Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение касается противораковой фармацевтической композиции, содержащей двухцепочечную миРНК в качестве активного ингредиента. Более конкретно, настоящее изобретение касается противораковой фармацевтической композиции, содержащей в качестве фармацевтически активного ингредиента miR-3670, miR-8078 или miR-4477a, которые способны эффективно ингибировать пролиферацию раковых клеток или индуцировать апоптоз раковых клеток, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В качестве эффективных и традиционных способов лечения заболеваний, вызванных неконтролируемой регуляцией генов, в особенности заболеваний, именуемых раковыми заболеваниями, применялись методы удаления опухолей хирургическим путем. Однако, когда первичный рак дает метастазы в другие органы, хирургическое удаление становится невозможным и применяется противораковая химиотерапия. В качестве противораковых средств для химиотерапии в основном применялись низкомолекулярные соединения, синтезированные органическими или неорганическими методами. Такие противораковые препараты разрабатывались и применялись против раковых заболеваний в основном с тем, чтобы они эффективно воздействовали на белки, нарушающие сигнальные пути, путем гиперэкспрессии фосфорилирующих белков, входящих в сигнальные пути, тем самым ингибируя активность тех белков. Такая традиционная химиотерапия может вызывать много побочных эффектов, поскольку используемые противораковые препараты представляют собой искусственно синтезированные чужеродные вещества, которые воздействуют на и так уже гиперэкспрессированные белки.
Предпринимались различные подходы к разработке терапевтических препаратов для замены традиционных средств химиотерапии. Одним из таких подходов является использование маленькой или короткой интерферирующей РНК (в дальнейшем именуется киРНК, siRNA) (Iorns E., Lord C.J., Turner N. & Ashworth A. Utilizing RNA interference to enhance cancer drug discovery. Nat Rev Drug Discov 6, 556-68, 2007). киРНК представляет собой одноцепочечную РНК, состоящую из 16-27 нуклеотидов, которая служит одним из компонентов рибонуклеопротеидного комплекса, известного как комплекс РНК-индуцируемого сайленсинга (RISC) в клетках (Tomari Y. & Zamore P.D. Perspective: machines for RNAi. Genes Dev 19, 517-29, 2005; Chu C.Y. & Rana T.M. Potent RNAi by short RNA triggers. RNA 14, 1714-9, 2008; Mittal V. Improving the efficiency of RNA interference in mammals. Nat Rev Genet 5, 355-65, 2004; Reynolds A. et al. Rational siRNA design for RNA interference. Nat Biotechnol 22, 326-30, 2004). RISC функционирует как ножницы для расщепления матричной РНК (в дальнейшем именуется мРНК), тем самым ингибируя вырабатывание белка из мРНК. Содержащаяся в RISC киРНК может связываться с такой мРНК, последовательность которой комплементарна последовательности киРНК, с образованием двухцепочечной РНК, а RISC может действовать как ножницы для расщепления целевой мРНК с тем, чтобы мРНК больше не функционировала в качестве матрицы, которая многократно вырабатывает белок.
Противораковые препараты на основе киРНК, как описано выше, считаются продвинутыми в сравнении с низкомолекулярными противораковыми препаратами, так как они расщепляют мРНК еще до выработки белка и используют РНК и внутриклеточный путь RISC. Тем не менее, существует побочный эффект, который не может быть устранен даже по технологии киРНК (Jackson A.L. et al. Widespread siRNA "off-target" transcript silencing mediated by seed region sequence complementarity. RNA 12, 1179-87, 2006; Jackson A.L. et al. Position-specific chemical modification of siRNAs reduces "off-target" transcript silencing. RNA 12, 1197-205, 2006; Jackson, A.L. et al. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol 21, 635-7, 2003; Nielsen C.B. et al. Determinants of targeting by endogenous and exogenous microRNAs and siRNAs. RNA 13, 1894-910, 2007; Peek A.S. & Behlke M.A. Design of active small interfering RNAs. Curr Opin Mol Ther 9, 110-8, 2007). Этот побочный эффект - явление, известное как сбой мишени. Как описано выше, киРНК действует, расщепляя мРНК, последовательность которой комплементарна последовательности киРНК. Однако киРНК также может связываться и расщеплять нецелевую мРНК, которая комплементарна не всей последовательности киРНК, а лишь части последовательности киРНК. Это явление известно как сбой мишени.
Для того, чтобы преодолеть описанный выше технический недостаток противораковых средств на основе киРНК, проводятся исследования по использованию микроРНК (в дальнейшем “миРНК”) в качестве терапевтических средств (Agostini M. & Knight R.A. miR-34: from bench to bedside. Oncotarget 5, 872-81, 2014; van Rooij E., Purcell A.L. & Levin A.A. Developing microRNA therapeutics. Circulation Research 110, 496-507, 2012; Burnett J.C. & Rossi J.J. RNA-based therapeutics: current progress and future prospects. Chem Biol 19, 60-71, 2012; Dangwal S. & Thum T. MicroRNA therapeutics in cardiovascular disease models. Annu Rev Pharmacol Toxicol 54, 185-203, 2014). миРНК представляет собой РНК, состоящую из 16-27 нуклеотидов, которая квалифицируется как РНК, не кодирующая белки, в отличие от матричной РНК (мРНК), которая транслируется в белок (Carthew R.W. & Sontheimer E.J. Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 136, 642-55, 2009; MacFarlane L.-A. & Murphy P.R. MicroRNA: biogenesis, function and role in cancer. Current Genomics 11, 537-561, 2010; Bartel D.P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136, 215-33, 2009). МикроРНК встречается в геноме высших животных и растительных клеток и, как известно, играет ключевую роль в регуляции метаболизма и функции клеток, включая образование, рост, дифференцировку и смерть клеток. К настоящему времени в геноме человека обнаружено около 2000 различных миРНК, причем функции значительной части этих миРНК пока еще не известны.
