АВИРУЛЕНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ Vibrio cholerae KM 263 БИОВАРА ЭЛЬТОР СЕРОВАРА ИНАБА - ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕКТИВНОГО О1 АНТИГЕНА Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C12R1/63 A61K39/106 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению авирулентного штамма холерного вибриона биовара эльтор серовара Инаба, характеризующегося высокой продукцией основного протективного O1 антигена Инаба, предназначенного для производства химических вакцин против возбудителя холеры и получения очищенного препарата O1 антигена Инаба для приготовления диагностической сыворотки.

К основным факторам вирулентности Vibrio cholerae, которые являются и основными протективными антигенами, относят холерный токсин, токсин-корегулируемые пили адгезии и O-антиген, отвечающие, соответственно, за формирование при холере антитоксического, антиколонизирующего и антибактериального иммунитета. Кроме того, O-антиген обладает серологической специфичностью и используется для серодиагностики и идентификации возбудителя холеры. Ключевым фактором вирулентности холерных вибрионов является холерный экзотоксин - термолабильный белок, вызывающий развитие тяжелой диареи - основного клинического симптома при холере. Биосинтез холерного токсина кодируют структурные гены ctxA и ctxB, входящие в состав коровой области умеренного нитчатого фага СТХφ, интегрированного в хромосому холерного вибриона. Коровая область профага СТХφ помимо генов ctxAB включает гены zot и асе, кодирующие продукцию двух других холерных токсинов, и гены orfU и сер, продукты которых необходимы для формирования фаговых частиц. Все вирулентные штаммы V. cholerae эффективно секретируют in vitro и/или in vivo холерный токсин. Для вакцинопрофилактики при создании вакцин как химических, так и живых используют штаммы холерных вибрионов, продуцирующие основные протективные антигены.

В настоящее время при производстве лицензированной бивалентной химической таблетированной холерной вакцины в Российской Федерации используют вирулентные штаммы холерного вибриона О1 серогруппы классического биовара, вызвавшего шесть предыдущих пандемий азиатской холеры. Однако в данной вакцине отсутствуют биовароспецифические антигены возбудителя текущей, седьмой пандемии холеры (V. cholerae О1 биовара эльтор) и она не может обеспечить высокий уровень защиты от холеры эльтор.

Известен вирулентный штамм V. cholerae KM207 O1 серогруппы классического биовара серовара Инаба продуцент протективных антигенов - холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии (патент RU 2222595 C1). Однако продукция O1 антигена у данного штамма неизвестна.

Известен штамм классического биовара серовара Инаба - продуцент холерного токсина V.cholerae КМ76 (штамм ранее использовался в производстве таблетированной бивалентной химической вакцины) (патент RU 1460075). Однако данный штамм является высоковирулентным и требует повышенных мер безопасности при работе с ним.

Известен штамм V.cholerae 569 В классического биовара серовара Инаба - продуцент холерного токсина и O1 антигена серовара Инаба, используемый как в отечественной, так и зарубежной медицине в качестве производственного для получения химической вакцины (патент RU 2159128, 20.11.2000; Ketley J. et al. Infect. Immun., 1990, v.141, p.893-899). Однако указанный штамм является высоковирулентным и требует больших материальных затрат для обеспечения биологической безопасности производства химической вакцины.

Штаммы классического биовара стабильно наследуют внедренный в хромосому фаг СТХφ. Для штаммов холерного вибриона биовара эльтор имеются литературные данные о потере в определенных условиях профага СТХφ, что ведет к образованию стабильных авирулентных клонов (Кульшань Т.А. с соавторами, Пробл. особо опасных инф. 2006, №91, с.44-48).

Задачей изобретения является получение авирулентного штамма V. cholerae O1 биовара эльтор серовара Инаба, эффективно продуцирующего O1 протективный антиген серовара Инаба, обеспечивающего формирование антибактериального иммунитета при холере.

Сущность изобретения состоит в получении авирулентного штамма V.cholerae биовара эльтор серовара Инаба, являющегося продуцентом основного протективного O1 антигена серовара Инаба.

Заявляемый штамм получен в модельном эксперименте из вирулентного природного штамма V.cholerae M569 Инаба, выделенного от больного на территории республики Мордовия (г.Саранск), в 1974 году, путем спонтанной потери профага СТХφ при длительном пребывании возбудителя холеры в стерильной речной воде.

В результате получен авирулентный штамм холерного вибриона эльтор биовара серовара Инаба, эффективно продуцирующий протективный O1 антиген Инаба.

Штамм V. cholerae M569 (ПВ) депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб» под номером КМ263

Основные свойства штамма V.cholerae KM263.

