ГЕТЕРОДИМЕРНЫЙ БЕЛОК IL-15 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2019 года по МПК C07K19/00 C07K14/54 C07K14/715 C12N15/62 C12N15/63 A61K38/20 A61K39/395 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к гетеродимерному белку IL(интерлейкин)-15 и к его применениям и дополнительно относится к гетеродимерному белковому комплексу IL-15/IL-15Rα и к его применению в качестве терапевтического средства, в частности, в качестве средства для терапии рака и аутоиммунного заболевания.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Интерлейкин 15 (IL-15) открыт группой исследователей Grabstein et al. в 1994 г., представляет собой цитокин около 12-14 кДа, который играет роль в нормальном иммунном ответе организма, например, в стимуляции пролиферации Т-клеток, В-клеток и натуральных киллеров (NK).

IL-15 представляет собой член небольшого семейства цитокинов, имеющих структуру пучка из четырех α-спиралей. Для осуществления биологической активности IL-15 необходимо его связывание с рецептором. Рецептор IL-15 состоит из трех рецепторных субъединиц: рецептора α IL-15 (IL-15Rα), рецептора β IL-2 (IL-2Rβ, также известен как IL-15Rβ или CD122) и γс (также известен как CD132). IL-15Rα содержит домен Sushi, который способен к связыванию с IL-15 и является существенным для биологических функций IL-15 после связывания.

Недавно обнаружено, что комплекс, образуемый IL-15 и его рецептором IL-15Rα, может значительно усиливать биологическую активность IL-15. Исследования показали, что комплекс, образуемый IL-15 и растворимым рецептором IL-15Rα, значительно превосходит отдельный IL-15 в стимуляции пролиферации Т лимфоцитов памяти CD8+ и клеток NT/NKT. Комплекс IL-15/IL-15Rα более чем в 10 раз сильнее, чем отдельный IL-15, стимулирует пролиферацию Т лимфоцитов памяти CD8+ и поддерживает их выживание, при этом механизм этого действия может быть обусловлен цис-презентированием.

Поскольку с IL-15 связаны большие ожидания в области иммунотерапии опухолей, в Национальном институте здравоохранения (NIH) было впервые начато исследование лечения IL-15 в области опухоли и сделана попытка его продвижения в клиническую фазу I. Тем не менее, IL-15 имеет недостатки, обусловленные небольшой молекулярной массой, коротким периодом полувыведения in vivo, слабо контролируемым повторным дозированием, и, вероятно, вызывает системный иммунный побочный эффект. Существует неотложная необходимость в нахождении подхода, который мог бы увеличить период полувыведения in vivo и стимулировать или усилить биологическую активность IL-15 in vivo. В исследования, связанные с иммунотерапией IL-15, вовлечено множество местных и иностранных компаний или научно-исследовательских институтов, например, патент CN 100334112C (Shanghai Haixin Biotechnology Co., Ltd.) относится к гомодимерному белку IL-15-hIgG4Fc при антибактериальном лечении инфекции, патент CN 1942481А (Швейцария, F.Hoffmann-LaRoche AG) относится к системе экспрессии слитого белка IL-15-Fc и к его применению; и патент CN 101360827 В (French Institute of Health and Medical Research) относится к слитому белку IL-15Rα(sushi + домен)-IL-15 и к его применению при лечении рака. Гетеродимерные молекулы согласно настоящей заявке проявляют более высокую стабильность, пролонгированный период полувыведения in vivo и повышенную биологическую активность за счет усиления межмолекулярных взаимодействий. На основании молекулярного конструирования в настоящей заявке можно создать направленные иммунные цитокины путем слияния и вставки функционального полипептида способами, хорошо известными в данной области техники, и настоящее изобретение также относится к применению направленных иммунных цитокинов в терапии рака и аутоиммунного заболевания.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложена молекула белка, обладающая пролонгированным периодом полувыведения in vivo, повышенной активностью in vitro и значительной противоопухолевой активностью, сконструированная и полученная генно-инженерными методами.

В настоящем изобретении предложен гетеродимерный белок IL-15, содержащий:

белок (I) и белок (II);

где белок (I) пересобран и образован IL-15 или его вариантом с первым вариантом Fc;

белок (II) представляет собой второй вариант Fc, или белок (II) пересобран и образован IL-15Rα или его вариантом со вторым вариантом Fc;

белок (I) и белок (II) образуют стабильный гетеродимерный белок посредством взаимодействия между первым вариантом Fc и вторым вариантом Fc.

Как описано выше, термин «пересобран и образован» означает «получен путем экспрессии рекомбинантов различных белков, полученных генно-инженерными методами».

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения первый вариант Fc и второй вариант Fc связаны с С-концом IL-15 и IL-15Rα.

В одном воплощении настоящего изобретения предложен гетеродимерный белок IL-15, где последовательность IL-15 представляет собой SEQ ID NO: 1.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложен гетеродимерный белок IL-15, где белок (II) представляет собой второй вариант Fc.

В одном воплощении настоящего изобретения предложен гетеродимерный белок IL-15, где белок (II) пересобран и образован IL-15Rα или его вариантом со вторым вариантом Fc.

В одном воплощении настоящего изобретения предложен гетеродимерный белок IL-15, где вариант IL-15Rα представляет собой участок внеклеточного домена IL-15Rα или его функциональный фрагмент, при этом функциональный фрагмент предпочтительно представляет собой укороченную форму участка внеклеточного домена IL-15Rα, содержащую от 65 до 120 аминокислот, более предпочтительно укороченную форму, содержащую от 65 до 102 аминокислот.

В одном воплощении настоящего изобретения предложен гетеродимерный белок IL-15, где последовательность варианта IL-15Rα выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-7.

В одном воплощении настоящего изобретения предложен гетеродимерный белок IL-15, где последовательность варианта IL-15Rα выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3-7.

В одном воплощении настоящего изобретения предложен гетеродимерный белок IL-15, где первый вариант Fc и второй вариант Fc соответственно выбраны из Fc, модифицированного с образованием структуры типа «выступ» (Knob), и Fc, модифицированного с образованием структуры типа «впадина» (Hole); или первый вариант Fc и второй вариант Fc соответственно выбраны из Fc, модифицированного с образованием Hole, и Fc, модифицированного с образованием Knob. Структура «Knob/Hole» способствует образованию первым вариантом Fc и вторым вариантом Fc гетеродимерного белка после модификации. Когда первый вариант Fc представляет собой Fc, модифицированный с образованием Knob, второй вариант Fc представляет собой Fc, модифицированный с образованием Hole; или когда второй вариант Fc представляет собой Fc, модифицированный с образованием Knob, первый вариант Fc представляет собой Fc, модифицированный с образованием Hole.

В одном воплощении настоящего изобретения предложен гетеродимерный белок IL-15, где последовательность первого варианта Fc выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29; и последовательность второго варианта Fc выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29. Белок (I) и белок (II) образуют гетеродимер типа «Knob/Hole» посредством вариантов Fc, представленных SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29. Например, когда последовательность первого варианта Fc представляет собой SEQ ID NO: 26, последовательность второго варианта Fc представляет собой SEQ ID NO: 27; или когда последовательность второго варианта Fc представляет собой SEQ ID NO: 26, последовательность первого варианта Fc представляет собой SEQ ID NO: 27.

В одном воплощении настоящего изобретения предложен гетеродимерный белок IL-15, где последовательность белка (I) выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14-17, предпочтительно SEQ ID NO: 14.

В одном воплощении настоящего изобретения предложен гетеродимерный белок IL-15, где последовательность белка (II) выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18-25 и 34-37, предпочтительно SEQ ID NO: 23 и 34-37, более предпочтительно SEQ ID NO: 34-37.

В одном воплощении настоящего изобретения предложен гетеродимерный белок IL-15, где последовательность белка (I) выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 30-31; последовательность белка (II) выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 32-33.

Гетеродимерный белок IL-15 по настоящему изобретению выбран из следующих димерных белков 3-17, где димерные белки 3-17 пересобраны и образованы соответствующим белком (I) и белком (II) в виде вздутия:

Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей вышеупомянутый гетеродимерный белок IL-15.

Настоящее изобретение также относится к ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) вектору, содержащему вышеупомянутую нуклеиновую кислоту.

Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, трансформированной ДНК вектором, упомянутым в настоящем изобретении.

Настоящее изобретение также относится к способу получения гетеродимерного белка IL-15, как описано выше, включающему: культивирование клетки-хозяина по настоящему изобретению в условиях, достаточных для экспрессии гетеродимерного белка IL-15, как описано выше; экспрессию и очистку гетеродимерного белка IL-15.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей гетеродимерный белок IL-15 по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент, разбавитель или носитель.

Настоящее изобретение также относится к направленной молекуле белка, содержащей гетеродимерную структуру белка IL-15 согласно настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к способу стимуляции или ингибирования иммунного ответа у млекопитающего, включающему: введение млекопитающему терапевтически эффективного количества гетеродимерного белка IL-15 согласно настоящему изобретению, или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, или направленной молекулы белка согласно настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к применению гетеродимерного белка IL-15 согласно настоящему изобретению, или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, или направленной молекулы белка согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения опосредованных IL-15 заболеваний или расстройств; где заболевание выбрано из группы, состоящей из инфекционного заболевания, рака, заболевания крови и аутоиммунного заболевания. Рак выбран из группы, состоящей из меланомы, рака толстой кишки, рака кожи, лимфомы, почечно-клеточного рака, солидной опухоли, рака печени, рака легкого, рака желудка и рака молочной железы; инфекционное заболевание выбрано из группы, состоящей из инфекции вируса оспы человека, инфекции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), бактериальной инфекции, грибковой инфекции й инфекции вируса гепатита В (HBV); заболевание крови выбрано из группы, состоящей из анемии, острого миелоидного лейкоза, миелодиспластического синдрома и Т-клеточного лейкоза больших зернистых лимфоцитов; аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из рассеянного склероза, псориаза, ревматоидного артрита, воспалительных заболеваний, гастрита и воспаления слизистой оболочки. При этом лекарственные средства представляют собой гетеродимерный белок IL-15 согласно настоящему изобретению или фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению, вводимые в комбинации с низкомолекулярным(-и) ингибитором(-ами) или антителом(-ами); низкомолекулярный(-ые) ингибитор(-ы) предпочтительно выбран(ы) из алкилирующего(-их) средства(средств); антитело(-а) предпочтительно выбрано(ы) из моноклонального(-ых) антитела(антител), более предпочтительно антитела(антител) к CD20, PD1, PDL1 или Her2. Дополнительно лекарственное средство согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с терапевтически эффективной дозой лекарственных средств, выбранных из группы, состоящей из темозоломида, доксорубицина, паклитаксела, цисплатина, карбоплатина, дакарбазина, топотекана, иринотекана, гемцитабина и бевацизумаба.

