Способ фотодинамической терапии с контролем эффективности в режиме реального времени Российский патент 2018 года по МПК A61N5/67 A61B6/08 A61K38/41 A61P43/00 

Изобретение относится к области медицины, а именно к лучевой терапии с использованием света, касается способа фотодинамической терапии (ФДТ) с контролем эффективности в режиме реального времени, который может быть использован для лечения доброкачественных и злокачественных образований.

Термин «молекулярные роторы» относится к соединениям, молекулы которых состоят из нескольких фрагментов, способных поворачиваться (вращаться) друг относительно друга. В большинстве случаев, молекулярный ротор состоит из электронодонорной и электроноакцепторной групп, объединенных в общую систему π-сопряжения. Такая структура создает предпосылки для внутримолекулярного переноса заряда от донора к акцептору при возбуждении молекулы светом [М.А. Haidekker, Е.А. Theodorakis. Environment-sensitive behavior of fluorescent molecular rotors. J. of Biol. Eng., 2010, 4, 1-14]. Это, в свою очередь, может привести к внутримолекулярному движению отдельных фрагментов молекулы (вращению или скручиванию). Индуцированное светом внутримолекулярное движение в значительной степени определяет фотофизические свойства молекулярного ротора, поскольку оказывает сильное влияние на баланс заселенностей излучательного и безызлучательного («темнового») состояния молекулы: вращение отдельных ее групп или скручивание фрагментов относительно друг друга приводит к увеличению заселенности «темнового» состояния молекул. Возможность безызлучательного расхода энергии возбужденного состояния посредством внутримолекулярного движения облегчается в средах с низкой вязкостью. Таким образом, в низковязких средах наблюдается сильное понижение флуоресцентных свойств красителя. И, напротив, в вязком окружении внутримолекулярное движение затруднено, и это приводит к резкому возрастанию флуоресценции и к изменению таких ее параметров, как квантовый выход и время жизни. Важно отметить также, что зависимость флуоресцентных параметров молекулярного ротора от вязкости может быть описана с помощью уравнений, полученных теоретически и подтвержденных экспериментально. Известно уравнение , связывающее квантовый выход флуоресценции с вязкостью растворителя

, где

ϕ - квантовый выход,

z и α - константы,

η - вязкость.

Аналогичное уравнение существует и для другого параметра флуоресценции - времени жизни [Т. Forster, G.Hoffmann, Die Viskositatsabhangigkeit der Fluoreszenzquantenausbeuten einiger Farbstoffsysteme, Z. Phys. Chem., 1971, 75, 63].

, где

τ - время жизни возбужденного состояния,

η - вязкость,

z и α - константы,

kr - константа скорости излучательного перехода.

Известно, что величина α, характеризующая такую зависимость для красителей, принадлежащих к классу молекулярных роторов, находится в интервале 0.3-0.6 [М.К. Kuimova. Molecular rotors image intracellular viscosity. Chimia, 2012, 66, №4, 159-165].

Наличие вязкостной чувствительности параметров флуоресценции открывает возможность использования молекулярных роторов для количественного измерения вязкости. В частности известно, что вязкость внутриклеточной среды увеличивается в процессе фотоиндуцированной смерти клеток [M. Kuimova, S. Butchway, A. Parker, H. Anderson, P. Ogiby Nature Chemistry, 1, 2009, 69-73]. Таким образом, измеряя фотофизические характеристики (квантовый выход и время жизни возбужденного состояния) молекулярных роторов можно оценить динамику течения фотодинамической реакции и ее эффективность на основании определения внутриклеточной вязкости.

Известно, что фотосенсибилизаторы из группы тетра(арил)тетрацианопорфиразинов характеризуются сильной зависимостью фотофизических свойств (времени жизни возбужденного состояния и квантового выхода флуоресценции) от вязкости среды [М. Angeles Izquierdo, Aurimas , Svetlana A. Lermontova, Ilya S.Grigoryev, Natalia Y. Shilyagina, Irina V. Balalaeva, Larisa G. Klapshina, Marina K. Kuimova Dual Use of Porphyrazines as Sensitizers and Viscosity Markers During Photodynamic Therapy// Journal of Materials Chemistry B. 2015. DOI: 10.1039/C4TB01678E; Lermontova S., Grigorev I., Shilyagina N., Peskova N., Balalaeva I., Shirmanova M., Klapshina L. New Porphyrazine Macrocycles with High Viscosity-Sensitive Fluorescence Parameters // Russian Journal of General Chemistry, 2016, №6, Vol. 86, p. 1011-1018; S.A. Lermontova, I.S. , N.N. Peskova, E.Yu. Ladilina, I.V. Balalaeva, L.G. Klapshina, V.P. Boyarskii. New promising porphyrazine-based agents for optical theranostics of cancer. Russian Journal of General Chemistry, 2017. V. 87, №3, pp 479-84 https://doi.org/10.1134/S1070363217030173] и могут быть отнесены к флуоресцентным молекулярным роторам.

