АВИРУЛЕНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ Vibrio cholerae КМ 262 БИОВАРА ЭЛЬТОР СЕРОВАРА ОГАВА - ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕКТИВНОГО О1 АНТИГЕНА Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 A61K39/106 C12R1/63 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению авирулентного штамма холерного вибриона биовара эльтор серовара Огава, характеризующегося высокой продукцией основного протективного О1 антигена Огава, предназначенного для производства химических вакцин против возбудителя холеры и получения очищенного препарата О1 антигена Огава для приготовления диагностической сыворотки.

К основным факторам вирулентности Vibrio cholerae, которые являются и основными протективными антигенами, относят холерный токсин, токсин-корегулируемые пили адгезии и О-антиген, отвечающие соответственно за формирование при холере антитоксического, антиколонизирующего и антибактериального иммунитета. Кроме того, О-антиген обладает серологической специфичностью и используется для серодиагностики и идентификации возбудителя холеры. Ключевым фактором вирулентности холерных вибрионов является холерный экзотоксин - термолабильный белок, вызывающий развитие тяжелой диареи - основного клинического симптома при холере. Биосинтез холерного токсина кодируют структурные гены ctxA и ctxB, входящие в состав коровой области умеренного нитчатого фага СТХφ, интегрированного в хромосому холерного вибриона. Коровая область профага СТХφ помимо генов ctxAB включает гены zot и асе, кодирующие продукцию двух других холерных токсинов, и гены orfU и сер, продукты которых необходимы для формирования фаговых частиц. Все вирулентные штаммы V.cholerae эффективно секретируют in vitro и/или in vivo холерный токсин. Для вакцинопрофилактики при создании вакцин как химических, так и живых используют штаммы холерных вибрионов, продуцирующие основные протективные антигены.

В настоящее время при производстве лицензированной бивалентной химической таблетированной холерной вакцины в Российской Федерации используют вирулентные штаммы холерного вибриона О1 серогруппы классического биовара, вызвавшего шесть предыдущих пандемий азиатской холеры. Однако в данной вакцине отсутствуют биовароспецифические антигены возбудителя текущей, седьмой пандемии холеры (V.cholerae О1 биовара эльтор) и она не может обеспечить высокий уровень защиты от холеры эльтор.

Известен вирулентный штамм V. cholerae KM 206 О1 серогруппы классического биовара серовара Огава продуцент протективных антигенов - холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии (патент RU 2222594, 27.01.2004). Однако продукция О1 антигена у данного штамма не известна.

Известен штамм V.cholerae KM 68 классического биовара серовара Огава - продуцент протективного антигена Огава. Штамм используют в отечественной медицине в качестве производственного для получения бивалентной химической таблетированной холерной вакцины - холероген-анатоксин + О-антиген (патент RU 2076734, 10.04.1997). Данный штамм является высоковирулентным, что требует больших материальных затрат для обеспечения биологической безопасности производства химической вакцины на основе данного штамма.

Известен авирулентный штамм бактерий V.cholerae биовара эльтор серовара Огава КМ 26, не содержащий некоторых генов коровой области профага СТХφ (ctxA, отвечающего за синтез токсической А-субъединицы холерного токсина, zot - отвечающего за синтез дополнительного холерного токсина), а так же генов tcpA (контролирующих адгезию холерных вибрионов) и генов глобального регулятора toxR (патент RU 2254371, 20.06.2005). Описанный авторами штамм выделен из внешней среды на территории Туркмении. Однако продукция О1 антигена у данного штамма не известна.

Из литературных данных известно, что штаммы классического биовара стабильно наследуют внедренный в хромосому фаг СТХср, а штаммы холерного вибриона биовара эльтор в определенных условиях способны терять его, что ведет к образованию стабильных авирулентных клонов (Кульшань Т.А. с соавторами. Пробл. особо опасных инф., 2006, №91, с.44-48).

Задачей изобретения является получение авирулентного штамма V.cholerae О1 биовара эльтор серовара Огава, продуцирующего протективный антиген, обеспечивающий формирование антибактериального иммунитета при холере.

Сущность изобретения заключается в том, что получен авирулентный штамм эльтор биовара V.cholerae серовара Огава, являющийся продуцентом основного протективного О1 антигена серовара Огава.

Заявляемый штамм получен в модельном эксперименте из вирулентного природного штамма V.cholerae 5/65 Огава, выделенного от больного на территории Ирана в 1965 г., путем спонтанной потери профага СТХφ при длительном пребывании возбудителя холеры в стерильной речной воде.

В результате получен штамм эльтор биовара серовара Огава, лишенный основных генов коровой области профага СТХφ, эффективно продуцирующий протективный антиген Огава.

Штамм V. cholerae 5/65 (ПВ) депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб» под номером КМ 262.

