Способ оценки состава биопленок грамположительных бактерий Российский патент 2019 года по МПК G01N33/52 C12Q1/00 

Описание патента на изобретение RU2688215C1

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, инфекционным болезням, дезинфектологии и может быть использовано для изучения действия факторов на биопленку и биопленкообразующую способность грамположительных микроорганизмов.

Биопленки - высокоорганизованные, подвижные, непрерывно изменяющиеся гетерогенные сообщества микроорганизмов, состоящие, как правило, из клеточной части и, преимущественно полисахаридного, матрикса, обеспечивающего защиту от неблагоприятных внешних факторов, в том числе эффекторов иммунитета и антибиотиков, снижая эффективность антибиотикотерапии в десятки раз (Сидоренко С.В. и соавт., 2017). Существующие методы визуализации биопленки не предусматривают дифференцированной окраски ее компонентов, т.к. нет возможности установить субстрат, окрашиваемый генцианвиолетом, поскольку этот краситель может формировать комплексы как с внутриклеточными, так и внеклеточными структурами. Такой подход не позволяет адекватно оценивать антибиопленочные эффекты препаратов, в то время как результаты изучения взаимодействия лекарственных средств с компонентами биопленки могут обеспечивать их наиболее корректный выбор.

Известен способ оценки биопленокоообразующей способности микроорганизмов при 45-минутной экспозиции в 0,1% водном растворе генцианвиолета с последующей его экстракцией спиртом в течение 45 минут [Карпова Т.Н., Дронина Ю.Е., Алексеева Н.В., Романова Ю.М., Тартаковский И.С. Формирование биопленок Legionella spp. в эксперименте // Журн. микробиол. - 2008. - №1. - С. 1-7.].

Недостатки прототипа: недостаточная точность способа из-за отсутствия возможности дифференцировки компонентов биопленки, длительность процедуры.

Технический результат: повышение информативности способа за счет дифференцировки клеточной составляющей и матрикса биопленки, сокращение времени процедуры.

Сущность метода заключается в том, что для оценки компонентного состава биопленок используют двухэтапный подход, позволяющий на первом этапе оценить долю матрикса, а на втором - ее клеточные и экстрацеллюлярные (внеклеточные) компоненты в совокупности. Такой дифференцированный анализ дает возможность определять точки действия лекарственных препаратов и повышать терапевтический эффект за счет комбинации лекарственных средств, с различными мишенями действия.

Способ осуществляют следующим образом:

Биопленки исследуемых культур формируют в плоскодонных микротитрационных планшетах традиционным способом, подготавливая не менее 5 повторностей на каждый вариант эксперимента. Далее в планшет вносят 0,1%-водный раствор генцианвиолета на 5 минут, а затем раствор Люголя на 2 минуты. По окончании окраски планшеты промывают забуференным раствором и высушивают на воздухе, предохраняя их от попадания солнечных лучей. В таком состоянии планшеты можно хранить.

На первом этапе часть лунок (не менее 5) заливают 70% спиртом и сразу же переносят элюат в новую планшету.

На втором этапе другую часть лунок (не менее 5) так же заливают 70% спиртом и выдерживают 15 минут, после чего собирают элюат в новую планшету.

Все пробы фотометрируют при длине волны 560 нм.

Для вычисления доли матрикса и клеточной составляющей в составе биопленки используют формулу:

М=(ОПбв/ОП15)×100,

Кб=100-М, где

М - доля матрикса, %

Кб - доля клеточной составляющей, %

ОПбв - оптическая плотность проб, когда спирт для элюации выдерживали не более 1 минуты,

ОП15 - оптическая плотность проб, когда спирт для элюации выдерживали 15 минут.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. В планшеты с готовыми биопленками Staphylococcus aureus вносили 200 мкл 0,1%-водного раствора генцианвиолета на 5 минут. Окрашивание проводили в темноте. После инкубации краситель из планшета сливали и однократно промывали. Затем вносили 200 мкл раствора Люголя на 2 минуты. Завершали процедуру окраски - промывкой планшета и его высушиванием. После высушивания в лунки планшета вносили 200 мкл 70% раствора спирта. Часть лунок после внесения спирта тут же декантировали, перенося элюат в новую планшету для фотометрии, а вторую половину лунок выдерживали со спиртом не менее 15 минут. Фотометрирование проводили при 560 нм.