МикроРНК транскрибируется из генома в РНК под действием РНК-полимеразы, известной как Pol II, а исходная длина миРНК весьма разнообразна (Carthew R.W. & Sontheimer E.J. Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 136, 642-55, 2009; Brodersen P. & Voinnet O. Revisiting the principles of microRNA target recognition and mode of action. Nat Rev Mol Cell Biol 10, 141-148, 2009). Это объясняется позиционным разнообразием миРНК в геноме. Оно возникает потому, что миРНК вырабатывается различными способами, включая тот, когда миРНК располагается в интроне (некодирующем участке мРНК) и транскрибируется в то же самое время, что и мРНК, и тот, когда миРНК располагается в межгенной области генома и транскрибируется индивидуально (Malone C.D. & Hannon G.J. Small RNAs as guardians of the genome. Cell 136, 656-68, 2009). миРНК, появившаяся на начальном этапе, как описано выше, известна как первичная микроРНК (miR). Первичная miR подвергается процессингу в miR-предшественник (предшественник миРНК или пре-miR), к примеру, под действием РНКазы, известной как внутриядерная Drosha (Bartel D.P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136, 215-33, 2009). Пре-miR имеет структуру РНК-шпильки и состоит примерно из 70-80 нуклеотидов. В клеточном ядре пре-miR транспортируется из ядра в цитозоль белком экспортин и т.п. и подвергается дальнейшему процессингу в цитозоле другой РНКазой, известной как Dicer, при этом образуется двухцепочечная зрелая микроРНК (в дальнейшем miR при описании без определителя означает зрелую miR), состоящая из 16-27 нуклеотидов. Одна из нитей двухцепочечной РНК miR отделяется, активируется при связывании с рибонуклеопротеидным комплексом RISC и связывается с целевой мРНК в соответствии с последовательностью miR.
Как правило, в мРНК выделяются в основном три участка на основании того, участвуют они или нет в кодировании белка: кодирующая область, содержащая информацию по трансляции кодируемого белка, и области 5′-UTR (нетранслируемая область)
и 3′-UTR, которые не несут никакой информации по кодированию белка. В то время как киРНК, которая индуцирует расщепление целевой мРНК с комплементарной последовательностью, действует независимо от 5′-UTR, 3′-UTR и кодирующей области мРНК, miR связывается главным образом с 3′-UTR (Carthew R.W. & Sontheimer E.J. Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 136, 642-55, 2009; Bartel D.P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136, 215-33, 2009).
Наряду с различием в положении места связывания с мРНК, характерное отличие между киРНК и миРНК состоит в том, что киРНК связывается главным образом с мРНК, последовательность которой комплементарна всей последовательности siРНК, тогда как миРНК распознает целевую мРНК прежде всего через последовательность посадочного участка (seed region), располагающегося на 2-8 нуклеотидов от 5′-конца миРНК и имеющего ограниченную длину. Таким образом, даже если не вся последовательность миРНК полностью комплементарна последовательности мишени и содержит некомплементарную часть последовательности, некомплементарная часть последовательности не влияет на активность миРНК (Bartel D.P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136, 215-33, 2009). Поскольку посадочный участок имеет длину в 6-8 нуклеотидов, то существует много таких различных мРНК, у которых 3′-UTR содержит последовательность, комплементарную посадочному участку, причем по этому участку можно одновременно контролировать несколько различных мРНК, используя всего одну миРНК. Эта особенность миРНК позволяет ей функционировать в качестве эффективного регулятора при управлении многими аспектами клеточной физиологии, включая деление, рост, дифференцировку и гибель клеток. Кроме того, функция миРНК в качестве регулятора дает преимущество в достижении эффективного противоракового действия. Это объясняется тем, что миРНК может одновременно ингибировать экспрессию целого ряда онкогенов, тогда как киРНК обычно ингибирует экспрессию лишь одного гена.
У многих мРНК область 3′-UTR содержит такую часть, с которой может связываться одна или несколько миРНК. По биоинформатическим расчетам известно, что около 30% всех мРНК регулируются миРНК.
То, что миРНК действует в качестве главного регулятора в сигнальных путях, видно из того, что миРНК играет важную роль в значительных заболеваниях, включая рак (MacFarlane L.-A. & Murphy P.R. MicroRNA: biogenesis, function and role in cancer. Current Genomics 11, 537-561, 2010; Malone C.D. & Hannon G.J. Small RNAs as guardians of the genome. Cell 136, 656-68, 2009; Nicoloso M.S., Spizzo R., Shimizu M., Rossi S. & Calin G.A. MicroRNAs - the micro steering wheel of tumour metastases. Nat Rev Cancer 9, 293-302, 2009; Landi D., Gemignani F. & Landi S. Role of variations within microRNA-binding sites in cancer. Mutagenesis 27, 205-10, 2012). Так, некоторые исследования показали, что профили экспрессии миРНК в раковых клетках сильно отличаются от профилей экспрессии миРНК в нормальных клетках. Кроме того, известно, что профили экспрессии миРНК сильно различаются в зависимости от тех первичных органов, в которых возник рак. В частности, при различных раковых заболеваниях, включая рак легких, рак печени, рак кожи и рак крови, проявляются характерные профили экспрессии миРНК в соответствии с первичными органами, указывая на то, что миРНК играет важную роль в биологии рака. В частности, известно, что уровень экспрессии миРНК в раковых клетках обычно ниже, чем уровень её экспрессии в нормальных клетках.
Исходя из тесной связи миРНК с раком, в последнее время предпринимались попытки использовать миРНК в качестве противораковых терапевтических средств. Так, миРНК под названием “miR-34a” проходит клинические испытания для проверки её способности ингибировать пролиферацию раковых клеток и индуцировать апоптоз раковых клеток (Wiggins J.F. et al. Development of a lung cancer therapeutic based on the tumor suppressor microRNA-34. Cancer Res 70, 5923-30, 2010; Bader A.G. et al. miR-34 Regulated Genes and Pathways as Targets for Therapeutic Intervention. Google Patents, 2009; Hermeking H. The miR-34 family in cancer and apoptosis. Cell Death Differ 17, 193-9, 2010; Chang T.C. et al. Transactivation of miR-34a by p53 broadly influences gene expression and promotes apoptosis. Mol Cell 26, 745-52, 2007).
Соответственно, авторы настоящего изобретения приложили значительные усилия для идентификации миРНК, обладающих лучшей способностью к ингибированию пролиферации раковых клеток и индуцированию апоптоза раковых клеток, чем miR-34a, которая проходит клинические испытания. В результате авторы настоящего изобретения идентифицировали miR-3670, miR-8078 и miR-4477a, которые обладают превосходной противораковой эффективностью, и обнаружили, что эти миРНК проявляют противораковые эффекты путем эффективного ингибирования экспрессии ряда генов, известных как онкогены, и тем самым совершили настоящее изобретение.
CУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая проблема
Целью настоящего изобретения является идентификация миРНК, обладающей превосходной способностью к ингибированию пролиферации раковых клеток и индуцированию апоптоза раковых клеток, а также получение такой фармацевтической композиции для лечения рака, которая содержит миРНК в качестве активного ингредиента.
