ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к белковому комплексу ИЛ-15 и его применению, а также к растворимому белковому комплексу ИЛ-15/ИЛ-15Rα и к его применению в качестве терапевтического средства, в частности, в качестве терапевтического средства для лечения рака и аутоиммунного заболевания.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Интерлейкин 15 (ИЛ-15), открытый Grabstein с соавторами в 1994 г., представляет собой цитокин приблизительно 12-14 кДа, который играет такую роль в нормальном иммунном ответе организма, как стимуляция пролиферации Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и естественных киллеров (NK).
ИЛ-15 является членом небольшого семейства цитокинов, характеризующихся структурой в виде пучка из четырех α-спиралей. Для осуществления биологической активности ИЛ-15 необходимо его связывание со своим рецептором. Рецептор ИЛ-15 состоит из трех рецепторных субъединиц: субъединицы α рецептора ИЛ-15 (ИЛ-15Rα), субъединицы β рецептора ИЛ-2 (ИЛ-2Rβ, также известной как ИЛ-15Rβ или CD122) и γс (также известной как CD132). ИЛ-15Rα содержит домен Sushi, способный к связыванию с ИЛ-15 и существенный для биологических функций ИЛ-15 после связывания.
Недавно было обнаружено, что комплекс, образованный ИЛ-15 и его рецептором ИЛ-15Rα, может значительно усиливать биологическую активность ИЛ-15. Исследования показали, что комплекс, образованный ИЛ-15 и растворимым рецептором ИЛ-15Rα, значительно превосходит отдельный ИЛ-15 по стимуляции пролиферации Т-лимфоцитов памяти CD8+ и клеток NT/NKT. ИЛ-15/ИЛ-15Rα вызывал значительное распространение и индуцировал пролиферацию клеток с высоким содержанием CD122, включая Т-лимфоциты памяти CD8+, которые были стимулированы антигенами. Комплекс ИЛ-15/ИЛ-15Rα более чем в 10 раз сильнее, чем отдельный ИЛ-15, стимулирует пролиферацию Т-лимфоцитов памяти CD8+ и поддерживает их выживание, и этот механизм может быть связан с транзиторным презентированием.
Поскольку ИЛ-15 является одним из наиболее перспективных в области иммунотерапии рака, Национальными институтами здравоохранения (NIH) было впервые начато исследование введения ИЛ-15 в область опухоли и сделана попытка его внедрения в фазу I клинических исследований. Однако ИЛ-15 обладает недостатками, заключающимися в его низкой молекулярной массе, коротком периоде полувыведения in vivo, трудно контролируемой дозировке при многократном введении, а также в том, что он, вероятно, вызывает побочный системный иммунный ответ. Имеется неотложная необходимость в том, чтобы найти подход, позволяющий увеличить период полувыведения in vivo и стимулировать или усилить биологическую активность ИЛ-15 in vivo. В исследованиях, относящихся к иммунотерапии ИЛ-15, участвуют многие национальные и зарубежные компании или научно-исследовательские институты, например, патент CN100334112C (Shanghai Haixin Biotechnology Co., Ltd.) относится к гомодимерному белку ИЛ-15-hIgG4Fc для лечения, направленного против микробных инфекций. Введение дисульфидной связи между молекулами ИЛ-15 и ИЛ-15Rα комплекса по настоящему изобретению может повысить молекулярную стабильность и биологическую активность и, в то же время, упростить процесс производства.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предложена молекула белка с пролонгированным периодом полувыведения in vivo, повышенной активностью in vitro и значительной противоопухолевой активностью, сконструированная и полученная генно-инженерными методами.
В настоящем изобретении предложен белковый комплекс ИЛ-15, содержащий растворимый слитый белок (I) и растворимый слитый белок (II), в котором:
растворимый слитый белок (I) представляет собой полипептид ИЛ-15 или его функциональный фрагмент; растворимый слитый белок (II) представляет собой полипептид ИЛ-15Rα или его функциональный фрагмент;
где растворимый слитый белок (I) и/или растворимый слитый белок (II) имеет Cys в результате мутации одной или более аминокислот, и дисульфидная связь образуется за счет спаривания соответствующего Cys, присутствующего в растворимом слитом белке (II) и в растворимом слитом белке (I).
