция экспрессионной кассеты значительно улучшает экспрессию представляющего интерес полипептида.

Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к экспрессионной кассете для экспрессии представляющего интерес полипептида, включающей:

а) промотор

b) полинуклеотидную последовательность 5'-UTR, причем указанную полинуклеотидную последовательность 5'-UTR выбирают из группы, состоящей из:

i) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

ii) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

iii) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

iv) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

v) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

vi) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

vii) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

viii) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно, по меньшей мере на 90% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 или SEQ ID NO 4, или SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 или SEQ ID NO 7;

c) полинуклеотид, кодирующий секреторную лидерную последовательность hCD33; и

d) полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид или инсерционный сайт для вставки полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид.

Согласно второму аспекту настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору для экспрессии представляющего интерес полипептида, содержащему по меньшей мере одну экспрессионную кассету по первому аспекту настоящего изобретения.

Согласно третьему аспекту настоящее изобретение относится к эукариотической клетке-хозяина, которая содержит по меньшей мере одну экспрессионную кассету по первому аспекту настоящего изобретения и/или по меньшей мере один экспрессионный вектор по второму аспекту настоящего изобретения.

Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение относится к способу получения клетки-хозяина по третьему аспекту настоящего изобретения, причем экспрессионный вектор по второму аспекту настоящего изобретения вводят в эукариотическую клетку-хозяина.

Согласно пятому аспекту настоящее изобретение относится к способу получения представляющего интерес полипептида, причем указанный способ включает культивирование клеток-хозяев по третьему аспекту настоящего изобретения в клеточной культуре при условиях, позволяющих экспрессию указанного представляющего интерес полипептида.

Согласно шестому аспекту настоящее изобретение относится к применению последовательности 5'UTR в комбинации с секреторной лидерной последовательностью hCD33 в экспрессионной кассете для экспрессии представляющего интерес полипептида с высоким выходом с указанной кассеты экспрессии, причем указанную полинуклеотидную последовательность 5'-UTR выбирают из группы, состоящей из:

i) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей последовательность

ii) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

iii) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

iv) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

v) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

vi) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

vii) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

viii) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно, по меньшей мере на 90% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 или SEQ ID NO 4, или SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 или SEQ ID NO 7.

Другие цели, признаки, преимущества и аспекты настоящей заявки будут очевидны специалистам в данной области техники из последующего описания и прилагаемой формулы изобретения. Однако следует понимать, что нижеследующее описание, прилагаемая формула изобретения и конкретные примеры, показывающие предпочтительные варианты применения, приведены только в качестве иллюстрации. Различные изменения и модификации в пределах сущности и объема описанного изобретения будут сразу очевидны для специалистов в данной области техники при прочтении нижеследующего описания.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к экспрессионной кассете для экспрессии представляющего интерес полипептида, содержащей новую комбинацию генетических элементов, а именно определенной полинуклеотидной последовательности 5'UTR и секреторной лидерной последовательности hCD33. Эта определенная комбинация генетических элементов приводит к значительному увеличению эффективности экспрессии кодируемого полипептида, представляющего интерес. Кроме того, было обнаружено, что может быть улучшен процессинг лидерной последовательности, так что могут быть снижено количество нежелательных удлинений или усечений (также известных как «обрезание») последовательности из-за ошибочного процессинга лидерной последовательности.

В соответствии с первым аспектом обеспечивается экспрессионная кассета для экспрессии представляющего интерес полипептида, включающая:

а) промотор

b) полинуклеотидную последовательность 5'-UTR, причем указанную полинуклеотидную последовательность 5'-UTR выбирают из группы, состоящей из:

i) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

ii) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

iii) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

iv) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

v) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

vi) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

vii) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

viii) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно, по меньшей мере на 90% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 или SEQ ID NO 4, или SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 или SEQ ID NO 7;

c) полинуклеотид, кодирующий секреторную лидерную последовательность hCD33; и

d) полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид или инсерционный сайт для вставки полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид.

Термин «экспрессионная кассета» при использовании в данном документе, в частности, относится к сегменту ДНК, который способен в соответствующей обстановке запускать экспрессию полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид, который включен в указанную экспрессионную кассету. При введении в клетку-хозяина экспрессионная кассета помимо прочего способна задействовать клеточные механизмы для транскрипции полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид, в РНК, которая затем обычно дополнительно процессируется и, наконец, транслируется в представляющий интерес полипептид. Экспрессионная кассета может содержаться в экспрессионном векторе, как будет более подробно описано ниже. Отдельные элементы экспрессионной кассеты по настоящему изобретению далее описаны более подробно.

Экспрессионная кассета по настоящему изобретению содержит в качестве элемента (а) промотор. Термин «промотор», используемый в настоящем документе, в частности, относится к элементу ДНК, который способствует транскрипции полинуклеотида, с которым функционально связан промотор. Промотор может также составлять часть элемента «промотор/энхансер». Хотя физические границы между элементами «промотор» и «энхансер» не всегда ясны, термин «промотор» обычно относится к месту на молекуле нуклеиновой кислоты, с которым связывается РНК-полимераза и/или связанные с ней факторы, и с которого инициируется транскрипция. Энхансеры усиливают активность промотора во времени, а также пространственно. В данной области известно множество промоторов, которые транскрипционно активны в широком диапазоне типов клеток. Промоторы могут быть разделены на два класса: на тех, которые функционируют конститутивно, и тех, которые регулируются индукцией или снятием репрессии. Для экспрессии белка пригодны оба класса. Промоторы, которые используются для продукции высокого уровня полипептидов в эукариотических клетках и, в частности, в клетках млекопитающих, должны быть сильными и, предпочтительно, должны быть активными в широком диапазоне типов клеток. Сильные конститутивные промоторы, которые способны запускать экспрессию во многих типах клеток, хорошо известны в данной области и, поэтому, нет необходимости в их подробном описании в данном документе. В соответствии с идеей настоящего изобретения предпочтительно использовать промотор цитомегаловируса (CMV). Промотор или промотор/энхансер, полученные из немедленной ранней (IE) области цитомегаловируса (hCMV) человека, в особенности подходят в качестве промотора в экспрессионной кассете по настоящему изобретению. Немедленная ранняя (IE) область цитомегаловируса (hCMV) человека и полученные из нее функциональные запускающие экспрессию фрагменты и/или функциональные усиливающие экспрессию фрагменты, например, описаны в ЕР 0173177 и ЕР 0323997, а также хорошо известны в данной области. Таким образом, несколько фрагментов немедленной ранней (IE) области hCMV могут использоваться в качестве промотора и/или промотора/энхансера. Согласно одному варианту осуществления изобретения промотор CMV человека используется в экспрессионной кассете по настоящему изобретению. Термин «промотор CMV человека», используемый в настоящем документе, в частности, относится к промотору, который получен из немедленной ранней (IE) области hCMV.

Согласно одному варианту осуществления изобретения используется промотор CMV человека, который выбран из группы, состоящей из:

а) промотора, содержащего следующую последовательность

или его функционального фрагмента, который действует как промотор;

b) промотора, содержащего последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, более предпочтительно, по меньшей мере на 97%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 99% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 8, или его функциональному фрагменту, который функционирует в качестве промотора.

% идентичности может быть рассчитан относительно всей длины эталонной последовательности.

В соответствии с идеей настоящего изобретения было найдено, что соответствующий промотор особенно хорошо работает в комбинации с определенной полинуклеотидной последовательностью 5'UTR, выбранной из указанной выше группы, и сигнальной последовательностью hCD33.

Экспрессионная кассета по настоящему изобретению дополнительно содержит в качестве элемента (b) определенную полинуклеотидную последовательность 5'-UTR (нетранслируемую область на 5'-конце). Термин «полинуклеотидная последовательность 5'-UTR», используемый в данном документе, в частности, относится к последовательности ДНК, которая транскрибируется в мРНК, но впоследствии не транслируется в полипептид. Полинуклеотидная последовательность 5'-UTR обычно начинается с сайта начала транскрипции и заканчивается перед старт-кодоном фактической кодирующей области. В экспрессионной кассете по настоящему изобретению полинуклеотидная последовательность 5'-UTR заканчивается до полинуклеотида, кодирующего начало секреторной лидерной последовательности hCD33.

Полинуклеотидная последовательность 5'-UTR, используемая в экспрессионной кассете по настоящему изобретению, предпочтительно содержит последовательность, показанную в SEQ ID NO 1. Соответствующая полинуклеотидная последовательность 5'-UTR описана в WO 2009/080720.

Согласно одному варианту осуществления изобретения полинуклеотидная последовательность 5'-UTR содержит последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, или содержит последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7. Последовательность 5'-UTR, которая показана в SEQ ID NO 1, представляет собой консенсусную последовательность, которая также содержится в последовательностях 5'-UTR, показанных в SEQ ID NO: 2, 3 и 4, а также в последовательностях 5'-UTR, показанных в SEQ ID NO: 5, 6 и 7. Предпочтительно использовать последовательность 5'-UTR, содержащую или состоящую из SEQ ID NO 3, для экспрессии легкой цепи антитела или ее функционального фрагмента, и использовать последовательность 5'-UTR, содержащую или состоящую из SEQ ID NO 1 или SEQ ID NO 4, для экспрессии тяжелой цепи антитела или ее функционального фрагмента. Последовательность 5'-UTR, содержащая или состоящая из SEQ ID NO: 5, согласно одному варианту осуществления изобретения используется для экспрессии легкой цепи антитела или ее функционального фрагмента. SEQ ID NO: 5 может также использоваться, например, для экспрессии нанотела в качестве примера варианта осуществления изобретения. Последовательность 5'-UTR, содержащая или состоящая из SEQ ID NO: 6, согласно одному варианту осуществления изобретения используется для экспрессии тяжелой цепи антитела или ее функционального фрагмента. Последовательность 5'-UTR, содержащая или состоящая из SEQ ID NO: 7, согласно одному варианту осуществления изобретения используется для экспрессии тяжелой цепи антитела или ее функционального фрагмента. Это также было протестировано в примерах.