Техническое решение
Для достижения вышеуказанной цели настоящим изобретением предусмотрена композиция для лечения рака, которая содержит в качестве активного ингредиента одну или несколько миРНК, выбранных из группы, состоящей из miR-3670, miR-8078 и miR-4477a.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На фиг. 1 представлены результаты измерения способности miR-34a, miR-100 и miR-125b ингибировать экспрессию белков. Для определения того, будет ли миРНК, использовавшаяся при построении библиотеки для скрининга, обладать активностью, из всей библиотеки скрининга были отобраны miR-34a, miR-100 и miR-125b, как обычно, и каждый 3′-UTRs из тех мРНК, которые подвергаются сайленсингу этими миРНК, вставляли в 3′-UTR экспрессирующих люциферазу векторов и измеряли их способность ингибировать экспрессию белка.
На фиг. 2 представлены результаты, полученные при обработке раковых клеток легких NCI-H460 библиотекой для скрининга, состоящей примерно из 1700 различных миРНК, количественном определении роста клеток с помощью реагента Resazurin и выражении результатов определения в виде относительных значений роста.
На фиг. 3 представлены результаты, полученные при отборе около 50 различных миРНК, проявляющих отличную эффективность на клетках линии NCI-H460, и измерении относительной способности к ингибированию роста раковых клеток у отобранных миРНК с помощью реагента WST-1.
На фиг. 4 представлены результаты, полученные при трансфекции каждой из miR-34a, miR-3670, miR-8078 и miR-4477a в клетки раковой линии легких, окрашивании клеток с помощью FITC-меченного Annexin V и анализе окрашенных клеток методом проточной цитометрии для определения апоптотического эффекта этих миРНК на клетки раковой линии легких.
На фиг. 5 представлены результаты, полученные при трансфекции каждой миРНК в клетки раковой линии легких, культивировании клеток на мягком агаре в течение 2 недель и измерении влияния миРНК на колониеобразующую способность клеток раковой линии легких.
На фиг. 6 представлены результаты, полученные при отборе целевых кандидатов с помощью программного обеспечения для прогнозирования мишеней миРНК и выражении апоптотической способности киРНК, нацеленных на отобранных кандидатов, в виде величины Z (Z-score).
На фиг. 7 представлены результаты кПЦР, полученные при анализе степени, в которой миРНК ингибирует экспрессию генов, приведенных на фиг. 6.
На фиг. 8 представлены результаты, полученные при клонировании 3′-UTR генов, приведенных на фиг. 6, в 3′-UTR люциферазы, и измерении степени, в которой миРНК ингибирует экспрессию белка люциферазы.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Если не указано иначе, все используемые здесь технические и научные термины имеют те же значения, которые обычно понимаются рядовыми специалистами в той области, к которой относится изобретение. Как правило, используемая здесь номенклатура хорошо известна и широко применяется в данной области.
В настоящем изобретении была предпринята попытка идентифицировать миРНК, обладающие лучшей эффективностью, чем miR-34a, которая, как известно, оказывает противораковое действие, и оценить противораковые эффекты идентифицированной миРНК.
В настоящем изобретении была синтезирована библиотека для скрининга, состоящая примерно из 1700 миРНК (табл. 1). Клетки NCI-H460 (линия раковых клеток легких) обрабатывали библиотекой для скрининга и измеряли способность этих миРНК ингибировать рост раковых клеток. При этом были идентифицированы miR-3670, miR-8078 и miR-4477a, которые проявляют лучшую эффективность, чем miR-34a, и имеют следующие нуклеотидные последовательности (табл. 3). Как оказалось, идентифицированные миРНК обладают отличным противораковым действием (фиг. 4-8).
Итак, настоящее изобретение направлено на фармацевтическую композицию для лечения рака, которая включает в качестве активного ингредиента одну или несколько миРНК, выбранных из группы, состоящей из miR-3670, miR-8078 и miR-4477a.
В настоящем изобретении miR-3670 может содержать в качестве активного ингредиента двухцепочечную РНК с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 67.
В настоящем изобретении miR-4477a может содержать в качестве активного ингредиента двухцепочечную РНК с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 68.
В настоящем изобретении miR-8078 может содержать в качестве активного ингредиента двухцепочечную РНК с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 66 или SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 69.
Иными словами, матричная нить miR-3670 по настоящему изобретению может быть представлена SEQ ID NO: 35:
5′-AGAGCUCACAGCUGUCCUUCUCUA-3′ (MIMAT0018093, SEQ ID NO: 35).
Несмотря на то, что миРНК, которая активна in vivo, является одноцепочечной, она должна поступать в клетки в двухцепочечном виде вместе с нуклеотидной последовательностью такой же длины с тем, чтобы она связывалась с RISC. При этом антисмысловая последовательность, которая связывается с этой последовательностью, должна быть комплементарна активной последовательности. Комплементарная последовательность может быть идеальной комплементарной последовательностью или эндогенной последовательностью. Нуклеотиды, располагающиеся либо на 3′-конце каждой двухцепочечной последовательности, либо на 3′-конце одной нити, могут не связываться с нуклеотидами антисмысловой последовательности, и такие нуклеотиды известны как 3′-выступающие. Двухцепочечная последовательность может содержать 3′-выступающий конец.
Иными словами, идеальная комплементарная последовательность miR-3670 может быть представлена SEQ ID NO: 36:
5′-GAGAAGGACAGCUGUGAGCUCUUU-3′ (SEQ ID NO: 36).
А эндогенная комплементарная последовательность miR-3670 может быть представлена SEQ ID NO: 67:
5′-GACUGGUAUAGCUGCUUUUGGAGCCUCA-3′ (SEQ ID NO: 67).
Как описано выше в разделе «Уровень техники», главным фактором активности является посадочная последовательность, соответствующая 8-9 нуклеотидам, считая от второго нуклеотида активной последовательности миРНК. Длинная двухцепочечная последовательность, включающая посадочный участок, может использоваться для получения двухцепочечной РНК.
Аналогично miR-3670, активные последовательности miR-4477a и miR-8078 и комплементарные последовательности для формирования из них двухцепочечных последовательностей могут быть представлены следующими последовательностями. Эти двухцепочечные последовательности при образовании длинных двухцепочечных последовательностей могут содержать 3′-выступающий конец, как описано выше, а также могут содержать посадочный участок.
miR-4477a
5′-CUAUUAAGGACAUUUGUGAUUC-3′ (MIMAT0019004, SEQ ID NO: 43).
Идеальная комплементарная последовательность miR-4477a:
5′-AUCACAAAUGUCCUUAAUAGUU-3′ (SEQ ID NO: 44).