После введения тетра(арил)тетрацианопорфиразины в течение 30-60 минут интенсивно накапливаются опухолевыми клетками в культуре, локализуясь в околоядерной области [Shilyagina N.Y., Peskova N.N., Lermontova S.A., Brilkina A.A., Vodeneev V.A., Yakimansky A.V., Klapshina L.G., Balalaeva I.V. Effective delivery of porphyrazine photosensitizers to cancer cells by polymer brush nanocontainers // J.Biophotonics, 2017. V. 10, №9. P. l189-1197. doi: 10.1002/jbio.201600212].

Надо отметить, что тетра(арил)тетрацианопорфиразины обнаруживают высокую фото динамическую активность при низких значениях темновой токсичности в отношении опухолевых клеток в культуре [Shilyagina N.Y., Peskova N.N., Lermontova S.A., Brilkina A.A., Vodeneev V.A., Yakimansky A.V., Klapshina L.G., Balalaeva I.V. Effective delivery of porphyrazine photosensitizers to cancer cells by polymer brush nanocontainers // J.Biophotonics, 2017. V. 10, №9. P. 1189-1197. doi: 10.1002/jbio.201600212]. Использование для фотодинамической терапии соединений, объединяющих свойства фотосенсибилизаторов и флуоресцентных молекулярных роторов обеспечит проведение лечения с контролем вязкостных свойств клеток и тканей в режиме реального времени. Это, в свою очередь, позволит расширить возможности флуоресцентного биоимиджинга и проводить процедуру лечения с индивидуализацией параметров фотодинамического воздействия с целью повышения ее эффективности.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому изобретению является способ повышения эффективности фотодинамической терапии путем определения степени выгорания фотосенсибилизатора, защищенный патентом RU 2552032 С1, кл. A61N 5/067 (2006.01), опубл. 10.06.2015 г., принятый за ближайший аналог (прототип).

В способе по прототипу во время проведения процедуры флуоресцентной диагностики при отношении флуоресцентного сигнала между опухолью и нормой более 1.0 диагностируют отсутствие выгорания. При отношении флуоресцентного сигнала между опухолью и нормой 0.8-1.0 диагностируют частичное выгорание. При отношении флуоресцентного сигнала между опухолью и нормой менее 0.8 диагностируют полное выгорание. В случае частичного выгорания или отсутствия выгорания процедуру ФДТ продолжают дополнительно с плотностью мощности 0.35 Вт/см² путем поэтапного подведения по 50 Дж/см² с оценкой степени выгорания после каждого этапа. При регистрации полного выгорания процедуру ФДТ завершают. Способ обеспечивает повышение эффективности ФДТ за счет объективного мониторинга проводимого лечения, подбора индивидуальных доз лазерного воздействия на основании параметров флуоресценции, что позволяет добиться полного ответа опухоли на лечение и сократить побочные эффекты и количество рецидивов.

Однако, прототип не лишен недостатков. В частности, способ повышения эффективности фотодинамической терапии основан на определении степени выгорания препарата, т.е. на определении интенсивности флуоресценции в опухоли и нормальной тканях после процедуры фотодинамической терапии. Однако известно, что интенсивность флуоресценции существенным образом зависит от концентрации препарата, таким образом, приток/отток фотосенсибилизатора из исследуемой ткани может внести искажения и привести к неверной интерпретации полученных данных.

В задачу изобретения положено создание нового способа фотодинамической терапии с контролем эффективности в режиме реального времени с тетрапиррольным красителем тетра(арил)тетрацианопорфиразинового ряда в качестве фотосенсибилизатора, который одновременно является эффективными фотодинамическим агентом и вязкостным сенсором.

Техническим результатом от использования предлагаемого изобретения является повышение вероятности полного удаления патологического образования за один сеанс фотодинамической терапии и минимизацию негативного воздействия на здоровые ткани за счет индивидуализации режима проведения фотодинамической терапии с применением фотосенсибилизаторов со свойствами вязкостных сенсоров.