Настоящее изобретение также относится к применению гетеродимерного белка IL-15 согласно настоящему изобретению, или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, или направленной молекулы белка согласно настоящему изобретению для клеточной иммунотерапии, в частности, для иммунотерапии опухоли с помощью дендритных клеток (DC), цитокин-индуцированных киллеров (CIK), CIK, культивированных в присутствии дендритных клеток (DC-CIK), усиленных цитокин-индуцированных киллеров (ECIK), натуральных киллеров (NK), ракового антигена модифицированных Т-клеток (CAS-T), биспецифических антител модифицированных Т-клеток (BiAb-T), нативного Т-клеточного рецептора модифицированных Т-клеток (TCR-T) и химерного антигенного рецептора модифицированных Т-клеток (CAR-T).

Иммунотерапия опухолей является горячей точкой терапии рака, которую рассматривают как четвертый метод лечения рака после операции, химиотерапии и радиотерапии. Задача иммунотерапии опухолей состоит в инициации или мобилизации иммунной системы организма, усилении противоопухолевого иммунитета в микроокружении опухоли и последующем контроле и уничтожении опухолевых клеток. Она может представлять собой наиболее эффективный и безопасный подход к лечению рака.

Механизм, лежащий в основе ускользания опухоли от иммунологического надзора, основан на ингибиторном воздействии самой опухоли на иммунную систему для поддержания или стимуляции роста опухоли. Иммунотерапия опухолей должна до крайней степени усилить ответ собственной иммунной системы пациента на опухоль. Необходимо не только активировать существующий ответ иммунной системы in vivo, но необходимо также поддерживать продолжительность и интенсивность ответа иммунной системы: это является основой иммунотерапии опухолей.

Иммунотерапия цитокинами разрабатывается параллельно с получением цитокинов высокой очистки или рекомбинантных цитокинов. Принцип состоит в том, что после инъекции в организм некоторые цитокины могут регулировать и усиливать одну или более функций иммунных клеток и усиливать противоопухолевый иммунитет.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения или профилактики заболевания, при котором клетки экспрессируют ассоциированный с указанным заболеванием антиген, где способ включает: введение пациенту гетеродимерного белка IL-15 согласно настоящему изобретению, или фармацевтической композиции согласно изобретению, или направленной молекулы белка, описанной в изобретении; образование специфично связанного комплекса между клетками, экспрессирующими ассоциированный с заболеванием антиген, и иммунными клетками, экспрессирующими IL-15Rα, достаточного для активации иммунных клеток; и уничтожение клеток, экспрессирующих ассоциированный с заболеванием антиген, посредством иммунных клеток. Клетки, экспрессирующие ассоциированный с заболеванием антиген, предпочтительно представляют собой опухолевые клетки или клетки, инфицированные вирусом. Иммунные клетки предпочтительно представляют собой Т-клетки, лимфокинактивированные клетки-киллеры (LAK-клетки) или натуральные киллеры (NK). Заболевание выбрано из группы, состоящей из инфекционного заболевания, рака, заболевания крови и аутоиммунного заболевания. Рак выбран из группы, состоящей из меланомы, рака толстой кишки, рака кожи, лимфомы, почечно-клеточного рака и солидной опухоли; инфекционное заболевание выбрано из группы, состоящей из инфекции вируса оспы человека, инфекции ВИЧ, бактериальной инфекции и грибковой инфекции; заболевание крови выбрано из группы, состоящей из анемии, острого миелоидного лейкоза, миелодиспластического синдрома и Т-клеточного лейкоза больших зернистых лимфоцитов; аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из рассеянного склероза, псориаза, ревматоидного артрита, воспалительных заболеваний, гастрита и воспаления слизистой оболочки.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения или профилактики заболевания, где способ включает стадию введения пациенту гетеродимерного белка IL-15 по изобретению, или фармацевтической композиции согласно изобретению, или направленного белка, описанного в настоящем изобретении, и совместного введения с другими лекарственными средствами, такими как низкомолекулярный(-ые) ингибитор(-ы) или антитело(-а); где низкомолекулярный(-ые) ингибитор(-ы) выбран(-ы) из алкилирующего(-их) средства(средств); антитело(-а) выбрано(-ы) из моноклонального(-ых) антитела(антител), более предпочтительно антитела(антител) к CD20, PD1, PDL1 или Her2.

Для лучшего понимания настоящего описания некоторые технические и научные термины конкретно определены ниже. Если где-либо еще в данном документе конкретно не определено иное, все остальные технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют значение, обычно понимаемое средним специалистом в области техники, к которой принадлежит данное изобретение.

Термины

При использовании в настоящем документе однобуквенный код и трехбуквенный код для аминокислот являются такими, как описано в статье J. Biol. Chem, 243 (1968), р. 3558.

При использовании в настоящем документе «гетеродимерный белок» относится к белку, образованному комбинацией двух различных мономерных белков. В настоящем изобретении два различных мономерных белка соответственно содержат фрагмент Fc или фрагмент варианта Fc и образуют гетеродимерный белок посредством взаимодействия фрагментов Fc или фрагментов вариантов Fc.

В настоящем изобретении «взаимодействие» между первым вариантом Fc и вторым вариантом Fc относится к взаимодействию между вариантами Fc. «Вариант Fc» относится к Fc, имеющему одну или более замен, инсерций, делеций аминокислот в соответствующем сайте(-ах), вызывающих изменение в структуре или функции Fc. «Взаимодействие между вариантами Fc» относится к эффектам пространственного заполнения, электростатического взаимодействия, образованию водородных связей, гидрофобным взаимодействиям и подобным взаимодействиям, образуемым мутированными вариантами Fc. Взаимодействие между вариантами Fc участвует в образовании стабильного гетеродимерного белка. Предпочтительную мутацию конструируют с образованием мутантной формы «выступ (Knob) во впадину (Hole)».

В настоящем изобретении гетеродимерный белок состоит из «мономерного белка» (т.е. белка (I), белка (II)), который может представлять собой слитый белок или не слитый белок.

При использовании в настоящем документе «слитый белок» относится к белковому продукту, полученному путем связывания кодирующих областей двух или более генов с использованием генетического рекомбинантного способа, химического способа или других подходящих способов; и экспрессии рекомбинантного гена под контролем идентичной регуляторной последовательности. В некоторых воплощениях настоящего изобретения белок (I) представляет собой слитый белок, полученный путем экспрессии рекомбинантного гена IL-15 или его варианта совместно с вариантом Fc; белок (II) может представлять собой слитый белок, полученный путем экспрессии рекомбинантного гена IL-15Rα совместно с вариантом Fc. В слитых белках по изобретению кодирующие области двух или более генов могут быть слиты посредством последовательности (-ей), кодирующих пептидный(-ые) линкер(-ы), в одной или нескольких локализациях. Пептидный линкер можно также использовать для конструирования слитого белка по изобретению.

При использовании в настоящем документе «IL-15» или «пептид IL-15» может представлять собой любой IL-15 (интерлейкин-15) или его мутантную форму, такой как IL-15 человека или млекопитающего, отличающегося от человека, или IL-15 не млекопитающего. Иллюстративные млекопитающие, отличающиеся от человека, включают таких млекопитающих, как свиньи, кролики, обезьяны, шимпанзе, мыши и тому подобные; не млекопитающие включают таких, как куры и тому подобные. Предпочтительно зрелую молекулу интерлейкина-15 человека находят в базе данных UniProtKB, номер доступа Р40933, 49-162аа. Термин «вариант IL-15» относится к варианту молекулы, обладающему повышенной или пониженной аффинностью к ее рецептору или повышенной или пониженной активностью при стимуляции Т клеток или NK клеток в результате одного или более из замен, дополнений или делеций аминокислот.

«IL-15Rα» согласно настоящему изобретению может представлять собой любое соединение IL-15Rα или его функциональный фрагмент, такой как IL-15Rα человека или IL-15Rα млекопитающего, отличающегося от человека, или IL-15Rα не млекопитающего. Иллюстративные млекопитающие, отличающиеся от человека, включают таких млекопитающих, как свиньи, кролики, обезьяны, шимпанзе, мыши и тому подобные; не млекопитающие включают таких, как куры и тому подобные. Предпочтительно IL-15Rα человека, более предпочтительно фрагмент внеклеточного домена рецептора a интерлейкина-15 человека, называемый IL-15Rα ECD (SEQ ID NO: 2), см. базу данных UniProtKB, номер доступа Q13261, 31-205аа. Термин «вариант IL-15Rα» относится к функциональному мутанту с одной или более мутаций, представляющих собой делеций, инсерции или замены аминокислот, который способен к связыванию с его молекулой-лигандом IL15. Предпочтительно молекула IL15Rα человека, более предпочтительно укороченная форма фрагмента внеклеточного домена IL-15Rα, представляет собой молекулу, обладающую активностью рецептора α интерлейкина-15 человека, и полученную путем делеций одной или более аминокислот, начиная с С-концевого фрагмента внеклеточного домена, предпочтительно делеционную мутантную форму, сохраняющую от 65 до 120 аминокислот, более предпочтительно укороченную делеционную мутантную форму, сохраняющую от 65 до 102 аминокислот, такую как IL-15Rα-sushi (77) (SEQ ID NO: 3), IL-15Rα-sushi (65) (SEQ ID NO: 4).

Термин «область Fc иммуноглобулина» относится к константной области цепи иммуноглобулина, в частности, к С-концу или участку константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, не обладающему антигенсвязывающей активностью, который является сайтом взаимодействия молекулы антитела с эффекторными молекулами и клетками. Например, область Fc иммуноглобулина может содержать два или более доменов СН1, СН2, СН3, СН4 тяжелой цепи в комбинации с шарнирной областью иммуноглобулина. Fc может иметь происхождение из различных видов, предпочтительно иммуноглобулинов человека. В соответствии с аминокислотной последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулины можно разделить на различные категории, в основном, содержащие пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Некоторые из них можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4; IgA-1 и IgA-2.

«Область Fc» предпочтительно содержит по меньшей мере одну шарнирную область иммуноглобулина и области СН2 и СН3 IgG. Более предпочтительно она содержит домен СН2, домен СН3 и шарнирную область иммуноглобулина IgG1, при этом положение начальной аминокислоты шарнирной области может изменяться.