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложен белковый комплекс ИЛ-15, где указанные растворимый слитый белок (I) и/или растворимый слитый белок (II) ковалентно связаны с фрагментом Fc или с его мутантом.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложен белковый комплекс ИЛ-15, где растворимый слитый белок (II) ковалентно связан с фрагментом Fc или с его мутантом.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложен белковый комплекс ИЛ-15, где указанная мутация аминокислоты до Cys происходит в полипептиде ИЛ-15 или его функциональном фрагменте.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложен белковый комплекс ИЛ-15, где положение мутации аминокислоты до Cys находится в L45, Q48, V49, L52, Е53, С88 или Е89 полипептида ИЛ-15 или его функционального фрагмента, предпочтительно в L52, Е53 или Е89, более предпочтительно в L52.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложен белковый комплекс ИЛ-15, где последовательность растворимого слитого белка (I) представляет собой SEQ ID NO: 2.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложен белковый комплекс ИЛ-15, где мутация аминокислоты до Cys происходит в полипептиде ИЛ-15Rα или его функциональном фрагменте.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложен белковый комплекс ИЛ-15, где положение мутации аминокислоты до Cys находится в К34, L42, А37, G38 или S40 полипептида ИЛ-15Rα или его функционального фрагмента, предпочтительно находится в А37, G38 или S40, более предпочтительно в S40.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложен белковый комплекс ИЛ-15, где указанный растворимый слитый белок (II) образован путем рекомбинации полипептида ИЛ-15Rα или его функционального фрагмента и фрагмента Fc; предпочтительно полипептид ИЛ-15Rα или его функциональный фрагмент присоединяется к N-концу фрагмента Fc; более предпочтительно фрагмент Fc представлен как SEQ ID NO: 9.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложен белковый комплекс ИЛ-15, где последовательность указанного растворимого слитого белка (II) выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, предпочтительно SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения белковый комплекс ИЛ-15 выбран из следующих комбинаций растворимого слитого белка (I) и растворимого слитого белка (II):
Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей белковый комплекс ИЛ-15/ИЛ-15Rα, как описано выше.
Настоящее изобретение также относится к ДНК-вектору, несущему нуклеиновую кислоту, как описано выше.
Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей ДНК-вектор, как описано выше.
Настоящее изобретение также относится к способу получения белкового комплекса ИЛ-15/ИЛ-15Rα, как описано выше, включающему культивирование клетки-хозяина по настоящему изобретению в условиях, достаточных для экспрессии белкового комплекса ИЛ-15/ИЛ-15Rα, как описано выше; экспрессию и очистку белкового комплекса ИЛ-15/ИЛ1-5Rα.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей белковый комплекс ИЛ-15/ИЛ1-5Rα по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент, разбавитель или носитель.
Настоящее изобретение также относится к способу стимуляции или ингибирования иммунного ответа у млекопитающего, включающему: введение млекопитающему терапевтически эффективного количества белкового комплекса ИЛ-15/ИЛ1-5Rα по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение также относится к применению белкового комплекса ИЛ-15/ИЛ1-5Rα по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению при получении лекарственного средства для лечения ИЛ-15-опосредованных заболеваний или расстройств; где заболевание выбрано из группы, состоящей из инфекционных заболеваний, рака, заболевания крови и аутоиммунного заболевания. Рак выбран из группы, состоящей из меланомы, колоректального рака, рака кожи, лимфомы, почечно-клеточной карциномы, солидной опухоли, рака печени, рака легкого, рака желудка и рака молочной железы; инфекционное заболевание выбрано из группы, состоящей из инфекции вирусом натуральной оспы, ВИЧ-инфекции, бактериальной инфекции, грибковой инфекции и HBV-инфекции (вируса гепатита В); заболевание крови выбрано из группы, состоящей из анемии, острого миелоидного лейкоза, миелодиспластического синдрома и Т-клеточного лейкоза из больших зернистых лимфоцитов; аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из рассеянного склероза, псориаза, ревматоидного артрита, воспалительных заболеваний, гастрита и мукозита. Белковый комплекс ИЛ-15/ИЛ-15Rα или фармацевтическую композицию можно применять отдельно или в комбинации с другими лекарственными средствами. Указанное другое лекарственное средство представляет собой низкомолекулярный ингибитор или лекарственный препарат антитела; низкомолекулярный ингибитор (ингибиторы) предпочтительно выбран из химиотерапевтических или радиотерапевтических средств направленного действия, более предпочтительно алкилирующего агента (агентов); лекарственный препарат (препараты) антитела предпочтительно выбран из моноклонального антитела, более предпочтительно антитела к CD20, PD1, PDL1, Her2, EGFR, с-МЕТ.