Поставленная задача достигается тем, что способ фотодинамической терапии с контролем эффективности в режиме реального времени, включает введение фотосенсибилизатора, проведение флуоресцентной визуализации опухоли и определение времени жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора в опухоли по достижении максимального накопления в опухоли, осуществление фотодинамической деструкции выявленных патологических очагов излучением с центральной длиной волны, совпадающей с максимумом поглощения фотосенсибилизатора, при этом в промежутках между этапами облучения оценивают время жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора, процедуру фотодинамического облучения повторяют до увеличения времени жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора в 1,5-2 раза относительно исходного уровня, в качестве фотосенсибилизатора для ФДТ используют тетрапиррольный краситель тетра(арил)тетрацианопорфиразинового ряда общей формулы:

где R - заместитель, R=2-MeOPh (2-метоксифенил), или 4-MeOPh (4-метоксифенил), или 4-EtO-3-MeOPh (3-метокси-4-этоксифенил), или 3-C2H3Ph (3-винилфенил), или Phen (9-фенантренил), или Et2NPh (4-диэтиламинофенил), или 4-C3H3OPh (4-(2-пропинилокси)фенил), или 4-С3Н3О-3-MeOPh (3-метокси-4-(2-пропинилокси)фенил), или 4-C3H3O-3-EtOPh (4-(2-пропинилокси)-3-этоксифенил), или 4-BnO-3-MeOPh (3-метокси-4-бензилоксифенил), или 4-BnO-EtOPh (4-бензилокси-3-этоксифенил), или 4-FBnO-3-MeOPh (3-метокси-4-((4-фтор)бензилокси)-фенил), или 4-FBnO-3-EtOPh (4-фторбензилокси)-3-этоксифенил), или 4-BnOPh (4-бензилоксифенил), или 4-BrBnO-3-MeOPh (4-бромбензилокси-3-метоксифенил), или 4-FPh (4-фторфенил), или 4-FBnOPh (4-фторбензилокси-3-метоксифенил), или 4-BrBnOPh (4-бромбензилоксифенил).

На фиг. 1 представлена структурная формула тетра(арил)тетрацианопорфиразина с различными вариантами боковых заместителей.

На фиг. 2 представлены графики зависимости квантового выхода флуоресценции (А) и времени жизни возбужденного состояния (Б) тетра(4-бензилоксифенил)тетрацианопорфиразина (Pz XIV) от вязкости растворителя (спирто-глицериновые смеси).

На фиг. 3 представлено флуоресцентное микроскопическое изображение клеток СТ-26 (карцинома толстой кишки мыши) через один час после инкубации с 5 мкМ тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразина (Pz XVI).

На фиг. 4 представлено флуоресцентное микроскопическое изображение клеток А431 (эпидермоидная карцинома кожи человека) через один час после инкубации с 5 мкМ тетра(4-бензилоксифенил)тетрацианопорфиразина (Pz XIV).

На фиг. 5 представлен график зависимости жизнеспособности клеток СТ-26 от концентрации в среде тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразина (Pz XVI). Метод МТТ.

На фиг. 6 представлен график зависимости жизнеспособности клеток А431 от концентрации в среде тетра(4-бензилоксифенил)тетрацианопорфиразина (Pz XIV). Метод МТТ.

На фиг. 7 представлены изображения клеток MCF-7 (аденокарцинома молочной железы человека) через различные периоды времени после фотодинамического воздействия, сенсибилизированного 5 мкМ тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразином (Pz XVI), и соответствующие гистограммы распределения усредненного времени жизни возбужденного состояния т_ау (черная кривая - для необлученного участка, красная - для облученного). Метод FLIM. При проведении фотодинамического воздействия поле зрения микроскопа было поделено на две равные части - верхняя часть изображения подвергалась фотодинамическому воздействию (594 нм, доза 50 Дж/см²), нижняя не подвергалась. Облученный и необлученный участки разделены пунктиром. При получении изображений была использована псевдоцветовая палитра, которая отражает усредненное время жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора (τ_aν) в каждом пикселе.

На фиг. 8 представлены изображение клеток А431 через различные периоды времени после фотодинамического воздействия (594 нм, 50 Дж/см²), сенсибилизированного 5 мкМ тетра(4-бензилоксифенил)тетрацианопорфиразина (Pz XIV). Метод FLIM. Область облучения выделена белым квадратом.

На фиг. 9 представлены фотографическое изображение животного-опухоленосителя (А) и изображение, полученное методом поверхностного флуоресцентного имиджинга (Б), через три часа после внутривенного введения 15 мг/кг тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразина (Pz XVI). Стрелкой показан опухолевый узел.

