ЭНАНТИОМЕРЫ 2-ГИДРОКСИПРОИЗВОДНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ Российский патент 2019 года по МПК C07C59/42 A61K31/19 A61P3/04 A61P3/06 A61P3/10 A61P35/00 A61P35/02 A61P9/00 A61P9/10 A61P9/12 

Настоящее изобретение относится к способу синтеза рацемических продуктов 2-гидроксипроизводных жирных кислот и разделения оптических изомеров [-] (который соответствует S-энантиомеру) и [+] (который соответствует R-энантиомеру), самим выделенным энантиомерам, содержащих их фармацевтическим композициям и применению указанных соединений в качестве лекарственных средств для лечения заболеваний, общая этиология которых основана на изменениях (независимо от их природы) липидов клеточной мембраны, таких как, например, изменения уровня, состава или структуры указанных липидов, а также для лечения заболеваний, при которых регулирование состава и структуры липидов в мембране может вызвать ремиссию патологического состояния. Терапевтический эффект достигается предпочтительно посредством регулирования (активации или ингибирования) активности фермента церамид:фосфохолинхолинфосфотрансферазы (также известного как сфингомиелинсинтаза, или ЕС 2.7.8.27 согласно номенклатуре ферментов IUBMB) или уровней продукта реакции, катализируемой указанным ферментом, - сфингомиелина (СМ). В результате активности указанного фермента, выработки СМ и накопления указанного продукта в мембране опухолевых клеток происходит повышение (вплоть до 600%) уровня глиофибриллярного кислого белка (ГФКБ) и снижение (вплоть до более чем на 90%) уровня фермента дигидрофолатредуктазы (ДГФР). Таким образом, как ГФКБ, так и ДГФР могут быть применены для определения терапевтической эффективности лекарственных средств для лечения заболеваний, обусловленных активностью сфингомиелинсинтазы или самим СМ. Настоящее изобретение также относится к разработке набора для обнаружения указанных заболеваний.

Кроме того, и фермент ЕС 2.7.8.27, и сфингомиелин (СМ) могут быть применены в качестве молекулярных маркеров действия соединений согласно настоящему изобретению в отношении вышеупомянутых заболеваний. Таким образом, настоящее изобретение также включает способ in vitro диагностики/прогнозирования указанных заболеваний на основании активности оценки регуляции активности или уровня указанного фермента ЕС 2.7.8.27 и/или уровня СМ, ГФКБ или ДГФР, а также наборы, включающие специально разработанные средства для осуществления указанных диагностики/прогнозирования. Указанные способы и наборы будут основаны на определении изменений, вызванных лечением с применением молекул, упомянутых в настоящей заявке, или на возможности изменения вышеупомянутых химических соединений при применении указанных способов лечения.

Кроме того, фермент ЕС 2.7.8.27 и/или СМ могут быть применены в качестве терапевтических мишеней, на которые можно направить молекулы, которые способны обеспечивать измененное состояние и, таким образом, лечить такие патологические процессы, которые, возможно, уже развились или могут развиться в будущем в результате аномальной активности фермента ЕС 2.7.8.27 или аномального уровня СМ. Таким образом, как фермент ЕС 2.7.8.27, так и сам СМ могут быть применены в качестве основы для разработки способов скрининга (отбора) возможных соединений для получения молекул, которые, подобно, например, энантиомерам [-] (также известному как S) и [+] (соответствующему форме R) 2-гидроксипроизводных жирных кислот согласно настоящему изобретению, способны регулировать активность фермента ЕС 2.7.8.27 и/или уровня СМ, оказывая терапевтический эффект.

Таким образом, благодаря широкому спектру применения настоящее изобретение может быть в целом отнесено к области медицины и фармации. Необходимо отметить, что регулирующие органы в области фармации требуют наличия способов или наборов для мониторинга эффективности соединения, обладающего определенной терапевтической активностью, поэтому не только описание указанных соединений, но и описание их синтеза, их терапевтических возможностей и их обнаружения следует рассматривать как части настоящего изобретения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Клеточные мембраны представляют собой структуры, которые определяют целостность клеток и органелл внутри них. Большинство биологических процессов происходят в клетках или рядом с ними. Липиды не только играют структурную роль, но также регулируют активность важных процессов. Более того, регуляция липидного состава мембраны также влияет на расположение или функционирование важных белков, участвующих в управлении клеточной физиологией, таких как G-белки или РКС ( с соавт., 1995; с соавт., 1997; Yang с соавт., 2005; Martinez с соавт., 2005). Указанные и другие исследования демонстрируют важность липидов для управления важными клеточными функциями. Действительно, многие заболевания людей, такие как (среди прочих) рак, сердечно-сосудистые заболевания, нейродегенеративные процессы, ожирение, нарушения обмена веществ, воспаление, инфекционные заболевания и аутоиммунные заболевания, связывают с изменениями уровней или состава липидов, присутствующих в биологических мембранах, что также доказывает, что положительные эффекты лечения с применением других жирных кислот, отличных от предложенных в настоящем изобретении и которые регулируют состав и структуру липидов мембран, могут быть применены для обеспечения ремиссии указанных заболеваний ( с соавт., 2006).

Липиды, которые мы принимаем с пищей, регулируют липидный состав клеточных мембран (Alemany с соавт., 2007). В то же время различные физиологические и патологические состояния могут изменять липиды, присутствующие в клеточных мембранах (Buda с соавт., 1994; с соавт., 2006). Изменения липидного состава мембран могут влиять на клеточную сигнализацию, вызывая развитие заболеваний или их ремиссию ( с соавт., 2006).

Различные исследования, проведенные в последние годы, свидетельствуют о том, что липиды в мембране играют намного более важную роль, чем предполагалось до настоящего времени ( с соавт., 2008). Одним из примеров указанной важной роли служат рыбы, которые живут в реках с различной температурой: их липиды подвергаются важным изменениям (касающимся количества и видов липидов в мембране) при падении температуры от 20°С (летом) до 4°С (зимой) (Buda с соавт., 1994). Указанные изменения позволяют поддерживать работоспособность самых разных видов клеток. На основании этого авторы настоящего изобретения могут утверждать, что мембранные липиды могут определять правильность или неправильность функционирования многочисленных механизмов клеточной сигнализации. Учитывая, что пораженный заболеванием организм болен, поскольку больны его клетки, изменения липидов мембран могут вызывать возникновение заболеваний. Аналогичным образом, терапевтические, нутрицевтические или косметические составы, которые ориентированы на регулирование уровней липидов мембран, могут предотвращать и вызывать ремиссию (излечение) патологических процессов. Кроме того, многочисленные исследования свидетельствуют о том, что потребление насыщенных и транс-мононенасыщенных жиров связано с ухудшением здоровья. Сосудистые заболевания и опухоли в числе прочих непосредственно связаны с указанным видом липидов (Stender с соавт., 2004). Указанное ухудшение состояния организма может выражаться в появлении указанных и других видов заболеваний.

Клеточные мембраны образуют селективный барьер, через который клетка обменивается метаболитами и информацией с другими клетками и с внешней средой. Однако мембраны обладают и другими важными функциями на клеточном уровне. С одной стороны, указанные мембраны выступают в качестве носителя для белков, участвующих в приеме и передаче сообщений, которые управляют важными органическими параметрами. Указанные сообщения с помощью многочисленных гормонов, нейромедиаторов, цитокинов, факторов роста и т.д. активируют мембранные белки, которые распространяют полученный сигнал внутрь клетки с помощью других белков, некоторые из которых также расположены в мембране. Учитывая, что (1) указанные системы функционируют как каскады усиления, и что (2) мембранные липиды могут регулировать расположение и функционирование вышеуказанных белков, липидный состав мембран может оказывать значительное влияние на клеточные функции. Более конкретно, взаимодействие некоторых белков (известных как периферические белки, такие как G-белки, протеинкиназа С, белок Ras и т.д.) с клеточной мембраной зависит от липидного состава указанной мембраны ( с соавт., 2004; с соавт., 2008). С другой стороны, липидный состав клеточных мембран зависит от вида и количества принимаемых липидов (Perona с соавт., 2007). Отсюда может быть сделать вывод, что потребление липидов может регулировать липидный состав мембран, а это может в свою очередь регулировать взаимодействие (и, следовательно, активность) белков, важных для обеспечения клеточной сигнализации (Yang с соавт., 2005).

Тот факт, что мембранные липиды могут управлять клеточной сигнализацией, свидетельствует о том, что указанные липиды также могут регулировать физиологическое состояние клеток. Действительно, было описано как положительное, так и отрицательное влияние липидов на здоровье ( с соавт., 2006; с соавт., 2008). Предварительные исследования показали, что 2-гидроксиолеиновая кислота, которая представляет собой мононенасыщенную жирную кислоту, способна вызывать ремиссию некоторых патологических состояний, таких как избыточный вес, гипертония и рак (Alemany с соавт., 2004; с соавт., 2005; с соавт., 2008).

Сердечно-сосудистые заболевания часто связаны с гиперпролиферацией клеток, образующих сердечную и сосудистую ткань. Указанная гиперпролиферация сердечно-сосудистых клеток приводит к образованию отложений во внутреннем просвете сосудов и полостей сердечно-сосудистой системы, которые вызывают широкий диапазон заболеваний, таких как гипертония, артериосклероз, ишемическая болезнь, сердечные приступы и т.д. (Schwartz с соавт., 1985). Разработка лекарственного средства, которое позволяет предотвратить пролиферацию клеток, фактически была предложена для предотвращения и лечения сердечно-сосудистых заболеваний (Jackson с соавт., 1992).

Ожирение или избыточный вес являются результатом изменения баланса между поступлением энергии в организм и ее расходом, частично вследствие изменений механизмов, которые регулируют указанные процессы. С другой стороны, указанная патология характеризуется гиперплазией (увеличением числа клеток) или гипертрофией (увеличением их размера) клеток жировой ткани, то есть адипоцитов. Многие исследования свидетельствуют о том, что жирные кислоты, как свободные радикалы или как часть других молекул, могут влиять на ряд параметров, связанных с энергетическим гомеостазом, в том числе таких, как масса жира в организме, метаболизм липидов, термогенез или потребление ( с соавт., 2008). В этом смысле модификация жирных кислот может представлять собой способ регулирования энергетического гомеостаза и, следовательно, массы тела. Действительно, настоящее изобретение демонстрирует, как низкие уровни СМ в клетках связаны с повышенной клеточной пролиферацией, и что указанное изменение связано с патологическим состоянием клеток человека. Кроме того, регулирование фермента ЕС 2.7.8.27 с применением молекул, описанных в настоящем изобретении, может нормализовать уровни СМ в патологических клетках и таким образом способствовать ремиссии патофизиологических изменений, описанных в настоящей заявке. В случае метаболических патологий потребление липидов помимо ожирения также определяет возможность возникновения других патологических процессов, таких как гиперхолестеринемия, гипертриглицеридемия, диабет или метаболический синдром (Sloan с соавт., 2008).

Нейродегенеративные процессы приводят к возникновению ряда заболеваний с различными симптомами, но с общей особенностью, заключающейся в том, что указанные заболевания вызваны дегенерацией клеток центральной и/или периферической нервной системы. Некоторые из указанных нейродегенеративных процессов предполагают значительное снижение когнитивной способности пациентов, как в случае болезни Альцгеймера или старческого слабоумия. Другие нейродегенеративные процессы вызывают изменения двигательных способностей, как в случае болезни Паркинсона или различных видов склероза. Наконец, некоторые нейродегенеративные заболевания могут вызывать процессы, которые приводят к слепоте, проблемам со слухом, нарушению пространственной ориентации, перепадам настроения и т.д.

Одним из примеров хорошо охарактеризованного нейродегенеративного расстройства является болезнь Альцгеймера, в ходе которой наблюдается образование сенильных бляшек, состоящих из остатков неправильно переработанных мембранных белков (таких как β-амилоидный пептид), которые накапливаются на внешней поверхности клеток, и клубков нейрофиламентов тау-белка, которые появляются внутри клетки. Указанный процесс связан с изменениями метаболизма холестерина и возникающим в результате изменением уровней холестерина в клеточных мембранах (Sagin с соавт., 2008). Действительно, развитие указанного заболевания связано с другими заболеваниями, при которых были описаны изменения метаболизма липидов, в частности холестерина, как в случае сердечно-сосудистых заболеваний.

С другой стороны, склероз и другие нейродегенеративные процессы связаны с «демиелинизацией», конечным результатом которой является потеря липидов оболочкой нейрональных аксонов, что приводит к изменениям процесса распространения электрических сигналов, в котором задействованы указанные аксоны. Миелин представляет собой липидный слой вокруг аксонов многих нейронов и образован несколькими спиральными складками плазматической мембраны клеток глии (шванновских клеток). Исходя из всего вышеизложенного очевидно, что липиды играют очень важную роль в развитии нейродегенеративных заболеваний. Более того, было продемонстрировано, что неизмененные природные полиненасыщенные жирные кислоты оказывают умеренное профилактическое воздействие на развитие нейродегенеративных процессов (Lane с соавт., 2005).

Нарушения обмена веществ составляют группу патологий, характеризующихся накоплением или дефицитом некоторых молекул. Типичным примером является накопление холестерина и/или триглицеридов выше нормальных уровней. Повышение уровней холестерина и/или триглицеридов, как на системном (например, повышение уровней в плазме), так и на клеточном (например, в клеточных мембранах) уровне, связано с изменениями клеточной сигнализации, которые приводят к функциональным нарушениям на нескольких уровнях, и которые обычно обусловлены отклонениями в активности некоторых ферментов или управлении указанными белками. Было обнаружено, что одними из основных метаболических патологий являются гиперхолестеринемия (высокий уровень холестерина) и гипертриглицеридемия (высокий уровень триглицеридов). Для указанных заболеваний характерны повышенные показатели заболеваемости, развития осложнений и смертности, поэтому их лечение является первоочередной задачей. Кроме того, принимаемые липиды могут обуславливать появление диабета (Sloan с соавт., 2008).