Схема мутирования варианта Fc широко применяется в данной области техники для получения биспецифического антитела или гетерологичного димерного слитого белка Fc. Репрезентативные примеры включают форму «выступ(Knob)-во-впадину(Hole)», предложенную Cater et al. (Protein Engineering vol. 9 no. 7 pp. 617-621, 1996); Fc-содержащую гетеродимерную форму, полученную техническими специалистами компании Amgen путем использования электростатического взаимодействия (US 20100286374 А1); гетеродимерную форму (слитые белки SEEDbodies), полученную путем обмена нитей IgG/IgA, предложенную Jonathan Н. Davis et al. (Protein Engineering, Design & Selection pp. 1-8, 2010); биспецифические молекулы, образуемые с помощью платформы DuoBody компании Genmab (Science, 2007.317 (5844)); гетеродимерные белки, сконструированные техническими специалистами компании Xencor посредством всестороннего анализа расчета структуры и мутаций аминокислот Fc и различных способов действия (mAb 3: 6, 546-557; ноябрь/декабрь 2011 г.); гетеродимерные формы белка, полученные компанией Suzhou Corning Jerry с использованием способов генно-инженерного конструирования Fc на основе схемы зарядов (CN 201110459100.7); и другие генно-инженерные способы для образования димерного функционального белка на основе изменения аминокислот Fc или изменения функции. Структура выступ/впадина на варианте Fc по настоящему изобретению относится к двум соответствующим образом мутированным фрагментам Fc, которые впоследствии связываются в форме «выступ(Knob)-во-впадину(Hole)». Гетеродимер образуют, предпочтительно используя модель «выступ(Knob)-во-впадину(Hole)», предложенную Cater et al., для проведения сайт-специфических мутаций в области Fc так, чтобы полученный в результате первый вариант Fc и второй вариант Fc были способны связываться вместе в форме «выступ(Knob)-во-впадину(Hole)». Выбор специфичной области Fc иммуноглобулина из конкретных классов и подклассов иммуноглобулинов находится в пределах компетенции специалистов в данной области техники. Предпочтительно выбирают области Fc антитела IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека, более предпочтительно область Fc антитела IgG1 человека. Случайным образом выбирают одно из первого варианта Fc и второго варианта Fc для мутации Knob, а другой для мутации Hole. В одном из воплощений изобретения первый вариант Fc мутируют с получением мутации типа Knob, такой как последовательность, показанная в SEQ ID NO: 26; второй вариант Fc с получением мутации типа Hole, такой как последовательность, показанная в SEQ ID NO: 27.

Термин «линкерный пептид (линкер)» в настоящем изобретении представляет собой пептид, соединяющий IL-15 или IL-15Rα с вариантом Fc, в целях обеспечения правильной укладки и стабильности белка. «Линкерный пептид» по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой (GGGGS)_n, где n может быть равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или более, предпочтительно n равно 2-4. Если последовательность линкерного пептида является слишком короткой, это может влиять на конечную укладку структуры двух белков и, следовательно, они будут мешать друг другу; если последовательность линкерного пептида является слишком длинной, возникает проблема иммуногенности, поскольку сама последовательность линкерного пептида является новым антигеном.

При использовании в настоящем документе «гетеродимерный белок» предпочтительно является продуктом совместно экспрессируемых генов, например, совместно экспрессируемых в прокариотических клетках, например в Е. coli; или совместно экспрессируемых в эукариотических клетках, таких как 293 и СНО (линия клеток яичников китайского хомячка).

При использовании в настоящем документе «совместная экспрессия» относится к множественным генам, совместно экспрессируемым в клетке с одновременным образованием их продуктов. Эти гены могут существовать одновременно и претерпевать отдельные или общие контроль и экспрессию. В настоящем изобретении два гена предпочтительно совместно экспрессируют в эукариотической клетке. Продукт, полученный путем совместной экспрессии генов, способен к эффективному и простому образованию комплекса; в настоящем изобретении он способен к образованию гетеродимерного белка.

При использовании в настоящем документе «иммуноглобулин» относится к структуре из четырех полипептидных цепей, соединенных вместе дисульфидной связью между двумя идентичными тяжелыми цепями и двумя идентичными легкими цепями. Константные области тяжелых цепей различных иммуноглобулинов проявляют различную композицию и упорядоченность аминокислот, следовательно, представляют различные виды антигенности. Соответственно, иммуноглобулины можно разделить на пять категорий или так называемых изотипов иммуноглобулинов, а именно IgM, IgD, IgG, IgA и IgE. В соответствии с аминокислотной композицией его шарнирной области и числом и локализацией дисульфидных связей тяжелых цепей один и тот же тип Ig можно разделить на различные подкатегории, например, IgG можно разделить на IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Легкую цепь можно разделить на цепь к или А в соответствии с различными константными областями.

Направленная молекула белка относится к классу белков, которые содержат фрагмент или область, способные взаимодействовать с другими белками и вводить направленные пептиды, такие как фрагменты антител, ScFv или связывающий пептид некоторых классов молекул клеточной поверхности и тому подобного, на основе иммунных цитокинов, таких как IL5, IL2 и т.д., или уникальную молекулярную конструкцию, содержащую такие цитокины, такую как молекулярная конструкция в данной заявке. Например, взаимодействие между антителом и антигеном или взаимодействие между лигандом и рецептором приводит к преимущественному обогащению этими молекулами определенной ткани, органа или части организма после поступления в организм посредством направленного эффекта для осуществления их биологических функций. Новая молекула образуется в результате слияния свободного конца молекулы согласно настоящей заявке с некоторыми классами полипептидов; способ, применяемый в настоящем документе, можно рационально вывести и разработать для создания серии молекул в данной области техники.

«Введение» или «лечение» применительно к животному, человеку, подопытному субъекту, клетке, ткани, органу или биологической текучей среде относится к приведению в контакт экзогенного фармацевтического, терапевтического средства, диагностического средства или композиции с животным, человеком, субъектом, клеткой, тканью, органом или биологической текучей средой. «Введение» или «лечение» может относиться, например, к терапевтическим, фармакокинетическим, диагностическим, исследовательским и экспериментальным способам. Лечение клетки охватывает как приведение в контакт реагента с клеткой, так и приведение в контакт реагента с текучей средой, где текучая среда находится в контакте с клеткой. «Введение» или «лечение» также означает виды лечения in vitro и ex vivo, например, клетки, реагентом, диагностическим, связывающим соединением или другой клетки. «Лечение» применительно к человеку, животному или подопытному субъекту относится к терапевтическому лечению, профилактическим или превентивным мерам, к исследовательским и диагностическим применениям. «Лечение» применительно к человеку, животному или подопытному субъекту или к клетке, ткани или органу охватывает приведение в контакт агониста IL15 или антагониста IL15 с человеком или животным, субъектом, клеткой, тканью, физиологическим компартментом или физиологической текучей средой. «Лечение клетки» также охватывает ситуации, где агонист IL15 или антагонист IL15 вступает в контакт с рецептором IL15, например, в текучей фазе или в коллоидной фазе, но также ситуации, где агонист или антагонист не вступает в контакт с клеткой или рецептором.

«Лечить» означает вводить внутрь или наружно терапевтическое средство, такое как композиция, содержащая гетеродимерный белок IL-5 по настоящему изобретению, пациенту, страдающему одним или более заболеваний или состояний. Известно, что указанное терапевтическое средство обладает терапевтическим воздействием на эти заболевания или состояния. Как правило, терапевтическое средство вводят в количестве, эффективном для облегчения одного или более заболеваний или состояний пациенту или популяции, подлежащим лечению, или в результате индукции регрессии этих заболеваний или состояний, или в результате ингибирования прогрессирования таких заболеваний или состояний до какой-либо клинически измеримой степени. Количество терапевтического средства, эффективного для облегчения какого-либо конкретного заболевания или состояния (также называемого «терапевтически эффективным количеством») может изменяться в соответствии с несколькими факторами, такими как статус заболевания, возраст и масса тела пациента и способность лекарственного средства вызывать желаемый ответ у пациента.

«Иммунное заболевание» или «иммунное расстройство» включает, например, патологическое воспаление, воспалительное расстройство и аутоиммунное заболевание или расстройство. «Иммунное заболевание» также относится к инфекции, хронической инфекции и пролиферативному расстройству, такому как рак, опухоль и ангиогенез. «Раковое заболевание» включает, например, рак, раковые клетки, опухоль, ангиогенез и предраковое повреждение, например дисплазию.

При использовании в настоящем документе «полимеразная цепная реакция» или «ПЦР» относится к методике или методу амплификации, описанному, например, в патенте США №4,683,195. Как правило, чтобы можно было сконструировать олигонуклеотидные праймеры, необходимо, чтобы была доступна информация о последовательности концов интересующей области или за пределами интересующей области. Эти праймеры будут идентичны или подобны по последовательности нити, противоположной амплифицируемой матрице.

«Необязательный» или «необязательно» означает, что следующие далее событие или ситуация могут произойти, но не обязательно происходят, и описание включает случаи, в которых событие или обстоятельство происходит или не происходит. Например, «необязательно содержит 1-3 вариабельные области тяжелой цепи антитела» означает, что вариабельная область тяжелой цепи антитела может присутствовать, но необязательно присутствует. Если она присутствует, их количество может составлять 1, 2 или 3.

«Фармацевтическая композиция» относится к смеси, содержащей одно или более соединений согласно настоящему изобретению или их физиологически/фармацевтически приемлемых солей или пролекарств с другими химическими компонентами, а также дополнительными компонентами, такими как физиологически/фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты. Фармацевтическая композиция нацелена на то, чтобы способствовать введению в организм, облегчать абсорбцию активного ингредиента и, следовательно, проявление им биологического действия.

Трансформацию клетки-хозяина рекомбинантной ДНК можно осуществлять традиционными методами, хорошо известными специалистам в данной области техники. Полученные трансформанты культивируют с использованием традиционных способов для экспрессии полипептида, кодируемого геном по изобретению. Культуральная среда может быть выбрана из различных традиционных культуральных сред в зависимости от применяемых клеток-хозяев. Клетки-хозяева выращивают в надлежащих условиях.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1. Отношение между временем дозирования и молярной концентрацией в пробах сыворотки.

Фиг. 2. Число метастатических узлов в легком у дозируемых мышей в модели метастазов легкого тестового примера 3. Символ * на фигуре обозначает р<0,05 по сравнению с фосфатно-солевым буфером (ФСБ); ** обозначает р<0,01 по сравнению с ФСБ; ## обозначает р<0,01 по сравнению с IL-15.

Фиг. 3. Относительная масса легкого (масса легкого/масса тела) у дозируемых мышей в модели метастазов легкого тестового примера 3. Символ ** на фигуре обозначает р<0,01 по сравнению с ФСБ; # обозначает р<0,05 по сравнению с интерлейкином-15.

Фиг. 4. Лечебное действие различных вводимых белков на ксенотрансплантаты HCT-116 (линия клеток опухоли толстой кишки человека) бестимусных мышей.