Было найдено, что 5'-UTR, которая используется в соответствии с настоящим изобретением, состоит из нескольких элементов и включает последовательность 5'-фланкирующей интрон области, интрон и последовательность 3'-фланкирующей интрон области. Интрон и интрон-фланкирующие области, содержащиеся в указанной 5'-UTR, имеют свое происхождение из тяжелой цепи мышиного IgG (см., например, Eaton et al., 1986, Biochemistry 25, 8343-8347, Neuberger et al., 1983, EMBO J. 2(8), 1373-1378; ее можно получить из вектора pRK-5 (BD PharMingen)). В нижеследующей таблице показаны предполагаемые границы указанных элементов, которые содержатся в 5'-UTR, которая может использоваться в соответствии с настоящим изобретением:

Кроме того, может использоваться полинуклеотидная последовательность 5'-UTR, которая содержит последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно, по меньшей мере на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 95%, более предпочтительно, по меньшей мере на 98%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 99% идентична последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4, или последовательности, показанной в SEQ ID NO 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7. Идентичность может быть рассчитана относительно всей длины последовательности эталонной 5'-UTR.

В многочисленных экспериментах авторы изобретения обнаружили, что указанные определенные полинуклеотидные последовательности 5'-UTR в комбинации с сигнальной последовательностью hCD33 имеют вышеописанные предпочтительные эффекты на выход экспрессии, который существенно увеличивается по сравнению с прототипными экспрессионными кассетами.

Экспрессионная кассета по настоящему изобретению дополнительно включает в себя элемент (с) - полинуклеотид, кодирующий секреторную лидерную последовательность hCD33. CD33 человека является членом связывающих сиаловую кислоту иммуноглобулин-подобных лектин ингибирующих рецепторов. CD33 представляет собой трансмембранный гликопротеин весом 67 кДа и специфически экспрессируется на клетках миелоидного ряда. Термин «полинуклеотид, кодирующий секреторную лидерную последовательность hCD33», используемый в данном документе, в частности, относится к полинуклеотиду, который кодирует секреторную лидерную последовательность, содержащую секреторную лидерную последовательность hCD33. Таким образом, после транскрипции и последующей трансляции получают секреторную лидерную последовательность, которая включает в себя и, предпочтительно, состоит из секреторной лидерной последовательности hCD33. Эффект указанной секреторной лидерной последовательности состоит в том, что слитый с ней полипептид, представляющий интерес, эффективно секретируется из клетки-хозяина. Секреторная лидерная последовательность отщепляется в процессе биосинтеза. Как обсуждалось выше, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что определенная комбинация вышеописанной полинуклеотидной последовательности 5'-UTR с секреторной лидерной последовательностью hCD33 приводит к значительному увеличению экспрессии полипептида. Поэтому, комбинация по настоящему изобретению превосходит другие комбинации, которые используют такую же 5'-UTR в сочетании с другими секреторными лидерными последовательностями, которые не включают секреторную лидерную последовательность hCD33, а, например иммуноглобулиновую секреторную лидерную последовательность, как описано в WO2009/080720. Согласно одному варианту осуществления изобретения секреторная лидерная последовательность hCD33, используемая в экспрессионной кассете по настоящему изобретению, содержит следующую аминокислотную последовательность:

MPLLLLLPLLWAGALA (SEQ ID NO: 12)

Различные аминокислотные последовательности описаны в литературе для секреторной лидерной последовательности hCD33. Большинство документов описывают секреторную лидерную последовательность hCD33, как состоящую из следующей аминокислотной последовательностью

MPLLLLLPLLWAGALAMD (SEQ ID NO: 13).

Очевидно, что SEQ ID NO: 13 содержит две дополнительные аминокислоты на 3'-конце по сравнению с SEQ ID NO: 12. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения полинуклеотид, кодирующий секреторную лидерную последовательность hCD33, кодирует секреторную лидерную последовательность, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO 12 или SEQ ID NO 13. Однако предпочтительно использовать более короткую секреторную лидерную последовательность hCD33, показанную в SEQ ID NO 12. Предполагается, что немного более короткая сигнальная последовательность повышает вероятность правильного расщепления пептидазой, обеспечивает возможность корректного процессинга и тем самым обеспечивает качество продукции. Использование более длинной секреторной лидерной последовательности CD33, показанной в SEQ ID NO 13, может представлять риск в том, что представляющий интерес полипептид несет дополнительные аминокислоты на своем N-конце после отщепления секреторной лидерной последовательности, что недопустимо, в частности, при экспрессии фармацевтических полипептидов. Этого риска можно избежать при использовании секреторной лидерной последовательности hCD33, показанной в SEQ ID NO 12. Кроме того, короткая последовательность, по-видимому, более эффективна в отношении секреции за счет лучшего распределения заряда, в частности, при использовании в комбинации с полинуклеотидной последовательностью 5'-UTR по настоящему изобретению. Поэтому предпочтительно, чтобы полинуклеотид кодировал секреторную лидерную последовательность hCD33, которая состоит из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO 12.

В экспрессионной кассете, промотор (элемент а) расположен в 5'-области от полинуклеотидной последовательности 5'-UTR (элемента b), которая, в свою очередь, расположена в 5'-области от полинуклеотида, кодирующего секреторную лидерную последовательность hCD33 (элемент с). Указанные элементы функционально связаны в экспрессионной кассете, чтобы позволить эффективную экспрессию полипептида, представляющего интерес, если полинуклеотид, кодирующий соответствующий полипептид, представляющий интерес, введен в указанную экспрессионную кассету.

Экспрессионная кассета по настоящему изобретению является «подходящей для экспрессии полипептида, представляющего интерес». Этот термин, в частности, описывает, что полипептид экспрессируется с указанной экспрессионной кассеты, если полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид, введен в экспрессионную кассету. Таким образом, согласно одному варианту осуществления изобретения экспрессионная кассета по настоящему изобретению содержит в качестве элемента (d) полинуклеотид, кодирующий полипептид, представляющий интерес. Таким образом, указанный полинуклеотид включает кодирующую область полипептида, представляющего интерес. Предпочтительно, чтобы указанный полинуклеотид представлял собой или был получен из кДНК. Предпочтительно, чтобы указанный полинуклеотид не содержал дополнительную секреторную лидерную последовательность. Указанный полинуклеотид, кодирующий полипептид, представляющий интерес, находится в 3'-области от полинуклеотида, кодирующего секреторную лидерную последовательность hCD33, так что при экспрессии получают слитый полипептид, который содержит секреторную лидерную последовательность hCD33 и представляющий интерес полипептид. 5'-UTR и секреторная лидерная последовательность, которые используются в экспрессионной кассете по настоящему изобретению, являются гетерологичными полинуклеотиду, кодирующему полипептид, представляющий интерес, то есть они в природе не связаны с указанным полинуклеотидом. Экспрессия полинуклеотида, кодирующего полипептид, представляющий интерес, находится под пост-транскрипционным контролем указанной 5'-UTR и указанной секреторной лидерной последовательности, содержащей и, предпочтительно, состоящий из лидерной последовательности hCD33.

Согласно альтернативному варианту осуществления изобретения экспрессионная кассета содержит инсерционный сайт для вставки полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид, однако еще не содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, представляющий интерес. Указанный инсерционный сайт расположен в 3'-области от полинуклеотида, кодирующего секреторную лидерную последовательность hCD33. Для этого экспрессионная кассета может содержать, например, сайт множественного клонирования (MCS), который может использоваться, например, во всех рамках считывания. Соответствующая «пустая» экспрессионная кассета, содержащая инсерционный сайт, может использоваться для вставки полинуклеотида, кодирующего целевой полипептид, представляющий интерес. Преимущество ее состоит в том, что потребитель может вставить полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид в указанный инсерционный сайт, таким образом получая конечную экспрессионную кассету. При экспрессии, целевой полипептид, слитый с секреторной лидерной последовательностью по настоящему изобретению, экспрессируется с указанной конечной экспрессирующей кассеты и секретируется. Поэтому, соответствующая «пустая» экспрессионная кассета является полезным инструментом для экспрессии различных полипептидов, представляющих интерес, так как экспрессионная кассета может быть легко адаптирована к предполагаемому использованию, просто путем вставки полинуклеотида, кодирующего целевой полипептид, представляющий интерес, в инсерционный сайт.