Основные свойства штамма V.cholerae KM 262:

- высокий уровень продукции антигена Огава (титр агглютинации с сывороткой Огава 1:1600),

- отсутствие в геноме штамма - V.cholerae генов коровой области профага СТХφ (ctxA, ctxB, асе, zot, orfU, сер),

- отсутствие вирулентности на модели кроликов-сосунков,

- отсутствие продукции холерного токсина.

Культурально-морфологические признаки.

Подвижные, слегка изогнутые палочки, не образующие капсул и спор. На твердых питательных средах растет в виде круглых серовато-голубоватых полупрозрачных колоний, при посеве в бульон вызывает равномерное помутнение среды. Штамм растет на простых средах. Прототроф.

Патогенные свойства - авирулентен для кроликов-сосунков в дозе 10⁵, 10⁷ м.т./мл.

Физиологические свойства.

Лизирует эритроциты барана, агглютинирует куриные эритроциты, растет на щелочном агаре с добавлением 50 мкг/мл полимиксина. Агглютинируется до титра холерными диагностическими сыворотками О и Огава. Чувствителен к холерному диагностическому фагу эльтор. Не ферментирует лактозу и арабинозу. До кислоты без газа ферментирует маннозу, сахарозу, маннит, мальтозу.

Штамм хранят в лиофильно высушенном состоянии не менее одного года.

Пример 1, показывающий отсутствие генов коровой области профага СТХφ.

Культуру штамма V.cholerae KM 262 рассевают на LB-агар для тестирования различных генов профага СТХφ с помощью полимеразной цепной реакцией (ПЦР) со специфическими праймерами. Препараты тотальной ДНК получают методом кипячения бактериальной взвеси (10⁷ м.к./мл) в дистиллированной воде в течение 30 минут на водяной бане с последующим центрифугированием при 10000 об/мин. ПЦР проводят в микропробирках объемом 600 мкл на программируемом термостате «Терцик». Выявление фрагментов генов в хромосомах изучаемых штаммов осуществляют с использованием олигонуклеотидных праймеров:

ctA1(5'-CGGGCAGATTCTAGACCTCCTG-3')

ctxA2(5'-CGATGATCTTGGAGCATTCCCAC-3')

zot1(5'-TCGCTTAACGATGGCGCGTTTT-3')

zot2(5'-TCGCTTAACGATGGCGCGTTTT-3')

zot2(5'-AACCCCGTTTCACTTCTACCCA-3')

ace1(5'-TAAGGATGTGCTTATGATGGACACCC-3')

ace2(5'-CGTGATGAATAAAGATACTCATAGG-3')

cep1(5'-CAGAACAATTGCCCCCACCAC-3')

cep2(5'-AAGCACGCTTTCACTCGGGG-3')

orfU1{5'-CAAAATGAGCATGGCGGC-3')

orfU2{5'-CCCATTGTGCAATCGGTGT-3')

синтезированных в НПФ «Литех» (Россия) на автоматическом синтезаторе ДНК «ACM102U». Продукты ПЦР фракционируют в 2% агарозном геле (BioRad) и регистрируют в ультрафиолетовом свете. ПЦР-анализ штамма КМ262 показывает отсутствие в его геноме генов профага СТХφ - ctxA, ctxB, асе, zot, orfU, сер.

Пример 2, подтверждающий отсутствие продукции холерного токсина штаммом V.cholerae KM 262 иммуноферментным методом.

Продукцию холерного токсина определяют с помощью иммуноферментного метода GM1 ELISA (Svennerholm A.M. et al. J. clin. Microbiol., 1983, v.l7, p.596-601). Выращивание клеток холерного вибриона проводили в AKI бульоне при 37°С в течение 4 ч без аэрации и последующих 16 ч в условиях интенсивной аэрации (Iwanaga М, Yamamoto К, Higa et al., J. Microbiol. Immunol., 1986, v.30, p.1075-1083). По истечении времени культивирования пробы центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость инкубируют в течение двух часов при 37°С в лунках микроплат, затем блокируют неспецифическую сорбцию инертным белком (бычий сывороточный альбумин). Проводят инкубацию с кроличьей антитоксической противохолерной сывороткой, разведенной 1:200, в течение 1 ч при 37°С. После промывания лунок 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,2-7,4, добавляют рабочее разведение иммуноферментных коньюгатов, которые представляют собой меченные пероксидазой козьи диагностические антитела против иммуноглобулинов кролика. Реакцию учитывают через 15 минут после добавления субстрата: 0,03% перекиси водорода в цитратном буфере, рН 4,0, с 0,1% ABTS [2,2-азино-бис-(3-этилбензтиазолинсульфонат)]. В качестве положительного контроля и для определения чувствительности метода используют очищенный препарат холерного токсина, полученный из эталонного высокотоксигенного штамма V.cholerae 569B. Чувствительность метода GM1 ELISA составляет в данной серии опытов 1 мкг/мл. Результаты, полученные при определении продукции холерного токсина штаммом V.cholerae KM 262, были отрицательные, что свидетельствует об отсутствии продукции данного белка.