Защитная роль некоторых ненасыщенных жирных кислот в отношении некоторых заболеваний уже была описана различными исследователями. Таким образом, ненасыщенные жирные кислоты замедляют развитие рака и обеспечивают положительные эффекты, направленные против развития сердечно-сосудистых заболеваний, нейродегенеративных патологий, патологий обмена веществ, ожирения, воспаления и т.д. (Trombetta с соавт., 2007; Jung с соавт., 2008; Florent с соавт., 2006). Однако фармакологическая активность указанных соединений сильно ограничена вследствие быстрого метаболизма и короткого периода полураспада в крови. Следовательно, необходимо разработать ненасыщенные жирные кислоты, которые характеризуются более медленным метаболизмом, приводящим к увеличению количества указанных кислот в клеточной мембране по сравнению с ненасыщенными жирными кислотами, применяемыми до сих пор, и облегчают взаимодействие между периферическими белками при клеточной сигнализации. Молекулы, описанные в настоящей заявке, соответствуют структурным характеристикам, которые обуславливают положительное воздействие некоторых природных жирных кислот на здоровье, в сочетании с молекулярными модификациями, которые усиливают воздействие первоначальных молекул и, кроме того, предотвращают их быстрый метаболизм, причем обе эти характеристики являются существенными для определения их фармакологической активности.

Говоря подробнее о важности липидов в клеточной мембране, следует заметить, что сфинголипиды или сфингофосфолипиды представляют собой важный класс липидов клеточной мембраны и наиболее распространенный класс липидов в тканях более сложных организмов. Молекулы сфинголипидов проявляют амфипатические свойства, то есть как гидрофобные, так и гидрофильные свойства, которые позволяют указанным молекулам играть важную роль в образовании биологических мембран. Некоторые из глюкосфинголипидов находятся на поверхности красных кровяных телец и в других клетках, действуя в качестве антигенов и определяя группы крови.

Таким образом, сфинголипиды очень важны с биологической точки зрения ввиду той роли, которую они играют в клеточной сигнализации. Если быть точным, СМ представляет собой вид сфинголипида, который в большом количестве содержится в клеточной мембране всех организмов (Huitema с соавт., 2004). Указанный липид, в основном, находится во внешнем монослое плазматической мембраны, где выполняет основную функцию в образовании микродоменов, известных как липидные рафты, которые являются специализированными частями клеточной мембраны с важными ролями в клеточной сигнализации, так как белки, которые взаимодействуют друг с другом благодаря сближению, которое происходит в результате их соединения с липидами, сконцентрированы в указанных доменах (Simons y Toomre, 2000). Фермент ЕС 2.7.8.27 отвечает за синтез СМ посредством переноса фосфохолина к первичной гидроксильной группе церамида с получением СМ и 1,2-диацилглицерола (ДАГ). Указанный фермент занимает центральное место в метаболизме сфинголипидов и глицерофосфолипидов. ЕС 2.7.8.27 находится в плазматической мембране, в аппарате Гольджи, активность указанного фермента также зафиксирована в ядерной мембране и в хроматине (Albi с соавт., 1999). ЕС 2.7.8.27 также регулирует уровни церамидов и диацилглицерола (ДАГ), при этом обе указанные молекулы являются в свою очередь регуляторами программируемой гибели клеток посредством апоптоза и аутофагии (Jiang с соавт., 2011; Van Helvoort с соавт., 1994; Tafesse с соавт., 2006). Полярная «головка» СМ имеет очень большой размер и препятствует закреплению белков, подобных Ras, которые содержат разветвленные липиды (подобные изопренильному, фарнезильному или геранилгеранильному фрагментам), и при этом способствует закреплению других белков с фрагментами насыщенных жирных кислот (подобных миристиновой или пальмитиновой кислотам).

Таким образом, принимая во внимание важность фермента ЕС 2.7.8.27 и СМ для правильного функционирования и структуры клеточной мембраны и зная о связи между структурными и функциональными изменениями липидов, расположенных в клеточной мембране, и возникновением различных заболеваний, таких как, например, рак, сердечно-сосудистые заболевания, ожирение, нейродегенеративные расстройства и нарушения обмена веществ, было бы очень важно обнаружить соединения, способные регулировать активность указанного фермента и, как следствие, уровень СМ, с тем чтобы иметь возможность обеспечить ремиссию патологий, происхождение которых обусловлено аномальной активностью фермента и/или изменением уровня СМ. Учитывая, что органы регулирования фармацевтического рынка, такие как Испанское фармацевтическое агентство, Европейское агентство лекарственных средств (ЕАЛС) и Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов, в настоящее время требуют наличия методик, позволяющих контролировать эффективность лекарственных средств, выявление молекул, на основании изменений экспрессии или активности (в числе прочих) которых можно было бы прогнозировать эффективность соединения, является желательным, чтобы гарантировать получение пациентами надлежащего лекарственного средства. Таким образом, изобретения, которые позволяют корректировать применение указанных способов лечения, могут считаться родственными изобретениями. Настоящее изобретение относится к синтезу ряда 2-гидроксипроизводных жирных кислот, разделению их рацемических форм и способам терапевтического применения указанных соединений. Кроме того, настоящее изобретение также включает описание клеток, на которые нацелена активность указанных соединений, активности указанных соединений и, кроме того, описание биомаркеров, которые позволяют определить эффективность указанных соединений, а также способ, применяемый для данной цели.

Более того, важно обнаружить соединения, которые могут регулировать активность других ферментов, участвующих в метаболизме липидов, например фермента серинпальмитоилтрансферазы (ЕС 2.3.1.50) или фермента стеароил-коА-десатуразы (ECD, ЕС 1.14.19.1), который отвечает за синтез олеиновой кислоты. Церамид, вырабатываемый вследствие активности ЕС 2.3.1.50, является липидной молекулой, представляющей большой биологический интерес. Важная роль, относящаяся к церамиду, заключается в его участии в индукции апоптоза, также известного как программируемая гибель клеток ( с соавт., 2010). Апоптоз представляет собой высокорегулируемый биологический процесс, функция которого заключается в уничтожении бесполезных клеток или клеток, которые представляют собой угрозу для здоровья организма. Таким образом, опухолевые клетки часто разрабатывают молекулярные механизмы избегания апоптоза ( с соавт., 2010).

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Краткое описание изобретения

Предпочтительно настоящее изобретение направлено на устранение изменений уровня СМ в клетках, в результате чего предложены соединения, которые могут инвертировать измененный уровень экспрессии фермента ЕС 2.7.8.27 посредством активации (в случае если фермент недостаточно экспрессирован или обладает пониженной активностью) или ингибирования (в случае если фермент сверхэкспрессирован или обладает повышенной активностью) с обеспечением таким образом регуляции уровня СМ, синтезируемого указанным ферментом, и ремиссии патологических процессов, вызванных дерегуляцией указанного фермента или аномальным уровнем СМ.

Таким образом, для достижения указанного результата в настоящем изобретении осуществляют способ, в котором молекулы синтезируют в их рацемической форме и далее выделяют [-]- и [+]-энантиомеры 2-гидроксипроизводных жирных кислот, которые, как показано в приведенных ниже примерах, способны регулировать активность фермента ЕС 2.7.8.27 и, следовательно, уровень синтезируемого СМ. Указанные жирные кислоты характеризуются большим периодом полураспада в крови, чем природные жирные кислоты. Фактически настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые содержат вышеуказанные энантиомеры, и к их применению в качестве лекарственных средств для лечения заболеваний, общая этиология которых основана на изменениях (независимо от их происхождения) липидов клеточной мембраны, таких как, например, изменения уровня, состава или структуры указанных липидов, а также для лечения заболеваний, при которых регулирование структуры и состава липидов мембраны может вызвать ремиссию патологического состояния. Терапевтический эффект предпочтительно достигается посредством регулирования (активации или ингибирования) активности фермента ЕС 2.7.8.27 и/или уровня продукта реакции, катализируемой указанным ферментом, - СМ - или даже уровня ГФКБ и/или ДГФР.

Помимо регулирования фермента ЕС 2.7.8.27 настоящее изобретение демонстрирует, что соединение 2OHOA (2-гидроксиолеиновая кислота) регулирует активность других ферментов, участвующих в метаболизме липидов, например, в клетках U118. Так, например, был исследован фермент ЕС 2.3.1.50. В настоящем изобретении показано, что 2OHOA стимулирует активность ЕС 2.3.1.50 (Пример 8 и Фигура 9), вызывая программируемую гибель лейкозных клеток человека. С другой стороны, в мембранах клеток U118, подвергаемых лечению 2OHOA, было также обнаружено значительное снижение уровня олеиновой кислоты, что свидетельствует о том, что 2OHOA является мощным ингибитором фермента ЕС 1.14.19.1, отвечающего за синтез олеиновой кислоты из стеариновой кислоты (Пример 9 и Фигура 10). В связи с этим, необходимо отметить, что как ЕС 2.7.8.27, так и ЕС 2.3.1.50 представляют собой ферменты, отвечающие за метаболизм сфинголипидов, которые связаны друг с другом тем, что принадлежат к метаболическому пути одного вида молекул. С другой стороны, фермент ЕС 1.14.19.1 представляет собой модификатор жирных кислот. Связь указанного фермента с двумя другими ферментами заключается в том, что сфинголипиды всегда содержат в своей структуре цепи жирных кислот. Поскольку каждая жирная кислота обеспечивает различные свойства сфинголипидов, то обстоятельство, что они могут быть модифицированы, влияет на их биологическую активность. Таким образом, можно констатировать, что три фермента, упомянутые в настоящем изобретении, тесно связаны друг с другом, и, следовательно, это нормально, что всего лишь одна молекула может регулировать активность указанных трех ферментов.

В настоящем изобретении [-]-энантиомеры (также изомер S) и [+] (также изомер R) отличаются направлением отклонения поляризованного света. В случае если оптический изомер поворачивает поляризованный свет вправо (по часовой стрелке), его обозначают знаком [+] (указанный изомер представляет собой правовращающий изомер или правую форму). Однако в случае если оптический изомер поворачивает поляризованный свет влево (против часовой стрелки), его обозначают знаком [-] (указанный изомер представляет собой левовращающий изомер или левую форму).

Конкретно в данном случае настоящее изобретение демонстрирует, что [-]-энантиомер 2-гидроксипроизводных жирных кислот действует как активатор фермента ЕС 2.7.8.27, осуществляя положительное регулирование синтеза СМ, представляющего собой сфинголипид, который, как указано выше, является соединением, преобладающим в мембранах клеток человека и животных, и является незаменимым для формирования правильной структуры липидного бислоя и функционирования клетки. Таким образом, указанный [-]-энантиомер может быть применен для получения фармацевтической композиции, предназначенной для лечения таких патологий, общая этиология которых заключается в структурных и/или функциональных изменениях липидов, расположенных в клеточной мембране, таких как рак, ожирение, гипертония, гипертриглицеридемия, гиперхолестеринемия или диабет и т.д., обусловленных аномально низкой активностью указанного фермента ЕС 2.7.8.27. Кроме того, рацемическая форма представляет собой активатор указанного фермента, принимая во внимание тот факт, что активность изомера [-] (который представляет собой активное вещество) является преобладающей по сравнению с изомером [+] (который не вызывает ферментативную активность). В связи с этим полагают, что положительная активность рацемической формы обусловлена тем обстоятельством, что активация, которая вызывает синтез новых молекул СМ, является более сильной в отношении активности данного фермента, чем ингибирование, которое может «выключить» молекулы фермента, которые ранее не были активны. В любом случае, сила активирующего воздействия рацемической формы меньше, чем сила активирующего воздействия [-]-энантиомера, что объясняет более низкую терапевтическую активность рацемической формы.

Как можно увидеть из примеров в настоящем изобретении, важным является тот факт, что [-]-энантиомер 2-гидроксипроизводных жирных кислот проявляет улучшенный терапевтический эффект по сравнению с рацематом (который содержит равные количества обоих энантиомеров). Более того, следует подчеркнуть, что [-]-энантиомер 2-гидроксипроизводных жирных кислот имеет более низкую токсичность и меньше побочных эффектов, чем рацемат и [+]-энантиомер (см. Таблицу 3, Пример 7).

Кроме того, настоящее изобретение также демонстрирует, что [+]-энантиомер 2-гидроксипроизводных жирных кислот, действует как ингибитор фермента ЕС 2.7.8.27, осуществляя отрицательное регулирование синтеза СМ, и может быть применен в фундаментальном исследовании для изучения регуляции самого фермента ЕС 2.7.8.27 или для лечения заболеваний, характеризующихся аномально высокой активностью фермента ЕС 2.7.8.27 и/или аномально высоким уровнем СМ, таких как, например, муковисцидоз (Slomiany с соавт., 1982). С другой стороны, высокий уровень холестерина и триглицеридов связан с важными изменениями в сердечно-сосудистой системе. В связи с этим, холестерин обычно связывается с СМ для образования высоко упорядоченных мембранных доменов, известных в научной литературе как «липидные рафты» или «Lo» (liquid ordered, то есть жидкая упорядоченная фаза). Увеличение количества холестерина способствует увеличению указанных липидных областей, которое вызывает изменения клеточной сигнализации, которые могут привести к различным сердечно-сосудистым и метаболических изменениям или заболеваниям. Таким образом, снижение уровня СМ в случае гиперхолестеринемии и гипертриглицеридемии может помочь снизить уровни холестерина и триглицеридов в плазме и мембранах. Соответственно, [+]-энантиомер играл бы защитную роль при нескольких видах нарушений, таких как гиперхолестеринемия и гипертриглицеридемия, поскольку указанный энантиомер вызывает снижение уровней указанных липидов в сыворотке крови, а также снижение уровня СМ, которое приводит к снижению плотности липидных рафтов в клетках.

Кроме того, учитывая, что фермент ЕС 2.7.8.27 отвечает за синтез СМ и, следовательно, за правильную структуру и функцию клеточной мембраны, как указанный фермент, так и сам СМ следует рассматривать в качестве молекулярных маркеров, применяемых для осуществления способа in vitro диагностики и/или прогнозирования заболеваний на основе изменений в клеточной мембране. Указанные изменения не происходят в естественных условиях, напротив, они вызваны активностью соединений, описанных в настоящем изобретении. Кроме того, было подтверждено, что соединения согласно настоящему изобретению также регулируют уровни белков ГФКБ и/или ДГФР. В результате, настоящее изобретение также относится к способу/набору для осуществления диагностики или прогнозирования таких патологий, связанных с измененными уровнями белков ГФКБ и ДГФР по отношению к нормальным уровням. Указанный набор включает реагенты или средства, с помощью которых можно оценить активность фермента ЕС 2.7.8.27 и/или уровень СМ, ГФКБ или ДГФР и, соответственно, осуществить указанные диагностику/прогнозирование как способ мониторинга эффективности лечения пациентов.