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения или профилактики заболевания, включающему без ограничений химиотерапевтическое, радиотерапевтическое, хирургическое лечение и т.д. При указанном заболевании экспрессируется антиген, ассоциированный с заболеванием. Способ включает введение пациенту белкового комплекса ИЛ-15/ИЛ-15Rα, как описано выше, или фармацевтической композиции, как описано выше; формирование комплекса специфичного связывания между клетками, экспрессирующими антиген, ассоциированный с заболеванием, и иммунными клетками, экспрессирующими ИЛ-15Rα, достаточного для активации этих иммунных клеток; и уничтожение иммунными клетками клеток, экспрессирующих антиген, ассоциированный с заболеванием. Клетки, экспрессирующие антиген, ассоциированный с заболеванием, предпочтительно являются опухолевыми клетками или клетками, инфицированными вирусом. Иммунные клетки предпочтительно представляют собой Т-лимфоциты, клетки LAK (лимфокин-активированные киллеры) или NK. Заболевание выбрано из группы, состоящей из инфекционных заболеваний, рака, заболевания крови и аутоиммунного заболевания. Рак предпочтительно выбран из группы, состоящей из меланомы, колоректального рака, рака кожи, лимфомы, почечно-клеточной карциномы, солидной опухоли, рака печени, рака легкого, рака желудка и рака молочной железы. Инфекционное заболевание выбрано из группы, состоящей из инфекции вирусом натуральной оспы, ВИЧ-инфекции, бактериальной инфекции, грибковой инфекции и HBV-инфекции. Заболевание крови выбрано из группы, состоящей из анемии, острого миелоидного лейкоза, миелодиспластического синдрома и Т-клеточного лейкоза из больших зернистых лимфоцитов. Аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из рассеянного склероза, псориаза, ревматоидного артрита, воспалительного заболевания, гастрита и мукозита.
Настоящее изобретение также относится к способу комбинированной терапии для лечения или профилактики заболевания, включающему введение пациенту белкового комплекса ИЛ-15/ИЛ-15Rα, как описано выше, или фармацевтической композиции, как описано выше, в комбинации с другими лекарственными средствами, такими как низкомолекулярный ингибитор или лекарственным препаратом антитела. Низкомолекулярный ингибитор (ингибиторы) предпочтительно выбран из химиотерапевтических или радиотерапевтических средств направленного действия, более предпочтительно алкилирующего агента; лекарственный препарат (препараты) антитела предпочтительно выбран из моноклонального антитела, более предпочтительно из антитела к CD20, PD1, PDL1, Her2, EGFR, с-МЕТ.
Для лучшего понимания настоящего описания ниже конкретно определены некоторые технические и научные термины. Если они специально не определены в других разделах настоящего документа, все остальные технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют общепринятое значение, понятное обычному специалисту в области техники, к которой принадлежит настоящее описание.
Термины
При использовании в настоящем документе однобуквенный код и трехбуквенный код для аминокислот являются такими, как описано в J. Biol. Chem, 243, (1968) р3558.
В настоящем изобретении "белковый комплекс" или "комплексный белок" по настоящему изобретению относится к белку, образованному путем связывания двух различных мономерных белков.
В настоящем изобретении мономерный белок (т.е. растворимый слитый белок (I), растворимый слитый белок (II)), входящий в состав белкового комплекса, может представлять собой слитый белок или не слитый белок.
Используемый в настоящем документе термин "слитый белок" относится к белковому продукту, полученному путем соединения кодирующих областей двух или более генов с использованием метода генетической рекомбинации, химического метода или других приемлемых методов; и экспрессии рекомбинантного гена под контролем идентичной регуляторной последовательности. В некоторых воплощениях настоящего изобретения растворимый слитый белок (I) представляет собой мономерный белок, полученный путем слитой экспрессии или экспрессии без слияния ИЛ-15 или его варианта с биологически активным полипептидом, таким как фрагмент Fc; и растворимый слитый белок (II) представляет собой мономерный белок, полученный путем слитой экспрессии или экспрессии без слияния ИЛ-15Rα или его варианта с биологически активным полипептидом, таким как фрагмент Fc. В слитых белках по изобретению кодирующие области двух или более генов могут быть соединены последовательностью (-ями), кодирующей пептидный линкер (линкеры), в одном или в нескольких положениях. Пептидный линкер можно также использовать для конструирования слитого белка по изобретению.