Фиг. 5. Лечебное действие различных вводимых белков на ксенотрансплантаты НСТ-116 бестимусных мышей. Масса опухоли на сутки 27. Символ * на фигуре обозначает р<0,05 по сравнению с пустым контролем (BLANK).

Фиг. 6. Лечебное действие различных вводимых белков на ксенотрансплантаты НСТ-116 + мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID).

Фиг. 7. Лечебное действие различных вводимых белков на ксенотрансплантаты НСТ-116 + МКПК мышей SCID, масса опухоли на сутки 28. Символ * на фигуре обозначает р<0,05 по сравнению с МКПК.

Фиг. 8. Сравнение количества метастатических узлов легких мышей после введения димерного белка 17, положительного контроля (IL-15) и отрицательного контроля (ФСБ), * на фигуре: р<0,05, **: р<0,01 по сравнению с ФСБ.

Фиг. 9. Сравнение относительной массы легкого (масса легкого/масса тела) у мышей после введения димерного белка 17, положительного контроля (IL-15) и отрицательного контроля (ФСБ).

Фиг. 10. Сравнение массы тела у мышей после введения димерного белка 17, положительного контроля (IL-15) и отрицательного контроля (ФСБ).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее в настоящем документе настоящее изобретение дополнительно описано со ссылкой на примеры; тем не менее, объем настоящего изобретения не ограничено ими.

В примерах настоящего изобретения, где конкретные условия не описаны, эксперименты, как правило, проводят в традиционных условиях или в условиях, предлагаемых производителя материала или продукта. См. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al, Greene Publishing Associates, Wiley Interscience, NY. Где источник реагентов конкретно не указан, реагенты представляют собой имеющиеся в продаже традиционные реагенты.

Пример 1. Получение гетеродимерного белка IL-15

Гетеродимерный белок, предложенный в настоящем изобретении, образуют путем связывания белка (I) и белка (II), где белок (I) представляет собой слитый белок, пересобранный и образованный IL-15 или его вариантом, с первым вариантом Fc; белок (II) может представлять собой второй вариант Fc или может представлять собой слитый белок, пересобранный и образованный IL-15Rα ECD или его вариантом, со вторым вариантом Fc; связывание предпочтительно представляет собой связывание первого варианта Fc со вторым вариантом Fc в форме Knob/Hole.

IL-15, используемый в воплощениях изобретения, относится к зрелой молекуле интерлейкина-15 человека (SEQ ID NO: 1) или его варианту. IL-15Rα ECD, используемый в воплощениях изобретения, относится к фрагменту внеклеточного домена рецептора а интерлейкина-15 человека (SEQ ID NO: 2); его вариант предпочтительно представляет собой укороченную форму, такую как IL-15Rα-sushi (77) (SEQ ID NO: 3), IL-15Rα-sushi (65) (SEQ ID NO: 4). Фрагмент Fc, используемый в воплощениях изобретения, может представлять собой фрагмент Fc антитела IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 человека, предпочтительно фрагмент Fc IgG1 человека. В настоящем изобретении первый вариант Fc или второй вариант Fc предпочтительно претерпевает мутацию в форме Knob (SEQ ID NO: 26) или мутацию в форме Hole (SEQ ID NO: 27). В гетеродимерном белке по настоящему изобретению белок (I) и белок (II) образует димер посредством структуры выступ/впадина между первым вариантом Fc и вторым вариантом Fc, предпочтительно образует гетеродимер посредством механизма «выступ-во-впадину» между первым вариантом Fc и вторым вариантом Fc. Димер, содержащий только одну эффекторную молекулу IL-15, может быть также слит с первым вариантом Fc посредством IL-15, и гетеродимерный белок, такой как гетеродимерный белок 3 по изобретению, образуется посредством механизма «выступ(Knob)-во-впадину(Hole)» между первым вариантом Fc и соответствующим вторым вариантом Fc.

В настоящем изобретении IL-15 или его вариант сливают с первым фрагментом Fc или первым вариантом Fc посредством линкерного пептида, в результате чего образуют слитый белок, и в настоящем изобретении IL-15Rα ECD или его вариант сливают со вторым фрагментом Fc или вторым вариантом Fc посредством линкерного пептида, в результате чего образуют слитый белок, где порядок присоединения каждого белкового компонента неограничен; линкерный пептид может представлять собой традиционный гибкий линкерный пептид в данной области техники, предпочтительно (GGGGS)_n, где n выбрано из 1-10, предпочтительно выбрано из 1-5, наиболее предпочтительно 2.

Соответствующие белковые последовательности представлены ниже:

IL-15 (последовательность белка 1): (аминокислотная последовательность интерлейкина 15 человека, также известная как последовательность контрольного IL-15)

IL-15Rα ECD (последовательность белка 2): (аминокислотная последовательность внеклеточного домена рецептора альфа интерлейкина 15 человека, также известная как указанный сегмент IL-15Rα в молекуле Н, образованной путем слияния с Fc)

IL-15Rα-sushi (77) (последовательность белка 3): (домен, сохраняющий более 90% связывающей активности во внеклеточном домене рецептора альфа интерлейкина-15 человека, известный как домен sushi, плюс короткий линкерный пептид, принадлежит к укороченной форме IL-15Rα)

IL-15Rα-sushi (65) (последовательность белка 4): (домен, сохраняющий более 90% связывающей активности во внеклеточном домене рецептора альфа интерлейкина-15 человека, известный как домен sushi, плюс короткий линкерный пептид, принадлежит к укороченной форме IL-15Rα)

IL15Rα-sushi (73) (последовательность белка 5):

IL15Rα-sushi (86) (последовательность белка 6):

IL15Rα-sushi (102) (последовательность белка 7):

IL-15-Fc (последовательность белка 8): (слитый белок, образованный путем связывания молекулы интерлейкина-15 человека с последовательностью IgG1-Fc человека посредством линкерного пептида, экспрессируемых в виде бивалентных гомодимеров, где молекула IL-15 находится на N-конце белка)

Fc-IL-15 (последовательность белка 9): (слитый белок, образованный путем связывания молекулы интерлейкина-15 человека с последовательностью IgG1-Fc человека посредством линкерного пептида, экспрессируемых в виде бивалентных гомодимеров, где молекула IL-15 находится на С-конце белка)

IL-15Rα ECD-Fc (последовательность белка 10): (слитый белок, образованный путем связывания внеклеточного домена рецептора альфа интерлейкина 15 человека с последовательностью IgG1-Fc человека посредством линкерного пептида, экспрессируемых в виде бивалентных гомодимеров, где молекула IL-15Rα-ECD находится на N-конце белка)

Fc-IL-15Rα ECD (последовательность белка 11): (слитый белок, образованный путем связывания внеклеточного домена рецептора альфа интерлейкина 15 человека с последовательностью IgG1-Fc человека посредством линкерного пептида, экспрессируемых в виде бивалентных гомодимеров, где молекула IL-15Rα-ECD находится на С-конце белка)

IL-15Rα-sushi(77)-Fc (последовательность белка 12): (слитый белок, образованный путем связывания фрагмента sushi (77), состоящего из домена sushi внеклеточного домена рецептора альфа интерлейкина-15 человека и линкерного пептида с последовательностью IgG1-Fc человека посредством линкерного пептида, где фрагмент sushi (77) находится на N-конце)

Fc-IL-15Rα-sushi(77) (последовательность белка 13): (слитый белок, образованный путем связывания фрагмента sushi+, состоящего из домена sushi внеклеточного домена рецептора альфа интерлейкина-15 человека и линкерного пептида с последовательностью IgG1-Fc человека посредством линкерного пептида, где фрагмент sushi+ находится на С-конце)

IL-15-Fc-Knob (последовательность белка 14): (участок Fc приведенной выше последовательности 8 мутирован в форму Knob и спарен с другой слитой молекулой в форме Hole)

IL-15-Fc-Hole (последовательность белка 15): (участок Fc приведенной выше последовательности 8 мутирован в форму Hole и спарен с другой слитой молекулой в форме Knob)

Fc-Knob-IL-15 (последовательность белка 16): (участок Fc приведенной выше последовательности 9 мутирован в форму Knob и спарен с другой слитой молекулой в форме Hole)

Fc-Hole-IL-15 (последовательность белка 17): (участок Fc приведенной выше последовательности 9 мутирован в форму Knob и спарен с другой слитой молекулой в форме Hole)

IL-15Rα ECD-Fc-Knob (последовательность белка 18): (участок Fc приведенной выше последовательности 10 мутирован в форму Knob и спарен с другой слитой молекулой в форме Hole)

IL-15Rα ECD-Fc-Hole (последовательность белка 19): (участок Fc приведенной выше последовательности 10 мутирован в форму Hole и спарен с другой слитой молекулой в форме Knob)

Fc-Knob-IL-15Rα ECD (последовательность белка 20): (участок Fc приведенной выше последовательности 11 мутирован в форму Knob и спарен с другой слитой молекулой в форме Hole)

Fc-Hole-IL-15Rα ECD (последовательность белка 21): (участок Fc приведенной выше последовательности 11 мутирован в форму Hole и спарен с другой слитой молекулой в форме Knob)

IL-15Rα-sushi (77)-Fc-Knob (последовательность белка 22): (участок Fc приведенной выше последовательности 12 мутирован в форме Knob и спарен с другой слитой молекулой в форме Hole)

IL-15Rα-sushi (77)-Fc-Hole (последовательность белка 23): (участок Fc приведенной выше последовательности 12 мутирован в форму Hole и спарен с другой слитой молекулой в форме Knob)

Fc-Knob-IL-15Rα-sushi (77) (последовательность белка 24): (участок Fc приведенной выше последовательности 13 мутирован в форму Knob и спарен с другой слитой молекулой в форме Hole)

Fc-Hole-IL-15Rα-sushi (77) (последовательность белка 25): (участок Fc приведенной выше последовательности 13 мутирован в форму Hole и спарен с другой слитой молекулой в форме Knob)

Fc-Knob (последовательность белка 26): (мутантная форма Knob сегмента IgG1-Fc человека, которая может быть спарена с IL-15-Fc-Hole/Fc-IL-15-Hole)

Fc-Hole (последовательность белка 27): (мутантная форма Hole сегмента IgG1-Fc человека, которая может быть спарена с IL-15-Fc-Knob/Fc-IL-15-Knob)

Fc-Knob (M) (последовательность белка 28): другая форма мутации Fc, которая может быть спарена с Fc-Hole (М) с образованием гетеродимера.

Fc-Hole (М) (последовательность белка 29): другая форма мутации Fc, которая может быть спарена с Fc-Knob (М) с образованием гетеродимера.