Штамм S. aureus АТСС 28922: ОПбв=0,310; ОП15=2,356; М=13,2%; Кб=86,8%. В составе биопленки, сформированной коллекционным штаммом удельный вес матрикса составляет 13,2%, а на клеточный компонент приходится 86,8%. Такое соотношение компонентов соответствует оптимальному для стафилококков уровню, что обусловлено адекватными условиями культивирования штамма.

Пример 2. Чтобы оценить влияние лизоцима на биопленкообразующую способность штамма Staphylococcus aureus АТСС 28922 при формировании биопленок в планшеты дополнительно вносили раствор лизоцима гидрохлорида в концентрации 1 мг/мл. На сформированные биопленки добавляли по 200 мкл 0,1%-водного раствора генцианвиолета на 5 минут. Окрашивание проводили в темноте. После инкубации краситель из планшета сливали и однократно промывали. Затем вносили 200 мкл раствора Люголя на 2 минуты. Завершали процедуру окраски - промывкой планшета и его высушиванием. После высушивания в лунки планшета вносили 200 мкл 70% раствора спирта. Часть лунок после внесения спирта тут же декантировали, перенося элюат в новую планшету для фотометрии, а вторую половину лунок выдерживали со спиртом не менее 15 минут. Фотометрирование проводили при 560 нм.

Штамм S. aureus АТСС 28922 после культивирования в присутствии лизоцима гидрохлорида: ОПбв=0,834; ОП15=2,559; М=32,6%; Кб=67,4%. В составе биопленки, сформированной коллекционным штаммом при действии лизоцима, удельный вес матрикса составляет 32,6%, а клеточный компонент - 67,4%, что связано с ингибирующим действием фермента на планктонные формы. Ответная реакция проявляется интенсификацией биопленкообразования за счет формирования защитного матрикса, что указывает на нецелесообразность использования лизоцима в терапии.

Пример 3. Для оценки действия цефазолина на биопленкообразующую способность штамма Staphylococcus aureus АТСС 28922 в лунки планшета дополнительно вносили раствор антибиотика в концентрации 50 мкг/мл. На готовые пленки S. aureus в планшеты вносили 200 мкл 0,1%-водного раствора генцианвиолета на 5 минут. Окрашивание проводили в темноте. После инкубации краситель из планшета сливали и однократно промывали. Затем вносили 200 мкл раствора Люголя на 2 минуты. Завершали процедуру окраски - промывкой планшета и его высушиванием. После высушивания в лунки планшета вносили 200 мкл 70% раствора спирта. Часть лунок после внесения спирта тут же декантировали, перенося элюат в новую планшету для фотометрии, а вторую половину лунок выдерживали со спиртом не менее 15 минут. Фотометрирование проводили при 560 нм.

Штамм S. aureus АТСС 28922 после культивирования. в присутствии цефазолина: ОПбв=0,189; ОП15=0,453; М=41,7%; Кб=58,3%. В составе биопленки, сформированной коллекционным штаммом при действии цефазолина, удельный вес матрикса увеличивается до 41,7%, а доля клеточного компонента существенно снижается. Полученный результат связан с действием антибиотика, который, как известно, ингибирует синтез основного вещества клеточной стенки стафилококков - пептидогликана. В результате этого число клеток в биопленке существенно снижается. Оставшиеся жизнеспособными клетки стафилококка, компенсаторно увеличивают продукцию веществ матрикса для защиты от антибиотика. В связи с этим, при использовании цефазолина необходимо дополнять терапевтическую схему препаратами (протеазы, липазы, нуклеазы), действие которых направлено на разрушение матрикса.