- высокий уровень продукции O1 антигена Инаба (титр агглютинации с сывороткой Инаба 1:3200);

- отсутствие в геноме генов коровой области профага СТХφ (ctxA, ctxB, асе, zot, orfU, сер);

- отсутствие холерогенного эффекта на модели кроликов-сосунков;

- отсутствие продукции холерного токсина;

Культурально-морфологические признаки.

Подвижные, слегка изогнутые палочки, не образующие капсул и спор. На твердых питательных средах растет в виде круглых серовато-голубоватых полупрозрачных колоний, при посеве в бульон вызывает равномерное помутнение среды. Штамм растет на простых средах. Прототроф.

Патогенные свойства - авирулентен для кроликов-сосунков в дозе 10⁵, 10⁷ м.т./мл.

Физиологические свойства.

Лизирует эритроциты барана, агглютинирует куриные эритроциты, растет на щелочном агаре с добавлением 50 мкг/мл полимиксина. Агглютинируется до титра холерными диагностическими сыворотками О и Инаба. Чувствителен к холерному диагностическому фагу эльтор. Не ферментирует лактозу и арабинозу. До кислоты без газа ферментирует маннозу, сахарозу, маннит, мальтозу.

Штамм хранят в лиофильно высушенном состоянии не менее одного года. Пример 1, показывающий отсутствие генов коровой области профага СТХφ. Культуру штамма V.cholerae KM263 рассевают на LB-агар для тестирования генов профага СТХφ с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими праймерами. Препараты тотальной ДНК получают методом кипячения бактериальной взвеси (10⁷ м.к./мл) в дистиллированной воде в течение 30 минут на водяной бане с последующим центрифугированием при 10000 об/мин ПЦР проводят в микропробирках объемом 600 мкл на программируемом термостате «Терцик». Выявление фрагментов генов коровой области профага СТХф в хромосоме изучаемого штамма осуществляют с использованием следующих олигонуклеотидных праймеров:

ctxA1(5'-CGGGCAGATTCTAGACCTCCTG-3')

ctxA2(5'-CGATGATCTTGGAGCATTCCCAC-3')

zot1(5'-TCGCTTAACGATGGCGCGTTTT-3')

zor2(5'-AACCCCGTTTCACTTCTACCCA-3')

ace1(5'-TAAGGATGTGCTTATGATGGACACCC-3')

ace2(5'-CGTGATGAATAAAGATACTCATAGG-3')

cep1(5'-CAGAACAATTGCCCCCACCAC-3')

cep2(5'-AAGCACGCTTTCACTCGGGG-3')

orfU1(5'-CAAAATGAGCATGGCGGC-3')

orfU2(5'-CCCATTGTGCAATCGGTGT-3')

синтезированных в НПФ «Литех» (Россия) на автоматическом синтезаторе ДНК «ACM102U». Продукты ПЦР фракционируют в 2% агарозном геле (BioRad) и регистрируют в ультрафиолетовом свете. При ПЦР-анализе штамма КМ263 гены ctxA, ctxB, асе, zot, orfU, сер отсутствуют, что указывает на отсутствие профага СТХφ.

Пример 2, подтверждающий отсутствие продукции холерного токсина штаммом V.cholerae KM263 иммуноферментным методом.

Продукцию холерного токсина определяют с помощью иммуноферментного метода GM1 ELISA (Svennerholm A.M. et al. J. Clin. Microbiol, 1983, v.17, p.596-601). Выращивание клеток холерного вибриона проводят в AKI бульоне при 37°C в течение 4 ч без аэрации и последующих 16 ч в условиях интенсивной аэрации (Iwanaga M, Yamamoto К, Higa et al., J Microbiol. Immunol, 1986, v.30, p.1075-1083). По истечении времени культивирования пробы центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость инкубируют в течение двух часов при 37°С в лунках микроплат, затем блокируют неспецифическую сорбцию инертным белком (бычий сывороточный альбумин). Проводят инкубацию с кроличьей антитоксической противохолерной сывороткой, разведенной 1:200, в течение 1 ч при 37°C. После промывания лунок 0,05 М фосфатным буфером pH 7,2-7,4 добавляют рабочее разведение иммуноферментных коньюгатов, которые представляют собой меченые пероксидазой козьи диагностические антитела против иммуноглобулинов кролика. Реакцию учитывают через 15 минут после добавления субстрата - 0,03% перекиси водорода в цитратном буфере pH 4,0 с 0,1% ABTS [2,2 azino-di-(3-thylbenzthiazoline sulphonate)]. В качестве положительного контроля и для определения чувствительности метода используют очищенный препарат холерного токсина, полученный из эталонного высокотоксигенного штамма V.cholerae 569B. Чувствительность метода GM1 ELISA составляет в данной серии опытов 1 мкг/мл. Результаты, полученные при определении продукции холерного токсина штаммом V.cholerae KM263, были отрицательные, что свидетельствует об отсутствии продукции данного белка.