Fc-Knob (M)-IL-15 (последовательность белка 30) (другие сайты мутации относительно Knob, другой способ мутации гетеродимера)

SEQ ID NO: 30

IL-15-Fc-Knob(M) (последовательность белка 31) (другой сайт мутации относительно Knob, другой способ мутации гетеродимера)

Fc-Hole (M)-IL-15Rα-sushi (65) (последовательность белка 32) (другой сайт мутации относительно Hole, другой способ мутации гетеродимера)

IL-15Rα-sushi (65)-Fc-Hole (М) (последовательность белка 33) (другой сайт мутации относительно Hole, другой способ мутации гетеродимера)

IL-15Rα-sushi(73)-Fc-Hole (последовательность белка 34): (sushi (73) относится к укороченной форме IL15Rα, содержащей домен sushi с 73 аминокислотами в длину)

IL-15Rα-sushi(65)-Fc-Hole (последовательность белка 35): (sushi (65) относится к домену sushi с 65 аминокислотами в длину)

IL-15Rα-sushi(86)-Fc-Hole (последовательность белка 36): (sushi (86) относится к укороченной форме IL15Rα, содержащей домен sushi с 86 аминокислотами в длину

IL-15Rα-sushi(102)-Fc-Hole (последовательность белка 37): (sushi (102) относится к укороченной форме IL15Rα, содержащей домен sushi с 102 аминокислотами в длину

Пример 2. Конструирование родственных векторов

Материалы:

Эукариотический экспрессионный вектор pcDNA3.1 (+) (Life technologies, № по каталогу V790-20);

Фрагменты ДНК IL-15 (последовательность ДНК 1), IL-15Rα ECD (последовательность ДНК 2) и IgGIFc (последовательность ДНК 3) были синтезированы компанией генного синтеза (GENEWIZ, Inc., Suzhou);

Фрагменты ДНК праймеров были синтезированы компанией генного синтеза (GENEWIZ, Inc., Suzhou).

Методика:

Фрагменты расщепляли традиционным способом ПЦР.

1. Лигирование фрагмента

Фрагмент IL-15-Fc: путем использования перекрывающейся ПЦР фрагмент IL-15-Fc (последовательность ДНК 4, SEQ ID NO: 42) был образован в результате соединения трех фрагментов ДНК в следующем порядке: IL-15, линкерный пептид и Fc.

Фрагмент IL-15Rα ECD-Fc: путем использования перекрывающейся ПЦР фрагмент IL-15Rα ECD-Fc (последовательность ДНК 5, SEQ ID NO: 43) был образован в результате соединения трех фрагментов ДНК в следующем порядке: IL-15Rα ECD, линкерный пептид и Fc.

Фрагмент Fc-IL-15: путем использования перекрывающейся ПЦР фрагмент Fc-IL-15 (последовательность ДНК 6, SEQ ID NO: 44) был образован в результате соединения трех фрагментов ДНК в следующем порядке: Fc, линкерный пептид и IL-15.

Фрагмент Fc-IL-15Rα ECD: путем использования перекрывающейся ПЦР фрагмент Fc-IL-15Rα ECD (последовательность ДНК 7, SEQ ID NO: 45) был образован в результате соединения трех фрагментов ДНК в следующем порядке: Fc, линкерный пептид и IL-15Rα ECD.

Фрагмент IL-15-Fc-Knob: путем использования перекрывающейся ПЦР фрагмент IL-15-Fc-Knob (последовательность ДНК 8, SEQ ID NO: 46) был образован в результате соединения трех фрагментов ДНК в следующем порядке: IL-15, линкерный пептид и Fc-Knob.

Фрагмент IL-15-Fc-Hole: путем использования перекрывающейся ПЦР фрагмент IL-15-Fc-Hole (последовательность ДНК 9, SEQ ID NO: 47) был образован в результате соединения трех фрагментов ДНК в следующем порядке: IL-15, линкерный пептид и Fc-Hole.

Фрагмент Fc-Knob-IL-15: путем использования перекрывающейся ПЦР фрагмент Fc-Knob-IL-15 (последовательность ДНК 10, SEQ ID NO: 48) был образован в результате соединения трех фрагментов ДНК в следующем порядке: Fc-Knob, линкерный пептид и IL-15.

Фрагмент Fc-Hole-IL-15: путем использования перекрывающейся ПЦР фрагмент Fc-Hole-IL-15 (последовательность ДНК 11, SEQ ID NO: 49) был образован в результате соединения трех фрагментов ДНК в следующем порядке: Fc-Hole, линкерный пептид и IL-15.

Фрагмент IL-15Rα ECD-Fc-Knob: путем использования перекрывающейся ПЦР фрагмент IL-15Rα ECD-Fc-Knob (последовательность ДНК 12, SEQ ID NO: 50) был образован в результате соединения трех фрагментов ДНК в следующем порядке: IL-15Rα ECD, линкерный пептид и Fc-Knob.

Фрагмент IL-15Rα ECD-Fc-Hole: путем использования перекрывающейся ПЦР фрагмент IL-15Rα ECD-Fc-Hole (последовательность ДНК 13, SEQ ID NO: 51) был образован в результате соединения трех фрагментов ДНК в следующем порядке: IL-15Rα ECD, линкерный пептид и Fc-Hole.

Фрагмент Fc-Knob-IL-15Rα ECD: путем использования перекрывающейся ПЦР фрагмент Fc-Knob-IL-15Rα ECD (последовательность ДНК 14, SEQ ID NO: 52) был образован в результате соединения трех фрагментов ДНК в следующем порядке: Fc-Knob, линкерный пептид и IL-15Rα ECD.

Фрагмент Fc-Hole-IL-15Rα ECD: путем использования перекрывающейся ПЦР фрагмент Fc-Hole-IL-15Rα ECD (последовательность ДНК 15, SEQ ID NO: 53) был образован в результате соединения трех фрагментов ДНК в следующем порядке: Fc-Hole, линкерный пептид и IL-15Rα ECD.

Фрагмент Fc-Knob, последовательность ДНК 16, SEQ ID NO: 54.

Фрагмент Fc-Hole, последовательность ДНК 17, SEQ ID NO: 55.

Fc-Knob (M)-IL-15, последовательность ДНК 18, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 30, SEQ ID NO: 56.

IL-15-Fc-Knob (М), последовательность ДНК 19, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 31.SEQ ID NO: 57.

Fc-Hole (M)-IL-15Rα-sushi (65), последовательность ДНК 20, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 32, SEQ ID NO: 58.

IL15Rα-sushi (65)-Fc-Hole (M), последовательность ДНК 21, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 33, SEQ ID NO: 59.

IL-15Rα-sushi(73)-Fc-Hole, последовательность ДНК 22, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 34, SEQ ID NO: 60.

IL-15Rα-sushi(65)-Fc-Hole, последовательность ДНК 23, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 35, SEQ ID NO: 61.

IL-15Rα-sushi(86)-Fc-Hole, последовательность ДНК 24, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 36, SEQ ID NO: 62.

IL-15Rα-sushi(102)-Fc-Hole, последовательность ДНК 25, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 37, SEQ ID NO: 63.

2. Встраивание сайтов рестрикции и последовательности сигнального пептида:

Сайт рестрикции эндонуклеазы KpnI, последовательность Козака и последовательность сигнального пептида встраивали на 5'-конце фрагмента гена методом ПЦР. Последовательность между сайтом KpnI и фрагментом гена показана в SEQ ID NO: 38:

(подчеркиванием выделен сайт рестрикции KpnI, курсивом выделена последовательность сигнального пептида);

Кодон терминации TGA и сайт фермента рестрикции Notl встраивали на 3'-конце трех фрагментов соответственно.

3. Конструирование экспрессионных векторов

Вышеупомянутые генные фрагменты встраивали в вектор pcDNA3.1(+) соответственно, используя сайты ферментов рестрикции KpnI и Notl, для конструирования экспрессионных векторов, таких как pcDNA3.1-IL-15-Fc, pcDNA3.1-IL-15Rα ECD-Fc, pcDNA3.1-Fc, pcDNA3.1-Fc-IL-15, pcDNA3.1-Fc-IL-15Rα ECD и тому подобного, в результате чего получили соответствующие экспрессионные плазмиды.

4. Сайт-направленный мутагенез в гене

Процесс сайт-направленного мутагенеза осуществляли путем использования набора KOD (TOYOBO № по каталогу KOD-201), система 25 мкл: 2,5 мкл 10×KOD буфера, 2,5 мкл 2 мМ dNTP, 1 мкл праймера 1 (10 мкМ), 1 мкл праймера 2 (10 мкМ), 0,5 мкл KOD plus, 1 мкл 25 мМ MgSO₄, 16 мкл ddH₂O. Методика синтеза: 94°С в течение 2 мин, 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с, 68°С в течение 11 минут, после 25 циклов амплификации, процесс ПЦР амплификации останавливали дополнительным выдерживанием в течение 11 минут при 68°С. Продукт ПЦР расщепляли в течение 5 часов путем прямого добавления 1 мкл Dpnl (NEB № по каталогу R0176L), трансформировали в компетентные клетки DH5a, клоны собирали для секвенирования с получением желаемых плазмид. Белок 3, включенный в пример настоящего изобретения, был получен путем экспрессии экспрессионного вектора, содержащего последовательность ДНК 8 (SEQ ID NO: 46) и последовательность ДНК 17 (SEQ ID NO: 55); белок 7 был получен путем экспрессии экспрессионного вектора, содержащего последовательность ДНК 8 (SEQ ID NO: 46) и последовательность ДНК 13 (SEQ ID NO: 51). Белки в других примерах совместно экспрессировали с помощью экспрессионного вектора, содержащего последовательности ДНК.

Конструирование нуклеотидной последовательности для экспрессионной плазмиды

Для конструирования вектора использовали следующие последовательности ДНК, где одна линия представляет собой последовательность ДНК сигнального пептида, пунктирная линия представляет собой последовательность ДНК для пептидного линкера, а двойная линия представляет собой последовательность ДНК для Fc, претерпевающего мутацию(-и) Knob/Hole.