Кроме того, экспрессионная кассета может содержать соответствующий сайт терминации транскрипции. Сайты терминации транскрипции хорошо охарактеризованы в данной области, и было показано, что их включение в экспрессионные кассеты оказывает положительный эффект на экспрессию генов. Как будет описано более подробно ниже, экспрессионная кассета по настоящему изобретению, в частности, предназначена для экспрессии представляющего интерес полипептида в эукариотической клетке-хозяине. Большинство синтезирующихся эукариотических мРНК имеют полиA-хвост на своем 3'-конце, который добавляется во время сложного процесса, включающего расщепление первичного транскрипта и связанной реакции полиаденилирования. ПолиА-хвост, помимо прочего, обеспечивает преимущество в стабильности мРНК. Поэтому предпочтительно, чтобы экспрессионная кассета содержала, соответственно, сайт полиаденилирования, подходящий для прекращения транскрипции и полиаденилирования. Существует несколько эффективных полиА-сигналов, которые могут использоваться в экспрессионных кассетах, предназначенных для экспрессии в эукариотических клетках, включая полученные из бычьего гормона роста (BGH), мышиного бета-глобина, ранней транскрипционной единицы SV40 и гена тимидинкиназы вируса простого герпеса. Однако также известны синтетические сайты полиаденилирования (см., например, экспрессионный вектор pCI-neo от Promega, который основан на публикации Levitt el al, 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025). Таким образом, сайт полиаденилирования, который используется в экспрессионной кассете по настоящему изобретению, может быть выбран из группы, состоящей из полиA-сайта SV40, такого как ранний и поздний полиА-сайт SV40 (см., например, плазмиду pSV2-DHFR, описанную в Subramani et al, 1981, Mol.Cell. Biol. 854-864), синтетический полиА-сайт (см., например, экспрессионный вектор pCI-neo от Promega, который основан на публикации Levitt el al, 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025) и полиА-сайт bgh (бычьего гормона роста). Сайт терминации транскрипции может быть представлен вместе с полинуклеотидом, кодирующим представляющий интерес полипептид, или может быть представлен в виде отдельного элемента в кассете экспрессии.

Таким образом, согласно одному варианту осуществления изобретения экспрессионная кассета дополнительно содержит последовательность 3'-UTR в качестве элемента (е). Три-штрих нетранслируемая область (3'-UTR) следует за кодирующей областью и включает в себя регуляторные элементы. Элементы, которые могут содержаться в указанной 3'-UTR, включают, но не ограничиваются ими, сайты связывания белков и/или молекул, которые инициируют РНКи, такие как микроРНК. Согласно одному варианту осуществления, используется 3'-UTR, содержащая следующую последовательность:

Кроме того, экспрессионная кассета может включать сигнал полиаденилирования в качестве элемента (f). Подходящие сайты полиаденилирования описаны выше. Согласно одному варианту осуществления изобретения используется полиА-сайт, содержащий следующую последовательность:

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения экспрессионная кассета включает следующие элементы:

а) промотор, предпочтительно промотор CMV человека, или промотор, полученный из промотора CMV человека;

b) полинуклеотидную последовательность 5'-UTR, выбранную из группы, состоящей из полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, включающей SEQ ID NO 1, полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, включающей SEQ ID NO 2, полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, включающей SEQ ID NO: 3, полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, включающей SEQ ID NO 4, полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, включающей SEQ ID NO 5, полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, включающей SEQ ID NO 6, полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, включающей SEQ ID NO: 7, и полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, включающей последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно, по меньшей мере на 90% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7;

с) полинуклеотид, кодирующий секреторную лидерную последовательность hCD33;

d) полинуклеотид, кодирующий полипептид, представляющий интерес, или инсерционный сайт для вставки полинуклеотида, кодирующего полипептид, представляющий интерес;

e) полинуклеотидную последовательность 3'-UTR; и

f) полиА-сайт.

Как описано, % идентичности может быть рассчитан относительно всей длины эталонной последовательности. Как обсуждалось выше и как показано в примерах, экспрессионная кассета по настоящему изобретению приводит к увеличению экспрессии представляющего интерес полипептида. «Полипептид» относится к молекуле, включающей полимер из аминокислот, соединенных между собой пептидной связью (связями). Полипептиды включают полипептиды любой длины, в том числе белки (например, имеющие более 50 аминокислот) и пептиды (например, имеющие 2-49 аминокислот). Полипептиды включают в себя белки и/или пептиды с любой активностью или биологической активностью. Полипептид, который необходимо получить, может представлять собой фармацевтически или терапевтически активное соединение, или исследовательский инструмент для использования в анализах и т. п. Полипептид, соответственно, не ограничивается каким-либо конкретным полипептидом или группой полипептидов, а, наоборот, может представлять собой любой полипептид любого размера, функции или происхождения, который кто-либо желает отобрать и/или проэкспрессировать с помощью способов, описанных в данном документе. Соответственно, несколько различных полипептидов, представляющих интерес, могут быть проэкспрессированы с экспрессионной кассеты по настоящему изобретению и/или в клетках-хозяевах по настоящему изобретению. Как описано выше, термин полипептид включает белки и/или пептиды с любой активностью или биологической активностью, включая, например, биологически активные полипептиды, такие как ферментативные белки или пептиды (например, протеазы, киназы, фосфатазы), рецепторные белки или пептиды, транспортные белки или пептиды, бактерицидные и/или эндотоксин-связывающие белки, структурные белки или пептиды, иммунные полипептиды, иммуноглобулины, токсины, антибиотики, гормоны, факторы роста, вакцины и т.п. Указанный полипептид может быть выбран из группы, состоящей из пептидных гормонов, интерлейкинов, активаторов тканевого плазминогена, цитокинов, иммуноглобулинов, в частности, антител или их функциональных фрагментов или производных, и однодоменных антител, также упоминаемых как нанотела. Согласно одному варианту осуществления изобретения представляющий интерес полипептид гликозилируется. Представляющий интерес полипептид, который экспрессируется с экспрессионной кассеты по настоящему изобретению, может также представлять собой субъединицу или домен одного из вышеуказанных полипептидов, такие как, например, тяжелая цепь или легкая цепь антитела или их функциональный фрагмент или производное. В предпочтительном варианте осуществления изобретения представляющий интерес полипептид является молекулой иммуноглобулина, более предпочтительно, антителом или его субъединицей или доменом, такими как, например, тяжелая или легкая цепь антитела или однодоменное антитело. Также включены функциональные фрагменты или производные вышеуказанных молекул или субъединица или домен вышеуказанных молекул, такие как, например, тяжелая или легкая цепь антитела или их функциональный фрагмент или производное. Согласно одному варианту осуществления изобретения представляющий интерес полипептид не является hCD33.

Термин «антитело», используемый в данном документе, в частности, относится к белку, включающему по меньшей мере две тяжелые цепи и две легкие цепи, соединенные дисульфидными связями. Термин «антитело» включает природные антитела, а также все рекомбинантные формы антител, например, гуманизированные антитела, полностью человеческие антитела и химерные антитела. Каждая тяжелая цепь обычно состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (CH). Каждая легкая цепь обычно состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL). Константная область тяжелой цепи включает три или, в случае антител IgM- или IgE-типа, четыре константных домена тяжелой цепи (CH1, CH2, CH3 и CH4), где первый константный домен CH1 примыкает к вариабельной области и может быть соединен со вторым константным доменом CH2 с помощью шарнирной области. Константная область легкой цепи состоит только из одного константного домена. Вариабельные области могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), перемежающиеся с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR), причем каждая вариабельная область содержит три CDR и четыре FR. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента. Термин «антитело» согласно изобретению однако также включает в себя другие типы и варианты антител, такие как антитела из тяжелых цепей, т.е. антитела, состоящие только из одной или нескольких, в частности, двух тяжелых цепей, и нанотела, т.е. антитела, состоящие только из одного мономерного вариабельного домена. Такие нанотела также могут быть соединены с образованием поливалентных структур. Предпочтительно, чтобы антитело при экспрессии в соответствующей клетке-хозяине было гликозилированно. Как обсуждалось выше, полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, может также кодировать одну или несколько субъединиц или доменов антитела, например, тяжелую или легкую цепь, или функциональный фрагмент или производное, в качестве представляющего интерес полипептида.

Однодоменное антитело, также называемое нанотелом, представляет собой фрагмент антитела, состоящий из одного мономерного вариабельного домена антитела. Подобно полноразмерному антителу, он способен селективно связываться со специфическим антигеном. С молекулярной массой, составляющей только 12-15 кДа, однодоменные антитела намного меньше обычных антител (150-160 кДа), которые состоят из двух тяжелых цепей и двух легких цепей, и даже меньше Fab-фрагментов и одноцепочечных вариабельных фрагментов. Первые однодоменные антитела были созданы на основе антител из тяжелых цепей, найденных у представителей семейства верблюдовых; они называются V_HH-фрагменты. Антитела из тяжелых цепей были также найдены у других видов. Альтернативный подход заключается в разделении димерных вариабельных доменов обычного иммуноглобулина G (IgG) людей или мышей на мономеры. Хотя большинство исследований однодоменных антител в настоящее время основывается на вариабельных доменах тяжелых цепей, также было показано, что нанотела, полученные из легких цепей, специфически связываются с целевыми эпитопами. Антитела, полученные из членов семейства двугорбых и одногорбых верблюдов (Camelus bactrianus и Camelus dromaderius), включая членов этого семейства из Нового Света, таких как виды лам (Lama paccos, Lama glama и Lama vicugna), были охарактеризованы по размеру, сложности структуры и антигенности для человека. Некоторые IgG-антитела из этого семейства млекопитающих, найденные в природе, не имеют легкой цепи, и, таким образом, структурно отличаются от типичной четырехцепочечной четвертичной структуры, имеющей две тяжелых и две легких цепи, у антител из других животных (см. WO94/04678). Область антитела верблюдовых, которая представляет собой небольшой одиночный вариабельный домен, идентифицированный как V_HH, может быть получена с помощью генной инженерии, давая небольшой белок, имеющий высокое сродство к мишени, что приводит в результате к низкомолекулярному полученному из антитела белку, известному как «нанотело верблюдовых» (см. US5,759,808; Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; и Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520). Генно-инженерно созданные библиотеки антител и фрагментов антител верблюдовых коммерчески доступны. Аналогично другим антителам, полученным из видов кроме человека, аминокислотную последовательность верблюжьего антитела можно изменять рекомбинантно с получением последовательности, в большей степени напоминающей человеческую последовательность, т.е. нанотело можно «гуманизировать». Соответствующие однодоменные антитела также могут быть проэкспрессированы с использованием идей настоящего изобретения. Кроме того, как описано, однодоменные антитела могут также соединены с образованием поливалентных структур. Соответствующие мультимерные нанотела также могут быть проэкспрессированы с использованием идей настоящего изобретения. Согласно одному варианту осуществления изобретения мультимерное нанотело экспрессируется с одной экспрессионной кассеты.