В связи с этим, указанный фермент ЕС 2.7.8.27 и/или продукт реакции, катализируемой указанным ферментом, представляющий собой СМ, можно рассматривать в качестве терапевтических мишеней, на которые можно направить молекулы, способные регулировать активность указанного фермента и/или уровень СМ, и таким образом вызывать ремиссию тех патологических процессов, которые могли развиться или могут начать развиться в будущем в результате изменений активности указанного фермента или уровня СМ, ГФКБ или ДГФР. Таким образом, например, [-]-энантиомер в настоящем изобретении приведен для иллюстрации возможного применения фермента ЕС 2.7.8.27 в качестве терапевтической мишени путем активации ферментативной функции указанного фермента в ходе патологических процессов, при которых указанная функция является недостаточной, с восстановлением таким образом нормального уровня СМ. С другой стороны, измерение активности фермента ЕС 2.7.8.27, и/или уровня СМ, и/или уровня ГФКБ, и/или уровня ДГФР также было бы подходящим для осуществления способов скрининга для отбора соединений-кандидатов для получения других молекул, которые подобно [-]- и [+]-энантиомерам согласно настоящему изобретению должны быть способны регулировать активность фермента ЕС 2.7.8.27, и/или уровень СМ, и/или уровень ГФКБ, и/или уровень ДГФР, а следовательно способны вызывать ремиссию патологических процессов.

Следовательно, настоящее изобретение демонстрирует исключительную важность отбора соединений с особыми структурными характеристиками, таких как жирные кислоты с по меньшей мере одной двойной связью, общим количеством атомов углерода (С), равным или меньшим 20, и заместителем, представляющим собой радикал, в частности гидроксильный радикал (ОН) при атоме углерода в положении 2 (или атома углерода в α-положении).

Точнее, настоящее изобретение относится к соединениям, которые представляют собой [-]- и [+]-энантиомеры Формулы I:

НООС-НОСН-(СН₂)_a-(СН=СН-СН₂)_b-(СН₂)_с-СН₃

(I),

где a, b и с независимо принимают значения от 0 до 6 с учетом того, что общее количество атомов углерода в молекуле ≤ 20.

Кроме того, установлено, что предпочтительная терапевтическая форма согласно настоящему изобретению представляет собой [-]-энантиомер (соответствующий пространственной конфигурации S) Формулы I, который, как показано, является наиболее эффективной формой при активации фермента ЕС 2.7.8.27, более эффективной, чем рацемическая форма и [+]-энантиомер (соответствующий пространственной конфигурации R) Формулы I, который, как показано, является ингибитором фермента ЕС 2.7.8.27.

В предпочтительном варианте реализации настоящее изобретение, в частности, относится к [-]- и [+]-энантиомерам Формулы I со следующими значениями a, b и c:

В особенно предпочтительном варианте реализации настоящее изобретение, в частности, относится к [-]-энантиомеру формулы [-] НООС-НОСН-(СН₂)₆-(СН=СН-СН₂)₁-(СН₂)₆СН₃, для целей настоящего изобретения именуемому [-]2OHOA.

Другой особенно предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения относится к [+]-энантиомеру формулы [+] НООС-НОСН-(СН₂)₆-(СН=СН-CH₂)₁-(CH₂)₆-CH₃, для целей настоящего изобретения именуемому [+]2OHOA.

В качестве примера, заболевания, характеризующиеся недостаточной активностью фермента ЕС 2.7.8.27 и, следовательно, аномально низким уровнем СМ в клеточных мембранах, которые могли бы быть подвергнуты лечению с применением [-]-энантиомера согласно настоящему изобретению, включают:

- рак: рак предстательной железы, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, лейкоз, рак матки, рак толстой кишки, рак мозга, рак легких, злокачественную меланому и рак печени (см. Таблицу 2);

- сосудистые патологии: гипертонию, артериосклероз, кардиомиопатии, ангиогенез, гиперплазию сердца и т.д.;

- патологии обмена веществ: диабет, метаболический синдром или ожирение;

- другие патологии: поражения продолговатого мозга, болезнь Альцгеймера, склероз, целлюлит и т.д.

Таким образом, более конкретно первый вариант реализации настоящего изобретения относится к [-]- или [+]-энантиомеру соединения Формулы I и/или по меньшей мере одной из его фармацевтически приемлемых солей:

НООС-НОСН-(СН₂)_а-(СН=СН-СН₂)_b-(СН₂)_c-СН₃

(I),

характеризующегося тем, что а, b и с независимо могут принимать значения от 0 до 6 с учетом того, что общее количество атомов углерода в молекуле ≤ 20. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения указанное соединение получается при выборе по меньшей мере одной из следующих комбинаций значений для а, b и с: a=6, b=1 и с=6; а=6, b=1 и с=4; а=6, b=2 и с=3; а=6, b=3 и с=0; у а=3, b=3 и с=3.

Кроме того, предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения относится к соединениям формулы [+]НООС-НОСН-(СН₂)₆-(СН=СН-СН₂)₁-(СН₂)₆-СН₃. В качестве примера, заболевания, характеризующиеся избытком активности фермента ЕС 2.7.8.27 и, следовательно, аномально высоким уровнем СМ в клеточных мембранах, которые могли бы быть подвергнуты лечению или предотвращены с применением [+]-энантиомера согласно настоящему изобретению, представляют собой муковисцидоз, гиперхолестеринемию и гипертриглицеридемию.

Другой особенно предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения относится к соединениям формулы [-]HOOC-HOCH-(CH₂)₆-(CH=CH-CH₂)₁-(СН₂)₆-СН₃.

Второй вариант реализации настоящего изобретения относится к применению по меньшей мере одного из ранее упомянутых соединений для получения фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения патологий, общая этиология которых представляет собой структурные и/или функциональные изменения клеточной мембраны вследствие дерегуляции активности фермента ЕС 2.7.8.27 и/или уровня или концентрации СМ, уровня ГФКБ или уровня ДГФР в клетках вообще и в мембранах в частности.

Более того, настоящее изобретение относится к по меньшей мере одному из вышеупомянутых соединений для применения в лечении и/или для предотвращения патологий, общая этиология которых представляет собой структурные и/или функциональные изменения клеточной мембраны вследствие дерегуляции активности фермента ЕС 2.7.8.27, уровня или концентрации СМ, уровня ГФКБ или уровня ДГФР в клетках вообще и в мембранах в частности.

Настоящее изобретение относится еще и к самой фармацевтической композиции, которая содержит по меньшей мере одно из вышеупомянутых соединений и, необязательно, фармацевтически приемлемые носители. Таким образом, соединения согласно настоящему изобретению могут быть введены отдельно или приготовлены в виде фармацевтических композиций, которые объединяют со вспомогательными веществами, такими как, например: связывающие агенты, заполнители, разрыхлители, смазывающие вещества, покрытия, подсластители, ароматизаторы, красители, транспортеры и т.д., а также комбинации указанных веществ. В то же время, соединения согласно настоящему изобретению могут входить в состав фармацевтических комбинаций в комбинации с другими активными ингредиентами.

При применения соединений согласно настоящему изобретению в качестве лекарственных средств, их введение можно осуществлять в любой форме, например: энтерально (через пищеварительную систему), перорально (посредством пилюлей, капсул или сиропов), ректально (посредством клизм или суппозиториев), местно (посредством кремов или пластырей), путем ингаляции, путем парентеральной инъекции, путем внутривенной инъекции, путем внутримышечной инъекции или путем подкожной инъекции, в указанной выше форме или в любой другой фармацевтически приемлемой форме, такой как, например, метилы, этилы, фосфаты, другие радикалы в форме сложного эфира, простого эфира, алкила и т.д.

В предпочтительном варианте реализации настоящее изобретение относится к применению соединения [-]НООС-НОСН-(СН₂)₆-(СН=СН-СН2)₁-(СН2)₆-СН₃ для получения фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения патологий, общая этиология которых заключается в структурных и/или функциональных изменениях клеточной мембраны вследствие недостаточной активности фермента ЕС 2.7.8.27 и/или аномально низкого уровня СМ в клеточной мембране, аномально низкого уровня ГФКБ или аномально высокого уровня ДГФР; причем указанные патологии предпочтительно выбраны из рака, предпочтительно рака предстательной железы, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, лейкоза, рака матки, рака толстой кишки, рака мозга, рака легких, злокачественной меланомы и рака печени; сосудистых патологий, предпочтительно гипертонии, артериосклероза, кардиомиопатий, ангиогенеза, гиперплазии сердца, или метаболических патологий, предпочтительно диабета, метаболического синдрома или ожирения.

Аналогичным образом настоящее изобретение относится к соединению [-]НООС-НОСН-(СН2)₆-(СН=СН-СН2)₁-(СН2)₆-СН₃ для применения для лечения и/или предотвращения патологий, общая этиология которых заключается в структурных и/или функциональных изменениях клеточной мембраны вследствие недостаточной активности фермента ЕС 2.7.8.27, аномально низкого уровня СМ в клеточной мембране, аномально низкого уровня ГФКБ или аномально высокого уровня ДГФР, причем указанные патологии предпочтительно выбраны из рака, предпочтительно рака предстательной железы, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, лейкоза, рака матки, рака толстой кишки, рака мозга, рака легких, злокачественной меланомы и рака печени; сосудистых патологий, предпочтительно гипертонии, артериосклероза, кардиомиопатий, ангиогенеза, гиперплазии сердца, или метаболических патологий, предпочтительно диабета, метаболического синдрома или ожирения.

В другом предпочтительном варианте реализации настоящее изобретение относится к применению соединения формулы [+] НООС-НОСН-(СН2)₆-(СН=СН-СН2)₁-(СН2)₆-СН₃ для получения фармацевтической композиции, предназначенной для лечения и/или предотвращения патологий, общая этиология которых заключается в функциональных и/или структурных изменениях клеточной мембраны вследствие избыточной активности фермента ЕС 2.7.8.27, аномально высокого уровня СМ в клеточной мембране, аномально высокого уровня ГФКБ или аномально низкого уровня ДГФР, причем указанная патология представляет собой, например, муковисцидоз, гиперхолестеринемию и гипертриглицеридемию.

Аналогичным образом настоящее изобретение относится к соединению формулы [+]НООС-НОСН-(СН2)₆-(СН=СН-СН2)₁-(СН2)₆-СН₃ для применения для лечения и/или предотвращения патологий, общая этиология которых заключается в структурных и/или функциональных изменениях клеточной мембраны вследствие избыточной активности фермента ЕС 2.7.8.27, аномально высокого уровня СМ в клеточной мембране, аномально высокого уровня ГФКБ или аномально низкого уровня ДГФР, причем указанная патология представляет собой, например, муковисцидоз, гиперхолестеринемию и гипертриглицеридемию.

Третий аспект настоящего изобретения относится к способу лечения и/или предотвращения патологий, общая этиология которых заключается в структурных и/или функциональных изменениях клеточной мембраны вследствие дерегуляции активности фермента ЕС 2.7.8.27, уровня СМ, уровня ГФКБ или уровня ДГФР, который включает введение пациенту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного/одной из ранее упомянутых соединений или композиций, которые содержат указанные соединения.

В предпочтительном варианте реализации настоящее изобретение относится к способу лечения и/или предотвращения патологий, общая этиология которых заключается в структурных и/или функциональных изменениях клеточной мембраны вследствие недостаточной активности фермента ЕС 2.7.8.27 и/или аномально низкого уровня СМ в клеточной мембране, который включает введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения [-]НООС-НОСН-(СН2)₆-(СН=СН-СН2)₁-(СН2)₆-СН₃ или композиции, которая содержит указанное соединение. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения указанные патологии предпочтительно выбраны из рака, предпочтительно рака предстательной железы, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, лейкоза, рака матки, рака толстой кишки, рака мозга, рака легких; злокачественной меланомы и рака печени; сосудистых патологий, предпочтительно гипертонии, артериосклероза, кардиомиопатий, ангиогенеза, гиперплазии сердца; или метаболических патологий, предпочтительно диабета, метаболического синдрома или ожирения.

В другом предпочтительном варианте реализации настоящее изобретение относится к способу лечения и/или предотвращения патологий, общая этиология которых заключается в структурных и/или функциональных изменениях клеточной мембраны вследствие избыточной активности фермента ЕС 2.7.8.27 и/или аномально высокого уровня СМ в клеточной мембране, который включает введение терапевтически эффективного количества соединения [+]НООС-НОСН-(СН2)₆-(СН=СН-СН2)₁-(СН2)₆-СН₃ или композиции, которая содержит указанное соединение. В предпочтительном варианте реализации патология представляет собой, например, муковисцидоз, гиперхолестеринемию и гипертриглицеридемию.

Для целей настоящего изобретения под «терапевтически эффективным количеством» понимают количество, которое вызывает ремиссию заболевания или предотвращает указанное заболевание, не демонстрируя вредных побочных эффектов. Под «терапевтически эффективным количеством» также понимают количество, которое при оказании значительного терапевтического эффекта имеет приемлемый уровень токсичности в случае, когда заболевание, подвергаемое лечению, является очень серьезным или смертельным.

Четвертый вариант реализации настоящего изобретения относится к способу in vitro отбора соединений-кандидатов, которые подходят для лечения и/или предотвращения патологий, общая этиология которых заключается в структурных и/или функциональных изменениях клеточной мембраны, который включает оценку изменений, обеспечиваемых в отношении активности фермента ЕС 2.7.8.27, уровня СМ, уровня ГФКБ или уровня ДГФР в присутствии указанного соединения-кандидата. То есть, настоящее изобретение включает применение фермента ЕС 2.7.8.27 или СМ, ГФКБ или ДГФР в качестве терапевтических мишеней, на которые должны быть направлены соединения с целью предотвращения и/или лечения описанных выше патологий, с целью разработки терапевтических средств, способных изменять активности или уровни вышеуказанных соединений (см., например, Фигуру 5).

