ВАКЦИННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/17/СИНГАПУР/2016/3571 (H3N2) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ И ДЛЯ ДЕТЕЙ Российский патент 2019 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2), полученной из вируса гриппа семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus А А/Сингапур/INFIMH-16-0019/2016 (H3N2), clade 3С.2а, subclade 3C.2a1.

В результате появления в циркуляции нового эпидемического штамма вируса гриппа А/Сингапур/INFIMH-16-0019/2016 (H3N2), известный вакцинный штамм А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) - прототип (Патент РФ №2606019 от 10.03.16. - Опубл. БИ. - 2017. - №1) - утратил антигенную актуальность и, вследствие этого, не может вызвать защитную реакцию во время эпидемии, вызванной штаммами вируса гриппа подобными А/Сингапур/INFIMH-16-0019/2016 (H3N2).

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение антигенно актуального вакцинного штамма для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового вируса А/Сингапур/INFIMH-16-0019/2016 (H3N2).

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации антигенно актуальных эпидемических вирусов с всесторонне исследованными холодоадаптированными штаммами носителями аттенуирующих свойств, так называемыми донорами аттенуации (Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа // Вопр. Вирусол. - 1977. - №4. - С. 387-395).

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (ca) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа - разрешен для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей (Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. - С. 0606-83).

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS) -от безвредного донора аттенуации.

Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Сингапур/INFIMH-16-0019/2016 (H3N2) с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии овечьей антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированиями методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору при пониженной (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts- и са-фенотип) и по формуле генома на соответствие вакцинному штамму.

Антигенная характеристика вакцинного штамма.

Изучение антигенных свойств вакцинного штамма А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2) показало, что:

- ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма гемагглютинин (НА) в РТГА с гомологичной сывороткой антигенно идентичен эпидемическому вирусу А/Сингапур/INFIMH-16-0019/2016 (H3N2), поскольку показатели взаимодействия реассортанта А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2) и родительского штамма А/Сингапур/INFIMH-16-0019/2016 (H3N2) с крысиной антисывороткой, полученной к вирусу А/Сингапур/INFIMH-16-0019/2016 (H3N2), полностью совпадали (табл. 1).

- Второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма нейраминидаза (NA) проверен методом частичного секвенирования, а также полногеномным секвенированием. Он также идентичен вирусу А/Сингапур/INFIMH-16-0019/2016 (H3N2).

¹ Гипериммунная крысиная антисыворотка.

Анализ состава генома.

Для определения состава генома полученных реассортантов использовали метод пиросеквенирования на оборудовании PyroMark Q24.

С помощью компьютерной программы PSQ Assay Design были разработаны специфические праймеры, позволяющие оценивать наличие специфических мутаций. Результаты изучения свидетельствуют, что вакцинный реассортант унаследовал гены НА и NA от эпидемического вируса А/Сингапур/INFIMH-16-0019/2016 (H3N2), а гены, кодирующие внутренние и неструктурные белки - от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Сводные данные суммированы в таблице 2, а на рисунке 1, в качестве примера, представлены результаты пиросеквенирования гена РВ1, подтверждающие идентичность профиля участка этого гена у вакцинного реассортанта А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2) и донора аттенуации А/Ленинград/134/57 (H2N2) и несовпадение их нуклеотидной последовательности с профилем соответствующего участка гена эпидемического родительского вируса.

Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA) принадлежат эпидемическому родительскому вирусу А/Сингапур/INFIMH-16-0019/2016 (H3N2), гены, кодирующие внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), принадлежат донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Данные, полученные при первичном отборе вакцинного кандидата, подтверждены полным секвенированием его генома. Все кодирующие нуклеотидные замены, охарактеризованные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), как ответственные за его аттенуацию, присутствуют во внутренних генах реассортантного штамма А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2) (табл. 3).

Таким образом, полное секвенирование генома вакцинного штамма А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2) показало генетическую стабильность характерных для донора аттенуации аттенуирующих мутаций.

¹ Лен17 - ген принадлежит донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2);

² Сингапур - ген принадлежит эпидемическому вирусу A/Cингапур/INFIMH-16-0019/2016 (H3N2).

Генетическую стабильность кодирующих мутаций вакцинного штамма А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2) изучали также сравнением сохранности кодирующих мутаций до и после пятикратного пассирования вакцинного штамма, подготовленного на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 в развивающихся куриных эмбрионах, с помощью частичного секвенирования ДНК копий генов (Isakova-Sivak I. et. al. Development and pre-clinical evaluation of two LAIV strains against potentially pandemic H2N2 influenza virus. PLoS One. 2014. Vol. 9. №7. P. e102339).

Секвенирование участков генов, в которых находятся специфичные для донора аттенуации мутации, показало, что нуклеотидная последовательность вакцинного штамма АЛ7/Сингапур/2016/3571 (H3N2) до и после его пятикратного пассирования, осталась неизменной, в том числе, в ответственных за аттенуирующий фенотип генах полимеразного комплекса (РВ2, РВ1, РА) (табл. 3).

На фиг. 1 представлены результаты пиросеквенирования фрагмента гена РВ1 вакцинного штамма А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2) в сравнении с эпидемическим вирусом А/Сингапур/INFIMH-16-0019/2016 (H3N2) и донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2), проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Установлено, что вакцинный штамм А/17/Сингапур/2016/3 571 (H3N2) является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 40°С была менее 1,2 lg ЭИД₅₀/мл, и холодоадаптированным (са фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации достигала 5,5 lg ЭИД₅₀/мл (табл. 4). По этим показателям он идентичен температурочувствительному и холодоадаптированному донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), что свидетельствует о безвредности вакцинного штамма А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2) для человека.

Сохранность фенотипических характеристик вакцинного штамма А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2) после пяти пассажей в РКЭ (табл. 4) соответствует его высокой генетической стабильности.

¹ в сравнении с «диким» предшественником донора аттенуации: А/Ленинград/134/57 (H2N2);

² ген NP донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) не содержит аттенуирующих мутаций.

Безвредность для мышей. Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2) проводили на белых беспородных мышах в соответствии с Методическими рекомендациями по доклиническим испытаниям новых иммунобиологических препаратов (Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов». М.: 2010. 39 с.) и с Правилами лабораторной практики (Приказ Минздрава РФ «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» http://docs.cntd.ru/document/420350679) от 1.04.2016 №199н). Животным вводили однократно 0,5 мл вакцинного вируса внутрибрюшинно в дозе 7.0 lg ЭИД₅₀/0.2 мл. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Данные физиологического исследования показали, что внутрибрюшинное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных (табл. 5) и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.

¹ ВШ - вакцинный штамм А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2).

Заключение

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Сингапур/INFIMH-16-0019/2016 (H3N2), структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека.

Образец паспорта на вакцинный штамм А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2) прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2) по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак^®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2) депонирован 18.01.2018 года в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского (Россия RU, 123098, город Москва, улица Гамалеи, 16) под №2861 и имеет характеристики, представленные в паспорте штамма.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм вируса гриппа А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2), депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, под №2861. Изобретение может использоваться для получения живой гриппозной интраназальной гриппозной вакцины для взрослых и для детей. 5 табл.

Штамм вируса гриппа А/17/Сингапур/2016/3571 (H3N2), депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2861, для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.