Эндогенная комплементарная последовательность miR-4477a:
5′-AUCACAAAUGUCCUUAAUGGCA-3′ (SEQ ID NO: 68).
miR-8078
5′-GGUCUAGGCCCGGUGAGAGACUC-3′ (MIMAT0031005, SEQ ID NO: 65).
Идеальная комплементарная последовательность miR-8078:
5′-GUCUCUCACCGGGCCUAGACCUU-3′ (SEQ ID NO: 66).
Эндогенная комплементарная последовательность miR-8078:
5′-CUCCACCGGGCUGACCGGCCUG-3′ (SEQ ID NO: 69).
В настоящем изобретении было обнаружено, что миРНК, идентифицированные при скрининге библиотеки, проявляют противораковые эффекты, контролируя те гены, которые вообще играют важную роль в индукции, появлении и росте раковых клеток. миРНК характеризуются тем, что одна миРНК может одновременно контролировать экспрессию целого ряда мРНК в одно и то же время. Такая особенность обнаруживалась и в настоящем изобретении, причем она полезна для разработки новых противораковых препаратов на основе олигонуклеотидов.
Было обнаружено, что miR-3670 по настоящему изобретению ингибирует экспрессию CBX4, NRAS, CASR, TXLNA, SNIP1, HNF1A, FZD4, TRIB1, ADMA19 и CKAP5, тогда как miR-8078 ингибирует экспрессию GREB1, HECTD3 и RIPK4, а miR-4477a ингибирует экспрессию STIL, KIF11, AKAP11 и FAM120A (фиг. 6).
Известно, что гены-мишени, которые ингибируются миРНК по настоящему изобретению, несут следующие функции.
Так, известно, что CBX4 (polycomb chromobox 4) участвует в ангиогенезе опухолей и стимуляции метастазирования опухолей, а NRAS играет важную роль в росте опухолей и делении клеток (Orouji E. et al. MAP Kinase pathway gene copy alterations in NRAS/BRAF wild-type advanced melanoma. Int J Cancer (2015); Zheng C. et al. MicroRNA-195 functions as a tumor suppressor by inhibiting CBX4 in hepatocellular carcinoma. Oncol Rep 33, 1115-22 (2015); Jiao H.K. et al. Prognostic significance of Cbx4 expression and its beneficial effect for transarterial chemoembolization in hepatocellular carcinoma. Cell Death Dis 6, e1689 (2015); Ohashi K. et al. Characteristics of lung cancers harboring NRAS mutations. Clin Cancer Res 19, 2584-91 (2013)).
Установлено, что CASR гиперэкспрессируется в опухолях и необходим для метастазирования опухолей, а TXLNA связан с ростом и метастазированием опухолей. Приведенные клинические результаты показали, что группа пациентов с высоким уровнем экспрессии TXLNA проявляет низкую выживаемость (Mashidori T., Shirataki H., Kamai T., Nakamura F. & Yoshida K. Increased alpha-taxilin protein expression is associated with the metastatic and invasive potential of renal cell cancer. Biomed Res 32, 103-10 (2011); Tennakoon S., Aggarwal A. & Kallay E. The calcium-sensing receptor and the hallmarks of cancer. Biochim Biophys Acta (2015); Ohtomo N. et al. Expression of alpha-taxilin in hepatocellular carcinoma correlates with growth activity and malignant potential of the tumor. Int J Oncol 37, 1417-23 (2010)).
SNIP1, известный как транскрипционный коактиватор, стимулирует экспрессию циклина D1, который необходим для роста и деления клеток. Известно, что группа пациентов с высоким уровнем экспрессии SNIP1 отличается плохим прогнозом. Кроме того, известно, что SNIP1 связывается с c-Myc, функционирующим в качестве главного регулятора пролиферации клеток, и при этом стимулирует рост опухолей (Li Q. et al. SNIP1: a new activator of HSE signaling pathway. Mol Cell Biochem 362, 1-6 (2012); Fujii M. et al. SNIP1 is a candidate modifier of the transcriptional activity of c-Myc on E box-dependent target genes. Mol Cell 24, 771-83 (2006); Roche K.C., Rocha S., Bracken C.P. & Perkins N.D. Regulation of ATR-dependent pathways by the FHA domain containing protein SNIP1. Oncogene 26, 4523-30 (2007); Jeon H.S. et al. High expression of SNIP1 correlates with poor prognosis in non-small cell lung cancer and SNIP1 interferes with the recruitment of HDAC1 to RB in vitro. Lung Cancer 82, 24-30 (2013); Liang X. et al. Hypoxia-inducible factor-1 alpha, in association with TWIST2 and SNIP1, is a critical prognostic factor in patients with tongue squamous cell carcinoma. Oral Oncol 47, 92-7 (2011)).
HNF1A и FZD4 являются компонентами сигнального пути Wnt, который глубоко вовлечен в росте опухолей и выживаемости. Сигнальные пути Wnt интенсивно изучались в биологии опухолей, и их значение широко известно. Известно, что TRIB1 играет роль в ингибировании роста, метастазирования и апоптоза опухолевых клеток и в регуляции сигнального пути MAPK, который является основным сигнальным путем роста опухолей (Pecina-Slaus N. et al. Wnt signaling transcription factors TCF-1 and LEF-1 are upregulated in malignant astrocytic brain tumors. Histol Histopathol 29, 1557-64 (2014); Ueno K. et al. Tumor suppressor microRNA-493 decreases cell motility and migration ability in human bladder cancer cells by downregulating RhoC and FZD4. Mol Cancer Ther 11, 244-53 (2012); Lin Z.Y. et al. MicroRNA-224 inhibits progression of human prostate cancer by downregulating TRIB1. Int J Cancer 135, 541-50 (2014); Soubeyrand S., Naing T., Martinuk A. & McPherson R. ERK1/2 regulates hepatocyte Trib1 in response to mitochondrial dysfunction. Biochim Biophys Acta 1833, 3405-14 (2013)).