Пятый вариант реализации настоящего изобретения относится к in vitro способу прогнозирования/диагностики патологий, общая этиология которых заключается в структурных и/или функциональных изменениях липидов, расположенных в клеточной мембране, который включает определение дерегуляции активности фермента ЕС 2.7.8.27 и/или наличия аномального уровня СМ, ГФКБ или ДГФР в клеточных мембранах или других частях клетки. Таким образом, настоящее изобретение включает применение фермента ЕС 2.7.8.27 или СМ, ГФКБ или ДГФР в качестве молекулярных маркеров для обеспечения прогнозирования и/или диагностики патологий, описанных выше. Важная роль СМ в отношении структуры и активности клеточной мембраны, а также важная роль фермента ЕС 2.7.8.27, отвечающего за выработку указанного липида, позволяет применять обнаружение концентрации/активности в клетках тканей, плазмы, спинномозговой жидкости, моче и/или других жидкостях организма средством для создания наборов для обнаружения, диагностики и мониторинга различных патологий, рассматриваемых в настоящем изобретении, таких как, например, рак, гипертония, ожирение и нарушения обмена веществ. В связи с этим, не только как СМ, но и фермент ЕС 2.7.8.27, ДГФР и ГФКБ представляют собой биомаркеры для обнаружения заболеваний человека и, как отмечалось выше, являются терапевтическими мишенями для разработки новых способов лечения людей.

В предпочтительном варианте реализации настоящее изобретение относится к способу in vitro прогнозирования/диагностики патологий, общая этиология которых заключается в структурных и/или функциональных изменениях липидов, расположенных в клеточной мембране, который включает определение недостаточной активности фермента ЕС 2.7.8.27, наличия аномально низкого уровня СМ в клеточной мембране, аномально низкого уровня ГФКБ или аномально высокого уровня ДГФР в клетке, при этом указанные патологии предпочтительно выбраны из рака, предпочтительно рака предстательной железы, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, лейкоза, рака матки, рака толстой кишки, рака мозга, рака легких, злокачественной меланомы и рака печени; сосудистых патологий, предпочтительно гипертонии, артериосклероза, кардиомиопатий, сердечного толчка, ангиогенеза, гиперплазии сердца; или метаболических патологий, предпочтительно диабета, метаболического синдрома или ожирения.

В другом предпочтительном варианте реализации настоящее изобретение относится к in vitro способу прогнозирования/диагностики патологий, общая этиология которых заключается в структурных и/или функциональных изменениях липидов, расположенных в клеточной мембране, который включает определение избыточной активности фермента ЕС 2.7.8.27, наличия аномально высокого уровня СМ в клеточной мембране, аномально высокого уровня ГФКБ или аномально низкого уровня ДГФР, где указанная патология предпочтительно представляет собой муковисцидоз гиперхолестеринемию и гипертриглицеридемию.

Шестой вариант реализации настоящего изобретения относится к наборам для применения в способе прогнозирования/диагностики, описанного выше, который включает подходящие средства для определения активности фермента ЕС 2.7.8.27, уровня СМ в клеточной мембране, уровня/активности ГФКБ и/или уровня/активности ДГФР. Указанные подходящие средства включают методы ТСХ и ВЭТСХ, газовую хроматографию, анализ изображений, абсорбционную или флуоресцентную спектроскопию, оптическую флуоресцентнуб микроскопию, конфокальную микроскопию, иммуноблоттинг, иммуноцитохимию, твердофазный ИФА или аналогичные методы (РИА, дот/слот-блоттинг, ФИА и т.д.).

В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения набор характеризуется тем, что прогнозирование/диагностику осуществляют путем прямого количественного определения уровня сфингомиелина и/или косвенного количественного определения уровня указанного соединения с помощью его предшественников (например, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилхолина, церамида и т.д.) или его производных (например, сфинголипидов). Предпочтительно указанный предшественник представляет собой церамид, производное представляет собой NBD-Cer или NBD-SM, а косвенное измерение производят с помощью лизенина.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу синтеза рацемических соединений и выделения и очистки энантиомеров молекул согласно настоящему изобретению, который включает следующие этапы:

1. Гидроксилирование в кислой среде ненасыщенной жирной кислоты для получения рацемического продукта.

2. Очистка посредством перекристаллизации и осаждения рацемической 2-гидроксилированной жирной кислоты в форме натриевой соли.

3. Этерификация рацемической смеси 2-гидроксилированной жирной кислоты в форме ее натриевой соли с применением раствора серной кислоты в этаноле, предпочтительно в концентрации 10%.

4. Энантиоселективный гидролиз сложного эфира, катализируемый липазой pseudomonas fluorescens (Amane Lipase, cas #9001-62-1) при 25°C.

5. Мониторинг хода реакции посредством жидкостной хроматографии.

6. Гидролиз смеси с применением разбавленной HCl до рН менее 2.

7. Экстракция продуктов метил-трет-бутиловым эфиром (МТБЭ) и промывка органической фазы.

8. Удаление растворителя в вакууме с получением исходного материала со смесью кислоты и сложного эфира.

9. Разделение кислоты и сложного эфира посредством кристаллизации кислоты.

10. Возвращение на этап 1 в случае кислоты и на этап 2 в случае сложного эфира для начала повторной обработки каждой выделенной фракции (кислоты и сложного эфира) до достижения желаемой энантиометрической чистоты (энантиомерный избыток 95%, который составляет 97,5% желаемого энантиомера и 2,5% нежелательного энантиомера).

Разделение и выделение двух энантиомеров 2OHOA на сегодняшний день неизвестно. Из-за технической трудности выделения конкретно [-]-энантиомера указанное выделение невозможно было осуществить до настоящего времени.

Настоящее изобретение также относится к способу in vitro мониторинга клеточных изменений, произведенных в клетках, пораженных болезнью, посредством воздействия соединений согласно настоящему изобретению или других соединений, которые действуют на тот же клеточный процесс или на клеточные процессы, связанные с указанным процессом, производя лечение или улучшение состояния пораженных клеток у пациента. Другими словами, настоящее изобретение включает применение фермента ЕС 2.7.8.27 или СМ, ГФКБ или ДГФР в качестве молекулярных маркеров, изменения которых, вызванные лечением с применением молекул согласно настоящему изобретению, позволяют узнать, вызывается ли у указанного пациента ответ на лечение, и, следовательно, определить эффективность лечения и время, в течение которого его следует осуществлять. Указанные способы также могут позволить прогнозировать, имеет ли пациент возможность отвечать на лечение с применением молекул согласно настоящему изобретению, таким образом, они могут быть применены для осуществления диагностики и/или прогнозирования вышеупомянутых патологий. Учитывая, что изменение состава мембраны, а конкретно уровня СМ, вызывает изменения уровней белков ГФКБ и ДГФР, предпочтительный аспект настоящего изобретения относится к способу, который позволяет отслеживать изменения, вызванные молекулами согласно настоящему изобретению или другими молекулами, которые оказывают аналогичное действие на патологические клетки. Таким образом, применение СМ, фермента ЕС 2.7.8.27, ГФКБ и/или ДГФР обеспечивает возможность того, что проводимая терапия может изменить уровни или активности указанных соединений. Цель указанного определения состоит в том, чтобы (1) прогнозировать эффективность лечения, для того чтобы предотвратить появление потенциально нечувствительных пациентов в результате неэффективной терапии, и (2) узнать об изменениях состояния пациентов, для того чтобы подтвердить, что он или она отвечает на терапию, и знать, каковы доставляемые дозы в зависимости от стадии лечения, а также какова продолжительность указанных стадий и самого лечения в целом. Поскольку указанные аспекты имеют крайне важное значение для недопущения ненужных фармацевтических расходов и для способности применить наиболее целесообразную терапию из всех возможных, крупные организации по регулированию в области фармации требуют наличия биомаркеров и диагностических систем, таких как те, которые описаны в настоящей заявке.

Аналогичным образом, настоящее изобретение относится к способу лечения пациентов, страдающих от вышеупомянутых патологий, который включает определение наличия указанной дерегуляции фермента ЕС 2.7.8.27, уровня СМ, уровня ГФКБ или уровня ДГФР, самих по себе, и лечения пациента, у которого проявляется указанная дерегуляция, с применением соединений согласно настоящему изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу выбора терапии для пациента с патологией, описанной в настоящем изобретении, который включает определение наличия указанной дерегуляции фермента ЕС 2.7.8.27, уровня СМ, уровня ГФКБ или уровня ДГФР и основанный на указанном определении выбор терапии на основе соединений согласно настоящему изобретению.

Следующие определения включены с целью иллюстрации настоящего изобретения:

- Высокая/низкая активность фермента ЕС 2.7.8.27: ферментативная активность, которая приводит к возникновению высокого или низкого уровней СМ в мембранах соответственно.

- Высокий/низкий уровень сфингомиелина: считается, что низкие уровни сфингомиелина представляют собой уровни, которые составляют менее 15% от общего содержания фосфолипидов в мембране. Считается, что высокие уровни сфингомиелина представляют собой уровни указанного фосфолипида, которые составляют 15% или более относительно общего содержания фосфолипидов.

- Высокий/низкий уровень ГФКБ: считается, что высокий уровень ГФКБ представляет собой уровень относительно общего содержания белка в миллиграммах, который вдвое или более чем вдвое (≥200%) превосходит нормальные уровни в клетках глии. Считается, что низкий уровень ГФКБ представляет собой уровень относительно общего содержания белка в миллиграммах, который подразумевает уровни вдвое меньше нормальных уровней в клетках глии или еще ниже (≤50%).

- Высокий/низкий уровень ДГФР: считается, что высокий уровень ДГФР представляет собой уровень относительно общего содержания белка в миллиграммах, который вдвое или более чем вдвое (≥200%) превосходит нормальные уровни в покоящихся клетках независимо от их вида. Считается, что низкий уровень ГФКБ представляет собой уровень относительно общего содержания белка в миллиграммах, который подразумевает уровни вдвое меньше нормальных уровней в покоящихся клетках независимо от их вида или еще ниже (≤50%).

Краткое описание чертежей

Фигура 1

А. Соединение 2OHOA вызывает значительное усиление синтеза СМ в различных клеточных линиях рака мозга человека (U118, SF767 и 1321N1), клетках рака легких человека (А549) и клетках лейкоза человека (Jurkat), но не в неопухолевых клетках (фибробластах легких человека MRC5). В то же время, было изучено противоопухолевое воздействие на указанные и другие линии опухолевых клеток (см. Таблицу 2). Клетки подвергали воздействию носителя (вода с 5% этанола, контроль) или соединения 2OHOA в течение 24 часов в концентрации 200 мкМ. Значения на оси ординат представляют собой средние значения ± SEM (стандартные ошибки среднего при количестве экспериментов n=3-5) уровней СМ (процент от общего количества фосфолипидов), определенные с помощью хроматографических методов (ТСХ или ВЭ-ТСХ с последующим спектроскопическим определением и количественным определением посредством анализа изображений), в виде процента от общего количества липидов по сравнению с их уровнями в клетках, не подвергнутых воздействию лекарственного средства (контролем). Уровни СМ, измеренные в опухолевых клетках, были значительно ниже, чем указанные уровни в нормальных клетках, и только соединение 2OHOA вызывало значительные изменения в раковых клетках. Указанные результаты свидетельствуют о том, что фермент ЕС 2.7.8.27 представляет собой терапевтическую мишень при лечении рака и биомаркер для мониторинга указанной патологии и развития указанной патологии на протяжении проводимой терапии, а с другой стороны что соединение 2OHOA является активатором указанного фермента и инвертирует низкие уровни СМ, демонстрируемые для раковых клеток. Наряду со способами измерения ферментативной активности и уровней СМ, описанными выше, были испытаны другие способы, которые приводят к очень похожим результатам, такие как газовая хроматография, конфокальная микроскопия, флуоресцентная спектроскопия и т.д.

На изображениях конфокальной микроскопии представлено свечение клеточного СМ посредством соединения с лизенином в клетках глиомы человека U118, подвергаемых обработке носителем (контроль) или 2OHOA (200 мкМ). В случае опухолевых клеток можно оценить, что количество СМ в мембране является недостаточным, и что способы лечения с применением 2OHOA вызывают значительное увеличение количества СМ в мембране, представляющее собой яркий показатель активации фермента ЕС 2.7.8.27. Кроме того, указанный эксперимент явным образом показывает, что повышение уровня клеточного СМ происходит, в основном, за счет накопления в плазматической мембране опухолевых клеток.

Верхняя группа изображений: полученное посредством иммуноцитохимических способов специфическое мечение СМ (левая колонка: лизенин, отслеживаемый по антителу, меченному флуорофором Alexa 488), ядерной ДНК с применением Hoechst 33258 (центральная колонка: Hoechst) или и того, и другой (правая колонка, наложение). Данные фигуры представляют собой части опухолей легких человека (клетки А549), образовавшихся у иммунодепрессированных мышей, подвергнутых воздействию носителя (контроль) или [-]2OHOA в количестве 600 мг/кг в сутки или 900 мг/кг в сутки (перорально, 50 суток). Указанные результаты четко показывают, что уровни СМ в указанных опухолях значительно повышаются после начала лечения с применением [-]2OHOA, но не повышаются в естественных условиях. Центральная группа изображений: фрагмент, представляющий собой мечение СМ (слева), ядерной ДНК (в центре) или и того, и другой (справа) в клетке, находящейся в срезе опухоли, развившейся у мыши, зараженной раком легких человека (А549) и подвергнутой воздействию [-]2OHOA (600 мг/кг в сутки, перорально, 50 суток). Изображение демонстрирует потерю ядерной ДНК, представляющую собой яркий показатель начала клеточной гибели, параллельно с увеличением СМ.

Нижняя диаграмма: ось ординат отображает количественную оценку интенсивности флуоресценции (в условных единицах) посредством конфокальной микроскопии в частях опухолей, представленных на верхней группе изображений (среднее значение ± стандартная ошибка среднего), полученных у животных, подвергнутых воздействию носителя (контроль) или 2OHOA в количестве 600 мг/кг в сутки (Л600) или 900 мг/кг в сутки (Л900) в течение 50 суток. *** Р<0,001.

