СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГАЗОВОГО СОСТАВА МЕТАБОЛИТОВ МИКРОБИОТЫ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2019 года по МПК G01N30/00 C12Q1/02 G01N33/48 C12N1/20 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для определения газовых сигнальных молекул, выделяемых микробиотой человека.

Микроорганизмы в процессе жизнедеятельности могут потреблять из внешней среды или выделять в нее различные вещества, в том числе короткоцепочечные летучие жирные кислоты, КЛЖК, (уксусная, пропионовая, масляная, изомасляная, валерьяновая, изовалерьяновая, капроновая, изокапроновая), а также простейшие по химической структуре газообразные соединения (оксид азота - NO, оксид углерода - СО, сероводород - H₂S, водород - Н₂, метан- СН₄, аммиак- NH₃ и другие), являющиеся разнообразными регуляторами внутри- и межклеточной коммуникации, и динамика их концентрации в среде является важным физиологическим показателем.

Микробные аутоиндукторы (КЛЖК), позволяют симбиотическим микроорганизмам распознавать окружающую их среду, взаимодействовать друг с другом и с клетками хозяина. Эти молекулы запускают каскад процессов в прокариотических и эукариотических клетках, когда их количество достигает определенного уровня («quorum»). Аутоиндукторы взаимодействуют с клеточными рецепторами, с распознающими их регуляторными белками и, в конечном счете, активируют экспрессию соответствующих генов в ДНК микробных, митохондриальных и эукариотических клеток хозяина. Благодаря аутоиндукторам, микроорганизмы и клетки макроорганизма обмениваются информацией и координируют свою деятельность.

Хотя точные концентрации газов в тканях до настоящего времени отсутствуют, доказано, что многие из них способны проявлять разнообразные физиологические эффекты практически в каждом органе человека, а в определенных условиях участвовать и в патофизиологии тех или иных заболеваний. Большое количество газовых молекул, например, О₂, NO, СО, H₂S, и СН₄, может проникать через клеточные мембраны, что является необходимым условием для выполнения ауто-, пара- или эндокринных функций. Газы способны влиять на взаимодействие клеток со средой, электролитный гомеостаз и межклеточная электрохимическая взаимосвязь происходит через изменение в окислительно-восстановительной сигнализации, разрыв распределительных каналов и ионное канальное регулирование, что дает им возможность регулировать множество физиологических процессов в клетках и тканях. Так, например, «психобиотики» используются для обозначения пробиотических бактериальных штаммов, применяемых в качестве биологически активных добавок или функционального питания для оптимизации пула газотрансмиттеров в человеческом организме и благотворного воздействия на мозговую и поведенческую деятельность, которые подлежат регулированию КЛЖК, оксидом азота, окисью углерода, H₂S и аммиаком. Таким образом, большинство газовых молекул, должны рассматриваться как совместно функционирующие агенты с низкой молекулярной массой, которые контролируют определенную функцию или целый комплекс функций. Газы отличаются стабильностью и, следовательно, могут проявлять свой эффект или непосредственно на месте образования (H₂S), или на удалении - в тканях/органах (например, СО и NH3). Молекулы NO могут диффундировать и влиять на метаболические процессы на расстоянии в несколько клеточных диаметров. Благодаря их высокой реакционной способности, газы не накапливаются в одном месте, вместо этого, они быстро достигают свои клетки-мишени, где взаимодействуют с внутриклеточными ферментами, транспортерами и белками ионовых каналов.

Существуют способы для количественного определения летучих и нелетучих жирных кислот с помощью газо-жидкостной хроматографии:

а) Способ, основанный на детектировании жирных кислот после их этерификации [Braunegg G., Sonnleither В., Lalferty R.M. 1978. A rapid method for the determination poly-hydroxybutyric acid in microbial biomass. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 6. P. 2937.]. Газохроматографический способ определения поли-β-гидроксимасляной кислоты (поли-β-ГОМК) состоит из слабого кислотного или щелочного метанолиза поли-β-гидроксимасляной кислоты непосредственно без предварительной экстракции поли-β-ГОМК из клеток; за этим следует газовая хроматография метилового эфира 3-гидроксимасляной кислоты. Этот способ характеризуется высокой точностью и воспроизводимостью, позволяя определять до 10^-5 г/л. Только 4 часа требуется от отбора проб из ферментера до завершения определения поли-β-ГОМК.