«Функциональный фрагмент или производное» антитела, в частности, относится к белку или гликопротеину, которые получены из антитела и способны связываться с тем же антигеном, в частности, с тем же эпитопом, что и антитело. То же самое относится к mutatis mutandis для фрагмента или производного молекулы иммуноглобулина, тяжелой цепи или легкой цепи. Было показано, что антиген-связывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела или их производными. Примеры фрагментов или производных антитела, включают: (i) Fab-фрагменты, моновалентные фрагменты, состоящие из вариабельной области и первого константного домена каждой из тяжелой и легкой цепей; (ii) F(аb)₂-фрагменты, двухвалентные фрагменты, содержащие два Fab-фрагмента, связанные дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагменты, состоящие из вариабельной области и первого константного домена CH1 тяжелой цепи; (iv) Fv-фрагменты, состоящие из вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи одного плеча антитела; (v) ScFv-фрагменты, Fv-фрагменты, состоящие из одной полипептидной цепи; (vi) (Fv)₂-фрагменты, состоящие из двух Fv-фрагментов, ковалентно связанных друг с другом; (vii) вариабельный домен тяжелой цепи; и (viii) политела, состоящие из вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, ковалентно связанных друг с другом таким образом, что объединение вариабельных областей тяжелой и легкой цепей может происходить только между молекулами, но не в молекуле. Эти фрагменты и производные антител могут быть получены с использованием обычных методов, известных специалистам в данной области.

Как очевидно из описанных выше примеров полипептидов, которые могут быть проэкспрессированы в соответствии с идеями настоящего изобретения, конечный полипептид, который должен продуцироваться и секретироваться клеткой-хозяином, также может представлять собой димерный или мультимерный белок. Предпочтительный пример соответствующего белка представляет собой молекулу иммуноглобулина, в частности, антитело, которое включает в себя, например тяжелые и легкие цепи. Существует несколько вариантов получения соответствующего димерного или мультимерного белка.

Согласно одному варианту осуществления изобретения две или несколько субъединиц или доменов указанного димерного или мультимерного белка экспрессируется с одной экспрессионной кассеты по настоящему изобретению. В этом варианте осуществления изобретения с соответствующей экспрессионной кассеты получают один длинный транскрипт, который содержит кодирующие области отдельных субъединиц или доменов димерного или мультимерного белка. Согласно одному варианту осуществления изобретения по меньшей мере один IRES-элемент (внутренний сайт связывания рибосомы) функционально расположен между кодирующими областями отдельных субъединиц или доменов, и каждой кодирующей области предшествует секреторная лидерная последовательность hCD33, как описано выше. Тем самым гарантируется, что из указанного транскрипта получают отдельные продукты трансляции, и конечный димерный или мультимерный белок может быть корректно собран и секретирован. Кроме того, с одной экспрессионной кассеты также могут быть проэкспрессированы мультимерные нанотела.

Однако в объем настоящего изобретения также входит (и для некоторых вариантов осуществления является даже предпочтительной) экспрессия отдельных субъединиц или доменов димерного или мультимерного белка с разных экспрессионных кассет. Согласно одному варианту осуществления изобретения экспрессионной кассетой по настоящему изобретению является моноцистронная экспрессионная кассета. В этом варианте осуществления изобретения каждая экспрессионная кассета содержит полинуклеотид, кодирующий одну субъединицу или один домен димерного или мультимерного белка в качестве представляющего интерес полипептида. Согласно одному варианту осуществления изобретения все эти экспрессионные кассеты сконструированы в соответствии с идеями настоящего изобретения. Однако в объем настоящего изобретения также входит использование различных конструкций для различных экспрессионных кассет. После экспрессии отдельных субъединиц/доменов с отдельных экспрессионных кассет, конечный димерный или мультимерный белок собирается и секретируется из клетки-хозяина. Этот вариант осуществления будет объяснен более подробно в описании экспрессионного вектора по настоящему изобретению.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, кодирует, в качестве представляющего интерес полипептида тяжелую или легкую цепь молекулы антитела или их функциональный фрагмент или производное.

Согласно одному варианту осуществления изобретения экспрессионная кассета по настоящему изобретению уже содержит полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере часть константной области молекулы иммуноглобулина. Полинуклеотид, кодирующий соответствующую вариабельную часть молекулы иммуноглобулина, может затем быть вставлен пользователем/потребителем в экспрессионную кассету путем использования соответствующих стратегий клонирования для получения конечной экспрессионной кассеты.

Экспрессионная кассета может содержать дополнительные элементы, которые могут использоваться для облегчения и/или улучшения отбора клеток-хозяев с сильной экспрессией. Один общепринятый способ отбора, известный в данной области для отбора клеток-хозяев, которые экспрессируют представляющий интерес полипептид с высоким выходом, основан на использовании проточной цитометрии, в частности, сортинга флуоресцентно-активируемых клеток (FACS). Способы отбора, использующие проточную цитометрию, имеют преимущество в возможности быстрого анализа большого числа клеток. В одном способе отбора, который особенно пригоден для идентификации высокопродуктивных клеточных клонов, часть представляющего интерес продукта, например, антитела, экспрессируют в качестве связанного с мембраной слитого полипептида. Таким образом, часть продукта представлена в виде слитого полипептида на поверхности клетки. Поскольку количество произведенного слитого полипептида коррелирует с общим уровнем экспрессии, клетки-хозяева могут быть отобраны с помощью проточной цитометрии, основанной на количестве слитого полипептида, представленного на клеточной поверхности. Это позволяет быстрый отбор высокопродуктивных клеток-хозяев. Экспрессионная кассета по настоящему изобретению может быть предпочтительно изменена так, чтобы ее можно было использовать в соответствующем способе отбора, основанном на использовании проточной цитометрии. Чтобы обеспечить эффективный отбор с помощью проточной цитометрии, предпочтительно FACS, для экспрессии представляющего интерес полипептида может использоваться специальная экспрессионная кассета. Таким образом, согласно одному варианту осуществления изобретения экспрессионная кассета для экспрессии полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид, сконструирована таким образом, что часть экспрессированного полипептида, представляющего интерес, предпочтительно менее 10%, более предпочтительно, менее 5% или даже менее 2,5%, включает в себя трансмембранный якорь. Существует несколько вариантов для достижения этого результата.

Согласно одному варианту осуществления изобретения указанная экспрессионная кассета дополнительно содержит по меньшей мере один стоп-кодон после полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид, и дополнительный полинуклеотид после стоп-кодона, кодирующий мембранный якорь и/или сигнал для мембранного якоря. Соответствующие элементы функционально связаны. Эта конструкция экспрессионной кассеты имеет свойство, состоящее в том, что посредством сквозной трансляции (стоп-кодон является «протекающим») часть представляющего интерес полипептида получают в виде слитого полипептида, содержащего мембранный якорь. В результате, слитый полипептид представлен на поверхности клетки, а клетки, имеющие высокий уровень полипептида, слитого с мембранным якорем, могут быть отобраны с помощью проточной цитометрии, предпочтительно, FACS. Тем самым отбираются клетки-хозяева, которые имеют высокий уровень экспрессии. Детали и предпочтительные варианты этой методики, основанной на протекании стоп-кодона, описаны в WO2005/073375 и WO2010/022961. Ссылка дана на это описание.

Согласно альтернативному варианту осуществления изобретения указанная экспрессионная кассета содержит после полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид, по меньшей мере интрон, содержащий 5'-донорный сайт сплайсинга и 3'-акцепторный сайт сплайсинга и содержащий трансляционный стоп-кодон в рамке и сигнал полиаденилирования и полинуклеотид после интрона, кодирующий мембранный якорь и/или сигнал для мембранного якоря. Соответствующие элементы функционально связаны. Эта конструкция экспрессионной кассеты имеет свойство, состоящее в том, что в результате транскрипции и процессинга транскрипта по меньшей мере две различных зрелых мРНК (мРНК-POI) и (мРНК-POI-ANCHOR) получаются из кассеты экспрессии. Трансляция мРНК-POI дает целевой продукт. Трансляция мРНК-POI-ANCHOR дает слитый полипептид, включающий целевой продукт и мембранный якорь. В результате этот слитый полипептид снова представлен на поверхности клетки, а клетки, имеющие высокий уровень полипептида, слитого с мембранным якорем, могут быть отобраны с помощью проточной цитометрии, предпочтительно, FACS. Тем самым отбираются клетки-хозяева, которые имеют высокий уровень экспрессии. Детали и предпочтительные варианты этой методики, основанной на интроне, описаны в WO2007/131774. Ссылка дана на это описание.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения который, в частности, пригоден для экспрессии антител в качестве представляющего интерес продукта, мембранным якорем является иммуноглобулиновый трансмембранный якорь. Другие подходящие мембранные якоря и предпочтительные варианты иммуноглобулинового трансмембранного якоря описаны в WO2007/131774, WO2005/073375 и WO2010/022961. Ссылка дана на соответствующее описание.

Согласно второму аспекту настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору для экспрессии представляющего интерес полипептида, содержащему по меньшей мере одну экспрессионную кассету по первому аспекту настоящего изобретения. Указанная экспрессионная кассета подробно была описана выше, и, поэтому, ссылка дана на вышеизложенное описание.