D. Определение уровней СМ посредством флуоресцентной спектроскопии.

Модельные мембраны (липосомы) с различным содержанием СМ сначала инкубировали в присутствии лизенина, а затем в присутствии антитела к лизенину, меченного флуорофором Alexa 488. Флуоресцирующие вещества, связывание с мембранами (уровни СМ) отделяли от несвязанных с мембранами путем центрифугирования при 80000 × g в течение 30 минут. Пеллеты ресуспендировали в среде с детергентом (1% додецилсульфат натрия) и оценивали флуоресценцию количественно (условные единицы в осадке) в каждой пеллете (ордината) как функцию концентрации СМ (абсцисса). Для обнаружения данного липида может быть использован любой флуорофор, который связывается с антителом или лизенином.

Фигура 2. Соединение 2OHOA вызывает усиление синтеза СМ, зависящее от концентрации и продолжительности лечения. Значения на оси ординат представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего уровней СМ (процент от общего количества фосфолипидов) по сравнению с контролем, не подвергаемым воздействию лекарственного средства (n=3-5). Уровни СМ определяли посредством тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ, то есть высокоэффективной тонкослойной хроматографии), мониторинг которых проводили посредством анализа изображений или газовой хроматографии: A. Раковые клетки глиомы человека U118 подвергали воздействию 2OHOA в концентрации 200 мкМ в течение различных периодов времени (2, 6, 12, 24, 48 и 72 часа). Белые столбики соответствуют клеткам, подвергнутым воздействию носителя (контролю).

B. Клетки U118 в течение 24 часов подвергали воздействию 2OHOA в различных концентрациях (25-400 мкМ).

Фигура 3. Соединение 2OHOA вызывает увеличение количества СМ в ядрах. Раковые клетки U118 в течение 24 часов подвергали воздействию носителя (контроль) или 2OHOA в концентрации 200 мкМ. Значения на оси ординат представляют собой средние значения ± ESM (n=3-5) уровней СМ по сравнению с контролем, не подвергаемым воздействию лекарственного средства (100%).

Фигура 4. Соединение 2OHOA действует непосредственно на фермент ЕС 2.7.8.27. Что касается диаграмм А, В, С, во всех случаях авторы настоящего изобретения инкубировали клетки или клеточные экстракты или средства инкубации с флуоресцентным субстратом указанного фермента NBD-Cer [(нитробензоксадиазолил)церамидом] в присутствии (черные столбики) или в отсутствие (контроль, белые столбики) 2OHOA. Затем подвергали липиды экстракции и определяли уровни образования NBD-SM посредством ВЭТСХ (ВЭ-ТСХ, высокоэффективной тонкослойной хроматографии). Значения представлены на оси ординат в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего (n=3-5).

A. In vivo эксперимент по определению активности фермента ЕС 2.7.8.27: клетки U118 с NBD-Cer инкубировали в течение 4 часов, а затем подвергали воздействию соединения 2OHOA (200 мкМ) в течение различных периодов времени (5, 15, 60 минут и 24 часов). Далее клетки гомогенизировали и измеряли метаболизм флуорофора NBD-Cer с получением NBD-SM.

B. In vitro эксперимент по определению активности фермента ЕС 2.7.8.27 в клеточных экстрактах, в ходе которого измеряли активность указанного фермента после разрушения клеток. Указанный эксперимент свидетельствует о том, что соединение 2OHOA способно активировать фермент ЕС 2.7.8.27 посредством прямого взаимодействия. В рамках указанных экспериментов гомогенизированные клетки инкубировали с соединением 2OHOA (200 мкМ) и NBD-Cer в течение 2 часов.

C. Воздействие соединения 2OHOA на активность изоформ 1 и 2 фермента ЕС 2.7.8.27. Активацию изоформ ЕС 2.7.8.27 (1) и ЕС 2.7.8.27 (2) определяли путем исследования их активности на поверхности клеток.

Фигура 5. Взаимосвязь между структурой и функцией при активации фермента ЕС 2.7.8.27. Увеличение количества СМ в клетках, U118 вызванное различными жирными кислотами (200 мкМ, 24 ч). Контроль: носитель; 18:1n-9 (октадеценовая кислота); 2Me-18:1n-9 (2-метилоктадеценовая кислота); 2OH-16:1 (2-гидроксигексадеценовая кислота); 2OH-18:0 (2-гидроксиоктадекановая кислота); 2OHOA (2OH-18:1n-9, 2-гидроксиоктадеценовая кислота); 2OH-18:2n-6 (2-гидроксилинолевая кислота); 2OH-18:3n-6 (2-гидрокси-γ-линоленовая кислота); 2OH-18:3n-3 (2-гидрокси-α-линоленовая кислота); 2ОН-20:4n-6 (2-гидроксиарахидоновая кислота); 2ОН-20:5n-3 (2-гидроксиэйкозапентаеновая кислота); 2OH-22:6n-3 (2-гидроксидокозагексаеновая кислота). Значения на оси ординат представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего (n=3-5) уровней СМ, определенные посредством тонкослойной хроматографии по сравнению с контролем, не подвергаемым воздействию лекарственного средства (100%). Жирные кислоты, содержащие 20 или более атомов углерода, не вызывают значительных изменений активности указанного фермента. Наличие других радикалов у атома углерода в положении 2 (таких как Н или СН₃) и отсутствие двойных связей в структуре жирной кислоты приводит к возникновению неактивных молекул.

Фигура 6.

А: Демонстрирует, что изменения композиции клеточной мембраны вызывают транслокацию белка Ras из мембраны в цитоплазму. Высокие уровни 2OHOA и СМ в мембране препятствуют закреплению белка Ras на мембране. На указанной фигуре представлены изображения клеток глиомы человека (SF767) полученные посредством оптической микроскопии с фазовым контрастом (ф. к.), и изображения, полученные посредством конфокальной микроскопии с применением антитела, специфичного к Ras, которое является флуоресцентно меченным, после подвергания воздействию носителя (контроль) или соединения 2OHOA в течение 10 минут (конфокальная микроскопия 1) и 24 часов (конфокальная микроскопия 2).

В: Транслокация белка Ras препятствует инактивации белка Raf, а также последующей активации белка MEK в сигнальном каскаде, что можно заметить по уменьшению количества обоих белков в состоянии фосфорилированной (активной) формы, определенного посредством иммуноблоттинга клеток U118, культивированных в отсутствие (контроль) или в присутствии 150, 200 или 250 мкМ 2OHOA.

С: Наконец, представлено значительное снижение состояния активности киназы белка MAP (ERK1 и ERK2), также определенного посредством иммуноблоттинга с применением специфических антител при концентрациях 2OHOA, указанных в В.

D: Состояние активности (уровни фосфорилированных форм) Akt и EGFR также снижается после инкубации с 250 мкМ 2OHOA.

На диаграммах B-D на оси ординат представлено процентное содержание фосфобелка по отношению к клеткам SF767, не подвергаемым воздействию лекарственного средства (контроль). На оси абсцисс представлена концентрация (микромолярная) соединения 2OHOA.

Е: Верхняя группа изображений: уровни экспрессии ДГФР в опухолях, полученных из клеток глиомы человека (SF767), имплантированных бесшерстным мышам, которые подвергали воздействию 2OHOA в течение 50 суток (600 мг/кг в сутки, перорально). На диаграмме слева представлены средние значения (n=4) флуоресценции, определенные посредством иммуноцитохимии с применением специфического антитела, меченного с применением флуоресценции, а фотографии справа представляют собой типичные изображения. Нижняя группа изображений: экспрессия ДГФР в клетках рака легких человека (А459). Все экспериментальные условия и детали указанной диаграммы аналогичны соответствующим условиям и деталям, относящимся к верхней группе изображений. Указанные результаты свидетельствуют о том, что уровни ДГФР изменяются в результате лечения с применения молекул согласно настоящему изобретению, так что активность или уровни указанного белка могут быть применены в качестве биомаркеров для мониторинга терапевтической эффективности соединений, описанных в настоящей заявке, или соединений, действующих аналогичным образом. Кроме того, можно сделать вывод, что опухоли, в которых уровни ДГФР являются высокими, могут хорошо отвечать на лечение с применением соединений согласно настоящему изобретению, так что указанный белок представляет собой хороший биомаркер для прогнозирования возможной эффективности энантиомеров, полученных из жирных кислот, и, соответственно, демонстрации эффективности лечения с применением указанных соединений.

F: Левая группа изображений: уровни ГФКБ в сыворотке животных с опухолью (глиомой) человека, определенные посредством иммуноблоттинга. Бесшерстных мышей инфицировали с применением клеток SF767 и подвергали воздействию носителя (глиома) или 2OHOA (леч., 600 мг/кг в сутки, 28 суток). Иммунологическую реактивность в отношении фрагментированного пептида из ГФКБ (см. фотографию) в сыворотке указанных животных, выраженную в процентах, сравнивали с иммунной активностью, обнаруженной у животных, не имеющих опухоли, и животных, не подвергаемых воздействию лекарственного средства (контроль). Правая группа изображений: проводили аналогичные эксперименты, но иммунологическую реактивность определяли посредством твердофазного ИФА в сыворотке животных, подвергнутых обработке 600 мг/кг 2OHOA (перорально) в течение 7 суток (7с600) или 28 суток (28с600). Во всех экспериментах применяли специфическое антитело против ГФКБ. Указанные результаты свидетельствуют о том, что уровни ГФКБ изменяются в результате лечения с применением молекул согласно настоящему изобретению, так что уровни указанного белка могут быть применены в качестве биомаркеров для контролирования терапевтической эффективности соединений, описанных в настоящей заявке, или соединений, действующих аналогичным образом. Кроме того, можно сделать вывод, что опухоли, в которых уровни ГФКБ являются низкими, могут иметь хороший ответ на лечение с применением соединений согласно настоящему изобретению, так что указанный белок представляет собой хороший биомаркер для прогнозирования возможной эффективности энантиомеров производных жирных кислот, и, соответственно, демонстрации эффективности лечения с применением указанных соединений. Для измерения ДГФР и ГФКБ были применены различные способы, которые включают электрофорез, иммуноблоттинг, твердофазный ИФА и аналогичные способы, такие как ОТ-ПЦР и т.д. Все указанные и другие аналогичные способы могут быть применены при определении уровней или активности ДГФР и ГФКБ.

Фигура 7. А) Специфичность действия [-]- и [+]-энантиомеров, рацемической смеси +/- 2OHOA на активность фермента ЕС 2.7.8.27. На фигуре представлены уровни СМ (процент СМ от общего количества липидов) в клетках глиомы U118 после лечения с применением рацемической (+/-) смеси изомеров 2-гидроксиолеиновой кислоты, соединения [-]2OHOA и соединения [+]2OHOA. Клетки подвергали воздействию указанных соединений в концентрации 50 мкМ (50) и 100 мкМ (100) в течение 24 часов. Значения на оси ординат представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего (n=3-5) уровней СМ, определенные посредством тонкослойной хроматографии, в виде процентов от общего количества липидов по сравнению с уровнями в клетках, не подвергаемых воздействию лекарственных средств (контроль). Как можно оценить, [-]-энантиомер вызывает увеличение количества СМ, которое указывает на то, что указанный энантиомер является активатором фермента ЕС 2.7.8.27, и [+]-энантиомер вызывает снижение уровней СМ (особенно заметное при воздействии [+]2OHOA в концентрации 100 мкМ), которое указывает на то, что указанный энантиомер является ингибитором указанного фермента. В данном контексте и без влияния на уровни других соединений было доказано, что смеси, содержащие указанный энантиомер, вызывают активацию фермента ЕС 2.7.8.27, причем рацемическая смесь представляет собой частный случай молекулярной смеси, хотя положительный эффект также был доказан в случае смесей [-]-энантиомера и различных носителей или различных терапевтических соединений.

В) Влияние [+]-формы (также энантиомер R: черные столбцы), [-]-формы (также энантиомер S: белые столбцы) и рацемической формы (серые столбцы), на уровни СМ в мембранах клеток U118 (значения измеряли после инкубации с указанными соединениями в концентрации 100 мкМ в течение 24 ч). Примененные лекарственные средства представляли собой носитель (контроль), 2-гидроксипальмитолеиновую кислоту (2OH16:1), 2-гидроксиолеиновую кислоту (2OH18:1), 2-гидроксилинолевую кислоту (2OH18:2), 2-гидрокси-α-линоленовую кислоту (2OH18:3a) и 2-гидрокси-γ-линоленовую кислоту (2OH18:3g).

Фигура 8. На указанной фигуре представлено влияние рацемической смеси (+/-) кислоты 2OHOA и оптических изомеров [-]2OHOA и [+]2OHOA на различные патологические процессы у животных моделей.

A. Влияние на объем опухолей, полученных из клеток рака легких человека (А549): иммунодепрессированных мышей инфицировали клетками рака легких человека и 7 суток спустя (когда опухоли становились заметными) начинали лечение с применением носителя (контроль), рацемической смеси (+/-)2OHOA и оптических изомеров [-]2OHOA и [+]2OHOA (600 мг/кг в сутки, 15 суток, перорально). Столбики соответствуют средним значениям из среднего ± стандартная ошибка среднего увеличения объема (мм³) опухолей (n=6). Лечение с применением рацемической смеси (+/-) 2OHOA вызывало значительное снижение (Р<0,01) по сравнению с контролем. Оптический изомер [-]2OHOA вызывал значительное снижение по сравнению со всеми остальными видами лекарственных средств (Р<0,01).

B. Влияние на артериальное давление: гипертензивных крыс (линии SHR) подвергали воздействию рацемической смеси (+/-) 2OHOA и оптических изомеров [-]2OHOA и [+]2OHOA (600 мг/кг каждые 12 ч, 15 суток, перорально). Все молекулы вызывали значительное понижение (Р<0,01) систолического артериального давления (мм рт. ст., ось ординат у) у крыс SHR, причем изомер [-]2OHOA являлся наиболее мощным средством, вызывавшим эффект понижения давления. Представлены средние значения систолического давления ± стандартная ошибка среднего (n=6).

C. Влияние на массу тела: крыс SHR подвергали воздействию рацемической смеси (+/-) 2OHOA и оптических изомеров [-]2OHOA и [+]2OHOA (600 мг/кг в сутки, 5 суток, перорально). Все молекулы вызывали значительное снижение (Р<0,01) массы тела животных, как на 3-й сутки лечения, причем изомер [-]2OHOA являлся наиболее мощным средством, вызывавшим снижение массы тела. Представлены средние значения массы тела ± стандартная ошибка среднего (ось абсцисс, n=6).