Последовательность ДНК 1: (IL-15, нуклеотидная последовательность интерлейкина-15 человека)

Последовательность ДНК 2: (IL-15Rα ECD, нуклеотидная последовательность внеклеточного домена рецептора альфа интерлейкина-15 человека)

Последовательность ДНК 3: (Fc, нуклеотидная последовательность Fc IgG человека)

Последовательность ДНК 4: (IL-15-Fc, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 5)

Последовательность ДНК 5: (IL-15Rα ECD-Fc, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 7)

Последовательность ДНК 6: (Fc-IL-15, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 6)

Последовательность ДНК 7: (Fc-IL-15Rα ECD, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 8)

Последовательность ДНК 8: (IL-15-Fc-Knob, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 11)

Последовательность ДНК 9: (IL-15-Fc-Hole, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 12)

Последовательность ДНК 10: (Fc-Knob-IL-15, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 13)

Последовательность ДНК 11: (Fc-Hole-IL-15, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 14)

Последовательность ДНК 12: (IL-15Rα ECD-Fc-Knob, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 15)

Последовательность ДНК 13: (IL-15Rα ECD-Fc-Hole, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 16)

Последовательность ДНК 14: (Fc-Knob-IL-15Rα ECD, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 17)

Последовательность ДНК 15: (Fc-Hole -IL-15Rα ECD, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 18)

Последовательность ДНК 16: (Fc-Knob, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 23)

Последовательность ДНК 17: (Fc-Hole, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 24)

Последовательность ДНК 18: (Fc-Knob (М) -IL-15, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 30)

Последовательность ДНК 19: (IL-15-Fc-Knob (М), нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 31)

Последовательность ДНК 20: (Fc-Hole (М) -IL-15Rα-sushi(65), нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 32)

Последовательность ДНК 21: (IL15Rα-sushi (65) -Fc-Hole (M), нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 33)

Последовательность ДНК 22: (IL-15Rα-sushi(73)-Fc-Hole, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 34)

Последовательность ДНК 23: (IL-15Rα-sushi(65)-Fc-Hole, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 35)

Последовательность ДНК 24: (IL-15Rα-sushi(86)-Fc-Hole, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 36)

Последовательность ДНК 25: (IL-15Rα-sushi(102)-Fc-Hole, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника белка 37)

Пример 3. Экспрессия белка

Белок IL-15 временно трансфицировали и экспрессировали с использованием клеток Freestyle 293 (GIBCO, № по каталогу R79007). Клетки Freestyle 293 культивировали в суспензии в экспрессионной среде Freestyle 293 (GIBCO, № по каталогу 12338018) с последующим добавлением фетальной бычьей сыворотки со сверхнизким содержанием IgG (ФБС со сверхнизкими иммуноглобулинами компании GIBCO, № по каталогу 16250078) при конечной концентрации 1%. Готовили соответствующие экспрессионные плазмиды, описанные в примере 1, и реагент трансфекции PEI (Polysciences, № по каталогу 239662), количество плазмид составляло 100 мкг/100 мл клеток, отношение плазмиды к PEI составляло 1:2 по массе. Плотность клеток на сутки трансфекции составляла 1×10⁶/мл. Для трансфекции готовили 1 л клеток Freestyle 293. 50 мл среды Opti-MEM (GIBCO, № по каталогу 11058021) смешивали с плазмидой, выдерживали еще в течение 5 мин и фильтровали; еще 50 мл среды Opti-MEM смешивали с PEI, выдерживали еще в течение 5 мин и фильтровали. Плазмиду смешивали с PEI и выдерживали еще в течение 15 мин. Смесь плазмиды и PEI медленно добавляли к клеткам и культивировали во встряхивателе-инкубаторе при 130 об/мин при 37°С, 8% СО₂. Через 5 суток супернатант собирали центрифугированием для очистки белка.

Пример 4. Очистка белка

(1) Гетеродимерный белок IL-15 для аффинной хроматографии: Супернатант собирали из культуры клеток после высокоскоростного центрифугирования и подвергали аффинной хроматографии, используя колонку с белком А от компании GE. Буфер для уравновешивания, используемый при хроматографии, представлял собой 1×ФСБ (рН 7,4), после чего наносили супернатант клеток и связывали, промывая ФСБ, до возвращения УФ (ультрафиолет) к исходному уровню, а затем элюировали целевой белок буфером для элюирования, представляющим собой 0,1 М глицин (рН 3,0). рН доводили до нейтрального уровня с помощью буфера Трис, и целевой белок хранили;

(2) Гетеродимерный белок IL-15 для ионообменной хроматографии:

рН продукта, полученного в результате аффинной хроматографии, доводили до значения на 1-2 единицы рН ниже или выше, чем pI, соответствующим образом разводили для контроля проводимости пробы менее 5 микросименс/см. Используя подходящий буфер, соответствующий рН, такой как фосфатный буфер, ацетатный буфер и другие, продукт элюировали градиентом NaCl при соответствующих условиях рН, используя способы колоночной ионообменной хроматографии, традиционные в данной области техники, такие как катионообменная или анионообменная хроматография, пробирку, содержащую целевой белок, отбирали в соответствии на основании электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ) и хранили.

(3) Гетеродимерный белок IL-15 для эксклюзионной хроматографии:

Продукт, полученный в результате ионообменной хроматографии, концентрировали ультрафильтрацией и наносили на эксклюзионную хроматографию, используя гель, такой как GE Superdex 200, чтобы удалить возможные полимеры и другие компоненты, с целью получения желаемого продукта с высокой чистотой. Чистоту полученного белка можно определить с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Концентрацию белка определяли с помощью УФ спектрофотомерии.

Полученные последовательности белков описаны в примере 1, каждый конкретный гетеродимерный белок состоял из одной или более последовательностей белков, выбранных из описанных выше последовательностей, где предпочтительно гетеродимерный белок образовывали посредством спаривания Knob/Hole, совместно экспрессируемых в клетке, и получали с помощью очистки; альтернативно бивалентный белок может состоять из области цепи Fc без мутаций. В предпочтительном воплощении изобретения, например, молекула 3 была образована путем спаривания слитого белка IL-15-Fc-Knob с Fc-Hole (полученного путем очистки после совместной экспрессии), молекула 7 в примерах была образована путем спаривания слитых белков IL-15-Fc-Knob с IL-15RαECD-Fc-Hole (полученных путем очистки после совместной экспрессии). Неограничивающие примеры димерного белка согласно настоящему изобретению показаны в таблице 1 ниже:

В таблице 1 конкретно показаны 17 димерных белков, включенных в настоящее изобретение, обозначенных как димерные белки 1-17 соответственно, каждый из которых был пересобран и образован соответствующим белком (I) и белком (II), как показано в таблице.

Тестовые примеры

Тестовый пример 1. Анализ пролиферации in vitro

Тестирование пролиферации мононуклеарных клеток свежей периферической крови человека (МКПК) под действием IL-15, димерных белков 1-17 по настоящему изобретению

Свежие МКПК культивировали в среде RPMI1640, содержащей 10% ФБС, центрифугировали и ресуспендировали до плотности клеток 5×10⁵ клеток/мл, добавляли 90 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета, пробы разводили ФСБ с определенным коэффициентом до различных концентраций, 10 мкл добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета и культивировали в термостате при 37°С, 5% СО₂ в течение 48 часов. Затем отбирали 50 мкл для определения пролиферации клеток с помощью набора для анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® по люминесценции. Результаты показаны в таблице 2:

Экспериментальные результаты в тестовом примере: анализ пролиферации МКПК человека показал, что действия гетеродимерных белков 3, 7, 11 и 14-17 по настоящему изобретению на стимуляцию пролиферации очевидно превосходят действие контрольного IL-15, а также очевидно превосходят действия гетеродимеров 1 и 2. Кроме того, действие слитого белка, где вариант Fc локализован на С-конце, превосходит действие при локализации варианта Fc на N-конце. Гетеродимерные белки 12 и 13 других вариантов молекул также обладают лучшим действием на стимуляцию пролиферации по сравнению IL-15.

Тестовый пример 2. Определение фармакокинетики (ФК) гетерологичного димера IL-15 in vivo

Цель

Оценить фармакокинетику гетеродимерных белков IL-15 3 и 7 у мышей.

Материалы и методы

1. Тестируемые соединения, представляющие собой образцы IL-15, гетеродимерных белков IL-15 3 и 7.

2. Животные

Мыши C57BL/6, свободные от патогенной флоры (СПФ), 15-16 г, самцы, полученные от компании Super В&К Laboratory Animal Corp. Ltd., г. Шанхай.

3. Методика тестирования животных

27 мышей линии C57BL/6 делили на 3 группы, по 9 в каждой группе и по 3 на клетку. Пробы крови от 3 мышей собирали в каждый момент времени, пробы крови брали из циркуляции. Инъецировали интраперитонеально 2 мкг IL-15, 10 мкг димерного белка 3 и 20 мкг димерного белка 7 (IL-15, димерный белок 3 и димерный белок 7 имели одинаковую молярную концентрацию 0,15 нмоль). Кровь брали через 30 мин, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72 и 120 ч после введения, в каждый момент времени брали пробу 50-100 мкл орбитальной крови. Сыворотку использовали для твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с IL-15.

3. Результаты и обсуждение

После введения эквимолярных количеств IL-15, димерного белка 3 и димерного белка 7 максимальная концентрация IL-15 достигалась в течение 30 минут, после чего он быстро метаболизировался со временем и полностью метаболизировался через 24 часа после введения. Максимальная концентрация димерного белка 3 достигалась через 2 часа после введения, после чего он со временем медленно метаболизировался и полностью метаболизировался через 120 часов после введения. Максимальное количество димерного белка 7 достигалось через 2 часа после введения, после чего он со временем медленно метаболизировался. Спустя 120 часов все еще обнаруживалась высокая концентрация белка.

Определение ФК (Фиг. 1) показало, что после введения максимальные молярные концентрации в сыворотке обоих белков, димерного белка 3 и димерного белка 7, были меньшими, чем IL-15, но время их пребывания в сыворотке превосходило время пребывания IL-15, что демонстрирует значительное долгосрочное воздействие.

Определение эффективности IL-15 in vivo

Данный пример состоит в тестировании эффективности IL-15, димерного белка 3 и димерного белка 7 в трех моделях метастаза легкого, в модели бестимусных мышей, несущих опухоль, и в модели мышей с диабетом без ожирения (NOD) и тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) (модель NOD-SCID). Результаты показаны в приведенных ниже тестовых примерах.

Тестовый пример 3. Модель метастаза легкого

Цель

Установить модель метастаза легкого у мыши с использованием клеток B16F10, чтобы оценить воздействие на метастазы и рост опухоли после введения лекарственного препарата IL-15.

Материал и протокол

1. Тестируемый белок

IL-15, димерный белок 3 и димерный белок 7.

2. Подопытные животные

Мыши C57BL/6, СПФ, 10-16 г, самцы, от компании Super В&К Laboratory Animal Corp. Ltd., г. Шанхай.

3. Методика тестирования на животных

Режим дозирования: 32 мыши линии C57BL/6 делили на 4 группы по 8 в каждой группе. 1,5×10⁵ клеток B16F10 внутривенно инъецировали в хвостовую вену. На сутки 1, 2 и 10 интраперитонеально вводили ФСБ, 2 мкг IL-15,11 мкг димерного белка 3 и 14 мкг димерного белка 7 (IL-15, димерный белок 3 и димерный белок 7 имеют одну и ту же молярную концентрацию 0,16 нмоль).