Используемый в настоящем документе термин "ИЛ-15" или "функциональный фрагмент" может относится к любому ИЛ-15 (интерлейкин-15) или его мутанту, например, ИЛ-15 человека или млекопитающего, отличающегося от человека, или ИЛ-15 вида, отличающегося от млекопитающего. Примеры млекопитающих, отличающихся от человека, включают таких млекопитающих, как свиньи, кролики, обезьяны, шимпанзе, мыши и т.п.; виды, отличающиеся от млекопитающих, включают такие, как курицы и т.п. Предпочтительным является ИЛ-15 человека и его функциональные фрагменты. Зрелая молекула интерлейкина-15 человека (SEQ ID NO: 1) представлена в базе данных UniProtKB, номер доступа Р40933, 49-162аа. Термин "функциональный фрагмент ИЛ-15" относится к мутанту, полученному путем одной или более замен, добавлений или делеций аминокислот с изменением влияния на биологическую функцию ИЛ-15 или другие свойства. Такие изменения аминокислот могут усиливать или ослаблять взаимодействие между ИЛ-15 и субъединицей его рецептора ИЛ-15Rα или ИЛ-15Rβ; либо увеличивать или уменьшать биологическую активность ИЛ-15, такую как активность, стимулирующую пролиферацию иммунных клеток; либо такие мутации аминокислот приведут к установлению ковалентных связей между ИЛ-15 и его рецептором или к повышению стабильности этой ковалентной связи. Например, в ИЛ-15 (L52C), т.е. в положении 52, лейцин L заменен цистеином С (SEQ ID NO: 2), и определенная аминокислота в ИЛ-15Rα, соответствующая этому положению, была заменена на С с образованием дисульфидной связи с ним.
Используемый в настоящем документе термин "ИЛ-15Rα" или "функциональный фрагмент" относится к любому ИЛ-15Rα или его функциональному фрагменту из любых биологических видов, например, ИЛ-15Rα человека или млекопитающего, отличающегося от человека, или ИЛ-15Rα биологического вида, отличающегося от млекопитающего. Примеры млекопитающих, отличающихся от человека, включают таких млекопитающих, как свиньи, кролики, обезьяны, шимпанзе, мыши и т.п.; биологические виды, отличающиеся от млекопитающих, включают такие, как куры и т.п.Предпочтителен ИЛ-15Rα человека, более предпочтителен участок внеклеточного домена субъединицы α рецептора интерлейкина-15 человека, обозначенный как ИЛ-15Rα ECD (SEQ ID NO: 3), см. базу данных UniProtKB, номер доступа Q13261, 31-205аа. Термин "функциональный фрагмент ИЛ-15Rα" предпочтительно относится к укороченной форме фрагмента внеклеточного домена ИЛ-15Rα, то есть к молекуле, содержащей домен sushi, полученной путем одной или более замен, добавлений или делеций аминокислот, обладающей активностью субъединицы α рецептора интерлейкина-15, такой как ИЛ-15Rα-sushi + (SEQ ID NO: 4).
Термин "фрагмент Fc" относится к константной области цепи иммуноглобулина человека, в частности, к С-концу, или к участку константной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, не обладающему антигенсвязывающей активностью, и представляет собой положение для взаимодействия между молекулой антитела и эффекторной молекулой или клетками. Например, область Fc иммуноглобулина может содержать два или более доменов тяжелой цепи СН1, СН2, СН3 и СН4 в комбинации с шарнирной областью иммуноглобулина. В соответствии с аминокислотной последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулины могут быть разделены на различные категории, главным образом, на пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подтипы (изотипы), например, IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4; IgA-1, IgA-2, и различные генотипы.
"Фрагмент Fc" предпочтительно содержит по меньшей мере одну шарнирную область иммуноглобулина и области СН2 и СН3 IgG. Более предпочтительно он содержит домен СН2, домен СН3 и шарнирную область иммуноглобулина, положение исходной аминокислоты шарнирной области может варьировать.