D. Влияние на уровни холестерина и триглицерида: крыс SHR подвергали воздействию рацемической смеси (+/-) 2OHOA и оптических изомеров [-]2OHOA и [+]2OHOA (600 мг/кг каждые 12 ч, 15 суток, перорально). Все молекулы вызывали значительное снижение (Р<0,01) уровней триглицерида (ТГ) и общего холестерина (ОХС), причем оптический изомер [-]2OHOA являлся наиболее мощным средством, вызывавшим снижение уровней указанных липидов. Представлены средние значения уровней липидов в сыворотке, выраженные в мг/дл, ± стандартная ошибка среднего (ось ординат; n=6).

E. Влияние на гликемию (уровни глюкозы в плазме): крыс SHR подвергали воздействию носителя (контроль), рацемической смеси 2OHOA (2OHOA) и оптических изомеров [-]2OHOA и [+]2OHOA (600 мг/кг, 12 ч, 15 суток, перорально). Рацемическое соединение и изомер [-] 2OHOA вызывали значительное снижение (*Р<0,05; **Р<0,01) уровней глюкозы в плазме (мг/дл, ось ординат). [+]-энантиомер вызвал незначительное снижение в данных условиях. Представленные значения среднее ± стандартная ошибка среднего уровней липидов в сыворотке выраженные в мг/дл (ось ординат, n=6).

Фигура 9. Регулирование активности фермента 2.3.1.50. На оси ординат (у) представлен уровень включения [³Н]пальмитата [(расп./мин)/мг белка] в различные липидные фракции клеток U118, инкубированных в отсутствие (контроль, белые столбики) или в присутствии 2OHOA (черные столбики). Значительное повышение радиоактивности обнаруживали только во фракциях сфингомиелина (СМ) и церамида (Cer), что ясно указывает на селективную активацию ферментов ЕС 2.7.8.27 и 2.3.1.50.

Фигура 10. Регулирование активности фермента 1.14.19.1. На оси ординат (оси у) представлен уровень включения [³Н]олеата [(расп./мин)/мг белка] в клеточные мембраны U118, инкубированные в отсутствие (контроль, белый столбик) или в присутствии 2OHOA (черный столбик). Снижение включения меченного тритием олеата в липиды клеточных мембран, инкубированных в присутствии 2OHOA, свидетельствует об ингибировании фермента 1.14.19.1.

Подробное описание настоящего изобретения

Далее представлены примеры, которые иллюстрируют подробные и предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения без ограничения объема его охраны настоящего изобретения.

Пример 1. Методика получения рацемических соединений и разделения [+]- и [-]-энантиомеров производных 2-гидроксилированных жирных кислот

Методика

Синтез рацемического соединения

Описанная далее методика, представляет собой подробности синтеза натриевых солей жирной 2-гидроксикислоты со степенью чистоты 99% посредством образования дианиона олеиновой кислоты путем реакции с ЛДА и последующего гидроксилирования с применением молекулярного кислорода; полученный таким образом необработанный материал обрабатывали NaOH с получением соли натрия и подвергали очистке посредством двух последовательных перекристаллизаций в МеОН/воде (избегая применения хроматографических колонок).

С помощью указанной методики можно получить от нескольких грамм до нескольких тонн конечного продукта. Продукт может иметь фармацевтическое качество чистоты и может быть произведен в условиях, соответствующих стандарту GMP («Надлежащей практике организации производства»), которые указывают в случае потребления продукта человеком.

причем R представляет собой -(СН₂)_a-(СН=СН-СН₂)_b-(СН₂)_c-СН₃ при условии, что общее количество всех атомов углеродов в R равно или больше 12 или равно или меньше 18 (при общей длине молекулы от 14 до 20 атомов углерода).

Описание способа

Этап 1: гидроксилирование

В эмалированном реакторе вместимостью 100 л в инертной атмосфере, раствор диизопропиламина (1,7 кг) в ТГФ (11 л) охлаждали до температуры ниже 5°С. К раствору порциями добавляли n-BuLi (23% в гексане) (4,6 кг), не позволяя температуре подниматься выше 17°С. После завершения добавления добавляли один эквивалент ДМПМ (1,0 кг) и раствор олеиновой кислоты (2,0 кг) в ТГФ (2.6 л), не позволяя температуре подниматься выше 20-25°С. Реакционную смесь нагревали до 50°С в течение 30 минут и снова охлаждали до 20°С. В этот момент подсоединяли баллон, содержавший O₂, и производили барботирование реакционной смеси кислородом в течение приблизительно 45 минут со скоростью потока 25 л/мин. После завершения барботирования раствор охлаждали до 10°С и подвергали гидролизу с применением 3 М HCl (20 л) до рН=1, регулируя температуру, чтобы она не поднималась выше 40°С. Необработанный материал подвергали экстракции этилацетатом (6 л), промывали смесью 3M HCl/рассол (1:1) и бисульфитом натрия (9 л) и рассолом (до тех пор, пока рН не становился равным 3 или менее 3), и раствор концентрировали досуха в роторном испарителе. Получали примерно 2 кг необработанного материала со степенью чистоты>70%.

Этап 2: очистка

Необработанный материал растворяли в 7,2 л этанола при 40°С в реакторе вместимостью 10 л и обрабатывали водным раствором гидроксида натрия (134 г в 1,4 л воды), повышая температуру до 50°С, с получением однородного раствора. Указанный раствор охлаждали до 5°С в течение по меньшей мере 6 ч для осаждения соли натрия, которую отфильтровывали и промывали ацетоном. Твердое вещество дважды подвергали перекристаллизации в (10%) H₂O/MeOH (0,5 л H₂O/5,0 л MeOH) при 50°С до полного завершения растворения и охлаждали до 0-5°С в течение минимум 6 ч. Конечный продукт отфильтровывали, промывали ацетоном и сушили в вакууме. Указанный продукт суспендировали в метаноле и получение соли завершали посредством добавления метоксида натрия. Производили полное осаждение продукта ацетоном (5 л) при охлаждении до 0-5°С в течение по меньшей мере 10 ч. Твердое вещество отфильтровывали, промывали ацетоном и сушили в вакууме. Получение энантиомеров [+] (R) и [-] (S)

100 г натриевой соли 2OHOA помещали в реактор вместимостью 1 л и добавляли 500 мл серной кислоты в этаноле (10% по массе). Смесь кипятили с обратным холодильником в течение 16 часов и с помощью ТСХ устанавливали, что превращение завершалось. После завершения реакции реакционную смесь нейтрализовали с применением насыщенного раствора бикарбоната натрия и концентрировали в вакууме для удаления этанола. 250 мл AcOEt (этилацетата) добавляли к водной эмульсии таким образом, чтобы экстрагировать этиловый эфир 2-гидроксиолеиновой кислоты, который сушили над сульфатом и концентрировали досуха.

100 г этилового эфира 2-гидроксиолеиновой кислоты (рацемической смеси) растворяли в 50 мл МТБЭ в реакторе вместимостью 1 л при механическом перемешивании. К раствору добавляли 267 мл фосфатного буфера (1 М, рН 7) и 1,3 г липазы АК бактерий рода Pseudomonas. Эмульсию перемешивали при комнатной температуре (25°С) до достижения 50% превращения (ВЭЖХ, Luna С8, 5 мкм, МеОН/вода/НСООН). Реакцию останавливали посредством гидролиза с применением 3 н. HCl до достижения рН кислого раствора (менее 2), реакционную смесь подвергали экстракции с применением МТБЭ и промывали солевым раствором до того, пока рН водной фазы не составил 5 или более. Неочищенный продукт очищали посредством кристаллизации, чтобы разделить фракцию гидролизованной кислоты (60% энантиомерного избытка) и фракцию негидролизованного сложного эфира (75% энантиомерного избытка).

Для каждой фракции требовалось две повторных обработки, при которых повторяли процедуру этерификации/гидролиза фракций по отдельности, до достижения энантиомерного избытка ≥95% для каждого энантиомера, который подвергали гидролизу и превращали в конечную натриевую соль. Конечный выход энантиомеров, полученных указанным способом, составлял 40-50% (20-25% каждого энантиомера).

Использованная методика

Условия, описанные для кинетического оптического расщепления, являются наилучшими условиями, полученными в процессе оптимизации после изучения двух липаз (липазы, полученной из Pseudomonas, и липазы из Candida Antarctica), растворителей (водного, органического или двухфазного), температур, ионной силы, встряхивания, рН и растворения. Также был определен наиболее подходящий способ мониторинга реакции гидролиза и очистки продуктов. Таким образом, способ получения энантиомеров гидроксилированных производных жирных кислот отличается от любого из способов, которые могут быть найдены в литературе, большинство из которых требует высокой степени растворения и очистки посредством хроматографии.

Масштабирование способа

Способ осуществляли в масштабе 1-150 г, получая аналогичные и воспроизводимые результаты. Энантиомеры могут быть разделены посредством кристаллизации, которая облегчает осуществление способа в килограммовом масштабе. Снижение выхода происходит вследствие воздействия и обработки. Однако новые примеси не образуются, и фазы после промывки и кристаллизации могут быть снова объединены и подвергнуты повторной обработке.

Пример 2. Опухолевые клетки имели более низкие уровни СМ в мембранах, которые повышались после лечения с применением молекул согласно настоящему изобретению

Уровни СМ, достигнутые в отсутствие (контроль) или в присутствии 200 мкМ [-]2OHOA, измеряли в мембранах нормальных клеток (MRC-5 и IMR90), а также в нескольких видах опухолевых клеток (см. Таблицу 2). Во всех случаях было обнаружено, что уровни СМ в мембранах опухолевых клеток составляли примерно половину или треть от уровней в нормальных клетках (Фигура 1). Таким образом, можно утверждать, что концентрация СМ представляет собой биомаркер, который служит признаком онкогенности клеток человека. С другой стороны, способы лечения с применением молекул согласно настоящему изобретению вызывают увеличение СМ в клетках опухолей, которое не происходит в естественных условиях. Таким образом, при обнаружении СМ с применением лизенина и последующим соединением с флуоресцирующим антителом и обнаружении флуоресценции посредством конфокальной микроскопии было выявлено большее количество меток (то есть большее количество СМ) в опухолях животных, подвергнутых лечению с применением молекул согласно настоящему изобретению (Фигура 1 с). Аналогичным образом, другие способы обнаружения на основе связывания лизенина с СМ мембраны и обнаружения посредством спектроскопических исследований раствора или посредством твердофазного ИФА демонстрировали, что мембраны клеток опухолей содержали более высокий уровень СМ только тогда, когда указанные клетки инкубировали в присутствии молекул согласно настоящему изобретению (Фигура 1). Например, спектрофотометрическое определение уровней СМ на основе флуоресценции раствора является очень простым, быстрым и эффективным способом анализа (Фигура 1D). Таким образом, в рамках настоящего изобретения создан способ диагностики для обнаружения описанных патологических процессов и патологий, при которых происходят изменения уровня СМ, позволяющие предсказать, может ли быть эффективным лечение с применением молекул согласно настоящему изобретению, а также для мониторинга эффективности терапии с применением молекул согласно настоящему изобретению и других молекул, проявляющих аналогичную активность. Исходя из указанной информации, настоящее изобретение также включает диагностические наборы для изначальной оценки потенциальной возможности применения данной терапии и для мониторинга эффективности лечения указанных заболеваний с применением молекул согласно настоящему изобретению после его проведения.

(1) Антипролиферативный эффект: + ингибирование роста клеток, - отсутствие эффекта.

(2) Способ, применяемый для анализа: 1) ТСХ или ВЭТСХ, 2) газовая хроматография, 3) анализ изображений, 4) флуоресцентная спектроскопия, 5) конфокальная или флуоресцентная микроскопия.

Пример 3. 2OHOA повышает уровни СМ посредством активации фермента ЕС 2.7.8.27

2OHOA повышает уровни СМ в опухолевых клетках, подвергнутых воздействию, описанному выше. Увеличение количества СМ в опухолевых клетках, подвергнутых воздействию 2OHOA, зависело от продолжительности лечения и использованной для него концентрации (Фигура 2), что свидетельствует о специфичности указанной молекулы. СМ представляет собой мембранный липид, который препятствует связыванию некоторых молекул, участвующих в пролиферации клеток, таких как белок Ras. Таким образом, уровни Ras измеряли посредством конфокальной микроскопии с применением флуоресцентно меченного антитела, и можно было обнаружить, что метка переходила из мембраны (Фигура 6: 95-99% от общей флуоресценции обнаружено в мембране перед лечением) в цитоплазму (94-97% флуоресценции, обнаруженной внутри клетки после лечения с применением 2OHOA) клеток глиомы, рака легких и лейкоза человека. Транслокация Ras из мембраны в цитоплазму означает отсутствие эффективного взаимодействия между Ras и рецепторной тирозинкиназой (РТК) или между Ras и Raf, вследствие чего белки в МАР-киназном пути не активируются, опухолевые клетки перестают размножаться, и начинается программируемая гибель клеток. Изменения физиологии клеток, вызванные молекулами согласно настоящему изобретению, в качестве промежуточного эффекта (до гибели раковых клеток или регулирования активности других клеток) вызывали резкое снижение уровней ДГФР и резкое повышение уровней ГФКБ (Фигура 6).

Другим эффектом, связанным со снижением пролиферации клеток, является повышение уровней СМ в ядрах. Способы лечения с применением 2OHOA вызывали повышение уровня СМ в ядрах (Фигура 3), которое свидетельствовало о том, что указанные способы вызывали ингибирование пролиферации клеток.

Пример 4. Регулирование фермента ЕС 2.7.8.27 зависит от молекулярной структуры жирной кислоты

Исследования in vitro с применением специфического флуоресцентного субстрата фермента ЕС 2.7.8.27, представлявшего собой NBD-Cer, демонстрировали, что 2OHOA взаимодействовала непосредственно с указанным ферментом, и активация фермента была заметна с первых нескольких минут инкубации клеточных культур (Фигура 4А). Скорость указанного процесса явно указывает на непосредственное и эффективное взаимодействие между энантиомером 2OHOA и ферментом ЕС 2.7.8.27. Таким образом, настоящее изобретение относится к применению вышеупомянутых соединений в качестве активаторов ([-]-энантиомер) или ингибиторов ([+]-энантиомер), специфичных к ферменту ЕС 2.7.8.27.