Положительный эффект заявляемого способа состоит в следующем: способ оценки компонентного состава биопленок грамположительных бактерий позволяет отдифференцировать внеклеточные вещества и структуры матрикса биопленки, окрашиваемые генцианвиолетом, обеспечивая получение дополнительной информации, способствующей повышению эффективности антимикробной терапии, при сокращении времени исследования.

Похожие патенты RU2688215C1

название год авторы номер документа
Способ оценки бактериальной биоплёнки 2021
  • Кряжев Дмитрий Валерьевич
  • Ермолина Галия Бариевна
  • Кропотов Василий Сергеевич
RU2770413C1
Способ оценки морфологической структуры биопленок микроорганизмов 2019
  • Годовалов Анатолий Петрович
  • Степанов Максим Сергеевич
  • Кобзаренко Ева Евгеньевна
RU2719402C1
Способ оценки морфологической структуры биоплёнок микроорганизмов в динамике биоплёнкообразования 2024
  • Кряжев Дмитрий Валерьевич
  • Кропотов Василий Сергеевич
RU2826880C1
ШТАММ БАКТЕРИОФАГА Staphylococcus aureus SA20, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЙ РАЗРУШЕНИЕ БИОПЛЕНОК, ОБРАЗУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ РОДА Staphylococcus 2014
  • Козлова Юлия Николаевна
  • Морозова Вера Витальевна
  • Тикунова Нина Викторовна
  • Рябчикова Елена Ивановна
  • Курильщиков Александр Михайлович
  • Власов Валентин Викторович
RU2565824C1
Экспресс-тест для обнаружения биологических плёнок бактерий на абиотических поверхностях (варианты) 2019
  • Емшанов Олег Владимирович
  • Синицин Аркадий Пантелеймонович
  • Романова Юлия Михайловна
  • Алексеева Наталья Валентиновна
  • Филипова Наталья Игоревна
  • Толордава Этери Ромеовна
RU2722795C1
СРЕДСТВО ДЛЯ СЕЛЕКТИВНОГО ВЛИЯНИЯ НА БИОПЛЕНКООБРАЗОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ 2016
  • Бухарин Олег Валерьевич
  • Фролов Борис Александрович
  • Чайникова Ирина Николаевна
  • Перунова Наталья Борисовна
  • Иванова Елена Валерьевна
  • Филиппова Юлия Владимировна
  • Бондаренко Таисия Александровна
  • Сидорова Оксана Игоревна
  • Панфилова Татьяна Владимировна
  • Железнова Алла Дмитриевна
  • Сарычева Юлия Александровна
RU2646488C2
ДОБАВКА К ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ БИОПЛЕНОК (ВАРИАНТЫ) 2014
  • Баранов Александр Александрович
  • Чеботарь Игорь Викторович
  • Смирнов Иван Евгеньевич
  • Лазарева Анна Валерьевна
RU2571854C1
СПОСОБ ДЕСТРУКЦИИ БИОПЛЁНОК PSEUDOMONAS AERUGINOSA КОМБИНАЦИЕЙ ОЗОНА С ПЕРОКСИДОМ ВОДОРОДА 2023
  • Ушакова Анастасия Алексеевна
  • Каримов Ильшат Файзелгаянович
  • Борисов Сергей Дилюсович
  • Паньков Александр Сергеевич
RU2802662C1
Способ оценки антибактериального действия антисептиков на микробные биопленки 2016
  • Кузнецова Марина Валентиновна
  • Самарцев Владимир Аркадьевич
  • Еньчева Юлия Абыталиновна
RU2621306C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ ХАРАКТЕРА МЕЖМИКРОБНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ 2010
  • Карпунина Тамара Исаковна
  • Кузнецова Марина Валентиновна
  • Николаева Нина Владимировна
  • Дробкова Вера Анатольевна
  • Ширева Юлия Владимировна
RU2448161C2

