Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/ГОНКОНГ/2014/8296 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей Российский патент 2017 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus А.

В результате появления в циркуляции нового эпидемического штамма вируса гриппа А/Гонконг/4801/2014 (H3N2) известный вакцинный штамм А/17/Техас/2012/30 (H3N2) - прототип [Патент РФ №2563352 от 20.09.15. - Опубл. БИ 2015. - №26] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не может вызвать защитную реакцию во время эпидемии, вызванной А/Гонконг/4801/2014-подобными штаммами вируса гриппа.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение антигенно актуального вакцинного штамма для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового вируса А/Гонконг/4801/2014 (H3N2).

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа // Вопр. Вирусол. - 1977. - №4 - С. 387-395.].

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа - разрешен для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. - С. 66-83].

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), от безвредного донора аттенуации.

Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Гонконг/4801/2014 (H3N2) с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии кроличьей антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированием методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору при пониженной (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts- и са-фенотип) и по формуле генома на соответствие вакцинному штамму.

Антигенная характеристика вакцинного штамма.

Изучение антигенных свойств вакцинного штамма А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) показало, что:

- ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА с гомологичной сывороткой антигенно идентичен эпидемическому вирусу А/Гонконг/4801/2014 (H3N2), поскольку показатели взаимодействия реассортанта А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) и родительского штамма А/Гонконг/4801/2014 (H3N2) с крысиной антисывороткой, полученной к вирусу А/Гонконг/4801/2014 (H3N2), полностью совпадали (табл. 1).

- второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - нейраминидаза (NA) - проверен методом частичного секвенирования, а также полногеномным секвенированием и идентичен вирусу А/Гонконг/4801/2014 (H3N2).

Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали частичное секвенирование ДНК копий генов [Isakova-Sivak I. et. al. Development and pre-clinical evaluation of two LAIV strains against potentially pandemic H2N2 influenza virus. PLoS One. 2014. Vol. 9. №7. P. e102339].

Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой

гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), принадлежат эпидемическому родительскому вирусу А/Гонконг/4801/2014 (H3N2), гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), принадлежат донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) представлены в табл. 2.

Данные, полученные при первичном отборе вакцинного кандидата, были подтверждены полным секвенированием его генома и показали, что вакцинный штамм А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) унаследовал все 6 генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (табл. 2).

Все кодирующие нуклеотидные замены, охарактеризованные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) как ответственные за его аттенуацию (табл. 3), присутствуют во внутренних генах реассортантного штамма А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2). Таким образом, полное секвенирование генома вакцинного штамма А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) показало генетическую стабильность аттенуирующих мутаций.

Генетическую стабильность кодирующих мутаций вакцинного штамма А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) изучали сравнением сохранности кодирующих мутаций до и после пятикратного пассирования вакцинного штамма, подготовленного на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57, в куриных эмбрионах с использованием метода пиросеквенирования. Для данного анализа были разработаны специфические праймеры, позволяющие оценивать наличие данных мутаций с использованием пиросеквенатора PyroMark Q24. Праймеры разработаны с использованием компьютерной программы PSQ Assay Design.

Пиросеквенирование показало, что нуклеотидная последовательность вакцинного штамма А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) до и после его пятикратного пассирования осталась неизменной, в том числе, в генах полимеразного комплекса (РВ2, РВ1, РА), ответственных за аттенуирующий фенотип, доказательством чего служат результаты пиросеквенирования, приведенные в таблице 3 и на фиг. 1.

На фиг. 1 в качестве примера представлены данные, подтверждающие наличие аттенуирующей мутации в позиции 1459 гена РВ2 вакцинного штамма А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) методом пиросеквенирования. Замена G на Т в позиции 1459 приводит к замене Val на Leu в позиции 478. 1-я последовательность соответствует вирусу А/Ленинград/134/57, у которого нет аттенуирующей мутации в данной позиции, 2-я последовательность соответствует донору А/Ленинград/134/17/57, у которого в данной позиции присутствует аттенуирующая мутация, и 3-я последовательность принадлежит пятому пассажу вакцинного штамма А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2), у которого в данной позиции сохраняется аттенуирующая мутация, что свидетельствует о генетической стабильности вакцинного штамма А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) в позиции 1459 гена РВ2.

Фенотипические характеристики пассажного варианта также не претерпели никаких изменений (табл. 4), что подтверждает высокую генетическую стабильность вакцинного штамма А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2).

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) в развивающихся куриных эмбрионах обладает выраженным температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 40°С составила ≤0.7 log₁₀ ЭИД₅₀/мл и холодоадаптированным (са фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации достигала 6.2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты фенотипического анализа представлены в таблице 4.

Безвредность для морских свинок. Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) проводили на морских свинках обоего пола в соответствии с Методическими рекомендациями по доклиническим испытаниям новых иммунобиологических препаратов [Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов». М.: 2010. 39 с.] и с «Правилами лабораторной практики» [Правила лабораторной практики. Приказ Минздрава РФ №708н от 23.08.20010. http://www.rg.ru/2010/10/22/laboratornaya-praktika-dok.html]. Морским свинкам вводили однократно 5 мл вакцинного вируса подкожно в дозе 7.0 lg ЭИД₅₀/0.2 мл. Животным контрольной группы вводили подкожно физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Показана безвредность вакцинного штамма для лабораторных животных при его подкожном введении (табл. 5).

Данные физиологического исследования показали, что подкожное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.

Заключение

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Гонконг/4801/2014 (H3N2), структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека.

Образец паспорта на вакцинный штамм А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак^®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) депонирован 14.12.2015 года в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского (Россия RU, 123098, город Москва, улица Гамалеи, 16) под №2818 и имеет характеристики, представленные в образце паспорта штамма.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 48 часов - 8.7 log₁₀ ЭИД₅₀/мл. Гемагглютинирующая активность - 1:256

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается штамма вируса гриппа. Предложен вакцинный штамм А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) - реассортант, полученный путем скрещивания «дикого» вируса А/Гонконг/4801/2014 (H3N2) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации, безвредным для людей. Представленный штамм А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32°С, характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных. Штамм депонирован в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского под №2818. Изобретение может быть использовано в практическом здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины. 1 ил., 5 табл.

Штамм вируса гриппа А/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2), депонированный в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского под №2818, используемый для получения живой гриппозной интраназальной гриппозной вакцины для взрослых и для детей.