«Экспрессионный вектор» по настоящему изобретению, в частности, относится к полинуклеотиду, способному нести по меньшей мере один чужеродный фрагмент нуклеиновой кислоты. Вектор функционирует в качестве молекулярного носителя, доставляя фрагменты нуклеиновых кислот, соответственно полинуклеотиды, в клетку-хозяина. Он включает по меньшей мере одну экспрессионную кассету по первому аспекту настоящего изобретения, которая содержит необходимые регуляторные последовательности для корректной экспрессии полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид, включенного в нее.

Согласно одному варианту осуществления изобретения экспрессионный вектор дополнительно содержит по меньшей мере одну экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий селективный маркер. Указанная экспрессионная кассета содержит необходимые регуляторные последовательности для корректной экспрессии полинуклеотида, кодирующего селективный маркер, включенного в нее. Селективные маркеры включают селективные маркеры, обеспечивающие эукариотические клетки-хозяева резистентностью к токсичным агентам или лекарственным веществам, таким как антибиотики, в частности аминогликозиды, например, неомициновый селективный маркер. Селективные маркеры также включают, но не ограничиваются ими, эукариотические селективные маркеры, такие как дигидрофолатредуктаза (DHFR) и глутаминсинтетаза (GS). Другие подходящие селективные маркеры, такие как рецептор фолиевой кислоты, описаны в WO 2009/080759 и WO 2010/097240. Предпочтительно, чтобы экспрессионный вектор содержал по меньшей мере одну экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий амплифицируемый селективный маркер. Амплифицируемый селективный маркер позволяет отбор содержащих вектор эукариотических клеток-хозяев, а также амплификацию гена. Неограничивающим примером амплифицируемого селективного маркерного гена млекопитающих является ген дигидрофолатредуктазы (DHFR). Другими системами, используемыми в настоящее время, являются среди прочего глутаминсинтетазная (GS) система (Hartmann and Mulligan, 1988). Эти амплифицируемые маркеры также являются селективными маркерами и, поэтому, могут использоваться для отбора тех клеток, которые получили вектор. DHFR и глутаминсинтетаза обеспечивают хорошие результаты. В обоих случаях отбор обычно происходит в отсутствие соответствующего метаболита (гипоксантина и тимидина в случае DHFR, глутамина в случае GS), тем самым предотвращая рост нетрансформированных клеток. С амплифицируемыми системами, такими как DHFR-система, экспрессия рекомбинантного белка может быть увеличена путем воздействия на клетки определенных агентов, способствующих амплификации гена, таких как антифолаты (например, метотрексат (МТХ)) в случае DHFR-системы. Подходящим ингибитором для GS-усиливаемой амплификации гена является метионинсульфоксимин (MSX). Воздействие MSX также приводит к амплификации гена. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения экспрессионный вектор содержит экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий фермент дигидрофолатредуктазу (DHFR) в качестве селективного маркера.

Кроме того, экспрессионный вектор может также содержать экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий прокариотический селективный маркер. «Прокариотическим селективным маркером» является селективный маркер, позволяющий отбор в прокариотических клетках-хозяевах при соответствующих условиях отбора. Примерами соответствующих прокариотических селективных маркеров являются маркеры, которые обеспечивают устойчивость к антибиотикам, таким как, например, ампициллин, канамицин, тетрациклин и/или хлорамфеникол. Включение прокариотического селективного маркера в экспрессионный вектор обеспечивает преимущество в том, что экспрессионный вектор может быть легко размножен в прокариотических клетках-хозяевах.

Предпочтительно, чтобы экспрессионный вектор содержал по меньшей мере одну экспрессионную кассету по первому аспекту настоящего изобретения, экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий эукариотический селективный маркер, который обеспечивает устойчивость к аминогликозидам, предпочтительно неомициновый селективный маркер, и экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий амплифицируемый селективный маркер, предпочтительно DHFR.

Экспрессионный вектор по настоящему изобретению может содержать более одной экспрессионной кассеты для экспрессии представляющего интерес полипептида. Таким образом, согласно одному варианту осуществления изобретения, несколько экспрессионных кассет для экспрессии одинаковых или различных полипептидов, представляющих интерес, расположены в экспрессионном векторе по настоящему изобретению. Поэтому, настоящее изобретение также относится к экспрессионному вектору, содержащему более одной экспрессионной кассеты, причем каждая экспрессионная кассета кодирует, например, субъединицу или домен димерного или более высокого порядка мультимерного белка. Экспрессионные кассеты, кодирующие различные субъединицы мультимерного белка, каждая из которых включена в другую экспрессионную кассету, могут быть помещены, например, рядом друг с другом. Для мультимерных белков, кодируемых по меньшей мере, двумя различными генами (например, легкой и тяжелой цепей антитела или их функциональных фрагментов или производных), полинуклеотиды, кодирующие целевые субъединицы или домены, вставляются в качестве полипептидов, представляющих интерес, в различные экспрессионные кассеты. Соответствующий вариант с использованием по меньшей мере двух различных экспрессионных кассет для экспрессии отдельных субъединиц или доменов димерного или мультимерного белка в качестве представляющего интерес полипептида является особенно предпочтительным для экспрессии молекул иммуноглобулинов, таких как, например, антитела. В клетке-хозяине димерный или мультимерный белок, например антитело, собирается и секретируется. Согласно одному варианту осуществления изобретения, конструкция экспрессионной кассеты по настоящему изобретению используется для экспрессии тяжелой цепи антитела. Экспрессионная кассета легкой цепи может иметь в вариантах осуществления различную конструкцию, например, она может содержать другую секреторную лидерную последовательность, такую как, например, лидерная последовательность иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления изобретения обе экспрессионные кассеты сконструированы в соответствии с идеями настоящего описания.

Таким образом, в соответствии с одним вариантом осуществления изобретения экспрессионный вектор содержит по меньшей мере две экспрессионные кассеты по первому аспекту настоящего изобретения. Полинуклеотид, содержащийся в одной из указанных экспрессионных кассет, кодирует тяжелую цепь молекулы иммуноглобулина или ее функциональный фрагмент или производное, в качестве представляющего интерес полипептида, а полинуклеотид, содержащийся в другой экспрессионной кассете, кодирует легкую цепь молекулы иммуноглобулина или ее функциональный фрагмент или производное, в качестве представляющего интерес полипептида. При экспрессии легкой цепи и тяжелой цепи с указанных экспрессионных кассет в клетке-хозяине, функциональная молекула иммуноглобулина, которая, предпочтительно, представляет собой антитело, собирается и секретируется из клетки-хозяина. Согласно одному варианту осуществления изобретения 5'-UTR для легкой цепи или ее функционального фрагмента или производного содержит или состоит из SEQ ID NO 3. Согласно одному варианту осуществления изобретения 5'-UTR для тяжелой цепи или ее функционального фрагмента или производного содержит или состоит из SEQ ID NO 1 или SEQ ID NO 4. Согласно одному варианту осуществления изобретения 5'-UTR для легкой цепи или ее функционального фрагмента или производного содержит или состоит из SEQ ID NO 5. Согласно одному варианту осуществления изобретения 5'-UTR для тяжелой цепи или ее функционального фрагмента или производного содержит или состоит из SEQ ID NO 6 или SEQ ID NO: 7.

Подходящие векторы экспрессии, которые могут использоваться в сочетании с настоящим изобретением, описаны в WO 2009/080720, где однако в соответствии с идеями настоящего изобретения иммуноглобулиновая секреторная лидерная последовательность согласно WO 2009/080720 заменена секреторной лидерной последовательностью hCD33 в экспрессионной кассете(ах), содержащей(их) полинуклеотид, кодирующий полипептид, представляющий интерес. Как описано выше, в случае, когда больше одной экспрессионной кассеты присутствует в экспрессионном векторе, достаточно того, чтобы одна экспрессионная кассета была сконструирована, как описано в настоящем документе.

В соответствии с третьим аспектом обеспечивается эукариотическая клетка-хозяин, содержащая по меньшей мере одну экспрессионную кассету по первому аспекту настоящего изобретения и/или содержащая по меньшей мере один экспрессионный вектор по второму аспекту настоящего изобретения. Экспрессионная кассета и экспрессионный вектор по настоящему изобретению были подробно описаны выше, ссылка дана на приведенное выше описание, которое также применимо в данном описании. Предпочтительно, чтобы экспрессионная кассета содержала полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид. Соответствующая экспрессионная кассета, предпочтительно содержащаяся в экспрессионном векторе, может быть введена в клетку-хозяина путем трансфекции.

Согласно одному варианту осуществления изобретения эукариотическая клетка-хозяин содержит по меньшей мере две экспрессионные кассеты по настоящему изобретению. Согласно одному варианту осуществления изобретения каждая из указанных экспрессионных кассет содержит полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одну субъединицу или домен димерного или мультимерного белка в качестве представляющего интерес полипептида. Этот вариант особенно подходит для экспрессии молекул иммуноглобулинов. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения клетка-хозяин содержит первую экспрессионную кассету по первому аспекту настоящего изобретения, которая содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь молекулы иммуноглобулина или ее функциональный фрагмент или производное, в качестве представляющего интерес полипептида, и вторую экспрессионную кассету по первому аспекту настоящего изобретения, которая содержит полинуклеотид, кодирующий легкую цепь молекулы иммуноглобулина или ее функциональный фрагмент или производное, в качестве представляющего интерес полипептида. Как обсуждалось выше, предпочтительно, чтобы 5'-UTR, которая используется в экспрессионной кассете для экспрессии легкой цепи, содержала или состояла из SEQ ID NO 3, а 5'-UTR, которая используется в экспрессионной кассете для экспрессии тяжелой цепи, содержала или состояла из SEQ ID NO 1 или SEQ ID NO 4. Согласно одному варианту осуществления изобретения 5'UTR, которая используется в экспрессионной кассете для экспрессии легкой цепи, содержала или состояла из SEQ ID NO 5, а 5'-UTR, которая используется в экспрессионной кассете для экспрессии тяжелой цепи содержала или состояла из SEQ ID NO 6 или SEQ ID NO 7. Указанные экспрессионные кассеты могут быть введены в клетки-хозяева с помощью одного или нескольких подходящих экспрессионных векторов, как описано выше. Согласно одному варианту осуществления изобретения первая экспрессионная кассета введена с помощью одного экспрессионного вектора, а вторая экспрессионная кассета введена с помощью второго экспрессионного вектора. Однако предпочтительно, чтобы обе экспрессионные кассеты были введены с помощью одного экспрессионного вектора, который несет обе экспрессионные кассеты.

