Регуляторная последовательность для увеличения экспрессии генов Российский патент 2023 года по МПК C12N15/11 C12N15/113 C12N15/85 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области генной инженерии, а именно к гетерологичным регуляторным последовательностям мРНК. В частности, настоящее изобретение относится к гетерологичному 5'UTR-нетранслируемому элементу мРНК, позволяющему увеличить эффективность синтеза белка.

Уровень техники

Пандемия коронавируса COVID-19 продемонстрировала угрозу, которую представляют пандемические возбудители. Вакцины являются мощным инструментом для противодействия угрозам инфекционных заболеваний с пандемическим потенциалом. Однако разработка вакцины от доклинической фазы до лицензирования занимает в среднем более 10 лет. Следовательно, в настоящее время разработка вакцин идет слишком медленно, чтобы вакцины были доступны для борьбы с новыми инфекционными штаммами вирусов и бактерий.

Скорость разработки, утверждения и производства вакцины - не единственная характеристика, необходимая для того, чтобы вакцина подходила для борьбы с возникающей пандемией. Для глобальной доступности вакцины во время пандемии необходимы масштабируемое и недорогое производство, а также термостабильность вакцины. Данная платформа должна быть способна индуцировать как клеточный, так и гуморальный иммунитет, чтобы иметь возможность бороться с новыми патогенами в отсутствие установленного коррелята защиты, в идеале с однократной дозой. Самое главное, необходимо показать безопасность, переносимость и эффективность данной вакцины.

Разработка РНК-вакцины против конкретного патогена может быть проведена в сжатые сроки, поскольку для ее создание может понадобиться только последовательности отдельных иммуногенных белков инфекционного возбудителя. Кроме того, снижение потребности в оптимизации и нормативных испытаниях новой вакцины может еще больше ускорить процесс разработки и утверждения. Это связано с тем, что новая РНК-вакцина будет отличаться только закодированной последовательностью белка-мишени, в то время как ее рецептура и способ доставки будут оптимизированы и лицензированы в прошлом. Компания Moderna установила рекорд по скорости разработки мРНК вакцины, начав испытания мРНК-вакцины SARS-CoV-2 на людях всего через 66 дней после секвенирования вирусного генома. Этот беспрецедентный прорыв был обеспечен не только ускоренной сборкой целевой последовательности и быстрым производством мРНК-вакцины для клинических испытаний, но и наличием предыдущих наработок для мРНК-вакцины для MERS-CoV, которая способствовала выбору антигена и предварительной стабилизации спайк-белка SARS-CoV-2. Это подтверждает идею о том, что, помимо технического совершенствования платформ вакцин быстрого реагирования, применение этих платформ к прототипам патогенов в семействах вирусов и бактерий с высоким пандемическим потенциалом может иметь решающее значение для обеспечения готовности к пандемии.

В разработке РНК-вакцин сыграло важную роль использование синтезированной in vitro РНК. Необходимо отметить, что синтез одноцепочечных молекул РНК in vitro - это широко используемая лабораторная процедура, которая активно используется как для научных задач по исследованию РНК, так и для получения терапевтических препаратов на основе РНК. Этот метод универсален и позволяет исследователю или разработчику адаптировать синтез РНК и вносить модификации в кодируемые последовательности для решения разных задач. Этот способ применим для биохимического и молекулярного анализа РНК и взаимодействия РНК-белок, а также структурного анализа комплексов, создания РНК-аптамеров, синтеза функциональных мРНК для экспрессии и создания малых РНК для изменения экспрессии генов (например, направляющие РНК). Кроме того, использование синтезированной in vitro РНК сыграло важную роль в разработке инструментов редактирования генома CRISPR / Cas9, создании плюрипотентных стволовых клеток, а также в разработке диагностики, основанной на амплификации РНК.

Безусловно, центральным компонентом мРНК-вакцины является ее конструкция мРНК. Транскрибируемая in vitro мРНК создается из сконструированной плазмидной ДНК, которая имеет промотор РНК-полимеразы и последовательность, соответствующую конструкции мРНК. Эффективность вакцины зависит от стабильности и структуры разработанной мРНК.Основной проблемой в разработке РНК-вакцины остается получение достаточной экспрессии трансгена в клетках-мишенях после переноса генов. Сила экспрессии гена и эффективность секреции белка зачастую значительно влияют на эффективность вакцины. Таким образом, особое внимание привлекают кассеты экспрессии, стимулирующие образование большего количества белка в целевых клетках.