С другой стороны, активация фермента ЕС 2.7.8.27 зависит от количества атомов углерода в жирной кислоте, так что жирные кислоты, содержащие более 20 атомов углерода, не вызывали значительных изменений активности указанного фермента (Фигура 5). Кроме того, другими необходимыми условиями активации фермент ЕС 2.7.8.27 являются присутствие группы ОН у атома углерода в положении 2 и одна или более двойных связей, тогда как присутствие других радикалов (таких как Н или СН₃) и отсутствие двойных связей в структуре жирной кислоты приводили к появлению неактивных молекул (Фигура 5). СМ имеет молекулярную структуру, которая определяет влияние на клеточную физиологию, и которой объясняется обеспечение ремиссии различных патологических процессов. Объемная полярная «головка» указанной молекулы препятствует закреплению Ras на мембране с помощью изопренильного фрагмента (который «предпочитает» участки мембраны с фосфолипидами с полярной «головкой» небольшого размера, подобными фосфатидилэтаноламину), что в свою очередь препятствует дальнейшей сигнализации с помощью белков в МАР-киназном каскаде. Инактивация указанного пути вызывала, помимо других процессов, остановку пролиферации опухолевых клеток (Фигура 8А и Таблица 2). Соединения согласно настоящему изобретению демонстрировали способность регулировать уровни СМ в клетках в положительном (повышение) или отрицательном (снижение) ключе. Учитывая, что состав мембраны имеет очень важное значение для правильной работы указанной мембраны, терапевтической активностью обладают не только активаторы (энантиомеры S или -), но и ингибиторы (энантиомеры R или +) фермента ЕС 2.7.8.27, как было продемонстрировано в настоящей заявке. Указанная активация основана на структурных особенностях и находится в зависимости от структурно-функциональных параметров любой другой молекулы, обладающей терапевтической активностью.

Пример 5. [-]-Изомеры жирных кислот С18, такие как [-]2OHOA, являются специфическими активаторами фермента ЕС 2.7.8.27

Относительная конфигурация гидроксильных групп у атомов углерода в положениях 1 и 2 (С1 и С2) приводит к образованию двух энантиомеров или оптических изомеров, которые обозначены как [-] (который соответствует конфигурации S) и [+] (который соответствует конфигурации R). С применением способа, описанного в настоящем изобретении (Пример 1), были синтезированы и выделены рацемическое соединение, которое обладало способностью как положительно, так и отрицательно регулировать фермент ЕС 2.7.8.27, а также энантомеры и оптические изомеры, была доказана и измерена их способность активировать фермент ЕС 2.7.8.27. На Фигуре 7А представлена активация указанного фермента, оцениваемая с помощью уровней СМ в мембранах клеток глиомы человека U118 через 24 часа инкубирования в присутствии 50 и 100 мкМ каждого изомера, а также рацемической смеси (которая содержит более или менее одинаковое количество обоих изомеров). Фигура 7А демонстрирует, как рацемическая смесь 2OHOA вызывала значительное повышение уровней СМ в мембранах клеток U118. В то же время, оптический изомер [-]2OHOA (соответствующий оптическому изомеру S) способен вызывать еще большее повышение уровней СМ. Таким образом, конкретно в случае указанного фермента присутствие смесей, содержащих некоторый процент [-]2OHOA (рацемическое соединение представляет собой особый случай) действует как специфический активатор ЕС 2.7.827. С другой стороны, оптический изомер [+]2OHOA не только не вызывал увеличение количества СМ, но также обеспечивал снижение уровня СМ в мембранах. Указанные данные свидетельствуют о том, что оптический изомер [-]2OHOA представляет собой специфический активатор фермента ЕС 2.7.8.27, и что оптический изомер [+]2OHOA (то есть R-энантиомер) представляет собой специфический ингибитор указанного фермента. Таким образом, настоящее изобретение защищает применение оптического изомера [-]2OHOA (S) в качестве активатора фермента ЕС 2.7.8.27 и оптического изомера [+]2OHOA (R) в качестве специфического ингибитора указанного фермента в способах терапевтического применения. Указанные результаты могут распространяться на все ненасыщенные жирные кислоты, содержащие 14 или более атомов углерода и 20 или менее атомов углерода, которые содержат одну или более двойных связей и гидроксильный радикал у атома углерода С2 (углерода в положении альфа) (Фигура 7 В).

Пример 6. [-]-Изомеры жирных кислот С18, такие как [-]2OHOA, применяли в качестве терапевтических агентов для лечения заболеваний человека

Энантиомер [-]2OHOA и его производные, представленные в настоящем изобретении, имеют терапевтическое применение в различных областях, таких как лечение рака, ожирения, сердечно-сосудистых патологий, диабета, метаболического синдрома, повреждений спинного мозга, болезни Альцгеймера и других процессов (Фигуры 6 и 8; Таблицы 2-5). С другой стороны, энантиомер [+]2OHOA оказывал положительное влияние на уровни холестерина и триглицерида, поскольку указанный энантиомер вызывал значительное снижение уровней указанных липидов в плазме, высокий уровни которых считаются негативно влияющими на здоровье человека (Фигура 8). Таким образом, был изучен терапевтический эффект каждого изомера, а также рацемической смеси, на различных патологических моделях.

На Фигуре 8А представлено влияние пероральных способов лечения (15 суток, 600 мг/кг ежесуточно, n=6) с применением рацемической смеси 2OHOA и энантиомеров [-]2OHOA и [+]2OHOA на объем опухолей, образовавшихся из рака легких человека (клетки А549) у бесшерстных мышей. Как можно увидеть, влияние оптического изомера [-]2OHOA выше, чем рацемата. С другой стороны, после 15 суток лечения с применением оптического изомера [+]2OHOA не произошло значительного изменения объема опухолей. Указанные результаты свидетельствуют о том, что изомер [-]2OHOA является соединением, которое активирует фермент ЕС 2.7.8.27 и обладает терапевтической противоопухолевой активностью. С другой стороны, противоопухолевая активность указанных соединений была исследована на различных линиях клеток рака человека (см. Таблицы 2, 4 и 5). В связи с этим, все [-]-энантиомеры согласно настоящему изобретению демонстрировали большую активность в лечении рака, чем рацемат и [+]-энантиомер, которая соответствовала значительно более низким значениям IC50 при ингибировании роста клеток рака легких человека (линия А549). Кроме того, была доказана активность указанных энантиомеров против очень большого числа видов рака человека различной природы, с учетом чего можно отметить, что [-]-энантиомеры 2-гидроксилированных жирных кислот обладают высокой активностью в лечении любого вида рака. Указанная активность, так или иначе, оказалась еще выше в случае солей (главным образом, натриевых солей указанных молекул), чем в случае жирной кислоты в свободном состоянии (результаты не показаны). В любом случае, [-]-энантиомеры как в форме кислоты, так и в форме соли постоянно демонстрировали большую активность в ингибировании роста опухолей, чем любая из альтернативных молекулярных форм.

Кроме того, было изучено влияние вышеуказанных изомеров на артериальное давление, массу тела и уровень холестерина, триглицеридов и гликемии (глюкозы в плазме) у крыс SHR (Фигуры 8В, 8С и 8D и 8Е). Аналогично результатам, указанным выше, был отмечен больший терапевтический эффект в отношении регулирования кровяного давления, массы тела и гликемии в случае применения изомера [-]2OHOA, тогда как энантиомер [+]2OHOA оказывал больший терапевтический эффект в отношении лечения гиперхолестеринемии и гипертриглицеридемии. Таким образом, у животных, получавших лечение с применением изомера [-]2OHOA, было показано снижение систолического давления более чем на 60 мм рт. ст., тогда как у животных, подвергнутых воздействию изомера [+]2OHOA и рацемического продукта, был отмечен значительный, но меньший терапевтический эффект. Аналогично, в течение периода между 1 ми и 5 ми сутками лечения крысы, подвергнутые воздействию рацемической смеси, теряли 11 граммов массы (примерно 3% от массы их тела), тогда как животные из группы, подвергнутой воздействию энантиомера [-]2OHOA, теряли 21 грамм, а животные из группы, подвергнутой воздействию энантиомера [+]2OHOA, теряли только 7 граммов массы. С другой стороны, больший эффект в отношении снижения уровней триглицерида (ТГ) и общего холестерина (ОХС) наблюдался для энантиомера [+]2OHOA (Фигура 8D). В связи с этим, базальный уровень ТГ в плазме крыс SHR составлял 108 мг/дл и снижался до 56 мг/дл через 2 недели лечения с применением энантиомера [+]2OHOA. С другой стороны, лечение с применением энантиомера [+]2OHOA вызывало снижение уровня ТГ в плазме до 47 мг/дл, тогда как энантиомер [-]2OHOA вызывал лишь незначительное снижение до 81 мг/дл. Параллельно уровни ОХС снижались от 73 мг/дл до 43 мг/дл (рацемат), 36 мг/дл (энантиомер [+]2OHOA) и 59 мг/дл (энантиомер [-]2OHOA), соответственно. Наконец, лечение с применением энантиомеров согласно настоящему изобретению также вызывало значительное снижение уровней глюкозы в плазме (Фигура 8Е). В указанном случае как рацемат (2OHOA), так и энантиомер [-]2OHOA вызывали значительное снижение гликемии у крыс (Р<0,05 и Р<0,01 соответственно) (Фигура 8Е). Тем не менее, R-энантиомер ([+]2OHOA) вызывал небольшое снижение, которое не обладало статистической значимостью.

Вследствие всего вышеописанного, в настоящем изобретении доказано, что оптические изомеры [+] [-] ненасыщенных гидроксилированных жирных кислот, содержащих 18 атомов углерода, представляют собой молекулы, которые эффективны и обладают терапевтической активностью при лечении вышеупомянутых патологий. Во всех изученных случаях было продемонстрировано, что один и только один из энантиомеров имеет более высокую активность, чем другие молекулярные формы (статистическая значимость всегда Р<0,05). Таким образом, было продемонстрировано, что [-]-энантиомер является более эффективным при лечении рака, ожирения, диабета, гипертонии и т.д., тогда как [+]-энантиомер демонстрировал большую эффективность в борьбе с гиперхолестеринемией или гипертриглицеридемией. В указанных случаях было продемонстрировано, что рацемическое соединение является промежуточным состоянием, способным оказывать положительный эффект, подобный эффекту каждого из оптических изомеров, но с более низкой активностью вследствие более низкой концентрации активного энантиомера в каждом случае. Кроме того, применение «неправильного» энантиомера вызывало нежелательные побочные эффекты, которых избегали, применяя терапевтические дозы наиболее активного энантиомера (Таблица 3).

Пример 7. Эффективность, токсичность и побочные эффекты энантиомеров согласно настоящему изобретению

В указанном примере описано исследование, проведенное на иммунодепрессированных мышах, инфицированных клетками глиомы человека (SF767) и в течение 15 суток подвергаемых лечению (пероральному) с применением указанных доз лекарственного средства (Таблица 3). В указанной таблице представлены объем опухолей в конце лечения и симптомы, наблюдаемые в течение периода лечения. Следует еще раз отметить, что эффективность энантиомера [-]2OHOA была выше, чем рацемического соединения 2OHOA, и что энантиомер [+]2OHOA демонстрировал отсутствие активности после 15 суток лечения с применением указанных доз энантиомера.

С другой стороны, доза, которая вызывала уменьшение объема опухолей примерно на треть, не оказывала побочных эффектов на животных, подвергнутых воздействию [-]2OHOA (50 мг/кг), тогда как у животных, подвергнутых воздействию рацемического соединения 2OHOA в дозе, которая вызывала аналогичное уменьшение объема опухолей (600 мг/кг), наблюдались опасные побочные эффекты (Таблица 3). Кроме того, в дозе 200 мг/кг энантиомер [-]2OHOA вызывал уменьшение объема опухоли на 89% без наблюдаемых вредных побочных эффектов, тогда как рацемическое соединение вызывало уменьшение объема опухоли только на 23%, и у некоторых животных в ответ на лечение наблюдались вредные побочные эффекты.

Из указанных результатов можно сделать вывод, что энантиомер [-]2OHOA обладает большей активностью и в максимальной терапевтической дозе не вызывает вредных побочных эффектов, тогда как рацемическое соединение оказывает меньшее воздействие и вызывает некоторые нежелательные побочные эффекты в терапевтических дозах. Различия в эффективности при лечении опухолевых процессов между энантиомером [-]2OHOA и рацематом могут означать различия в ожидаемой продолжительности жизни пациентов, составляющие месяцы или годы. Кроме того, различия в эффективности могут означать излечение пациента от конкретного вида рака или отсутствие выздоровления. С другой стороны, различия в токсичности при воздействии в терапевтических дозах могут означать более высокое качество жизни для пациентов, которые получают энантиомерную форму [-]2OHOA. Учитывая, что механизм активации соединения связан с активностью фермента ЕС 2.7.8.27, и [-]- и [+]-энантиомеры оказывают противоположное влияние на указанный фермент (Фигура 7), введение рацемического соединения предполагает присутствие молекулярной формы, которая вызывает эффект, противоположный эффекту активного компонента ([-]2OHOA), инвертируя часть терапевтического эффекта последнего.

1. Изменение размера опухоли после 15 суток лечения с применением (пероральным) лекарственного средства в указанной дозе по сравнению с животными, не подвергнутыми воздействию лекарственного средства (n=6 во всех группах). В указанном случае значение 100% было присвоено объему опухоли контрольных животных (подвергнутых воздействию носителя) по истечении 15 суток лечения.

2. Отмеченные симптомы и процент животных, у которых они наблюдались. Симптомы, относящиеся к поведению, включают снижение подвижности в течение по меньшей мере 30 минут, вставание шерсти дыбом, прыжки или пребывание в углу клетки.