ADAM19 - это белок, распределенный в клеточной мембране, который выполняет различные биологические функции, включая взаимодействия между клетками и взаимодействия между клетками и внеклеточным матриксом. Как известно в биологии опухолей, ADAM19 тесно связан с ростом и метастазированием опухолей. В настоящем изобретении посредством функционального скрининга генов было установлено, что ген CKAP5, который играет важную роль в выживании опухолей, контролируется миРНК. GREB1 связан с сигнальными путями в тканях или опухолях, реагирующих на гормоны, и гиперэкспрессируется в различных опухолевых клетках, стимулируя рост клеток (Zhang Q. et al. Role of microRNA-30c targeting ADAM19 in colorectal cancer. PLoS One 10, e0120698 (2015); Shan N., Shen L., Wang J., He D. & Duan C. MiR-153 inhibits migration and invasion of human non-small-cell lung cancer by targeting ADAM19. Biochem Biophys Res Commun 456, 385-91 (2015); Martens-de Kemp S.R. et al. Functional genetic screens identify genes essential for tumor cell survival in head and neck and lung cancer. Clin Cancer Res 19, 1994-2003 (2013); Rae J.M. et al. GREB1 is a novel androgen-regulated gene required for prostate cancer growth. Prostate 66, 886-94 (2006); Zhang L. et al. Development of transcriptomic biomarker signature in human saliva to detect lung cancer. Cell Mol Life Sci 69, 3341-50 (2012); Laviolette L.A., Hodgkinson K.M., Minhas N., Perez-Iratxeta C. & Vanderhyden B.C. 17beta-estradiol upregulates GREB1 and accelerates ovarian tumor progression in vivo. Int J Cancer 135, 1072-84 (2014)).
HECTD3 является убиквитин-лигазой E3, которая присоединяет полиубиквитин к каспазе-8, запускающей апоптоз, вызывая деградацию каспазы-8, тем самым ингибируя апоптоз опухолевых клеток. Также известно, что HECTD3 стабилизирует белок MALT1 и тем самым повышает устойчивость к противораковым препаратам группы цисплатина. RIPK4 представляет собой взаимодействующую с рецептором протеинкиназу 4, которая индуцирует накопление сигнального фактора роста клеток β-катенина и активирует сигнальный путь Wnt. Известно, что искусственное удаление RIPK4 может ингибировать рост опухолей на моделях рака у животных (Li Y. et al. The HECTD3 E3 ubiquitin ligase facilitates cancer cell survival by promoting K63-linked polyubiquitination of caspase-8. Cell Death Dis 4, e935 (2013); Li Y. et al. The HECTD3 E3 ubiquitin ligase suppresses cisplatin-induced apoptosis via stabilizing MALT1. Neoplasia 15, 39-48 (2013); Huang X. et al. Phosphorylation of Dishevelled by protein kinase RIPK4 regulates Wnt signaling. Science 339, 1441-5 (2013)).
Ген STIL, который является существенным фактором в переходе из фазы G2 в фазу M в клеточном цикле, сильно экспрессируется в различных клетках и необходим для роста и выживания опухолей. Известно, что KIF11 также необходим для роста и метастазирования опухолей, а ингибирование активности KIF11 может ингибировать рост опухолей (Erez A. et al. Sil overexpression in lung cancer characterizes tumors with increased mitotic activity. Oncogene 23, 5371-7 (2004); Erez A. et al. The SIL gene is essential for mitotic entry and survival of cancer cells. Cancer Res 67, 4022-7 (2007); Tang Y., Orth J.D., Xie T. & Mitchison T.J. Rapid induction of apoptosis during Kinesin-5 inhibitor-induced mitotic arrest in HL60 cells. Cancer Lett 310, 15-24 (2011); Venere M. et al. The mitotic kinesin KIF11 is a driver of invasion, proliferation, and self-renewal in glioblastoma. Sci Transl Med 7, 304ra143 (2015)).
AKAP11, который связывается с протеинкиназой A (PKA) и повышает активность PKA, также связывается с бета-GSK-3 и усиливает опосредованное PKA фосфорилирование GSK-3. Фосфорилированный бета-GSK-3 теряет свою активность, что является основным механизмом, который распознается клетками как сигнал стимуляции роста и индуцирует рост опухолей. Опухолевые клетки подвергаются различным стрессовым воздействиям, как-то кислотным условиям, условиям нехватки кислорода и т.п., поэтому они поддерживают механизм, при котором гибель опухолевых клеток ингибируется даже при таких тяжелых условиях. Например, известно, что FAM120A, являющийся РНК-связывающим белком, активирует киназы типа Src, ингибируя апоптоз клеток и повышая устойчивость к лекарственным средствам (Logue J.S. et al. AKAP220 protein organizes signaling elements that impact cell migration. J Biol Chem 286, 39269-81 (2011); Whiting J.L. et al. Protein kinase A opposes the phosphorylation-dependent recruitment of glycogen synthase kinase 3beta to A-kinase anchoring protein 220. J Biol Chem 290, 19445-57 (2015); Tanji C. et al. A-kinase anchoring protein AKAP220 binds to glycogen synthase kinase-3beta (GSK-3beta) and mediates protein kinase A-dependent inhibition of GSK-3beta. J Biol Chem 277, 36955-61 (2002); Tanaka M. et al. A novel RNA-binding protein, Ossa/C9orf10, regulates activity of Src kinases to protect cells from oxidative stress-induced apoptosis. Mol Cell Biol 29, 402-13 (2009); Bartolome R.A. et al. IL13 receptor alpha2 signaling requires a scaffold protein, FAM120A, to activate the FAK and PI3K pathways in colon cancer metastasis. Cancer Res 75, 2434-44 (2015)).
В настоящем изобретении было показано, что при снижении внутриклеточного содержания вышеописанных генов с помощью киРНК ингибируется рост клеток, как и при использовании miR-3670, miR4477a или miR-8078 (фиг. 6). Кроме того, результаты кПЦР показали, что при введении miR-3670, miR-4477a или miR-8078 в раковые клетки легких снижаются уровни экспрессии мРНК этих генов (фиг. 7). Кроме того, результаты определения люциферазы показали, что именно на эти вышеописанные гены непосредственно воздействует miR-3670, miR-4477a или miR-8078 (фиг. 8). Это говорит о том, что miR-3670, miR-4477a или miR-8078 прямо и одновременно ингибируют экспрессию различных генов, важных для роста и выживания опухолевых клеток, и тем самым индуцируют апоптоз опухолевых клеток.
В настоящем изобретении рак может представлять собой одно или несколько раковых заболеваний, выбранных из группы, состоящей из первичного рака типа рака легких, рака печени, рака желудка, колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака желчного пузыря и желчных протоков, рака молочной железы, лейкемии, рака пищевода, неходжкинской лимфомы, рака щитовидной железы, рака шейки матки или рака кожи; метастатической карциномы, возникающей при метастазировании в другие органы из исходного места первичного рака; и неопластических заболеваний, вызванных аномально чрезмерным усилением деления клеток, но не ограничивается этим.