Во время поздней фазы инфекции вирусные белки вырабатываются в большом количестве, в то время как синтез клеточных белков резко, если не полностью, ингибируется через 18-20 ч после заражения. Ни стабильность, ни трансляционная способность клеточных мРНК in vitro не изменяются при аденовирусной инфекции, что указывает на то, что вирусные мРНК избирательно транслируются на поздней фазе инфекции. Механизмы, ответственные за эффективный синтез вирусных белков при ингибировании трансляции клеточной мРНК, до конца не изучены. Однако ингибиторные изменения в компонентах клеточного трансляционного аппарата, по-видимому, важны. 5'-нетранслируемые последовательности TPL, присутствующие во всех вирусных мРНК, происходящих из основных поздних транскриптов, которые усиливают трансляцию на поздней фазе инфекции, снижают или устраняют потребность в кэпировании. связывающий комплекс e1F-4F. Считается, что это свойство TPL последовательности способствует избирательной трансляции вирусных мРНК в инфицированных клетках, поскольку кэп-связывающий белок недофосфорилирован с сопутствующим ингибированием активности e1F-4F.

Таким образом, представляется целесообразным разработка генетических кассет, регулирующих экспрессию гена и содержащих лидерную регуляторную последовательность TPL, который в составе вакцины будет способствовать увеличению трансляционной эффективности РНК в клетках эукариот и регулировать экспрессию генов.

Из евразийской патентной заявки ЕА 201992001 А1 (АДВЕРУМ БАЙОТЕКНОЛОДЖИС, ИНК.) известна полинуклеотидная кассета для улучшенной экспрессии трансгена в клетке млекопитающего, дополнительно содержащая нетранслируемую область (5'-UTR) по ходу транскрипции от промоторной области против хода транскрипции от кодирующей последовательности в расположении от 5’ к 3’, последовательность TPL:

ctcactctcttccgcatcgctgtctgcgagggccagctgttgggctcgcggttgaggacaaactcttcgcggtctttccagtactcttggatcggaaacccgtcggcctccgaacggtactccgccaccgagggacctgagcgagtccgcatcgaccggatcggaaaacctctcgagaaaggcgtctaaccagtcacagtcgcaaggtaggctgagcaccgtggcgggcggcagcgggtggcggtcggggttgtttctggcggaggtgctgctgatgatgtaattaaagtaggcggtcttgagacggcggatggtcga

(SEQ ID NO: 1).

Из евразийской патентной заявки ЕА 201390461 А1 (КАДИЛА ХЕЛЗКЭР ЛИМИТЕД) известен вектор экспрессии, содержащий промотор, функционально связанный с представляющим интерес геном, повышающими экспрессию элементами, генами VA I и II, терминатором трансляции, антибиотиком-маркером и TPL:

gtttagtgaaccgtcagatcctcttccgcatcgctgtctgcgagggccagctgttggggtgagtactccctctcaaaagcgggcatgacttctgcgctaagaatgtcagtttccaaaaacgaggaggatttgatattcactggcccgcggtgatgcctttgagggtggccgcgtccatctggtcagaaaagacaatctttttgttgtcaagcttccttgatgatgtcatacttatcctgtcccttttttttccacagctcgcggttgaggacaaactcttcgcggtctttccagtactcttggatcggaaacccgtcggcctccgaacggtactccgccaccgagggacctgagcgagtccgcatcgaccggatcggaaaacctctcgacgtacc (SEQ ID NO: 2).

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение в общем смысле относится к области генной инженерии и, в частности, к кассетам экспрессии генов и плазмидам, содержащих их. Описанные в настоящем изобретении генетические конструкции могут использоваться для in vitro синтеза РНК, а также увеличения ее трансляционной эффективности в клетках эукариот и регуляции экспрессии генов.

В частности, в настоящем изобретении описан полинуклеотидный компонент 5'UTR эукариотического экспрессионного вектора для повышения экспрессии представляющей интерес последовательности, который содержит лидерную регуляторную последовательность TPL (SEQ ID NO: 3), а также РНК последовательность TPL (SEQ ID NO: 5)

Предложенный полипептидный компонент с лидерной регуляторной последовательностью TPL можно применять в различных исследовательских, диагностических, терапевтических схемах, включая предотвращение и лечение заболеваний человека. Настоящий полинуклеотидный компонент может, например, входить в состав вирусного вектора, такого как аденоассоциированный вектор, который затем можно вводить в эукариотические клетки, клетки млекопитающих in vitro или млекопитающему, страдающему или имеющему риск развития предотвращаемого заболевания. В частности, описанный полинуклеотидный компонент может найти свое применение в мРНК-вакцинах.