Пример 3, подтверждающий отсутствие вирулентности на модели кроликов-сосунков.

Вирулентность штамма V.cholerae KM263 определяют путем внутрикишечного заражения крольчат-сосунков по N.K.Dutta и M.K.Habbu (Brit. J. Pharmacol., 1955, v.256 (23), p.12252-12256). Для заражения используют 4-х часовую агаровую культуру, выращенную при 37°C. В опытах используют 8-10 дневных кроликов-сосунков, которым вводят внутрикишечно две заражающие дозы - 1×10⁵ и 1×10⁷ м.к. Наблюдение за животными ведут в течение 48 ч. В кишечнике экспериментальных животных, зараженных штаммом V.cholerae KM263, не наблюдают никаких видимых изменений, что подтверждает отсутствие вирулентности у заявляемого штамма.

Пример 4. Определение продукции протективного O1 антигена Инаба.

Высушенную ампульную культуру штамма V.cholerae KM263 засевают на агар Хоттингера pH 7.6 и инкубируют 18 ч при 37°C. Выросшую культуру рассевают на агар Хоттингера pH 7.6 и используют для изучения антигенных свойств с помощью развернутой реакции агглютинации с холерными сыворотками O1, Инаба, Огава и RO. Готовят взвесь штамма холерного вибриона, соответствующего 5 единицам отраслевого стандартного образца мутности (ОСО 42-28-86П), эквивалентную 1×10⁹ м.к./мл. Диагностические сыворотки двукратно разводят 0,3%-м раствором натрия хлорида в объеме 0,5 мл соответственно величине диагностического титра и добавляют 0,5 мл взвеси изучаемого штамма KM263. Пробирки тщательно встряхивают, инкубируют при температуре 37°C в течение 2 ч, и еще 18-20 ч при температуре 20-22°C. Изучаемый штамм KM263 агглютинируется сывороткой к O1-антигену в титре 1:3200 и серовароспецифической сывороткой к антигену Инаба в титре 1:3200. Агглютинация с серовароспецифической сывороткой Огава и RO отсутствует.

Пример 5. Использование штамма в производстве экспериментальных серий химической противохолерной вакцины.

Для подтверждения способности заявляемого штамма V. cholerae KM263 вырабатывать протективный биовароспецифический антиген Инаба проводят глубинное культивирование штамма в течение 7-10 ч на ферментере с автоматическими системами поддержания параметров культивирования с подкормкой (глюкоза 40%) и коррекцией pH (аммиак). Объем питательной среды составляет 14 л, температура культивирования 37°C. Питательной средой служит казеиновый бульон с 1% пептоном (pH 7,6-8,0). Для получения препаратов O-антигена используют формалинизированный центрифугат бульонной культуры. Содержание антигенов O1 и Инаба определяют в реакции диффузной преципитации в агарозном геле по Оухтерлони (РДП) со специфическими агглютинирующими сыворотками O1 и Инаба. Сыворотки против антигенов O1 и Инаба образовывают линию преципитации в РДП с формалинизированным центрифугатом в трех экспериментальных сериях препарата в разведениях 1:16 и 1:32, соответственно, что сопоставимо с данными при выращивании вирулентных штаммов холерных вибрионов, используемых в настоящее время при производстве химической таблетированной вакцины.

Таким образом, заявляемый штамм Vibrio cholerae KM263 является авирулентным штаммом, продуцирующим протективный антиген Инаба. Штамм может быть использован в производстве для получения химической холерной вакцины, производство которой основано на выращивании авирулентных штаммов, а также для получения очищенных препаратов антигена Инаба, используемого для приготовления диагностической сыворотки.

Авирулентный штамм Vibrio cholerae KM 263 биовара эльтор серовара Инаба - продуцент протективного O1 антигена получен в модельном эксперименте из вирулентного природного штамма Vibrio cholerae M569 Инаба путем спонтанной потери профага СТХφ при длительном пребывании возбудителя холеры в стерильной речной воде. Штамм характеризуется высоким уровнем продукции основного протективного O1 антигена серовара Инаба. Изобретение предназначено для производства химических вакцин против возбудителя холеры, обеспечивающих формирование антибактериального иммунитета при холере, и получения очищенного препарата O1 антигена серовара Инаба для приготовления диагностической сыворотки.

Авирулентный штамм бактерий Vibrio cholerae биовара эльтор серовара Инаба, депонированный в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» под номером КМ263, - продуцент протективного O1 антигена.