Последовательность миРНК, которая может применяться в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции для лечения рака по настоящему изобретению, представляет собой последовательность, происходящую из генома человека, но это может быть и последовательность миРНК, полученная из генома других животных, не ограничивая происхождение миРНК геномом человека.
В настоящем изобретении миРНК может применяться в виде различных подобий миРНК, дающих биологически эквивалентный эффект. Например, можно использовать модифицированную миРНК, включающую последовательность миРНК, содержащую тот же посадочный участок. При этом можно уменьшить длину SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, а также можно использовать укороченную миРНК, состоящую из 15 нуклеотидов.
В настоящем изобретении аналоги миРНК могут частично содержать фосфоротиоатную структуру, в которой структура фосфатного остова РНК замещена другим элементом типа серы. Кроме того, можно использовать и такие, которые получены при полной или частичной замене РНК молекулой ДНК, ПНК (пептидной нуклеиновой кислоты) или LNA (блокированной нуклеиновой кислоты). Кроме того, можно использовать и такие, которые получены путем замещения 2′-гидроксильной группы сахара в РНК различными функциональными структурами. Такие модификации включают, без ограничения, метилирование, метоксилирование, фторирование и т.п.
В настоящем изобретении миРНК не ограничивается зрелой миРНК и двухцепочечной РНК происходящих из неё имитаций миРНК, а может применяться в виде предшественника миРНК. Предшественники миРНК также могут быть получены при замещении вышеописанной структуры фосфатного остова РНК, полной или частичной замене нуклеиновой кислоты РНК молекулой ДНК, ПНК или LNA либо модификации
2′-гидроксильной группы сахара в РНК.
В настоящем изобретении миРНК может применяться в виде предшественника миРНК или первичной миРНК (pri-miRNA), которые можно синтезировать химическим методом или доставить в клетки в виде плазмиды с тем, чтобы их экспрессировать.
Примеры способов доставки миРНК в клетки, культивируемые в культуральных чашках, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают способ с использованием смеси миРНК и катионного липида, способ доставки миРНК в клетки при электрическом воздействии и способ с использованием вируса, но не ограничиваются этим.
Фармацевтическая композиция для лечения рака, включающая миРНК настоящего изобретения в качестве активного ингредиента, может дополнительно включать в себя фармацевтически приемлемый носитель и может быть составлена вместе с носителем.
В настоящем изобретении термин “фармацевтически приемлемый носитель” означает такой носитель или разбавитель, который не ухудшает биологическую активность и характеристики вводимого соединения без раздражения организма. В качестве фармацевтически приемлемого носителя в композиции, составленной в виде жидкого раствора, используется стерильный и биосовместимый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой физиологический раствор, стерильную воду, раствор Рингера, забуференный физраствор, раствор альбумина для инъекций, раствор декстрозы, раствор мальтодекстрина, глицерин, этанол или смесь из двух или нескольких из них. Кроме того, композиции настоящего изобретения могут, при необходимости, содержать другие стандартные добавки, включая антиоксиданты, буферы и бактериостатические средства. Кроме того, композиции настоящего изобретения могут быть составлена в виде форм для инъекций типа водных растворов, суспензий или эмульсий с помощью разбавителей, диспергирующих средств, поверхностно-активных веществ, связующих и смазывающих веществ. Кроме того, композиции по настоящему изобретению могут быть составлены в виде пилюль, капсул, гранул или таблеток.
Композиции для профилактики или лечения рака, которые включают миРНК по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, могут применяться в виде любой лекарственной формы, содержащей её в качестве активного ингредиента, и могут быть приготовлены в виде пероральной или парентеральной формы. Фармацевтические формы настоящего изобретения включают формы, подходящие для перорального, ректального, назального, местного (включая буккальное и подъязычное), подкожного, вагинального или парентерального (включая внутримышечное, подкожное и внутривенное) введения, или же формы, подходящие для введения путем ингаляции или вдувания.
Примеры пероральных форм, содержащих композицию настоящего изобретения в качестве активного ингредиента, включают таблетки, пастилки, лепешки, водные или эмульгированные суспензии, порошки, гранулы, эмульсии, твердые или мягкие капсулы, сиропы или эликсиры. Такие формы, как таблетки или капсулы, могут включать в себя связующее вещество типа лактозы, сахарозы, сорбита, маннита, крахмала, амилопектина, целлюлозы или желатина, наполнитель типа дикальцийфосфата, разрыхлитель типа кукурузного крахмала или картофельного крахмала и смазывающее вещество типа стеарата магния, стеарата кальция, стеарилфумарата натрия или полиэтиленгликолевого воска. Формы типа капсул могут содержать, помимо вышеупомянутых веществ, жидкий носитель типа жирного (нелетучего) масла.
Парентеральные формы, содержащие композицию настоящего изобретения в качестве активного ингредиента, включают инъекционные формы для подкожных, внутривенных или внутримышечных инъекций, свечи или вдыхаемые через респираторные органы спреи типа аэрозолей. Формы для инъекций могут быть получены путем смешивания композиции настоящего изобретения со стабилизатором или буфером в воде с получением раствора или суспензии и внесения раствора или суспензии в ампулы или флаконы для получения стандартные дозовых форм. Формы типа свечей включают суппозитории или удерживающие клизмы, напр., содержащие стандартные основания свечей типа масла какао или другие глицериды. Для распыляемых форм типа аэрозолей можно использовать сжатый газ-вытеснитель для распыления диспергированного в воде концентрата или влажного порошка в сочетании с добавками.
ПРИМЕРЫ
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно на примерах. Рядовым специалистам в данной области должно быть ясно, что эти примеры приводятся только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Пример 1. Конструирование библиотеки миРНК для скрининга
Исходя из структуры типа стебель и петля у 21 варианта последовательностей миРНК человека, полученных из базы данных miRBase по миРНК (www.mirbase.org), синтезировали библиотеку для скрининга, состоящую примерно из 1700 различных миРНК, в виде последовательностей двухцепочечных миРНК методом твердофазного синтеза, который применяется при традиционном синтезе олигонуклеотидов. Каждую нить синтезированных миРНК очищали методом обратнофазовой хроматографии на смоле C18. Все синтезированные нити миРНК подвергали анализу методом масс-спектрометрии MALDI-TOF для определения того, что были синтезированы требуемые последовательности. Для получения двухцепочечных миРНК комплементарные нити нагревали в присутствии соли при 95°C в течение 2 минут, а затем медленно охлаждали для получения двойных нитей.