На фиг. 10 представлена диаграмма динамики роста объема опухолевого узла у животных в контрольной (контроль) и опытных группах: 150 Дж/см² - световое воздействие в дозе 150 Дж/см²; Pz XVI-ПЩ - внутривенное введение тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразина (Pz XVI), солюбилизированного в водной среде добавками полимерных щеток, 15 мг/кг; Pz XVI-ПЩ+150 Дж/см² - внутривенное введение тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразина (Pz XVI), солюбилизированного в водной среде добавками полимерных щеток, 15 мг/кг и световое воздействие в дозе 150 Дж/см². Планки погрешностей представлены стандартной ошибкой среднего. * - р<0.005, # р<0.0001, тест Манна-Уитни (n=5).

На фиг. 11 представлены фотографические изображения животного до и после фотодинамической терапии с тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразином (Pz XVI), солюбилизированного в водной среде добавками полимерных щеток, 15 мг/кг и 150 Дж/см².

На фиг. 12 представлен график изменения времени жизни τ₁ возбужденного состояния тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразина (Pz XVI), солюбилизированного в водной среде добавками полимерных щеток, в опухоли и норме до и после фотодинамического воздействия. Фотодинамическое воздействие в дозе 150 Дж/см² осуществлялось через 3 часа (начало ФДТ показано черной стрелкой, окончание ФДТ показано синей стрелкой).

На фиг. 13 представлены кривые выживаемости Каплана-Мейера в контрольной и опытных группах. Выживание определяется как время, прошедшее с момента ФДТ до достижения опухолью объема 2500 мм³.

Предлагаемый способ фотодинамической терапии с контролем эффективности в режиме реального времени осуществляют следующим образом.

Для осуществления способа в качестве фотосенсибилизатора используют тетрапиррольный краситель тетра(арил)тетрацианопорфиразинового ряда общей формулы:

где R - заместитель, R=2-MeOPh (2-метоксифенил), или 4-MeOPh (4-метоксифенил), или 4-EtO-3-MeOPh (3-метокси-4-этоксифенил), или 3-C2H3Ph (3-винилфенил), или Phen (9-фенантренил), или Et2NPh (4-диэтиламинофенил), или 4-C3H3OPh (4-(2-пропинилокси)фенил), или 4-C3H3O-3-MeOPh (3-метокси-4-(2-пропинилокси)фенил), или 4-С3Н3О-3-EtOPh (4-(2-пропинилокси)-3-этоксифенил), или 4-BnO-3-MeOPh (3-метокси-4-бензилоксифенил), или 4-BnO-EtOPh (4-бензилокси-3-этоксифенил), или 4-FBnO-3-MeOPh (3-метокси-4-фторбензилоксифенил), или 4-FBnO-3-EtOPh (4-фторбензилокси-3-этоксифенил), или 4-BrBnOPh (4-бензилоксифенил), или 4-BrBnO-3-MeOPh (4-(бромбензилокси)-3-метоксифенил), или. 4-FPh (4-фторфенил), или 4-FBnOPh (4-фторбензилокси-3-метоксифенил), или 4-BrBnOPh (4-бромбензилоксифенил).

Используемый фотосенсибилизатор характеризуется сильной зависимостью фотофизических свойств (времени жизни возбужденного состояния и квантового выхода флуоресценции) от вязкости среды. Например, на фиг. 2 показаны зависимость квантового выхода флуоресценции (А) и времени жизни возбужденного состояния (Б) тетра(4-бензилоксифенил)тетрацианопорфиразина (Pz XIV) от вязкости растворителя (спирто-глицериновые смеси). Коэффициент α, который количественно характеризует вязкостную чувствительность параметров флуоресценции красителя, равен 0.74 и 0.49 для квантового выхода флуоресценции и времени жизни возбужденного состояния соответственно. Приведенные значения α, позволяют отнести полученные красители к флуоресцентным молекулярным роторам.

Используемый фотосенсибилизатор обнаруживает высокую фотодинамическую активность при низких значениях темновой токсичности в отношении опухолевых клеток в культуре. Например, на фиг. 5 и 6 представлены графики зависимости жизнеспособности клеток СТ-26 от концентрации в среде тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразина (Pz XVI) и клеток А431 от концентрации в среде тетра(4-бензилоксифенил)тетрацианопорфиразина (Pz XIV) соответственно. IC₅₀(темнота) составляет более 50 мкМ для тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразина (Pz XVI) и более 10 мкМ для тетра(4-бензилоксифенил)тетрацианопорфиразина при IC₅₀(свет) 11 и 1 мкМ соответственно. Многократная разница между ингибирующими концентрациями соединения в темноте и при световом воздействии подтверждает высокую фотодинамическую активность используемого фотосенсибилизатора.