Согласно одному варианту осуществления изобретения эукариотическая клетка-хозяин содержит по меньшей мере одну экспрессионную кассету по первому аспекту для экспрессии тяжелой цепи антитела. Как описано, для этой цели может использоваться, например, 5'-UTR, содержащая или состоящая из SEQ ID NO: 1, 4, 6 или 7.

В принципе, любые эукариотические клетки-хозяева могут использоваться совместно с настоящим изобретением, если они позволяют эффективную экспрессию полипептида с экспрессионной кассеты по настоящему изобретению. Предпочтительно, чтобы эукариотической клеткой-хозяином являлась клетка млекопитающего. Указанную клетку млекопитающего, предпочтительно, выбирают из группы, состоящей из клеток грызунов, клеток человека и клеток обезьян. Особенно предпочтительным является использование клеток грызунов, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из клеток СНО, клеток ВНК, клеток NS0, клеток мышиных фибробластов 3Т3 и SP2/0. Особенно предпочтительным является использование клеток СНО в качестве клеток-хозяев. Клетки человека могут быть, например, выбраны из группы, состоящей из клеток НЕК293, клеток MCF-7, клеток PerC6 и клеток HeLa. Клетки обезьян могут быть выбраны, например, из клеток COS и клеток Vero. Экспрессионный вектор по настоящему изобретению особенно подходит для получения полипептидов в клетках грызунов, таких как клетки СНО, включая DHFR^- клетки СНО или DHFR⁺ клетки СНО. Предпочтительно, чтобы клетка-хозяин представляла собой клетку линии CHO.

В соответствии с четвертым аспектом обеспечивается способ получения клетки-хозяина по третьему аспекту настоящего изобретения, где экспрессионный вектор по второму аспекту настоящего изобретения вводят в эукариотическую клетку-хозяина, которая, предпочтительно, представляет собой клетку-хозяина из млекопитающего. Посредством этого экспрессионную кассету по первому аспекту, которая, предпочтительно, содержит полинуклеотид для экспрессии представляющего интерес полипептида, вводят в клетку-хозяина.

Введение может быть осуществлено, например, путем трансфекции экспрессионного вектора по второму аспекту настоящего изобретения. Согласно одному варианту осуществления изобретения экспрессионный вектор интегрирует в геном клетки-хозяина (стабильная трансфекция). Подходящие экспрессионные векторы, позволяющие введение экспрессионной кассеты по первому аспекту настоящего изобретения в клетку-хозяина, подробно описаны выше в связи со вторым аспектом настоящего изобретения. Если введенная экспрессионная кассета не встроена в геном (временная трансфекция), она может быть потеряна на более поздней стадии, например, при прохождении клетками митоза. Подходящие экспрессионные векторы также могут сохраняться в клетке-хозяине без встраивания в геном, например, путем эписомальной репликации. Существует несколько подходящих способов, известных в данной области, для введения экспрессионного вектора в эукариотическую клетку-хозяина, включая клетки-хозяева из млекопитающих, в частности, путем трансфекции. Соответствующие способы включают, но не ограничиваются ими, трансфекцию с помощью фосфата кальция, электропорацию, липофекцию, биолистический и полимер-опосредованный перенос генов. Помимо традиционных способов, основанных на случайной интеграции, также могут использоваться рекомбинационные подходы. Такие рекомбинационные способы могут включать в себя использование сайта определенных рекомбиназ, таких как Cre, Flp or ΦС31 (см., например Oumard et al, Cytotechnology (2006) 50: 93-108), которые могут опосредовать направленную вставку трансгенов. Кроме того, для встраивания экспрессионной кассеты по настоящему изобретению может использоваться механизм гомологичной рекомбинации (обзор дан в Sorrell et al, Biotechnology Advances 23 (2005) 431-469). Встраивание генов на основе рекомбинации позволяет минимизировать количество элементов, которые будут включены в экспрессирующий вектор, вводимый в клетку-хозяина. Варианты подходящего экспрессионного вектора или комбинации экспрессионных векторов по настоящему изобретению, а также подходящих клеток-хозяев, подробно описаны выше; ссылка дана на приведенное выше описание. Как обсуждалось выше в связи с вариантом осуществления, экспрессионные кассеты, содержащие полинуклеотиды, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь молекулы иммуноглобулина или их функциональный фрагмент или производное, могут находиться в одной или в разных экспрессионных векторах, в случае когда для трансфекции клеток-хозяев используется комбинация по меньшей мере двух экспрессионных векторов.

Согласно пятому аспекту обеспечивается способ получения представляющего интерес полипептида, причем указанный способ включает культивирование клеток-хозяев по третьему аспекту настоящего изобретения в клеточной культуре при условиях, позволяющих экспрессию указанного полипептида, представляющего интерес.

Существуют два основных формата культивирования клеток-хозяев, а именно культивирование прикрепленных клеток и суспензионное культивирование. Предпочтительно использование суспензионных культур. Согласно одному варианту осуществления изобретения указанные клетки-хозяева культивируют в бессывороточных условиях.

Представляющий интерес полипептид экспрессируется с экспрессионной кассеты по настоящему изобретению и секретируется из клетки-хозяина, например, в культуральную среду, и секретируемый полипептид может быть получен из нее. Если в клетке-хозяине присутствует более одной экспрессионной кассеты, например, при экспрессии димерного или мультимерного белка (см. выше), димерный или мультимерный белок собирается в клетке и затем секретируется из клетки-хозяина. Благодаря выдающейся экспрессии, которая достигается с помощью новой комбинации 5'-UTR и секреторной лидерной последовательности по настоящему изобретению, полипептиды могут экспрессироваться и секретироваться с высоким выходом. Секретируемый полипептид может быть также предметом дальнейших стадий обработки, таких как, например, стадии очистки и/или модификации. Соответственно, способ получения представляющего интерес полипептида может включать по меньшей мере одну из следующих стадий:

- выделение представляющего интерес полипептида из указанной клеточной культуральной среды; и/или

- обработку выделенного полипептида, представляющего интерес.

Таким образом, полипептид, полученный по изобретению, может быть выделен и, возможно, дополнительно обработан, например, дополнительно очищен, выделен и/или модифицирован способами, известными в данной области. Например, полипептид может быть выделен из питательной среды обычными процедурами, включающими, но не ограниченными ими, центрифугирование, фильтрацию, ультрафильтрацию, экстракцию или осаждение. Очистка может быть выполнена различными способами, известными в данной области, включающими, но не ограниченными ими, хроматографию (например, ионообменную, аффинную, гидрофобную, хроматофокусирование и гель-фильтрацию), электрофоретические процедуры (например, препаративную изоэлектрическую фокусировку), дифференциальную растворимость (например, осаждение сульфатом аммония) или экстракцию.

Как обсуждалось выше, представляющим интерес полипептидом, предпочтительно, являются молекула иммуноглобулина или его функциональный фрагмент или производное, более предпочтительно, антитело или его функциональный фрагмент или производное.

Согласно шестому аспекту настоящее изобретение относится к применению последовательности 5'-UTR в комбинации с секреторной лидерной последовательностью hCD33 в экспрессионной кассете для экспрессии представляющего интерес полипептида с высоким выходом с указанной экспрессионной кассеты, где указанную полинуклеотидную последовательность 5'-UTR выбирают из группы, состоящей из полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей SEQ ID NO 1, полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей SEQ ID NO 2, полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей SEQ ID NO 3, полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей SEQ ID NO 4 и полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно, по меньшей мере на 90% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO 4, или где указанную полинуклеотидную последовательность 5'-UTR выбирают из группы, состоящей из полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей SEQ ID NO 5, полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей SEQ ID NO 6, полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей SEQ ID NO 7 и полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно, по меньшей мере на 90% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7. Идентичность может быть рассчитана относительно всей длины эталонной последовательности.

Преимущества соответствующей комбинации, пригодные и предпочтительные варианты полинуклеотидной последовательности 5'-UTR и секреторной лидерной последовательности hCD33, а также подходящие и предпочтительные варианты осуществления экспрессионной кассеты и полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид, подробно описаны выше. Ссылка дана на приведенное выше описание, которое также применимо в данном описании.

Предпочтительно, чтобы экспрессионная кассета имела конструкцию экспрессионной кассеты, которая описана выше в связи с первым аспектом настоящего изобретения. Ссылка дана на приведенное выше описание. Согласно одному варианту осуществления изобретения экспрессионная кассета имеет одну или несколько из следующих характеристик:

а) она содержит промотор;

b) она содержит полинуклеотидную последовательность 5'-UTR, описанную выше;

с) она содержит секреторную лидерную последовательность hCD33, которая содержит и, предпочтительно, состоит из последовательности MPLLLLLPLLWAGALA (SEQ ID NO: 12);

d) она содержит полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид или инсерционный сайт для вставки полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид;

е) она содержит последовательность 3'-UTR и/или

f) она содержит полиА-сайт.