Таблица 1. Последовательности миРНК
Пример 2. Измерение активности образцов из библиотеки миРНК
Для того, чтобы определить, будут ли активными двухцепочечные миРНК, синтезированные в Примере 1, из библиотеки, состоящей примерно из 1700 различных миРНК, были отобраны miR-34a, miR-100 и miR-125b. Выбранные миРНК были отобраны потому, что имеется много исследований по целевым мРНК, функции и экспрессия которых должны контролироваться, а также по участкам, связывающимся с 3′-UTR мРНК. Участки 3′-UTR каждой из мРНК Bcl2, mTOR и Lin28b, экспрессия которых контролируется каждым из miR-34a, miR-100 и miR-125b, вставляли в 3′-UTR вектора люциферазы светлячков, получая при этом вектор, соответствующий каждой из миРНК. Каждый вектор и контрольный miR либо miR-34a, miR-100 или miR-125b, соответствующие каждому вектору, подвергали совместной трансфекции в клетки HEK-293T с помощью Lipofectamine 2000 (Lipofectamine 2000, Invitrogen), который является реагентом для внутриклеточной доставки олигонуклеотидов (в тройных повторах), и культивировали клетки в условиях 37°C и 5% (об/об) CO2 в течение 24 часов. Для определения активности синтезированных миРНК измеряли активность люциферазы на люминометре (Thermo Scientific) (фиг.1).
Пример 3. Скрининг для идентификации тех микроРНК, которые ингибируют пролиферацию раковых клеток легких
Вносили по ~3000-10000 клеток NCI-H460 в лунки 96-луночных планшетов и культивировали в условиях 37°C и 5% (об/об) CO2 в течение 24 часов, а затем эти клетки подвергали трансфекции каждой из миРНК, выбранных из библиотеки миРНК, при конечной концентрации 100 нМ, с помощью реагента RNAiMAX (Invitrogen). Поскольку трансфекцию каждой миРНК повторяли три раза, то готовили по три 96-луночных планшета на каждую миРНК. Далее клетки культивировали 24 часа в тех же условиях, что описаны выше, а затем измеряли значения флуоресценции, полученные при добавлении реагента Resazurin (Promega), на флуориметре (Tecan). Для сравнительной оценки способности миРНК ингибировать рост клеток рассчитывали среднее значение и стандартное отклонение из 96 значений, измеренных для 96-луночного планшета, а затем рассчитывали кратность стандартного отклонения (Z-score) измеряемой величины для каждой лунки (по каждой миРНК) от среднего значения по следующему уравнению:
где xi - значение, измеренное в данной лунке, μ - среднее из измеренных значений по всем лункам планшета, а σ - стандартное отклонение. Кратность стандартного отклонения zi для данной лунки есть среднее из значений, полученных для трех планшетов, причем сначала отбирали миРНК-кандидаты, проявляющие значения zi менее -2 (фиг. 2 и табл. 2).
Таблица 2. Последовательности первых отобранных миРНК
Пример 4. Второй скрининг для идентификации тех миРНК, которые ингибируют пролиферацию раковых клеток легких
Используя около 50 миРНК-кандидатов, полученных при первом скрининге, проводили второй скрининг с повышенной точностью измерения. Эксперимент проводили в тех же условиях, что и первый скрининг, за исключением того, что вместо реагента Resazurin для измерения потенциала пролиферации клеток использовали реагент WST-1 (Roche). WST-1 обладает преимуществом перед ресазурином в том, что можно более точно количественно измерить интенсивность сигналов. Значения, полученные при измерении способности каждой миРНК ингибировать пролиферацию клеток, выражали в виде относительных значений по сравнению с контролем, а результаты представлены на фиг. 3. В качестве положительного контроля использовали miR-34a.
Пример 5. Анализ способности индуцировать апоптоз клеток
Метод, используемый при скрининге, заключается в измерении относительного ингибирования пролиферации клеток путем количественного измерения количества клеток. Механизмы ингибирования пролиферации клеток включают снижение скорости деления клеток и индуцирование апоптоза. Для анализа механизма, по которому миРНК, выявленные в настоящем изобретении, ингибируют пролиферацию клеток, анализировали степень апоптоза методом активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS). В частности, в 6-луночные планшеты вносили клетки и трансфицировали в них миРНК с помощью реагента RNAiMAX, а затем культивировали клетки в тех же условиях, что описаны выше, в течение 48 часов. Далее клетки обрабатывали FITC-меченым Annexin V и анализировали на активируемом флуоресценцией сортировщике клеток (FACS) (фиг. 4). Результаты анализа показали, что клетки, обработанные каждой из miR-3670, miR-4477a и miR-8078, в основном погибли. Это говорит о том, что эффект ингибирования роста опухолевых клеток миРНК, идентифицированными при скрининге, является результатом индукции апоптоза (табл. 3).
Таблица 3. Последовательности окончательно отобранных миРНК
Пример 6. Ингибирование миРНК роста опухолевых клеток на мягком агаре
При культивировании опухолевых клеток на мягком агаре можно определить характеристики опухолевых клеток. Нормальные клетки требуют подложки типа культуральной чашки для роста, тогда как опухолевые клетки отличаются тем, что растут даже в такой среде, как мягкий агар, который не имеет физически сильной опоры. Используя эту характерную для опухолей особенность, исследовали колониеобразующую способность клеток на мягком агаре. Раковые клетки легких NCI-H460 обрабатывали контрольной miRNA и каждой из miR-34a, miR-8078, miR-3670, miR-4477a и miR-4765 и культивировали в течение 24 часов. Затем клетки смешивали с мягким агаром и культивировали в 6-луночных планшетах в течение 2 недель. Клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым и измеряли количество колоний в каждой группе (фиг. 5). При этом видно, что клетки, обработанные miR-8078 или miR-3670, почти или совсем не образовывали колоний, а клетки, обработанные miR-4477a, проявляли колониеобразующую способность, равную примерно 30% от контрольной группы.