Сильная зависимость фотофизических свойств (времени жизни возбужденного состояния и квантового выхода флуоресценции) от вязкости среды (коэффициент α) и высокая фотодинамическая активность при низких значениях темновой токсичности в отношении опухолевых клеток в культуре характерна для всей серии соединений тетрапиррольных красителей тетра(арил)тетрацианопорфиразинового ряда (Таблица 1).

Осуществляют доставку фотосенсибилизатора к опухолевым клеткам. Например, при работе in vitro фотосенсибилизатор добавляют в среду инкубации, при работе in vivo фотосенсибилизатор вводят внутривенно. Для обеспечения доставки гидрофобных фотосенсибилизаторов возможно использование солюбилизаторов. Введенный фотосенсибилизатор накапливается в опухолевых клетках через 30-60 минут при работе in vitro, и через 3 часа при работе in vivo. С целью подтверждения накопления фотосенсибилизатора опухолевыми клетками проводят флуоресцентную микроскопию in vitro, либо флуоресцентный имиджинг при работе in vivo.

После подтверждения накопления фотосенсибилизатора опухолевыми клетками проводят регистрацию времени жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора в области, которая в дальнейшем будет подвергаться фотодинамическому воздействию. При работе с клеточными культурами время жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора оценивают с помощью метода время-разрешенной флуоресцентной микроскопии (FLIM). Данный метод позволяет получить пространственное распределение времени жизни возбужденного состояния молекул в пределах микроскопических изображений. Для регистрации времени жизни фотосенсибилизатора возбуждение осуществляют с помощью импульсного лазера с длиной волны соответствующей спектру однофотонного или многофотонного возбуждения фотосенсибилизатора, регистрацию осуществляют в диапазоне, который соответствует спектру флуоресценции фотосенсибилизатора.

При работе in vivo возбуждение флуоресценции осуществляют с помощью импульсного лазера с длиной волны, соответствующей спектру однофотонного возбуждения фотосенсибилизатора. Сигнал флуоресценции регистрируется с помощью фотоэлектронного умножителя, работающего в режиме счета фотонов.

Для полученных кривых затухания флуоресценции осуществляется их аппроксимация экспоненциальной функцией, или суммой нескольких экспоненциальных функций. В последнем случае определяются времена жизни для каждой из экспонент (τ₁, τ₂ и т.д.) и усредненное временя жизни возбужденного состояния (τ_aν). Все перечисленные показатели могут быть использованы для оценки состояния облучаемого участка. Затем осуществляют фотодинамическое воздействие путем фракционированного поэтапного облучения по 10 Дж/см² при работе in vitro и по 50 Дж/см² при работе in vivo.

Фотодинамическое воздействие осуществляется с помощью светодиодной установки или лазера. Центральная длина волны оптического излучения должна соответствовать спектру возбуждения фотосенсибилизатора. Для исключения влияния излучения на здоровые ткани животное накрывается светозащитной тканью и облучение опухоли осуществляется локально через отверстие, размер которого соответствует размеру опухолевого узла.

После первого акта фотодинамического воздействия регистрируют время жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора. Далее процедуру фотодинамического облучения повторяют до увеличения времени жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора в 1,5-2 раза относительно исходного уровня.

Время жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора оценивают в промежутках между этапами облучения.

Увеличение времени жизни возбужденного состояния в полтора-два раза относительно исходного уровня указывает на эффективность осуществляемого фотодинамического воздействия.

Следует отметить, что такой параметр как время жизни возбужденного состояния не зависит от концентрации фотосенсибилизатора в ткани. В отличие от интенсивности флуоресценции, время жизни является собственным свойством флуорофора, и, следовательно, на измерение этого параметра не влияет нестабильность возбуждающего света и фотообесцвечивание. Измерения с временным разрешением позволяют получить динамическую информацию о микроокружении флуорофора и его взаимодействии с другими молекулами.

За счет индивидуализации режима проведения фотодинамической терапии с применением фотосенсибилизаторов со свойствами вязкостных сенсоров предлагаемый способ обеспечивает повышение вероятности полного удаления патологического образования за один сеанс фотодинамической терапии и минимизацию негативного воздействия на здоровые ткани.

Ниже представлены примеры осуществления предлагаемого изобретения.