Подробности в отношении отдельных элементов и предпочтительных вариантов и комбинаций описаны выше в связи с первым аспектом настоящего изобретения. Ссылка дана на приведенное выше описание.

Согласно одному варианту осуществления изобретения полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, кодирует в качестве представляющего интерес полипептида две или несколько субъединиц или доменов димерного или мультимерного белка, где по меньшей мере один элемент IRES находится между кодирующими областями отдельных субъединиц или доменов, и каждой кодирующей области предшествует секреторная лидерная последовательность hCD33. Однако в контексте настоящего изобретения использование моноцистронных экспрессионных кассет является предпочтительным.

Согласно альтернативному варианту осуществления изобретения полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, кодирует в качестве представляющего интерес полипептида субъединицу или домен димерного или мультимерного белка. Предпочтительно, чтобы полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, кодировал в качестве представляющего интерес полипептида тяжелую или легкую цепь молекулы антитела или их функциональный фрагмент или производное. Согласно одному варианту осуществления изобретения конструкция экспрессионной кассеты по настоящему изобретению используется для экспрессии тяжелой цепи антитела. В данном изобретения экспрессионная кассета для экспрессии легкой цепи может иметь другую конструкцию и может, например, включать в себя другую лидерную последовательность, например лидерную последовательность иммуноглобулина, или также может быть сконструирована в соответствии с идеями настоящего изобретения. Согласно одному варианту осуществления изобретения конструкция экспрессионной кассеты по настоящему изобретению используется для экспрессии легкой цепи антитела. В данном изобретения экспрессионная кассета для экспрессии тяжелой цепи может иметь другую конструкцию и может, например, включать в себя другую лидерную последовательность, например лидерную последовательность иммуноглобулина, или также может быть сконструирована в соответствии с идеями настоящего изобретения.

Согласно одному варианту осуществления, предмет изобретения, описанный в данном документе, как включающий определенные элементы, относится также к предмету изобретения, состоящему из соответствующих элементов. В частности, 5'UTR, описанные в данном документе, как содержащие определенные последовательности, могут также состоять из соответствующих последовательностей.

Предпочтительно выбирать и комбинировать предпочтительные варианты осуществления изобретения, описанные в данном документе, и конкретный предмет изобретения, возникающий из соответствующей комбинации предпочтительных вариантов, также относится к настоящему изобретению.

Полное содержание текстов и документов, указанных в данном документе, включено в него путем ссылки и, таким образом, составляют часть настоящего изобретения.

Нижеследующие примеры служат для иллюстрации настоящего изобретения без какого-либо ограничения его объема. В частности, примеры относятся к предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Примеры были выполнены в соответствии со следующим протоколом:

ПРИМЕР А

I. Материалы и способы

Клетки-хозяева

В качестве клеток-хозяев используются клетки СНО (яичника китайского хомячка), полученные из клеток СНО-К1.

Экспрессионные векторы

В качестве стандартного контроля используется экспрессионный вектор, имеющий конструкцию, описанную в WO 2009/080720 (см., в частности, пример 6), где в экспрессионных кассетах используется секреторная лидерная последовательность иммуноглобулина (Ig) для экспрессии легких и тяжелых цепей антитела. CMV-промотор содержал SEQ ID NO 8. SEQ ID NO 3 используется в качестве 5'-UTR для экспрессии легкой цепи, и SEQ ID NO 4 использовалась в качестве 5'-UTR для экспрессии тяжелой цепи. Экспрессионный вектор в соответствии с идеей настоящего изобретения получен из указанного контрольного вектора заменой существующей секреторной лидерной последовательности легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина следующей секреторной лидерной последовательностью hCD33:

MPLLLLLPLLWAGALA (SEQ ID NO: 12).

Указанные экспрессионные векторы применяются для экспрессии молекул антитела. Соответствующая конструкция вектора также применяются для экспрессии нанотела в качестве представляющего интерес полипептида, где однако применялась 5'-UTR в соответствии с SEQ ID NO 5. Однако в данном случае необходима только одна экспрессионная кассета. Контрольный вектор имел такую же конструкцию, однако снова применялась лидерная последовательность Ig.

Культивирование клеток, трансфекция и отбор

Клетки культивируют с использованием запатентованной в компании культуральной клеточной среды и регулярно пассируют 2-3 раза в неделю с целью поддержания в логарифмической фазе роста на протяжении всего исследования. Клетки трансфицировали с использованием стандартного метода нуклеофекции. Клетки 5E6 центрифугируют и повторно суспендируют в трансфекционном буфере. 3 мкг векторной ДНК, кодирующей представляющий интерес полипептид, добавляют и выполняют нуклеофекцию. Трансфицированные клетки переносят во встряхиваемую колбу с объемом 125 мл и культивируют при встряхивании в течение 24-48 часов. Первую стадию отбора с использованием G-418 выполняют, как описано ранее в WO 2009/080720. Дальнейший отбор производят с использованием 2-х дополнительных стадий отбора на метотрексате (МТХ), а именно на 500 нМ МТХ и 1000 нМ МТХ. Отдельные пулы, состоящие из резистентных в основном высокопродуктивных клеток, клонируют с плотностью 0,5-1 клеток на лунку, либо методом лимитированных разведений, либо с помощью FACS. Для полученных клонов, клональную продуктивность и рост анализируют различными скрининговыми методами.

II. Результаты

Экспериментальные данные, полученные с использованием прототипного экспрессионного вектора (контрольного экспрессионного вектора), содержащего секреторную лидерную последовательность Ig, и экспрессионного вектора по настоящему изобретению, содержащего секреторную лидерную последовательность hCD33, показывают, что полученный титр антител заметно увеличивается при использовании новой комбинации определенной 5'-UTR и секреторной лидерной последовательности hCD33 по настоящему изобретению. В качестве представляющего интерес белка было проэкспрессировано антитело IgG. Наблюдаемое увеличение продуктивности на уровне пулов составляло в среднем 2,88 раза при использовании экспрессионного вектора по настоящему изобретению. Результаты могут быть дополнительно улучшены на уровне клонов, где 4,1-кратное повышение продуктивности может быть получено при использовании экспрессионного вектора по настоящему изобретению (при сравнении лучшего контрольного клона, полученного с использованием контрольного экспрессионного вектора, и лучшего клона, полученного с использованием экспрессионного вектора по настоящему изобретению).

При экспрессии нанотела в качестве белка, представляющего интерес, сравнение лучших клонов показывает увеличение продуктивности в 1,1 раза при использовании экспрессионного вектора по настоящему изобретению, а при сравнении 6 лучших клонов было получено увеличение продуктивности в среднем в 1,6 раза. Это проиллюстрировано следующими таблицами:

Таблица 2
Оценка новой комбинации с использованием антитела IgG: 2,88-кратное повышение продуктивности достигается на уровне пула с экспрессионным вектором по настоящему изобретению. Титр (г/л) G-418 1000 нМ МТХ Сигнальный пептид hCD33 0,006 0,094 Контроль 0,005 0,038

Таблица 3
Оценка новой комбинации с использованием антитела IgG: 4,1-кратное увеличение продуктивности при сравнении лучших клонов прототипного экспрессионного вектора и экспрессионного вектора по настоящему изобретению, и в среднем 6 лучших клонов: 4-кратное увеличение производительности. Лучшие 6 клонов с hCD33 Контрольные лучшие 6 клонов Титр (г/л) 2,99 0,727 2,69 0,656 2,65 0,642 2,21 0,622 2,12 0,575 2,11 0,503

Таблица 4
Оценка новой комбинации с использованием нанотел: 1,1-кратное увеличение производительности при сравнении лучших клонов прототипного экспрессионного вектора и экспрессионного вектора по настоящему изобретению, и в среднем 6 лучших клонов: 1,6-кратное увеличение производительности. Лучшие 6 клонов с сигнальным пептидом hCD33 Контрольные лучшие 6 клонов Титр (г/л) 0,92 0,75 0,92 0,58 0,90 0,57 0,88 0,57 0,88 0,57 0,87 0,57

ПРИМЕР В

Экспрессионные векторы

В качестве стандартного контроля используется экспрессионный вектор, имеющий базовую конструкцию, описанную в WO 2009/080720 (см., в частности, пример 6), где в экспрессионных кассетах используется секреторная лидерная последовательность иммуноглобулина (Ig) для экспрессии легких и тяжелых цепей антитела. Экспрессионная кассета для тяжелой цепи была модифицирована с использованием методики «протекающего стоп-кодона», описанной в WO2010/022961 для облегчения отбора посредством FACS. CMV-помотор содержал SEQ ID NO 8. SEQ ID NO 5 используется в качестве 5'-UTR для экспрессии легкой цепи, и SEQ ID NO 7 использовалась в качестве 5'-UTR для экспрессии тяжелой цепи. Экспрессионный вектор в соответствии с идеей настоящего изобретения получен из указанного контрольного вектора заменой существующей секреторной лидерной последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина следующей секреторной лидерной последовательностью hCD33:

MPLLLLLPLLWAGALA (SEQ ID NO: 12).

Указанные экспрессионные векторы используются для экспрессии различных молекул антител.