Реферат патента 2019 года Способ оценки состава биопленок грамположительных бактерий

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, инфекционным болезням, дезинфектологии, и может быть использовано для изучения действия факторов на биопленку и биопленкообразующую способность грамположительных микроорганизмов. Способ оценки состава биопленок грамположительных бактерий, сформированных в полистироловых планшетах, осуществляют с помощью 0,1% водного раствора генцианвиолета с его экстракцией спиртом и фотометрированием проб при длине волны 560 нм, при этом окраску генцианвиолетом осуществляют в течение 5 минут с последующей фиксацией красителя в бактериальных клетках раствором Люголя, растворяют окрашенные продукты 70% спиртом: компоненты матрикса в течение 1 минуты, совокупной биопленки в течение 15 минут, после чего оценивают состав биопленок по формулам М=(ОПбв / ОП15) × 100; Кб=100-М, где М - доля матрикса, %; Кб - доля клеточной составляющей, %; ОПбв - оптическая плотность проб, когда спирт для растворения окрашенного продукта выдерживают не более 1 минуты; ОП15 - оптическая плотность проб, когда спирт для растворения окрашенного продукта выдерживают 15 минут. Способ позволяет отдифференцировать клеточную составляющую и матрикс биопленки, при сокращении времени исследования. 3 пр.

Формула изобретения RU 2 688 215 C1

Способ оценки состава биопленок грамположительных бактерий, сформированных в полистироловых планшетах, с помощью 0,1% водного раствора генцианвиолета с его экстракцией спиртом и фотометрированием проб при длине волны 560 нм, отличающийся тем, что окраску генцианвиолетом осуществляют в течение 5 минут с последующей фиксацией красителя в бактериальных клетках раствором Люголя, растворяют окрашенные продукты 70% спиртом: компоненты матрикса в течение 1 минуты, совокупной биопленки в течение 15 минут, после чего оценивают состав биопленок по формуле

М=(ОПбв/ОП15)×100, Кб=100-М, где

М - доля матрикса, %,

Кб - доля клеточной составляющей, %,

ОПбв - оптическая плотность проб, когда спирт для растворения окрашенного продукта выдерживают не более 1 минуты,

ОП15 - оптическая плотность проб, когда спирт для растворения окрашенного продукта выдерживают 15 минут.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2019 года RU2688215C1

КАРПОВА Т.Н
и др
Формирование биопленок Legionella spp
в эксперименте
Журнал микробиологии
Станок для изготовления деревянных ниточных катушек из цилиндрических, снабженных осевым отверстием, заготовок 1923
  • Григорьев П.Н.
SU2008A1
Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
СПОСОБ ОЦЕНКИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ ОЗОНИРОВАННОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА 2010
  • Карпунина Тамара Исаковна
  • Кузнецова Марина Валентиновна
  • Николаева Нина Владимировна
  • Самарцев Владимир Аркадьевич
  • Еремеева Марина Ивановна
  • Осокин Александр Степанович
  • Кирилова Татьяна Анатольевна
RU2425888C1
Кипрегель, снабженный теодолитом 1930
  • Ковальский Г.И.
SU20326A1
Прибор для контроля исправности цепей управления 1950
  • Будницкий Ш.М.
SU89508A1
STIEFEL P
et al
Приспособление в пере для письма с целью увеличения на нем запаса чернил и уменьшения скорости их высыхания 1917
  • Латышев И.И.
SU96A1
Applied Microbiology and Biotechnology, 2016, V
Облицовка комнатных печей 1918
  • Грум-Гржимайло В.Е.
SU100A1
Разборный с внутренней печью кипятильник 1922
  • Петухов Г.Г.
SU9A1
Устройство для электрической телескопии 1926
  • Горин Е.Е.
SU4135A1

RU 2 688 215 C1

Авторы

Карпунина Тамара Исаковна

Годовалов Анатолий Петрович

Рябова Лидия Дмитриевна

Даты

2019-05-21Публикация

2018-12-12Подача