Мышей умерщвляли на сутки 21. Легкие извлекали, взвешивали, наблюдали черные узелки в легких, фотографировали, фиксировали в нейтральном формалине и определяли число черных узелков.

3. Результаты

При режиме дозирования в легких мышей в группе ФСБ показан рост большого числа метастатических меланом (175±23); в легких группы IL-15 показано большое число узелков меланомы (157±20), составляющее около 90% от группы ФСБ; в легких группы димерного белка 3 продемонстрировано небольшое число метастатических узелков меланомы (26±6), составляющее около 15% от группы ФСБ; в легких группы димерного белка 7 показаны более видимые метастатические узелки меланомы в легких (83±28), около 49% от группы ФСБ. Число узелков в легких в группе ФСБ было значимо больше, чем в группе димерного белка 3 и димерного белка 7, но значимого отличия от группы IL-15 не показано. Число узелков в легких в группе IL-15 было значимо больше, чем в группе димерного белка 3. Число узелков в легких в группе димерного белка 7 было значимо больше, чем в группе димерного белка 3, как показано на Фиг. 2. Относительная масса легкого в группе ФСБ была значимо больше, чем в группе димерного белка 3 и в группе димерного белка 7, но значимого отличия от группы IL-15 не показано. Относительная масса легкого в группе IL-15 была значимо больше, чем в группе димерного белка 3 и в группе димерного белка 7, как показано на Фиг. 3.

В заключение, в модели B16F10 мыши, показатели эффективности трех видов белков распределялись следующим образом: димерный белок 3> димерный белок 7>IL-15.

Тестовый пример 4. Модель бестимусных мышей, несущих опухоль

Цель

Установить модель бестимусных мышей, несущих опухоль, с использованием клеток НСТ-116 (карциномы ободочной кишки человека), чтобы оценить воздействие на рост опухоли после введения лекарственных препаратов IL-15.

Материал и протокол

1. Тестируемый белок

IL-15, димерный белок 3 и димерный белок 7.

2. Подопытное животное

Бестимусные мыши BALB/cA, СПФ, 16-20 г, самки, от компании Super В&К Laboratory Animal Corp. Ltd., г. Шанхай.

3. Методика тестирования на животных

(1) Бестимусных мышей было необходимо адаптировать к условиям лаборатории в течение 10 суток.

(2) Трансплантация опухолевых клеток

Бестимусным мышам прививали подкожно в правой области ребер клетки НСТ-116 (5×10⁶/мышь). Опухоль росла в течение 20 суток. Когда объем опухоли вырастал до 100±15 мм³, животных делили на группы случайным порядком (d0), n=6.

(3) Дозировка и способ введения

Каждой группе инъецировали интраперитонеально каждые двое суток (три раза в неделю) тестируемый препарат IL-15 (2 мкг/мышь), или димерный белок 3 (10 мкг/мышь), или димерный белок 7 (20 мкг/мышь) (IL-15, димерный белок 3 и димерный белок 7 имели одинаковую молярную концентрацию 0,15 нмоль).

(4) Определение объема опухоли и массы бестимусной мыши

Объем опухоли мышей измеряли 2-3 раза в неделю (Фиг. 4), мышей взвешивали и регистрировали массу тела. На сутки 27 мышей умерщвляли и собирали опухоль.

(5) Статистическая обработка

Статистическое программное обеспечение Excel: средние значения вычисляют как avg; стандартное отклонение (СО) вычисляют как STDEV; стандартную ошибку среднего (СОС) вычисляют как STDEV/SQRT; значение Р между различными группами вычисляют как TTEST.

Объем опухоли (V) вычисляют как: V=1/2×L_{длинная}×L_{короткая}²

Относительный объем (RTV)=V_T/V₀

Коэффициент ингибирования (%)=(C_RTV-T_RTV)/C_RTV (%)

V₀ и V_T представляют собой средний объем опухоли в начале эксперимента и в конце эксперимента соответственно. C_RTV и T_RTV представляют собой группу пустого контроля (Blank) и относительный объем опухоли в конце эксперимента, соответственно.

3. Результаты

Действие белка IL-15, ингибирующее рост опухоли НСТ-116, показано в таблице 3 и на Фиг. 4. Эквимолярные количества IL-15, димерного белка 3 и димерного белка 7 непрерывно вводили в течение 27 суток, один раз каждые двое суток. IL-15, димерный белок 3 и димерный белок 7 могли ингибировать рост трансплантированной опухоли НСТ-16, при этом коэффициенты ингибирования составляли 32%, 45% и 20% соответственно. Тем не менее статистически значимого отличия от контрольной группы не наблюдали в связи со значительными индивидуальными различиями. Ни в одной группе в процессе введения не наблюдалось ни смертельных случаев, ни значительного снижения массы тела, что позволяет предположить отсутствие значительной токсичности при введении настоящей дозы.

На сутки 27 опухоли в каждой группе вырезали и взвешивали, как показано на Фиг. 5, символ * на Фиг. 5 обозначает: р<0,05 по сравнению с Blank, что указывает на то, что масса опухоли в группе димерного белка 3 была значимо снижена по сравнению с Blank, массы опухолей в группах IL-15 и димерного белка 7 были сравнимы с группой Blank.

В заключение, в модели НСТ-116 бестимусных мышей ингибиторная эффективность 3 видов белков распределялась следующим образом: димерный белок 3>IL-15> димерный белок 7.

Тестовый пример 5. Мыши с диабетом без ожирения и тяжелым комбинированным иммунодефицитом (NOD-SCID)

Цель

Клетки НСТ-116 смешивали с мононуклеарными клетками периферической крови (МКПК) человека in vitro и прививали мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом NOD-SCID. Оценивали воздействие введения IL-15 на рост опухоли. У мышей NOD-SCID теоретически отсутствуют Т-клетки и клетки NK, в результате после введения IL-15 клетки МКПК человека (включая Т и NK клетки) могут активироваться для уничтожения раковых клеток и ингибировать рост опухолевых клеток. Модель мышей NOD-SCID ближе всего имитирует иммунную систему человека для уничтожения опухолевых клеток.

Материал и протокол

1. Тестируемый белок

Белок IL-15 приобретали у компании Novoprotein Scientific Inc;

IL-15, димерный белок 3 и димерный белок 7.

2. Подопытное животное

Самок мышей NOD SCID приобретали у компании Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, г. Пекин (номер партии: 11400700006527), в возрасте 6-8 недель, приблизительно 20 г, 5 в каждой группе препарата.

3. Методика тестирования животного

(1) Мышей SCID необходимо было адаптировать к условиям лаборатории в течение 10 суток.

(2) Выделение клеток МКПК

6 мл среды для выделения лимфоцитов (среда для фракционирования лимфоцитов, LSM) асептически переносили в центрифужную пробирку на 15 мл (перед этим LSM тщательно перемешивали, переворачивая бутылку);

4 мл венозной крови, обработанной антикоагулянтом гепарином, смешивали с физиологическим раствором, 8 мл разведенной крови осторожно добавляли к LSM в центрифужную пробирку (при комнатной температуре, медленно добавляли с образованием четкой стратификации между кровью и LSM без смешения с LSM);

После центрифугирования при комнатной температуре при 400 g в течение 15-30 минут эритроциты и полиморфноядерные лейкоциты осаждались, в то время как над LSM образовывался слой мононуклеарных клеток;

Плазму отсасывали из фракции на 4-6 см выше лимфоцитов;

Слой лимфоцитов и половину слоя ниже LSM отсасывали и переносили в другую центрифужную пробирку, после чего добавляли равный объем уравновешенного солевого буфера ФСБ и центрифугировали в течение 10 минут при комнатной температуре при 1000 об/мин;

Клетки промывали буфером ФСБ или средой RPMI-1640 и ресуспендировали средой RPMI-1640;

После 3-4 часов инкубации при 37°С суспендированные клетки собирали и считали.

(3) Трансплантация опухолевых клеток

Клетки НСТ-116 однородно смешивали с клетками МКПК в отношении 4:1 и прививали подкожно в правую сторону ребер мышей SCID (клетки НСТ-116: 5×10⁶/мышь, МКПК: 1,25×10⁶/мышь). Опухоль росла в течение 28 суток.

(4) Дозировка и способ введения

Лекарственные препараты инъецировали интраперитонеально, начиная со следующих суток после инокуляции клеток НСТ-116 + МКПК, один раз каждые двое суток, в количестве 10 последовательных доз, дозировка IL-15 составляла 2 мкг/мышь, дозировка димерного белка 3 составляла 10 мкг/мышь, дозировка димерного белка 7 составляла 20 мкг/мышь (IL-15, димерный белок 3 и димерный белок 7 имеют одинаковую молярную концентрацию 0,15 нмоль).

(5) Измерение объема опухоли и массы тела мышей SCID

Начиная с суток 12, у мышей измеряли объем опухоли, мышей взвешивали и регистрировали массу тела каждые 2-3 суток. На сутки 28 мышей умерщвляли для получения опухоли.

(6) Статистическая обработка

Статистическая обработка

Статистическое программное обеспечение Excel: средние значения вычисляют как avg; стандартное отклонение (СО) вычисляют как STDEV; стандартную ошибку среднего (СОС) вычисляют как STDEV/SQRT; значение Р между различными группами вычисляют как TTEST.

Объем опухоли (V) вычисляют как: V=1/2×L_длиная×L_{короткая}²

Коэффициент ингибирования (%) = (V_T-V₀)/V_T (%)

V₀ и V_T представляют собой средний объем опухоли в начале эксперимента и в конце эксперимента соответственно..

3. Результаты

Начиная со следующих суток после прививания клеток, эквимолярные количества IL-15, димерного белка 3 и димерного белка 7 вводили непрерывно в течение 20 суток, один раз каждые двое суток. Действие белка IL-15 на ингибирование роста опухоли НСТ-116 + МКПК показано в таблице 4 и на Фиг. 6: в первую неделю ни в одной группе опухоль не обнаруживалась. Начиная с суток 12 (D12), опухоль в каждой группе обнаруживалась, объемы опухоли в группе IL-15, в группе димерного белка 3 и в группе димерного белка 7 были меньше, чем в группе МКПК. На сутки 28 (D28) IL-15 и димерный белок 3 могли значимо ингибировать рост трансплантированных опухолевых клеток НСТ-16 с коэффициентами ингибирования 42% и 41% соответственно; коэффициент ингибирования группы димерного белка 7 составлял 27%, не показывая значимого отличия от группы МКПК. Ни в одной группе в процессе введения не наблюдалось ни смертельных случаев, ни значительного снижения массы тела, что позволяет предположить отсутствие значительной токсичности при введении настоящей дозы.