Пример 1.

Эксперимент in vitro осуществляли на клеточных культурах СТ-26 (карцинома толстой кишки мыши), А431 (эпидермоидная карцинома кожи человека) и MCF-7 (аденокарцинома молочной железы человека).

При работе с клеточными культурами фотосенсибилизатор добавляли в среду инкубации в концентрации 5 мкМ.

Введенный фотосенсибилизатор накапливался в опухолевых клетках через 30-60 минут. С целью подтверждения накопления опухолевыми клетками фотосенсибилизатора проводили флуоресцентную микроскопию. Например, по интенсивному сигналу флуоресценции в красной области спектра определяли, что введенный фотосенсибилизатор накапливался в цитоплазме клеток возле ядра и в ядерной оболочке клеток СТ-26 (карцинома толстой кишки мыши) через один час после инкубации с тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразином (Pz XVI) и клеток А431 (эпидермоидная карцинома кожи человека) через один час после инкубации с тетра(4-бензилоксифенил)тетрацианопорфиразином (Pz XIV) (фиг. 3 и 4).

После подтверждения накопления фотосенсибилизатора опухолевыми клетками проводили регистрацию времени жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора в области, которую в дальнейшем подвергали фотодинамическому воздействию.

Регистрацию времени жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора осуществляли на системе лазерной сканирующей микроскопии Axio Observer Z1 LSM-710 DUO NLO (Carl Zeiss, Германия) с модулем FLIM (Becker & Hickl, Германия) при двухфотонном возбуждении фемтосекундным лазером Chameleon (Coherent, США).

Затем осуществляли фотодинамическое воздействие путем фракционированного поэтапного облучения по 10 Дж/см².

Фотодинамическое воздействие осуществляли путем сканирования участка образца гелий-неоновым лазером 594 нм, мощность на объективе 160 мкВт, в течение 8-20 минут, в зависимости от площади облучаемого участка. Доза облучения составляла 50 Дж/см².

После первого акта фотодинамического воздействия регистрировали время жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора.

Далее процедуру фотодинамического облучения повторяли до увеличения времени жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора в полтора-два раза относительно исходного уровня.

В эксперименте in vitro установили, что тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразин (Pz XVI), солюбилизированный в водной среде добавками полимерных щеток, характеризуется высокой фотодинамической активностью. Например, на фиг. 5 и 6 представлены графики зависимости жизнеспособности клеток СТ-26 от концентрации в среде тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразина (Pz XVI) и клеток А431 от концентрации в среде тетра(4-бензилоксифенил) тетрацианопорфиразина (Pz XIV) соответственно. IC₅₀(темнота) составляет более 50 мкМ для тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразина (Pz XVI) и более 10 мкМ для тетра(4- бензилоксифенил)тетрацианопорфиразина при IC₅₀(свет) 11 и 1 мкМ соответственно. Многократная разница между ингибирующими концентрациями соединения в темноте и при световом воздействии подтверждает высокую фотодинамическую активность используемого фотосенсибилизатора.

Кроме этого, на фиг. 7 хорошо видно, что через 90 минут после фотодинамического воздействия (594 нм, 50 Дж/см²) в облучаемой зоне культуры опухолевых клеток MCF-7 (аденокарцинома молочной железы человека), сенсибилизированных 5 мкМ тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразином (Pz XVI), регистрируется увеличение времени жизни возбужденного состояния фтосенсибилизатора - τ_aν изменяется с 370 пс до 530 пс через 90 минут после начала воздействия. Также, мониторинг, проведенный с помощью FLIM (фиг. 8) показал, что после фотодинамического воздействия в облученной области происходит увеличение времени жизни возбужденного состояния тетра(4-бензилоксифенил)тетрацианопорфиразина (Pz XIV): короткоживущая компонента τ₁ увеличивается с 300 до 370 пс, долгоживущая компонента τ₂ - с 1849 до 2484 пс, данные представлены в таблице 2.

Пример 2.

Эксперимент in vivo осуществляли на лабораторных мышах линии Balb/c с подкожной опухолью СТ-26 (номер по каталогу АТСС^® CRL-2638™). Для получения экспериментальных опухолей животным подкожно в область задней поверхности левого бедра вводили суспензию опухолевых клеток в количестве 500000 клеток в 50 мкл 10 мМ фосфатно-солевого буфера (PBS). Исследования начинались по достижении опухолями объема ~0,5 см³, через 7 дней после прививки опухоли.