В исследованиях, выполненных с применением рацемических и энантиомерных соединений согласно настоящему изобретению, было доказано, что во всех случаях [-]-энантиомер обладал более высокой противоопухолевой активностью в отношении ингибирования роста раковых клеток человека (А459, Таблица 4), чем другие молекулярные формы. В связи с этим, концентрации, которые ингибировали рост клеток опухолей (IC₅₀), в случае энантиомера S ([-]) были ниже во всех изученных линиях клеток опухолей (Таблица 5). С другой стороны, указанные соединения не вызывали гибель нормальных клеток (MRC-5, IMR90). Во всех случаях примененные молекулы находились в форме натриевой соли.

Пример 8. Регулирование активности фермента ЕС 2.3.1.50 посредством соединений согласно настоящему изобретению

Клетки глиомы человека U118 инкубировали в присутствии или в отсутствие (контроль) 2OHOA (200 мкМ, 24 ч), а затем инкубировали с [³Н]пальмитатом в течение 5 минут. После завершения указанных периодов инкубации клеточные липиды экстрагировали и разделяли посредством ТСХ. Полосы, соответствовавшие каждому экстрагированному виду липида и количество включенного радиоактивного пальмитата измеряли посредством жидкостной сцинтилляции. Как можно оценить, происходило не только значительное включение во фракцию СМ (показатель активности фермента ЕС 2.7.8.27), но и во фракцию церамида, что свидетельствует об активности фермента ЕС 2.3.1.50 (серинпальмитоилтрансферазы). Таким образом, можно сделать вывод о том, что 2OHOA представляет собой специфический активатор фермента ЕС 2.3.1.50 (Фигура 9).

Пример 9. Регулирование активности фермента ЕС 1.14.19.1 посредством соединений согласно настоящему изобретению

Олеиновая кислота синтезируется из стеариновой кислоты благодаря активности фермента стеароил-СоА-десатуразы (ЕС 1.14.19.1). Указанный фермент играет крайне важную роль в метаболизме липидов, так как представляет собой ограничитель синтеза жирных кислот. Чтобы понять, происходило ли указанное уменьшение вследствие регулирования фермента ЕС 1.14.19.1, клетки U118 инкубировали в присутствии или в отсутствие 2OHOA (200 мкМ, 24 ч) и далее в присутствии [³Н]олеата (5 минут). Может быть подтверждено, что включение радиоактивной олеиновой кислоты в мембраны клеток U118, инкубированных в присутствии 2OHOA, было значительно меньшим, чем в контрольные клетки (Фигура 10). Указанные результаты свидетельствуют о том, что 2OHOA представляет собой мощный ингибитор фермента ЕС 1.14.19.1, регулирование которого, как предполагают, является важным для лечения различных патологий человека.

ИСТОЧНИКИ

1. Albi Е. and М. V. Magni (1999). Sphingomyelin synthase in rat liver nuclear membrane and chromatin. FEBS Lett 460: 369-72.

2. Alemany R, S, Baamonde C, Benet M, O, PV. (2004) 2-hydroxyoleic acid: a new hypotensive molecule. Hypertension. 43: 249-54.

3. Alemany R, Perona JS, JM, Montero E, J, Brezan R, PV and V (2007) G protein-coupled receptor systems and their lipid environment in health disorders during aging. BBA Biomembr. 1768: 964-975.

4. Buda C, Dey I, Balogh N, Horvath LI, Maderspach K, Juhasz M, Yeo YK, Farkas T (1994) Structural order of membranes and composition of phospholipids in fish brain cells during thermal acclimatization. Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 8234-8238.

5. Escriba PV, Sastre M, Garcia-Sevilla JA. (1995) Disruption of cellular signaling pathways by daunomycin through destabilization of nonlamellar membrane structures. Proc Natl Acad Sci USA. 92: 7595-7599.

6. Escriba PV, Ozaita A, Ribas C, Miralles A, Fodor E, Farkas T, Garcia-Sevilla JA (1997) Role of lipid polymorphism in G protein-membrane interactions: nonlamellar-prone phospholipids and peripheral protein binding to membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 94: 11375-11380.

7. PV (2006) Membrane-lipid therapy: a new approach in molecular medicine. Trends Mol. Med. 12: 34-43

8. PV, JM, FM, Kinnunen PKJ, Vigh L, L, AM, Busquets X, I, G (2008) Membranes: A meeting point for lipids, proteins and therapies. J Cell. Mol. Med. 12: 829-875.

9. Florent S, Malaplate-Armand C, Youssef I, Kriem B, Koziel V, MC, Fifre A, Sponne I, Leininger-Muller B, Olivier JL, Pillot T, Oster T. (2006) Docosahexanoic acid prevents neuronal apoptosis inducced by soluble amyloid-beta oligomers. J Neurochem. 96: 385-95.

10. Huitema K., et al. (2004). Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J 23: 33-44.

11. Jackson CL, Schwartz SM (1992) Pharmacology of smooth muscle cell replication. Hypertension 20: 713-716.

12. Jiang Q, et al. (2011). Gamma-tocotrienol induces apoptosis and autophagy in prostate cancer cells by increasing intracellular dihydrosphingosine and dihydroceramide. Int J Cancer, doi: 10.1002/ijc.26054.

13. Jung UJ, Torrejon C, Tighe AP, Deckelbaum RJ. (2008). N-3 Fatty acids and cardiovascular disease mechanisms underlying beneficial effects. Am J Clin Nutr. 87: 2003S-2009S.

14. Lane RM, Farlow MR. (2005) Lipid homeostasis and apolipoprotein E in the development and progression of Alzheimer's disease. J Lipid Res. 46: 949-968.

15. V, Gutierrez A, J, et al. Minerval induces apoptosis in Jurkat and other cancer cells. J. Cell Mol Med. 2010; 13: 1-12.

16. J, O, Casas J, F, Alemany R, Prades J, Nagy T, Baamonde C, Kasprzyk P, S, Saus C, PV. (2005) Membrane structure modulation, protein kinase С alpha activation, and anticancer activity of minerval. Mol Pharmacol 67:531-40.

17. Perona JS, O, JM, Montero E, PV and Ruiz-Gutierrez EV (2007) Consumption of virgin olive oil influences membrane lipid composition and regulates intracellular signaling in elderly adults with type 2 diabetes mellitus. J. Gerontol A Biol Sci Med Sci 62: 256-263.

18. Sagin FG, Sozmen EY (2008) Lipids as key players in Alzheimer disease: alterations in metabolism and genetics. Curr Alzheimer Res 5:4-14.

19. Simons K. and D. Toomre (2000). Lipid rafts and signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol 1: 31-9.

20. Sloan F.A., Bethel M. A, Ruiz D. Jr., Shea A. M & Feinglos M. N. The growing burden of diabetes mellitus in the US elderly population. Arch. Intern. Med. 168, 192-199 (2008).

21.Slomiany A, Murty VL, Aono M, Snyder СЕ, Herp A and Slomiany BL (1982) Lipid composition of tracheobronchial secretions from normal individuals and patients with cystic fibrosis. Biochim Biophys Acta. 10: 106-111 D.

22. Stender S, Dyerberg J (2004) Influence of trans fatty acids on health. Ann. Nutr. Metab. 48: 61-66.

23. Schwartz SM, Campbell GR, Campbell JH. (1985). Replication of smooth muscle cells in vascular disease. Circ Res 58: 427-444.

24. Tafesse F. G., P. Ternes, et al. (2006). The multigenic sphingomyelin synthase family. J Biol Chem 281:29421-5.

25. Trombetta A, Maggiora M, Martinasso G, Cotogni P, Canuto RA, Muzio G. (2007). Arachidonic and docosahexanoic acids reduce the growth of A549 human lung tumor cells increasing lipid peroxidation and PPARs. Chem Biol Interact. 165: 239-50.

26. Van Helvoort A., W. van't Hof, et al. (1994). Conversion of diacylglycerol to phosphatidylcholine on the basolateral surface of epithelial (Madin-Darby canine kidney) cells. Evidence for the reverse action of a sphingomyelin synthase. J Biol Chem 269: 1763-9.

27. O, Casas J, D, Nagy T, Borchert G, Martorell G and Escriba PV. (2004) The G betagamma dimer drives the interaction of heterotrimeric Gi proteins with nonlamellar membrane structures. J Biol Chem. 279: 36540-36545.

28. O, Lopez-Bellan A, Alemany R, S, M, Quevedo J, Pereg V, Barcelo F and PV. (2008) Structure-effect relation of C18 long-chain fatty acids in the reduction of body weight in rats. Int J Obes. 32: 464-473.

29. Yang Q, Alemany R, Casas J, Kitajka K, Lanier SM, Escriba PV (2005) Influence of the membrane lipid structure on signal processing via G protein-coupled receptors. Mol Pharmacol 68: 210-7.

Настоящее изобретение относится к энантиомеру [-] формулы [-]НООС-НОСН-(СН₂)₆-(СН=СН-СН₂)₂-(СН₂)₃-СН₃ или его фармацевтически приемлемым солям. Изобретение также относится к фармацевтической композиции на основе указанного энантиомера и к способу лечения патологий, общая этиология которых представляет собой аномально низкий уровень сфингомиелина, аномально низкий уровень глиофибриллярного кислого белка (ГФКБ), аномально высокий уровень дигидрофолатредуктазы (ДГФР). 7 н. и 11 з.п. ф-лы, 17 ил., 5 табл., 9 пр.

1. Энантиомер [-] формулы

[-]НООС-НОСН-(СН₂)₆-(СН=СН-СН₂)₂-(СН₂)₃-СН₃ или его фармацевтически приемлемые соли.

2. Энантиомер по п. 1, отличающийся тем, что указанный энантиомер представляет собой фармацевтически приемлемую соль формулы

[-]NaOOC-HOCH-(CH₂)₆-(CH=CH-CH₂)₂-(CH₂)₃-CH₃.

3. Фармацевтическая композиция для лечения патологии, вызванной аномально низким уровнем сфингомиелина, содержащая терапевтически эффективное количество энантиомера формулы

[-]НООС-НОСН-(СН₂)₆-(СН=СН-СН₂)₂-(СН₂)₃-СН₃ и/или по меньшей мере одной из его фармацевтически приемлемых солей и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.

4. Фармацевтическая композиция по п. 3, отличающаяся тем, что указанный энантиомер представляет собой фармацевтически приемлемую соль формулы

[-]NaOOC-HOCH-(CH₂)₆-(CH=CH-CH₂)₂-(CH₂)₃-CH₃.

5. Фармацевтическая композиция для лечения патологии, вызванной аномально низким уровнем глиофибриллярного кислого белка (ГФКБ), содержащая терапевтически эффективное количество энантиомера формулы

[-]НООС-НОСН-(СН₂)₆-(СН=СН-СН₂)₂-(СН₂)₃-СН₃ и/или по меньшей мере одной из его фармацевтически приемлемых солей и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.

6. Фармацевтическая композиция по п. 5, отличающаяся тем, что указанный энантиомер представляет собой фармацевтически приемлемую соль формулы

[-]NaOOC-HOCH-(CH₂)₆-(CH=CH-CH₂)₂-(CH₂)₃-CH₃.

7. Фармацевтическая композиция для лечения патологии, вызванной аномально высоким уровнем дигидрофолатредуктазы (ДГФР), содержащая терапевтически эффективное количество энантиомера формулы

[-]НООС-НОСН-(СН₂)₆-(СН=СН-СН₂)₂-(СН₂)₃-СН₃ и/или по меньшей мере одной из его фармацевтически приемлемых солей и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.

8. Фармацевтическая композиция по п. 7, отличающаяся тем, что указанный энантиомер представляет собой фармацевтически приемлемую соль формулы

[-]NaOOC-HOCH-(CH₂)₆-(CH=CH-CH₂)₂-(CH₂)₃-CH₃.

9. Способ лечения патологий, общая этиология которых представляет собой аномально низкий уровень сфингомиелина, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества энантиомера формулы

[-]НООС-НОСН-(СН₂)₆-(СН=СН-СН₂)₂-(СН₂)₃-СН₃ и/или по меньшей мере одной из его фармацевтически приемлемых солей или композиции, содержащей указанный энантиомер и/или по меньшей мере одну из его фармацевтически приемлемых солей.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что указанный энантиомер представляет собой фармацевтически приемлемую соль формулы

[-]NaOOC-HOCH-(CH₂)₆-(CH=CH-CH₂)₂-(CH₂)₃-CH₃.

11. Способ лечения патологий, общая этиология которых представляет собой аномально низкий уровень глиофибриллярного кислого белка (ГФКБ), включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества энантиомера формулы

[-]НООС-НОСН-(СН₂)₆-(СН=СН-СН₂)₂-(СН₂)₃-СН₃ и/или по меньшей мере одной из его фармацевтически приемлемых солей или композиции, содержащей указанный энантиомер и/или по меньшей мере одну из его фармацевтически приемлемых солей.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что указанный энантиомер представляет собой фармацевтически приемлемую соль формулы

[-]NaOOC-HOCH-(CH₂)₆-(CH=CH-CH₂)₂-(CH₂)₃-CH₃.

13. Способ лечения патологий, общая этиология которых представляет собой аномально высокий уровень дигидрофолатредуктазы (ДГФР), включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества энантиомера формулы

[-]НООС-НОСН-(СН₂)₆-(СН=СН-СН₂)₂-(СН₂)₃-СН₃ и/или по меньшей мере одной из его фармацевтически приемлемых солей или композиции, содержащей указанный энантиомер и/или по меньшей мере одну из его фармацевтически приемлемых солей.

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что указанный энантиомер представляет собой фармацевтически приемлемую соль формулы

[-]NaOOC-HOCH-(CH₂)₆-(CH=CH-CH₂)₂-(CH₂)₃-CH₃.

15. Способ по любому из пп. 9-14, отличающийся тем, что указанная патология, в отношении которой проводят лечение, выбрана из группы, состоящей из рака, сосудистых патологий и метаболических патологий.

16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что указанный рак выбран из рака печени, меланомы, рака предстательной железы, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, лейкоза, рака шейки матки, рака толстой кишки, рака мозга или рака легких.

17. Способ по п. 15, отличающийся тем, что указанная сосудистая патология выбрана из гипертонии, атеросклероза, кардиомиопатий, ангиогенеза, гиперплазии сердца.

18. Способ по п. 15, отличающийся тем, что указанная метаболическая патология выбрана из диабета, метаболического синдрома или ожирения.