Оценку проводили для проверки экспрессии IgG и корректного процессинга сигнального пептида (лидерной последовательности) на кассете тяжелой цепи для 3 различных антител. Корректный процессинг лидерной последовательности, т.е. расщепление лидерной последовательности сигнальной пептидазой, необходим для получения целевой последовательности представляющего интерес полипептида на его N-конце, и, таким образом, функциональной молекулы с ожидаемым качеством. Ранее было отмечено, что в некоторых случаях с использованием прототипных конструкций процессинг сигнального пептида был некорректным, и синтезировались, например, тяжелая или легкая цепи с одной или несколькими дополнительными аминокислотами на N-конце. В зависимости от одной или нескольких аминокислот, которые некорректно оставались на N-конце, это удлинение аминокислотной последовательности на остающиеся одну или несколько аминокислот лидерной последовательности может, например, увеличивать склонность молекулы к агрегации или инициировать образование дисульфидных связей. Поэтому, это может оказывать серьезное влияние на качество продукции. Кроме того, было обнаружено, что некорректный процессинг сигнального пептида представляет риск того, что представляющий интерес полипептид, такой как антитело, расщепляется протеазой после заданного сайта расщепления в N-конце (также именуется обрезанием). Это создает укороченный продукт, который также может оказывать серьезное влияние на качество молекул.

В таблице 5 проиллюстрированы результаты процессинга сигнального пептида (лидерной последовательности), полученного с помощью методики по настоящему изобретению по сравнению с контролем. Как можно увидеть, с использованием методики по настоящему изобретению значительно снижается нежелательный процессинг сигнального пептида и, таким образом, улучшается качество.

Таблица 5: оценка различных сигнальных пептидов в кассете тяжелой цепи показывает улучшенный и корректный процессинг в клеточной линии при экспрессии трех различных модельных антител.

Полипептид, представляющий интерес Удлинение и обрезание при процессинге сигнального пептида с использованием hCD33 Удлинение и обрезание при процессинге сигнального пептида с использованием других сигнальных пептидов Антитело 1 <1% ~3,6% Антитело 2 <1% ~3,2% Антитело 3 Нет ~1,5%
~1,2%

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано для экспрессии представляющего интерес полипептида в клетках CHO. Путем комбинации определенной полинуклеотидной последовательности 5'UTR и секреторной лидерной последовательности hCD33 в экспрессионной кассете для экспрессии представляющего интерес полипептида и дальнейшей трансформации полученной генетической конструкцией хозяйской клетки получают клетку CHO - продуцент с более высоким уровнем экспрессии представляющего интерес полипептида по сравнению с прототипными экспрессионными кассетами. Изобретение позволяет получать представляющий интерес полипептид с высоким выходом. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 5 табл., 2 пр.

1. Клетка-хозяин CHO для экспрессии представляющего интерес полипептида с высоким выходом, где указанная клетка-хозяин CHO стабильно трансфицирована по меньшей мере одной экспрессионной кассетой и/или по меньшей мере одним экспрессионным вектором, и, где по меньшей мере одна экспрессионная кассета и/или по меньшей мере один экспрессионный вектор встроен в геном клетки-хозяина, и, где

a) экспрессионная кассета представляет собой экспрессионную кассету, подходящую для экспрессии представляющего интерес полипептида, где экспрессионная кассета содержит по меньшей мере:

aа) промотор;

ab) полинуклеотидную последовательность 5'-UTR, где

i) указанная полинуклеотидная последовательность 5'-UTR включает последовательность, которую выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7; или

ii) указанная полинуклеотидная последовательность 5'-UTR включает последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7;

ac) полинуклеотид, кодирующий секреторную лидерную последовательность hCD33 SEQ ID NO: 12; и

ad) полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид;

и

b) экспрессионный вектор является экспрессионным вектором для экспрессии представляющего интерес полипептида, содержащим по меньшей мере одну экспрессионную кассету в соответствии с a).

2. Клетка-хозяин CHO по п.1, где экспрессионная кассета, определенная в a), дополнительно содержит после aa)-ad)

ae) последовательность 3'-UTR и/или

af) полиA-сигнал.

3. Клетка-хозяин CHO по п.1, где экспрессионная кассета имеет одну или несколько из следующих характеристик:

i) полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, кодирует в качестве представляющего интерес полипептида субъединицу или домен димерного или мультимерного белка;

ii) полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, кодирует в качестве представляющего интерес полипептида тяжелую или легкую цепь молекулы антитела или их функциональный фрагмент или производное;

iii) полинуклеотидная последовательность 5'-UTR содержит SEQ ID NO: 3, и полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, кодирует в качестве представляющего интерес полипептида легкую цепь молекулы антитела или ее функциональный фрагмент или производное;

iv) полинуклеотидная последовательность 5'-UTR содержит SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4, и полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, кодирует в качестве представляющего интерес полипептида тяжелую цепь молекулы антитела или ее функциональный фрагмент или производное;

v) полинуклеотидная последовательность 5'-UTR содержит SEQ ID NO: 5, и полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, кодирует в качестве представляющего интерес полипептида легкую цепь молекулы антитела или ее функциональный фрагмент или производное;

vi) полинуклеотидная последовательность 5'-UTR содержит SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7, и полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, кодирует в качестве представляющего интерес полипептида тяжелую цепь молекулы антитела или ее функциональный фрагмент или производное;

vii) экспрессионная кассета является моноцистронной экспрессионной кассетой;

viii) промотором, содержащимся в экспрессионной кассете, является промотор CMV человека;

ix) промотором, содержащимся в экспрессионной кассете, является промотор CMV человека, содержащий SEQ ID NO: 8.

4. Клетка-хозяин CHO по п.1, где экспрессионная кассета содержит следующие элементы:

aa) промотор CMV человека;

ab) полинуклеотидная последовательность 5'-UTR выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 7;

аc) полинуклеотид, кодирующий секреторную лидерную последовательность, где секреторная лидерная последовательность hCD33 состоит из последовательности SEQ ID NO: 12;

ad) полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид;

ae) последовательность 3'-UTR; и

af) полиA-сайт.

5. Клетка-хозяин CHO по п.1, отличающаяся тем, что экспрессионный вектор, определенный в b) для экспрессии представляющего интерес полипептида, содержит по меньшей мере одну экспрессионную кассету, определенную в любом из пп.2-4.

6. Клетка-хозяин CHO по п.5, отличающаяся тем, что экспрессионный вектор дополнительно содержит одно или несколько из следующего:

а) по меньшей мере одну дополнительную экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий селективный маркер;

b) по меньшей мере одну вторую экспрессионную кассету, определенную в любом из пп. 1-4, для экспрессии дополнительного представляющего интерес полипептида.

7. Клетка-хозяин CHO по п.6, отличающаяся тем, что экспрессионный вектор содержит по меньшей мере две экспрессионные кассеты, где каждая экспрессионная кассета содержит полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, причем полинуклеотид, содержащийся в одной экспрессионной кассете, кодирует тяжелую цепь молекулы иммуноглобулина или ее функциональный фрагмент или производное, а полинуклеотид, содержащийся в другой экспрессионной кассете, кодирует легкую цепь молекулы иммуноглобулина или ее функциональный фрагмент или производное.

8. Клетка-хозяин CHO по п.7, где в экспрессионном векторе полинуклеотидная последовательность 5'-UTR из экспрессионной кассеты, кодирующей тяжелую цепь молекулы иммуноглобулина или ее функциональный фрагмент или производное, содержит SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4, и где полинуклеотидная последовательность 5'-UTR из экспрессионной кассеты, кодирующей легкую цепь молекулы иммуноглобулина или ее функциональный фрагмент или производное, содержит SEQ ID NO: 3.

9. Способ получения клетки-хозяина CHO по любому из пп.1-8, включающий введение экспрессионного вектора в эукариотическую клетку-хозяина, которая представляет собой клетку-хозяина CHO, где экспрессионный вектор является экспрессионным вектором для экспрессии представляющего интерес полипептида, содержащим по меньшей мере одну экспрессионную кассету, где экспрессионная кассета представляет собой экспрессионную кассету, подходящую для экспрессии представляющего интерес полипептида, где экспрессионная кассета содержит по меньшей мере:

aа) промотор;

ab) полинуклеотидную последовательность 5'-UTR, где

i) указанная полинуклеотидная последовательность 5'-UTR включает последовательность, которую выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7; или

ii) указанная полинуклеотидная последовательность 5'-UTR включает последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7;

ac) полинуклеотид, кодирующий секреторную лидерную последовательность hCD33 SEQ ID NO: 12; и

ad) полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид.

10. Способ по п.9, в котором экспрессионный вектор представляет собой экспрессионный вектор, определенный в любом из пп.5-8.

11. Способ получения представляющего интерес полипептида, причем указанный способ включает культивирование клеток-хозяев CHO по любому из пп.1-8 в клеточной культуре при условиях, позволяющих экспрессию указанного представляющего интерес полипептида.

12. Способ по п.11, где указанный представляющий интерес полипептид секретируется в клеточную культуральную среду и выделяется из клеточной культуральной среды.

13. Способ по п.12, в котором выделенный полипептид дополнительно обрабатывают.

14. Способ по любому из пп.11-13, где указанный полипептид представляет собой молекулу иммуноглобулина или ее фрагмент.

15. Применение полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, включающей последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7, или полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, включающей последовательность, которую выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, в комбинации с полинуклеотидом, кодирующим секреторную лидерную последовательность hCD33 SEQ ID NO: 12, в экспрессионной кассете или в экспрессионном векторе, содержащем указанную экспрессионную кассету, для экспрессии представляющего интерес полипептида с высоким выходом с указанной экспрессионной кассеты в клетке-хозяине CHO, где клетка-хозяин CHO стабильно трансфицирована указанной экспрессионной кассетой или указанным экспрессионным вектором, содержащим указанную экспрессионную кассету, и, где по меньшей мере одна экспрессионная кассета и/или по меньшей мере один экспрессионный вектор, содержащий указанную экспрессионную кассету, встроены в геном клетки-хозяина.