Также используется модифицированный способ кислотного метанолиза Braunegg et al. [Mustafa Kansiz, Helen Billman-Jacobe, and Don McNaughton 2000 Quantitative Determination of the Biodegradable Polymer Poly(P-hydroxybutyrate) in a Recombinant Escherichia coli Strain by Use of Mid-Infrared Spectroscopy and Multivariative Statistics Appl. Environ. Microbiol. V. 66 №8. P. 3415-3420]. Точно взвешенную часть лиофилизированной клеточной массы от 20 до 30 мг помещали в пробирку с пробкой из политетрафторэтилена и измельчали до мелкого порошка. К этому добавляли объем хлороформа, который приводил к концентрации лиофилизированной клеточной массы от 3 до 4 мг/см³ хлороформа и полученный раствор обрабатывали ультразвуком в течение 30 мин или до полной гомогенизации раствора. Один кубический сантиметр этого раствора затем помещали в другую пробирку с крышкой из политетрафторэтилена, к которой добавляли 0,85 см³ метанола, содержащего 0,5 мг бензойной кислоты на см³, внутренний стандарт, и 0,15 мл концентрированной серной кислоты. Реакционную смесь нагревали при 100°С в течение 2 ч и быстро охлаждали; затем добавляли 1 см³ дистиллированной воды и смесь перемешивали в течение 1 мин. Органический и водный слои оставляли для разделения, и 0,5 мкл нижнего органического слоя вводили в газовый хроматограф (ГХ). Используемая ГХ модель Varian 3700 GC, оборудована капиллярной колонкой DB-Wax (15 м на 0,53 мм, толщина внутренней пленки 1,0 мкм), соединенной с интегратором Hewlett-Packard модели 3396А. Температуры инжектора и пламени ионизационного детектора устанавливались соответственно на уровне 200 и 250°С. Температуру устанавливали при 80°С и затем увеличивали со скоростью 10°С/мин до достижения максимальной температуры 200°С. В этих условиях время удерживания для производного РНВ (метил-3-гидроксимасляная кислота) и внутреннего стандарта бензойной кислоты составляло 4,4 и 5,8 мин соответственно.

б) Определение жирных кислот непосредственно в водных растворах [T.V. Laurinavichene, D.N. Tekucheva, K.S. Laurinavichius, M.L. Ghirardi, M.Seibert, A.A. Tsygankov. Towards the integration of dark and photo fermentative waste treatment. 1. Hydrogen photoproduction by purple bacterium Rhodobacter capsulatus using potential products of starch fermentation // Int. J. of hydrogen energy. 2008. V. 33. P. 7020-7026.].

С помощью этого способа можно проводить определение количества ацетата, пропионата, бутирата и изобутирата (и др. при подборе условий) в пробе. Образец: клетки микроорганизмов из 1 мл культуры осаждают при 12 тыс.g в течение 2 мин., затем 300 мкл надосадочной жидкости подкисляют до рН=3 30% H2PO4. 3 мкл образца исследуют без дополнительной предобработки методом газо-жидкостной хроматографии на хроматографе Цвет-800 (Дзержинск, Россия). Газовый хроматограф оснащен пламенно-ионизационным детектором и стеклянной колонкой длиной 1 м с диаметром 2 мм (наполнитель Chromosorb W/AW-DMCS+5% неопентилгликолсукцинат фракция 100-200 (Fluka)). Температура инжектора 145°С, температура детектора 185°С. Температурный режим программы колонки следующий: 80°С в течение 3 мин; затем возрастание температуры до 175°С со скоростью 60 С/мин; финальная температура 175°С поддерживается в течение 8 мин. Диоксид углерода используется в качестве газа-носителя и подается со скоростью 30 мл/мин.