Инъекцию фотосенсибилизатора, солюбилизированного в водной среде добавками полимерных щеток, проводили через хвостовую вену в концентрации 15 мг/кг. Облучение проводили через 3 часа после инъекции фотосенсибилизатора.

Наблюдали, что введенный фотосенсибилизатор у животных-опухоленосителей накапливается в опухоли в максимальной концентрации через 3 часа. С целью подтверждения накопления фотосенсибилизатора в опухоли проводили флуоресцентный имиджинг. Например, на флуоресцентном изображении животного-опухоленосителя, полученном методом поверхностного флуоресцентного имиджинга через три часа после внутривенного введения 15 мг/кг тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразина (Pz XVI), на фиг. 9Б хорошо видно, что в области опухоли регистрируется интенсивный флуоресцентный сигнал, соответствующий флуоресценции тетра(4-фторфенил) тетрацианопорфиразина (Pz XVI).

После подтверждения накопления фотосенсибилизатора в опухоли проводили регистрацию времени жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора в области, которую в дальнейшем подвергали фотодинамическому воздействию.

Регистрация времени жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора в опухоли и нормальных тканях проводилась с помощью установки для время-коррелированного счета одиночных фотонов на основе платы SPC-150 (Becker & Hickle, Германия). Возбуждение флуоресценции фотосенсибилизатора осуществляли с помощью импульсного лазера Fianium SC-450 в спектральном диапазоне 590-595 нм.

Затем осуществляли фотодинамическое воздействие на опухоль путем фракционированного поэтапного облучения по 50 Дж/см².

Фотодинамическое воздействие на опухоль проводилось с помощью светодиодного источника излучения с центральной длиной волны 640 нм. Доза облучения в эксперименте составляла 150 Дж/см². Дозу облучения при этом регулировали временем воздействия. Для исключения влияния излучения на нормальные ткани животное накрывалось светозащитной тканью, облучение опухоли осуществлялось локально через отверстие, размер которого соответствовал размеру опухолевого узла.

После первого акта фотодинамического воздействия регистрировали время жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора.

Далее процедуру фотодинамического облучения повторяли до увеличения времени жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора в полтора-два раза относительно исходного уровня.

В эксперименте in vivo установили, что тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразин (Pz XVI), солюбилизированный в водной среде добавками полимерных щеток, характеризуется высокой фотодинамической активностью. Например, фотодинамическое воздействие с тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразином (Pz XVI), солюбилизированным в полимерных щеках, вызывает существенное (10-20 раз) уменьшение объемов опухолевого узла у животных в опытных группах по сравнению с другими экспериментальными группами (фиг. 10), что свидетельствует о его высокой фотодинамической активности in vivo. Коэффициент торможения опухолевого роста при фотодинамическом воздействии с тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразином (Pz XVI), рассчитанный на основе полученных данных (фиг. 10) составил около 95%.

Наблюдали, что у животного через 4 недели после терапии происходит полная регрессия опухолевого узла (фиг. 11), что подтверждает эффективность тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразина (Pz XVI) как фотодинамического агента. Кроме этого, при эффективном фотодинамическом воздействии с использованием тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразина (Pz XVI), солюбилизированного в водной среде добавками полимерных щеток, происходит увеличение времени жизни его возбужденного состояния в облученных опухолевых клетках. Например, после фотодинамического воздействия с тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразином (Pz XVI) в области опухоли происходит увеличение времени жизни возбужденного состояния в 1.5-2 раза по сравнению с исходным уровнем, при этом в необлученной нормальной ткани таковых изменений не происходит (фиг. 12). Фотодинамическая терапия с применением тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразина (Pz XVI), солюбилизированного в полимерных щеках, значительно увеличивает продолжительность жизни животных-опухоленосителей по сравнению с животными, которые не подвергались лечению (фиг. 13). Выживание определяется как время, прошедшее с момента ФДТ, до достижения опухолью объема 2500 мм³.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и лучевой терапии, и может быть использовано для фотодинамической терапии с контролем эффективности в режиме реального времени. Для этого осуществляют доставку фотосенсибилизатора к опухолевым клеткам. В качестве фотосенсибилизатора используют тетрапиррольный краситель тетра(арил)тетрацианопорфиразинового ряда общей формулы:

где R - заместитель, R=2-MeOPh (2-метоксифенил), или 4-MeOPh (4-метоксифенил), или 4-EtO-3-MeOPh (3-метокси-4-этоксифенил), или 3-C2H3Ph (3-винилфенил), или Phen (9-фенантренил), или Et2NPh (4-диэтиламинофенил), или 4-С3Н3ОРh (4-(2-пропинилокси)фенил), или 4-C3H3O-3-MeOPh (3-метокси-4-(2-пропинилокси)фенил), или 4-C3H3O-3-EtOPh (4-(2-пропинилокси)-3-этоксифенил), или 4-BnO-3-MeOPh (3-метокси-4-бензилоксифенил), или 4-BnO-EtOPh (4-бензилокси-3-этоксифенил), или 4-FBnO-3-MeOPh (3-метокси-4-фторбензилоксифенил), или 4-FBnO-3-EtOPh (4-фторбензилокси-3-этоксифенил), или 4-BnOPh (4-бензилоксифенил), или 4-BrBnO-3-MeOPh (4-(бензилокси)-3-метоксифенил), или 4-FPh (4-фторфенил), или 4-FBnOPh (4-фторбензилоксифенил), или 4-BrBnOPh (4-бромбензилоксифенил). Далее проводят флуоресцентную визуализацию опухоли и определение времени жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора по достижении максимального накопления в опухоли. Выполняют фотодинамическую деструкцию выявленных патологических очагов путем фракционированного поэтапного облучения с центральной длиной волны, совпадающей со спектром поглощения фотосенсибилизатора. При этом в промежутках между этапами облучения оценивают время жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора. Процедуру фотодинамического облучения повторяют до увеличения времени жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора в 1,5-2 раза относительно исходного уровня. Способ обеспечивает повышение вероятности полного удаления патологического образования за один сеанс фотодинамической терапии при минимизации негативного воздействия на здоровые ткани за счет индивидуализации режима проведения фотодинамической терапии с применением фотосенсибилизаторов со свойствами вязкостных сенсоров. 1 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр., 13 ил.

1. Способ фотодинамической терапии с контролем эффективности в режиме реального времени, включающий доставку фотосенсибилизатора к опухолевым клеткам, проведение флуоресцентной визуализации опухоли и определение времени жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора по достижении максимального накопления в опухоли, осуществление фотодинамической деструкции выявленных патологических очагов путем фракционированного поэтапного облучения с центральной длиной волны, совпадающей со спектром поглощения фотосенсибилизатора, при этом в промежутках между этапами облучения оценивают время жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора, процедуру фотодинамического облучения повторяют до увеличения времени жизни возбужденного состояния фотосенсибилизатора в 1,5-2 раза относительно исходного уровня, в качестве фотосенсибилизатора используют тетрапиррольный краситель тетра(арил)тетрацианопорфиразинового ряда общей формулы:

где R - заместитель, R=2-MeOPh (2-метоксифенил), или 4-MeOPh (4-метоксифенил), или 4-EtO-3-MeOPh (3-метокси-4-этоксифенил), или 3-C2H3Ph (3-винилфенил), или Phen (9-фенантренил), или Et2NPh (4-диэтиламинофенил), или 4-С3Н3ОРh (4-(2-пропинилокси)фенил), или 4-C3H3O-3-MeOPh (3-метокси-4-(2-пропинилокси)фенил), или 4-C3H3O-3-EtOPh (4-(2-пропинилокси)-3-этоксифенил), или 4-BnO-3-MeOPh (3-метокси-4-бензилоксифенил), или 4-BnO-EtOPh (4-бензилокси-3-этоксифенил), или 4-FBnO-3-MeOPh (3-метокси-4-фторбензилоксифенил), или 4-FBnO-3-EtOPh (4-фторбензилокси-3-этоксифенил), или 4-BnOPh (4-бензилоксифенил), или 4-BrBnO-3-MeOPh (4-(бензилокси)-3-метоксифенил), или 4-FPh (4-фторфенил), или 4-FBnOPh (4-фторбензилоксифенил), или 4-BrBnOPh (4-бромбензилоксифенил).

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при работе in vitro фотосенсибилизатор добавляют в среду инкубации, при работе с in vivo фотосенсибилизатор вводят внутривенно.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для подтверждения накопления опухолевыми клетками фотосенсибилизатора проводят флуоресцентную микроскопию при работе in vitro либо флуоресцентный имиджинг при работе in vivo.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что осуществляют фракционированное поэтапное облучение по 10 Дж/см² при in vitro и по 50 Дж/см² при работе in vivo.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фотодинамическое воздействие производят либо с помощью светодиодов, либо с помощью лазеров.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что увеличение времени жизни возбужденного состояния в 1,5-2 раза относительно исходного уровня указывает на эффективность осуществляемого фотодинамического воздействия.