Также описан плазмидный экспрессионный вектор pS_5-TPL-lucf-3-Mod, содержащий полинуклеотидный компонент 5'UTR эукариотического экспрессионного вектора для повышения экспрессии представляющей интерес последовательности, который содержит последовательность TPL (SEQ ID NO: 3).

Также описано применение предложенного плазмидного экспрессионного вектора pS_5-TPL-lucf-3-Mod, содержащего полинуклеотидный компонент 5'UTR эукариотического экспрессионного вектора для повышения экспрессии представляющей интерес последовательности, для in vitro синтеза РНК.

Краткое описание графических материалов

На рис. 1 показан вариант реализации рекомбинантной плазмиды p.Smart, кодирующей последовательность люциферазы светлячка (Photinus pyralis), содержащей последовательность TPL.

На рис. 2 приведены данные по относительной биолюминесценции люциферазы, конструкций с различными вариантами 5’ нетранслируемых последовательностей. Данные нормированы на конструкцию, содержащую 5’ последовательность вакцины Pfizer/BioNTech.

Описание изобретения

Определения:

Под «белками-мишенями» в настоящем изобретении понимаются целевые белки вирусов и бактерий, против которых формируется иммунный ответ.

Под «5′-нетранслируемой областью» в настоящем изобретении понимается лидерная последовательность - некодирующий участок мРНК, располагающийся сразу после кэпа, но перед кодирующей областью.

Под «РНК-вакциной» в настоящем изобретении понимается вакцина на основе матричной рибонуклеиновой кислоты - вакцина, действующая часть которой - рибонуклеиновая кислота, кодирующая белок, характерный для патогена. Помимо собственно РНК, в вакцине присутствует липидная оболочка, защищающая РНК от разрушения и обеспечивающая проникновение РНК в клетку.

Под «регуляторной последовательностью» в настоящем изобретении понимается нуклеотидная последовательность, которая влияет на экспрессию генов в организме.

Под «трансляционной эффективностью» в настоящем изобретении понимается количество кодируемого белкового продукта.

Под «экспрессионным вектором» в настоящем изобретении понимается последовательность нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает возможность экспрессии белка в клетке-хозяине, в особенности микроорганизме. Он включает в себя последовательность нуклеиновых кислот , которая кодирует белок.

Под «экспрессией генов» в настоящем изобретении понимается процесс, в ходе которого наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт - РНК или белок. Экспрессия генов может регулироваться на всех стадиях процесса: и во время транскрипции, и во время трансляции, и на стадии посттрансляционных модификаций белков.

Используемые сокращения:

гены VA I и II - гены I и II вирус-связанной РНК

мРНК - матричная РНК

TPL - состоящая из трех частей лидерная последовательность

5'-UTR - нетранслируемая область.

Раскрытие сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к полинуклеотидному компоненту 5'UTR эукариотического экспрессионного вектора для повышения экспрессии представляющей интерес последовательности, который содержит лидерную регуляторную последовательность TPL (SEQ ID NO: 3), а также РНК последовательность TPL (SEQ ID NO: 5).

Таким образом, целью настоящего изобретения является получение генетической последовательности 5'UTR эукариотического экспрессионного вектора для повышения экспрессии представляющей интерес последовательности, который содержит лидерную регуляторную последовательность TPL.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение плазмидного экспрессионного вектора pS_5-TPL-lucf-3-Mod, содержащего полинуклеотидный компонент 5'UTR эукариотического экспрессионного вектора для повышения экспрессии представляющей интерес последовательности, содержащего лидерную регуляторную последовательность TPL (SEQ ID NO: 3).

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение применения плазмидного экспрессионного вектора pS_5-TPL-lucf-3-Mod, содержащего полинуклеотидный фрагмент 5'UTR эукариотического экспрессионного вектора для повышения экспрессии представляющей интерес последовательности для in vitro синтеза РНК.

Настоящее изобретение может быть использовано для in vitro синтеза РНК, а также увеличения ее трансляционной эффективности в клетках эукариот и регуляции экспрессии генов.