Недостаток аналога: известно, что жирные кислоты участвуют в поддержании ионного обмена, осуществлении антибактериального эффекта и блокировке адгезии патогенов, активации местного иммунитета, но они не могут считаться маркерами в диагностике заболеваний различных систем органов, как сигнальные молекулы NO, СО, H₂S, Н₂.

Наиболее близким по своим признакам, принятым за прототип является бактериологический метод, который является золотым стандартом в микробиологии и позволяет идентифицировать микроорганизмы с определением морфологических, тинкториальных, культур альных, биохимических, антигенных свойств, чувствительности к антибиотикам, бактериофагам.

Прототип не может быть применен для определения газовых сигнальных молекул, которые участвуют в различных фундаментальных физиологических и патофизиологических процессах организма хозяина.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение является разработка способа определения простых газовых сигнальных молекул, таких как NO, СО, H₂S, Н₂, летучих жирных кислот (уксусная, пропионовая, масляная, изомасляная, валерьяновая, изовалерьяновая, капроновая, изокапроновая и др.), выделяемых представителями микробиоты здоровых людей и с различными заболеваниями неврологического, стоматологического, терапевтического, гинекологического и других профилей с помощью газового хроматографа.

Предлагаемой способ позволит выявить закономерности между выделением газовых сигнальных молекул и различными заболеваниями (например, сердечно-сосудистыми, неврологическими) и составить диагностические критерии, что в свою очередь позволит использовать эти молекулы как маркеры в диагностике заболеваний.

Авторы предлагают способ, характеризующийся простотой, удобством, малыми временными затратами и высокой результативностью.

Способ позволяет определить количество газовых сигнальных молекул, выделяемых микробиотой человека, с большой точностью и специфичностью.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка быстрого способа определения газовых сигнальных молекул, выделяемых микробиотой человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов, использованием минимального количества биомассы микроорганизмов в микрообъемах, отсутствием необходимости использования опасных химических реагентов. В итоге будет создана база данных для дальнейшего использования с диагностическими, профилактическими и терапевтическими целями.

Заявленное техническое решение осуществляется следующим образом:

Определение газовых сигнальных молекул (Н₂, H₂S, N₂, О₂, NO, СО₂, СО, СН₄, С₂Н₆, С₃Н₈ и др.) проводится с помощью газовой хроматографии с применением газового хроматографа «Хроматэк-Кристалл 5000.2», оснащенного детектором по теплопроводности (ДТП), пламенно-ионизационным детектором (ПИД) и электронозахватным детектором (ЭЗД), подключенными последовательно, что обеспечивает одновременный анализ горючих и негорючих компонентов. Разделение газовой смеси проводится на трехметровой надосадочной и капиллярной хроматографической колонках, заполненной полимером MN270, фракции 100-125 мкм. Анализ проводится в режиме программирования температуры в течение от 6 до 15 минут.

ПИД используется для детекции углеродсодержащих газов (СО, СО₂, СН₄) в течении 15 минут в следующем режиме:

Канал старта - 1

Время анализа, мин 15,00

Время продувки, мин 0,00

Время стабилизации, мин 0,00

Термостат колонок - 1

Температура,°С 120,0; 15,0

Температура продувки,°С 0,0

ПИД - 1

Температура,°С 270,0

Расход водорода, мл/мин 25,0

Расход воздуха, мл/мин 250,0

Температура продувки,°С 0,0

Расход водорода при продувке, мл/мин 0,0

Расход воздуха при продувке, мл/мин 0,0

ЭЗД - 1

Температура,°С 270,0

Расход поддувного газа, мл/мин 10,0

Температура продувки,°С 0,0

Расход поддувного газа при продувке, мл/мин 0,0

ДТП - 1

Температура,°С 100,0

Расход газа сравнения, мл/мин 20,0

Температура продувки,°С 0,0

Расход газа сравнения при продувке, мл/мин 0,0

Порт ввода - 1

Температура,°С 80,0

Экономия газа False

Температура продувки,°С 0,0

Порт ввода - 2

Температура,°С 80,0

Экономия газа False

Температура продувки,°С 0,0

Порт ввода - 3

Температура,°С 80,0

Экономия газа False

Температура продувки,°С 0,0

Колонка - 1

Расход, мл/мин 30,000; 0,000

Расход при продувке, мл/мин 0,0

Колонка - 2

Расход, мл/мин 30,000; 0,000

Расход при продувке, мл/мин 0,0

Колонка - 3

Расход, мл/мин 20,000; 0,000

Расход при продувке, мл/мин 0,0

Метанатор - 1

Температура,°С 350,0

Температура продувки,°С 0,0

ЭЗД используется для детекции NO, H₂S, H₂O в течение 12 минут в следующем режиме:

Канал старта -1

Время анализа, мин 12,00

Время продувки, мин 0,00

Время стабилизации, мин 0,00

Термостат колонок - 1

Температура,°С 45,0; 5,0; 4,0; 60,0; 3,3

Температура продувки,°С 0,0

ПИД - 1

Температура,°С 270,0

Расход водорода, мл/мин 25,0

Расход воздуха, мл/мин 250,0

Температура продувки,°С 0,0

Расход водорода при продувке, мл/мин 0,0

Расход воздуха при продувке, мл/мин 0,0

ЭЗД - 1

Температура,°С 270,0

Расход под дувного газа, мл/мин 0,0

Температура продувки,°С 0,0

Расход поддувного газа при продувке, мл/мин 0,0

ДТП - 1

Температура,°С 100,0

Расход газа сравнения, мл/мин 20,0

Температура продувки,°С 0,0

Расход газа сравнения при продувке, мл/мин 0,0

Порт ввода - 1

Температура,°С 80,0

Экономия газа False

Температура продувки,°С 0,0

Порт ввода - 2

Температура,°С 80,0

Экономия газа False

Температура продувки,°С 0,0

Порт ввода - 3

Температура,°С 80,0

Экономия газа False

Температура продувки,°С 0,0

Колонка -1

Расход, мл/мин 30,000; 0,000

Расход при продувке, мл/мин 0,0

Колонка - 2

Расход, мл/мин 45,000; 0,000

Расход при продувке, мл/мин 0,0

Колонка - 3

Расход, мл/мин 20,000; 0,000

Расход при продувке, мл/мин 0,0

Метанатор - 1

Температура,°С 350,0

Температура продувки,°С 0,0

ДТП используется для детекции H₂, О₂, N₂ в течение 6 минут следующем режиме:

Канал старта - 1

Время анализа, мин 6,00

Время продувки, мин 0,00

Время стабилизации, мин 0,00

Термостат колонок - 1

Температура,°С 60,0; 6,0

Температура продувки,°С 0,0

ПИД-1

Температура,°С 270,0

Расход водорода, мл/мин 25,0

Расход воздуха, мл/мин 250,0

Температура продувки,°С 0,0

Расход водорода при продувке, мл/мин 0,0

Расход воздуха при продувке, мл/мин 0,0

ЭЗД - 1

Температура,°С 270,0

Расход поддувного газа, мл/мин 10,0

Температура продувки,°С 0,0

Расход поддувного газа при продувке, мл/мин 0,0

ДТП - 1

Температура,°С 100,0

Расход газа сравнения, мл/мин 15,0

Температура продувки,°С 0,0

Расход газа сравнения при продувке, мл/мин 0,0

Порт ввода - 1

Температура,°С 80,0

Экономия газа False

Температура продувки,°С 0,0

Порт ввода - 2

Температура,°С 80,0

Экономия газа False

Температура продувки,°С 0,0

Порт ввода - 3

Температура,°С 80,0

Экономия газа False

Температура продувки,°С 0,0

Колонка - 1

Расход, мл/мин 30,000; 0,000

Расход при продувке, мл/мин 0,0

Колонка - 2

Расход, мл/мин 30,000; 0,000

Расход при продувке, мл/мин 0,0

Колонка - 3

Расход, мл/мин 15,000; 0,000

Расход при продувке, мл/мин 0,0

Метанатор -1

Температура,°С 350,0

Температура продувки,°С 0,0

В качестве эталона для калибровочных кривых используются чистые газы с объемной долей компонентов (производитель ООО «Мониторинг» Санкт-Петербург). Первый баллон (вместимость 4 дм³) содержит: СО 5,1 млн^-1, СН₄ 5,0 млн^-1, СО₂ 5,1 млн^-1, N₂ (остальное). Второй баллон (вместимость 4 дм³) содержит: H₂S 1020 млн^-1 и Ar (остальное). Третий баллон (вместимость 4 дм³) содержит: Н₂ 5,2 млн^-1 и N₂ (остальное). Четвертый баллон (вместимость 5 дм³) содержит: NO 5,1 млн^-1 и N₂ (остальное).

Культура микроорганизмов выращивается в 5 мл питательного бульона (MRS бульон для лактобацилл, МПБ для стафилококков, стрептококков, грибов рода Candida, Шедлера бульон для бифидобактерий) в стеклянной емкости объемом 10 мл с резиновой пробкой, которую плотно закрывают кримпером, в течение 24 часов в аэробных микроаэрофильных или анаэробных условиях при температуре 37°С. Объем пробы (надбульонного пара) - 1 мл забирается с помощью шприца. Все концентрации пересчитываются с текущих условий анализа на стандартные условия.

Пример 1

Пример 2.

Пример 3.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется базой данных (выборочные данные), включающей сведения о количественном и качественном составе газовых сигнальных молекул, которые выделяют микроорганизмы различных биотопов организма здоровых людей и людей с заболеваниями различного профиля:

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и микробиологии и описывает способ определения наличия газовых сигнальных молекул в метаболитах микробиоты человека. Способ характеризуется тем, что осуществляют выращивание культуры микроорганизмов в течение 24 часов в аэробных, микроаэрофильных или анаэробных условиях при температуре 37°С, после инкубирования забирают пробу, представляющую собой пар над питательным бульоном, и проводят анализ пробы в режиме программирования температуры в течение от 6 до 15 минут, детектор ПИД используют для определения углеродсодержащих газов в течение 15 минут, детектор ЭЗД для определения NO, H₂S, Н₂О в течение 12 минут, детектор ДТП для определения Н₂, О₂, N₂ в течение 6 минут. Изобретение позволяет определять наличие газовых сигнальных молекул, выделяемых микробиотой человека, и далее использовать их в качестве маркеров в диагностике заболеваний различного профиля. 3 пр.

Способ определения наличия газовых сигнальных молекул в метаболитах микробиоты человека, заключающийся в том, что осуществляют выращивание культуры микроорганизмов в 5 мл питательного бульона, при этом бульон выбран из MRS бульона для лактобацилл, МПБ бульона для стафилококков, стрептококков, грибов рода Candida, бульона Шедлера для бифидобактерий, в стеклянной емкости объемом 10 мл с резиновой пробкой, которую плотно закрывают кримпером, в течение 24 часов в аэробных, микроаэрофильных или анаэробных условиях при температуре 37°С, после инкубирования забирают с помощью шприца пробу объемом 1 мл, представляющую собой пар над питательным бульоном, и вводят в хроматографический детектор, включают Старт и начинают анализ пробы в режиме программирования температуры в течение от 6 до 15 минут, детектор ПИД используют для определения углеродсодержащих газов в течение 15 минут, детектор ЭЗД для определения NO, H₂S, Н₂О в течение 12 минут, детектор ДТП для определения Н₂, О₂, N₂ в течение 6 минут, все концентрации пересчитывают с текущих условий анализа на стандартные условия.