На сутки 28 опухоли в каждой группе вырезали и взвешивали, как показано на Фиг. 7, масса опухоли в группе димерного белка 3 значимо уменьшалась по сравнению с группой МКПК; масса опухоли в группе IL-15 уменьшалась по сравнению с группой МКПК без значимого различия; и масса опухоли в группе димерного белка 7 была сравнимой с массой в группе МКПК.

В заключение, в модели НСТ-116 + МКПК мышей SCID ингибиторный эффект 3 видов белка распределялся следующим образом: димерный белок 3 ≥ IL-15> димерный белок 7.

Тестовый пример 6. Анализ пролиферации клеток Мо7е in vitro

1. Основные материалы

Мо7е (линия лейкоза мегакариоцитов человека) приобретали в Пекинском объединенном медицинском колледже;

IL-15 приобретали у компании Novoprotein, № по каталогу С016, аналоги IL-15 (димерные белки 11-17) внутрифирменного приготовления;

Набор Cell Counting Kit-8 (ССК-8) приобретали у компании WST, № по каталогу ЕХ660;

Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) приобретали у компании Novoprotein, № по каталогу СС79.

2. Методика

1) Мо7е культивировали в термостате с модифицированной средой RPMI-1640 при 37°С (5% CO₂) (содержащей 2,05 мМ L-глутамин, 10% ФБС и 15нг/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF));

2) Клетки Мо7е в надлежащем состоянии центрифугировали при комнатной температуре, 150×g в течение 5 мин. Супернатант сливали;

3) Осадок клеток дважды промывали средой, не содержащей GM-CSF, а затем клетки считали;

4) Концентрацию клеток доводили до надлежащей концентрации и высевали в 96-луночный планшет, причем число клеток составляло 2×10⁴/лунка, а объем составлял 90 мкл (среда, не содержащая GM-CSF), выдерживали в термостате для клеточных культур;

5) IL-15 и его аналоги (димерные белки 11-17) разводили ФСБ в 4-кратной пропорции, в систему клеточной культуры добавляли 10 мкл/лунка после 2 часов инкубации клеток в 96-луночных планшетах. Каждую концентрацию титровали в трех повторных лунках, а также в бланковых лунках (титровали только ФСБ);

6) Планшеты с клетками культивировали в термостате в течение 3 суток;

7) Во все тестируемые лунки добавляли 10 мкл ССК-8 и инкубировали в термостате в течение 3 часов;

8) определяли поглощение при 450 нм (OD450).

Анализ пролиферации Мо7е показал, что тестируемые димерные белки 11-17 значительно превосходили контрольный IL-5.

Тестовый пример 7. Модель метастазов легких мыши

1. Методика

32 мыши линии C57BL/6 (СПФ, получены от компании Super В&К Laboratory Animal Corp. Ltd, г. Шанхай) инъецировали внутривенно 1,5×10⁵ клетками B16F10 (Центр клеточных ресурсов института наук о жизни шанхайского университета, номер партии ТСМ36) и делили мышей на 4 группы, 8 в каждой группе. Каждой группе инъецировали интраперитонеально ФСБ, 2 мкг IL-15 или 4,2 мкг, 12,5 мкг димерного белка 17 на сутки 1, взвешивали один раз каждые 2-3 суток, и одну мышь из каждой группы умерщвляли на сутки 14 для наблюдения метастазов в легких. Всех мышей C57BL/6 умерщвляли на сутки 16. Легкие собирали, взвешивали, наблюдали черные узелки в легких, фотографировали, фиксировали в метаноле и считали число черных узелков.

2. Результаты

В легких мышей в группе ФСБ показано большое число метастатических узелков меланомы (73±43). В легких мышей в группе введения IL-15 показано большое число метастатических узелков меланомы (65±29), составляющее 90% от группы ФСБ. В легких в группе введения 4,2 мкг димерного белка 17 продемонстрировано небольшое число метастатических узелков меланомы (32±24), составляющее 44% от группы ФСБ; в легких в группе введения 12,5 мкг димерного белка 17 продемонстрировано меньшее число метастатических узелков меланомы (14±14), составляющее 19% от группы ФСБ.

В настоящей модели B16F10 эффективность димерного белка 17 значимо превосходила эффективность IL-15, как показано на Фиг. 8, на которой представлено число метастатических узелков в легких в каждой группе по сравнению с группой ФСБ, символ * обозначает р<0,05, ** обозначает р<0,01.

Относительная масса легкого в группе ФСБ больше, чем в группе введения димерного белка 17, как показано на Фиг. 9.

Масса тела мышей в группе 12,5 мкг димерного белка 17 несколько уменьшилась на сутки 5 после введения, а затем постепенно восстановилась, как показано на Фиг. 10.

В заключение, димерный белок 17 может ингибировать метастатические клетки B16F10 в легких мышей и демонстрирует дозозависимое действие.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению гетеродимерных белков IL-15/IL-15Rα, и может быть использовано в медицине для противоопухолевой терапии. Гетеродимерный белок IL-15 содержит белок (I) и белок (II), где указанный белок (I) пересобран и образован IL-15 или его вариантом, слитым с первым вариантом Fc; при этом белок (II) представляет собой второй вариант Fc или пересобран и образован IL-15Rα или его вариантом, слитым со вторым вариантом Fc. Первый вариант Fc и второй вариант Fc связаны посредством механизма "выступ (Knob) во впадину (Hole)". Изобретение позволяет получить гетеродимерный белок IL-15 со значительной противоопухолевой активностью, лучшей биологической активностью и пролонгированным периодом полувыведения in vivo по сравнению с отдельной молекулой IL-15. 11 н. и 10 з.п. ф-лы, 4 табл., 7 пр., 10 ил.

1. Гетеродимерный белок агонист IL(интерлейкина)-15, состоящий из:

белка (I) и белка (II),

где указанный белок (I) образован IL-15, слитым с первым вариантом Fc, причем первый вариант Fс связан с C-концом IL-15;

указанный белок (II) представляет собой второй вариант Fc или образован IL-15Rα или его вариантом, слитым со вторым вариантом Fc, причем второй вариант Fс связан с C-концом IL-15Rα;

белок (I) и белок (II) образуют стабильный гетеродимерный белок посредством взаимодействия с образованием структуры "выступ (Knob) во впадину (Hole)" между первым вариантом Fc и вторым вариантом Fc;

где вариант IL-15Rα представляет собой внеклеточный домен IL-15Rα или его функциональный фрагмент, где функциональный фрагмент представляет собой укороченную форму участка внеклеточного домена IL-15Rα, содержащую от 65 до 102 аминокислот;

где первый вариант Fc и второй вариант Fc выбраны из Fc, модифицированного с образованием Knob, и Fc, модифицированного с образованием Hole, соответственно; когда первый вариант Fc представляет собой Fc, модифицированный с образованием Knob, а второй вариант Fc представляет собой Fc, модифицированный с образованием Hole, или когда второй вариант Fc представляет собой Fc, модифицированный с образованием Knob, а первый вариант Fc представляет собой Fc, модифицированный с образованием Hole.

2. Гетеродимерный белок агонист IL-15 по п. 1, где последовательность IL-15 представляет собой SEQ ID NO: 1.

3. Гетеродимерный белок агонист IL-15 по п. 1, где белок (II) представляет собой второй вариант Fc.

4. Гетеродимерный белок агонист IL-15 по п. 1, где белок (II) образован IL-15Rα или его вариантом, слитым со вторым вариантом Fc.

5. Гетеродимерный белок агонист IL-15 по п. 1, где последовательность варианта IL-15Rα выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2–7, более предпочтительно выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3–7.

6. Гетеродимерный белок агонист IL-15 по п. 1, где последовательность первого варианта Fc выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29, и последовательность второго варианта Fc выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29.

7. Гетеродимерный белок агонист IL-15 по п. 1, где последовательность белка (I) выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 15, предпочтительно SEQ ID NO: 14; последовательность белка (II) выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18, 19, 22, 23 и 34–37, предпочтительно выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23 и 34–37, более предпочтительно выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 34–37.

8. Гетеродимерный белок агонист IL-15 по п. 1, где последовательность белка (I) представлена на SEQ ID NO: 31, последовательность белка (II) представлена на SEQ ID NO: 33.

9. Гетеродимерный белок агонист IL-15 по п. 1, выбранный из группы, состоящей из следующих димерных белков 3, 4, 7, 8, 11, 13–17, где димерные белки 3, 4, 7, 8, 11, 13–17 пересобраны и образованы соответствующим белком (I) и белком (II), как показано ниже:

10. Нуклеиновая кислота, кодирующая гетеродимерный белок агонист IL-15 по любому из пп. 1-9.

11. ДНК (дезоксирибонуклеиновокислотный) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 10 для получения гетеродимерного белка агониста IL-15 по любому из пп. 1-9.

12. Клетка-хозяин, трансформированная указанным ДНК-вектором по п. 11, для получения гетеродимерного белка агониста IL-15 по любому из пп. 1-9, где клетка-хозяин не является происходящей из человеческих эмбриональных клеток.

13. Способ получения гетеродимерного белка агониста IL-15 по любому из пп. 1-9, включающий

культивирование клетки-хозяина по п. 12 в условиях, достаточных для экспрессии гетеродимерного белка агониста IL-15 по любому из пп. 1–9, экспрессию и очистку гетеродимерного белка агониста IL-15.

14. Противораковая фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество гетеродимерного белка агониста IL-15 по любому из пп. 1–9 и фармацевтически приемлемый эксципиент, разбавитель или носитель.

15. Способ стимуляции противоопухолевого иммунного ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества гетеродимерного белка IL-15 по любому из пп. 1-9 или фармацевтической композиции по п. 14.

16. Применение гетеродимерного белка агониста IL-15 по любому из пп. 1-9, или фармацевтической композиции по п. 14 для получения лекарственного средства для лечения рака.

17. Применение по п. 16, где рак выбран из группы, состоящей из меланомы, рака толстой кишки, рака кожи, лимфомы, почечно-клеточной карциномы, рака печени, рака легкого, рака желудка и рака молочной железы.

18. Применение гетеродимерного белка агониста IL-15 по любому из пп. 1–9 или фармацевтической композиции по п. 14 в комбинации с низкомолекулярным ингибитором, при этом низкомолекулярный ингибитор выбран из алкилирующего средства, для получения лекарственного средства для лечения рака.

19. Применение гетеродимерного белка агониста IL-15 по любому из пп. 1–9 или фармацевтической композиции по п. 14 в комбинации с антителом для получения лекарственного средства для лечения рака.

20. Применение по п. 19, где антитело выбрано из антитела к CD20, PD1, PDL1 и Her2.

21. Применение гетеродимерного белка агониста IL-15 по любому из пп. 1–9 или фармацевтической композиции по п. 14 для получения лекарственного средства для противоопухолевой клеточной иммунотерапии.