Способы осуществления данного изобретения

Пример 1. Получение конструкции с последовательностью TPL в качестве регуляторного 5’-UTR региона.

В качестве вектора для вставки была использована плазмида p.Smart, кодирующая последовательность люциферазы светлячка (Photinus pyralis) и 3’-UTR Moderna (SEQ ID NO: 4), а также хвост из 110 аденинов после 3' нетранслируемого региона.

Амплификацию целевой последовательности осуществляли путем сшивки трех фрагментов методом ПЦР с перекрывающимися праймерами. Затем полученный фрагмент инкубировали с эндонуклеазами рестрикции EcoRI и BglII, очищали на агарозном геле и осуществляли лигирование с аналогично подготовленным коммерческим вектором pSmart (Lucigen, США). Вектор содержал polyA хвост длиной 110. Для трансформации использовали штамм E. coli NEB-stable (New England Biolabs, UK). Клоны отбирали методом ПЦР с колоний и подтверждали последовательность вставки секвенированием. Культивирование E. coli для наработки верифицированной плазмиды проводили на шейкере-инкубаторе при 30°C и 180 оборотах в минуту. Затем с помощью набора QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen, США) проводили выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток. Полученный препарат плазмиды pS_5-TPL-lucf-3-Mod линеаризовали по уникальному сайту рестрикции SpeI с последующей визуализацией в агарозном геле.

Пример 2. Наработка мРНК in vitro.

In vitro транскрипцию проводили в буфере, содержащем 20 мМ DTT, 2 мМ спермидина, 80 мМ HEPES-KOH pH 7.4, 24 мМ MgCl₂. Реакционная смесь также содержала по 3 мМ каждого из рибонуклеозид трифосфатов (Биосан, Новосибирск), 12 мМ аналога кэпа ARCA (Биолабмикс, Новосибирск). Остальные компоненты, из расчета на 100 мкл реакции: 40 единиц ингибитора рибонуклеаз RiboCare (Евроген, Москва), 500 единиц T7 РНК-полимеразы (Биолабмикс, Новосибирск), 5 мкг линеаризованной плазмиды pS_5-TPL-lucf-3-Mod (полученной по методике из примера 1) и 1 мкл смеси ферментов из набора RiboMAX Large Scale RNA Production System (Promega, США) в качестве источника неорганической пирофосфатазы. Реакцию проводили 2 часа при температуре 37°C, после чего в реакцию добавляли еще по 3 мМ каждого из рибонуклеозид трифосфатов и инкубировали в течение еще 2 часов. ДНК гидролизовали при помощи нуклеазы RQ1 (Promega, США), РНК преципитировали добавлением LiCl до концентрации 0,32M и EDTA pH 8.0 до концентрации 20 мМ с последующей инкубацией на льду в течение часа. Далее раствор центрифугировали в течение 15 минут (25000g, 4°C). Осадок РНК промывали 70% этанолом, растворяли в ультрачистой воде и еще раз преципитировали спиртом по стандартной методике. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически по поглощению на длине волны 260 нм.

Пример 3. Трансфекция в клеточные линии.

Данные были получены на клеточной линии мышиных дендритных клеток DC2.4 (целевые клетки для мРНК вакцины).Клетки DC2.4 выращивали в среде RPMI-1640 (Capricorn), содержавшей 10% FBS (HyClone), 50 мкм бета-меркаптоэтанол, аланил-глутамин и витамины. За сутки до трансфекции клетки 293Т и DC2.4 высевали в 48-луночный планшет (0,2 мл среды) в плотности 30%.

РНК разводили до концентрации 100 нг/мкл. В отдельной пробирке приготовляли раствор референсной мРНК в стерильном фосфатном буфере (pH 7.5) из расчета 25 мкл буфера и 50 нг мРНК Nluc на одну лунку. Далее переносили этот раствор по 25 мкл в стерильные пробирки, добавляли тестируемые мРНК (по 100 нг в случае клеток 293T и DC2.4 и по 200 нг в случае клеток THP1). В отдельной пробирке приготовляли раствор трансфицирующего реагента GenJect-40 (Молекта, Москва) в стерильном фосфатном буфере рН 7.5 из расчета 0,25 мкл реагента на 100 нг трансфицируемой мРНК. В соответствии с протоколом фирмы-производителя реагент инкубировали в PBS на комнатной температуре в течение 10 минут, после чего добавляли по 25 мкл к раствору мРНК, перемешивали и инкубировали в течение еще 15 минут при комнатной температуре. Далее трансфицирующую смесь добавляли по каплям к клеткам и инкубировали клетки 4, 8, 12, 24 или 72 часа.