Пример 3, подтверждающий отсутствие вирулентности на модели кроликов-сосунков.

Вирулентность штамма V.cholerae KM 262 определяют путем внутрикишечного заражения крольчат-сосунков по N.K.Dutta и M.K.Habbu (Brit. J. PharmacoL, 1955, v.256 (23), p.12252-12256). Для заражения используют 4-часовую агаровую культуру, выращенную при 37°С. В опытах используют 8-10-дневных кроликов-сосунков, которым вводят внутрикишечно две заражающие дозы: 1×10⁵ и 1×10⁷ м.к. Наблюдение за животными ведут в течение 48 ч. У животных, зараженных штаммом V.choleras KM 262, не наблюдается никаких видимых изменений в кишечнике экспериментальных животных, что подтверждает отсутствие вирулентности у штамма KM 262.

Пример 4. Определение продукции протективного антигена Огава.

Высушенную ампульную культуру штамма V.cholerae KM 262 засевают на агар Хоттингера, рН 7,6, и инкубируют 18 ч при 37°С. Выросшую культуру рассевают на агар Хоттингера, рН 7,6, и используют для изучения антигенных свойств с помощью развернутой реакции агглютинации с холерными сыворотками O1, Инаба, Огава и RO. Готовят взвесь штамма холерного вибриона, соответствующего 5 единицам отраслевого стандартного образца мутности (ОСО 42-28-86П), эквивалентную 1×10⁹ м.к./мл. Диагностические сыворотки двукратно разводят 0,3%-ным раствором натрия хлорида в объеме 0,5 мл соответственно величине диагностического титра и добавляют 0,5 мл взвеси изучаемого штамма KM 262. Пробирки тщательно встряхивают, инкубируют при температуре 37°С в течение 2 ч и еще 18-20 ч при температуре 20-22°С. Изучаемый штамм KM 262 агглютинируется сывороткой к О1-антигену (обратная величина титра составляет 3200) и серовароспецифической сывороткой к антигену Огава (обратная величина титра составляет 1600). Агглютинация с серовароспецифической сывороткой Инаба и RO отсутствует.

Пример 5. Использование штамма в производстве экспериментальных серий химической противохолерной вакцины.

Для подтверждения способности заявляемого штамма V. cholerae KM 262 вырабатывать протективный антиген Огава проводят глубинное культивирование штамма в течение 7-10 ч на ферментере с автоматическими системами поддержания параметров культивирования с подкормкой (глюкоза 40%) и коррекцией рН (аммиак). Объем питательной среды составляет 14 л, температура культивирования 37°С. Питательной средой служит казеиновый бульон с 1% пептоном (рН 7,6-8,0). Для получения препаратов О-антигена используют формалинизированный центрифугат бульонной культуры. Содержание антигенов О1 и Огава определяют в реакции диффузной преципитации в агарозном геле по Оухтерлони (РДП) со специфическими агглютинирующими сыворотками О1 и Огава. Сыворотки против антигенов О1 и Огава образовывают линию преципитации в РДП с формалинизированным центрифугатом в трех экспериментальных сериях препарата в разведениях 1:16 и 1:32 соответственно, что сопоставимо с данными при выращивании вирулентных штаммов холерных вибрионов, используемых в настоящее время при производстве химической таблетированной вакцины.

Таким образом, заявляемый штамм Vibrio cholerae KM 262 является авирулентным штаммом, продуцирующим протективный антиген Огава. Штамм может быть использован в производстве для получения химической холерной вакцины, производство которой основано на выращивании авирулентных штаммов, а также для получения очищенных препаратов антигена Огава, используемого для приготовления диагностической сыворотки.

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для производства химических вакцин против возбудителя холеры и получения очищенного препарата O1 антигена Огава для приготовления диагностической сыворотки. Авирулентный штамм Vibrio cholerae биовара эльтор серовара Огава - продуцент основного протективного O1 антигена серовара Огава получен в модельном эксперименте из вирулентного природного штамма V.cholerae M 569 Огава путем спонтанной потери профага СТХφ при длительном пребывании возбудителя холеры в стерильной речной воде. Штамм депонирован в ГК патогенных бактерий «Микроб» под номером КМ 262. Особенностью штамма является отсутствие генов коровой области профага СТХφ. Штамм авирулентен для кроликов сосунков, агглютинируется холерными сыворотками O1 и Огава в разведениях выше диагностического титра. Использование изобретения позволяет получить вакцину на основе O1 протективного антигена серовара Огава, обеспечивающую формирование антибактериального иммунитета при холере.

Авирулентный штамм бактерий Vibrio cholerae биовара эльтор серовара Огава, депонированный в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» под номером КМ262, - продуцент протективного O1 антигена.