Пример 7. Измерение ингибирующего эффекта миРНК на пролиферацию клеток после нокдауна целевой мРНК
мРНК мишени, экспрессия которой контролируется миРНК, имеет последовательность, комплементарную части последовательности миРНК. Для ингибирования мРНК особенно важна последовательность посадочного участка миРНК, так как последовательность посадочного участка связывается с мРНК, содержащей комплементарную ей последовательность, и ингибирует экспрессию гена. Однако, поскольку последовательность посадочного участка сравнительно короткая (8-9 нуклеотидов), то мРНК, которые являются мишенями миРНК, можно предсказать с помощью компьютерной программы. Однако известно, что даже при использовании компьютерных программ лишь некоторые из предсказанных мишеней являются существенными. Чтобы преодолеть этот недостаток, уменьшали внутриклеточное содержание генов-мишеней, предсказанных программой, с помощью киРНК, а затем определяли, будет ли ингибироваться рост клеток, тем самым отбирая целевые гены. Для прогнозирования целевых мРНК, которые должны быть мишенями миРНК, использовали программу TargetScan, которая обычно применяется в данной области для прогнозирования мишеней, и отобрали около 600 различных генов, которые были предсказаны как мишени miR-3670, miR-4477a или miR-8078. Для каждого из отобранных генов синтезировали 3 различных киРНК и проводили эксперимент таким же образом, как описано в примере 3, используя синтезированные киРНК. В частности, в 96-луночные планшеты вносили клетки, обрабатывали их каждой из киРНК, а затем культивировали в течение 48 часов, после чего измеряли пролиферационную способность клеток с помощью ресазурина. Таким же образом, как описано в примере 3, рассчитывали Z-показатели каждого гена из средних значений, измеренных для всех 1800 образцов (около 600 генов × три разных киРНК). Результаты представлены на фиг. 6.
Пример 8. Анализ мРНК, являющихся мишенями миРНК
миРНК действуют, ингибируя образование белка из мРНК и вызывая деградацию большинства мРНК-мишеней. Итак, в клетки трансфицируют миРНК и методом кПЦР анализируют внутриклеточное содержание тех мРНК, которые должны быть мишенями миРНК, определяя, будет ли уменьшаться их содержание, тем самым определяя, будет ли данная мРНК мишенью этой миРНК. Для того, чтобы определить, будет ли при введении в клетки миРНК существенно снижаться внутриклеточное содержание генов-мишеней, обнаруженных в примере 7, каждую из miR-3670, miR-4477a и miR-8078 трансфицировали в раковые клетки легких, которые затем культивировали в течение 48 часов, после чего из каждых клеток экстрагировали РНК и количественно измеряли содержание РНК в клетках (фиг. 7). При этом видно, что содержание тех мРНК, которые были предсказаны как мишени miR-3670, miR-4477a или miR-8078, значительно снижалось.
Пример 9. Исследование мРНК-мишеней люциферазным методом
миРНК связывается с 3′-UTR (нетранслируемой областью) мРНК-мишени и ингибирует образование белка из данной мРНК. Поэтому для прямого измерения взаимосвязи между миРНК и целевой мРНК обычно применяется люциферазный метод. По программе TargetScan была получена последовательность 3′-UTR, содержащая последовательность, связывающую миРНК. Для конструирования вектора последовательность 3′-UTR клонировали в 3'-UTR люциферазы светлячков, как описано выше в Примере 2. Полученный вектор и миРНК подвергали совместной трансфекции в эмбриональные клетки почек человека (HEK) и измеряли уровень экспрессии люциферазы вектора. Для коррекции на эффективность трансфекции также подвергали трансфекции люциферазу морской фиалки. После совместной трансфекции миРНК, люциферазы светлячков и люциферазы морской фиалки клетки культивировали в течение 48 часов, а затем измеряли люциферазную активность клеток на люминометре (фиг. 9). При этом видно, что целевая мРНК контролируется непосредственно соответствующей миРНК.
Промышленная применимость
Как описано выше, фармацевтическая композиция для лечения рака по настоящему изобретению содержит в качестве активного ингредиента одну или несколько миРНК, выбранных из группы, состоящей из miR-3670, miR-4477a и miR-8078. Фармацевтическая композиция настоящего изобретения проявляет лучшие противораковые эффекты по сравнению с miR-34a, которая в настоящее время проходит клинические испытания для определения пригодности в качестве противоракового средства, и другими фармацевтическими композициями для лечения рака, содержащими другие миРНК в качестве активных ингредиентов. Таким образом, фармацевтическая композиция настоящего изобретения может широко применяться в качестве противораковой композиции.
Хотя настоящее изобретение было подробно описано на конкретных примерах, однако специалистам в данной области должно быть ясно, что это описание приводится только для предпочтительного воплощения и не ограничивает объем настоящего изобретения. Таким образом, существенный объем настоящего изобретения будет определяться прилагаемой формулой изобретения и её эквивалентами.
Изобретение относится к области медицины. Предложена фармацевтическая композиция для лечения рака, включающая одну или несколько миРНК, выбранных из группы, состоящей из miR-3670 и miR-8078, где miR-3670 включает двухцепочечную РНК, представленную нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36, и miR-8078 включает двухцепочечную РНК, представленную нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 66. Изобретение обеспечивает ингибирование пролиферации и индуцирование апоптоза раковых клеток. 3 з.п. ф-лы, 8 ил., 3 табл., 9 пр.
1. Фармацевтическая композиция для лечения рака, которая включает в качестве активного ингредиента одну или несколько миРНК, выбранных из группы, состоящей из miR-3670 и miR-8078, где miR-3670 включает двухцепочечную РНК, представленную нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36, и miR-8078 включает двухцепочечную РНК, представленную нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 66.
2. Фармацевтическая композиция по п. 1, где миРНК индуцирует апоптоз раковых клеток при лечении рака.
3. Фармацевтическая композиция по п. 1, где рак представляет собой одно или несколько раковых заболеваний, выбранных из группы, состоящей из первичного рака типа рака легких, рака печени, рака желудка, колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака желчного пузыря и желчных протоков, рака молочной железы, лейкемии, рака пищевода, неходжкинской лимфомы, рака щитовидной железы, рака шейки матки или рака кожи, метастатической карциномы, возникающей при метастазировании в другие органы из исходного места первичного рака, и неопластических заболеваний, вызванных аномально чрезмерным усилением деления клеток.
4. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-3, где миРНК представляет собой миметик миРНК, где миметик миРНК выбран из группы, состоящей из миРНК, частично включающей фосфоротиоатную структуру, в которой фосфат каркасной структуры РНК замещен другим элементом, таким как сера, и миРНК, в которой 2’-гидроксильная группа сахара РНК замещена различными функциональными структурами, такими как метилирование, метоксилирование или фторирование.
WO 2014100252 A1, 26.06.2014 | |||
US 2014080894 A1, 20.03.2014 | |||
ON01910.NA, УСИЛИВАЮЩИЙ АКТИВНОСТЬ ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО АГЕНТА В РЕЗИСТЕНТНЫХ К ЛЕКАРСТВЕННЫМ СРЕДСТВАМ ОПУХОЛЯХ | 2008 |
|
RU2476239C2 |
Авторы
Даты
2019-04-25—Публикация
2016-02-25—Подача