Затем отбирали среду, промывали клетки фосфатным буфером pH 7.5 и анализировали экспрессию люцифераз при помощи набора Dual Luciferase Assay (Promega, США).

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Последовательность

для увеличения экспрессии генов.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.2.0" productionDate="2023-01-13">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022133537</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-12-20</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>3</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Автономная некоммерческая

образовательная организация высшего образования

&quot;Научно-технологический университет

&quot;Сириус&quot;</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Sirius University of Science and

Technology</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Регуляторная последовательность

для увеличения экспрессии генов</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>5</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>317</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..317</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcactctcttccgcatcgctgtctgcgagggccagctgttgggctcgcg

gttgaggacaaactcttcgcggtctttccagtactcttggatcggaaacccgtcggcctccgaacggtac

tccgccaccgagggacctgagcgagtccgcatcgaccggatcggaaaacctctcgagaaaggcgtctaac

cagtcacagtcgcaaggtaggctgagcaccgtggcgggcggcagcgggtggcggtcggggttgtttctgg

cggaggtgctgctgatgatgtaattaaagtaggcggtcttgagacggcggatggtcga</INSDSeq_se

quence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>395</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..395</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtttagtgaaccgtcagatcctcttccgcatcgctgtctgcgagggcca

gctgttggggtgagtactccctctcaaaagcgggcatgacttctgcgctaagaatgtcagtttccaaaaa

cgaggaggatttgatattcactggcccgcggtgatgcctttgagggtggccgcgtccatctggtcagaaa

agacaatctttttgttgtcaagcttccttgatgatgtcatacttatcctgtcccttttttttccacagct

cgcggttgaggacaaactcttcgcggtctttccagtactcttggatcggaaacccgtcggcctccgaacg

gtactccgccaccgagggacctgagcgagtccgcatcgaccggatcggaaaacctctcgacgtacc</IN

SDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>245</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..245</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>HAdV-D37</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gggaaatactctcttcgcatcgctgtctgcgagggccagctgttgggct

cgcggttgaggacaaactcttcgcggtctttccagtactcttggatcggaaacccgtcggcctccgaacg

gtactccgccaccgagggacctgagcgagtccgcatcgaccggatcggaaaacctctcgagaaaggcgtc

taaccagtcacagtcgcaagaagcttagcattccggtaactgttggtaaagccacc</INSDSeq_sequ

ence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>110</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..110</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gctggagcctcggtggcctagcttcttgccccttgggcctccccccagc

ccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtgtctttgaataaagtctgagtgggcggca</INSDSeq

_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>245</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..245</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>HAdV-D37</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gggaaatactctcttcgcatcgctgtctgcgagggccagctgttgggct

cgcggttgaggacaaactcttcgcggtctttccagtactcttggatcggaaacccgtcggcctccgaacg

gtactccgccaccgagggacctgagcgagtccgcatcgaccggatcggaaaacctctcgagaaaggcgtc

taaccagtcacagtcgcaagaagcttagcattccggtaactgttggtaaagccacc</INSDSeq_sequ

ence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к полинуклеотидному компоненту 5'UTR эукариотического экспрессионного вектора, и может быть использовано для in vitro синтеза РНК, увеличения ее трансляционной эффективности в клетках эукариот и регуляции экспрессии генов. Полинуклеотидный компонент 5'UTR эукариотического экспрессионного вектора содержит лидерную регуляторную последовательность TPL (состоящую из трех частей лидерную последовательность) с SEQ ID NO:5. Изобретение обеспечивает повышение экспрессии представляющей интерес последовательности в эукариотических экспрессионных системах за счет использования указанной лидерной регуляторной последовательности TPL. 3 н.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

1. Полинуклеотидный компонент 5'UTR эукариотического экспрессионного вектора для повышения экспрессии представляющей интерес последовательности, который содержит лидерную регуляторную последовательность TPL (состоящую из трех частей лидерную последовательность) с SEQ ID NO:5.

2. Плазмидный эукариотический экспрессионный вектор, кодирующий полинуклеотидный компонент 5'UTR по п. 1.

3. Применение плазмидного экспрессионного вектора из п. 2 для in vitro синтеза РНК.