Термин "линкерный пептид (линкер)" в настоящем изобретении относится к пептиду, используемому для соединения ИЛ-15 или ИЛ-15Rα с вариантом Fc, чтобы обеспечить правильную укладку и стабильность белка. "Линкерный пептид" по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой (GGGGS)n, где n может быть равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или более, предпочтительно n равно 2-4. Если последовательность линкерного пептида является слишком короткой, это может повлиять на укладку высшей структуры двух белков, и, следовательно, они взаимодействуют друг с другом; если последовательность линкерного пептида является слишком длинной, это затрагивает проблему иммуногенности, поскольку сама последовательность линкерного пептида является новым антигеном.
Используемый в настоящем документе термин "белковый комплекс" предпочтительно относится к продукту коэкспрессированных генов, например, коэкспрессированных в прокариотических клетках, таких как Е. coli; или коэкспрессированных в эукариотических клетках, таких как 293 и СНО.
Используемый в настоящем документе термин "коэкспрессия" относится ко множественным генам, экспрессируемым в клетке совместно с одновременным образованием их продуктов. Эти гены могут существовать одновременно, а их контроль и экспрессия осуществляются по отдельности или совместно. В настоящем изобретении коэкспрессия двух генов предпочтительно осуществляется в эукариотической клетке. Продукт, полученный в результате коэкспрессии генов, способен эффективно и легко образовывать комплекс.
Термин "введение" или "лечение" при применении к биологическим объектам, таким как животное, человек, подопытный субъект, клетка, ткань, орган или биологическая жидкость, относится к приведению в контакт экзогенного фармацевтического, терапевтического агента, диагностического агента или композиции с биологическим объектом, включающим животное, человека, субъекта, клетку, ткань, орган или биологическую жидкость. Термин "введение" или "лечение" может относиться, например, к терапевтическим, фармакокинетическим, диагностическим, исследовательским и
экспериментальным способам. Обработка клеток включает в себя приведение в контакт реагента с клеткой, а также приведение в контакт реагента с текучей средой, где текучая среда находится в контакте с клеткой. Термин "введение" или "лечение" также означает методы обработки in vitro и ex vivo, например, клетки, реагентом, диагностическим средством, связывающим соединением или другой клеткой. Термин "лечение" применительно к человеку, животному или субъекту относится к терапевтическому лечению, профилактическим или превентивным мерам для исследовательских и диагностических применений. Термин "лечение" применительно к человеку, животному или субъекту, либо к клетке, ткани или органу включает приведение в контакт агониста ИЛ 15 или антагониста ИЛ 15 с человеком или животным, субъектом, клеткой, тканью, физиологическим компартментом или физиологической текучей средой. Термин "обработка клетки" включает ситуацию, где агонист ИЛ 15 или антагонист ИЛ15 вступает в контакт с рецептором ИЛ 15, например, в текучей фазе или в коллоидной фазе, а также включает ситуацию, где агонист или антагонист не вступает в контакт с клеткой или рецептором.
Термин "лечить" означает вводить внутренне или наружно терапевтический агент, такой как белковый комплекс ИЛ-5 по настоящему изобретению или содержащая его композиция, пациенту, страдающему одним или более заболеванием или состоянием, выбранным из "иммунных заболеваний" или "раковых заболеваний". Известно, что указанный терапевтический агент оказывает терапевтическое действие на эти заболевания или состояния. Как правило, терапевтический агент вводят в количестве, эффективном для облегчения одного или более заболевания или состояния пациента или популяции, подлежащего (-ей) лечению, либо посредством индукции регрессий этих заболеваний или состояний, либо посредством ингибирования прогрессирования таких заболеваний или состояний в какой-либо клинически измеримой степени. Количество терапевтического агента, которое является эффективным для облегчения какого-либо конкретного заболевания или состояния (также обозначено термином "терапевтически эффективное количество") может изменяться в соответствии с несколькими факторами, такими как статус заболевания, возраст и масса тела пациента, и способность лекарственного средства вызывать желаемый ответ у пациента.
Термин "иммунное заболевание" или "иммунное расстройство" включает, например, патологическое воспаление, воспалительное расстройство и аутоиммунное заболевание или расстройство. "Иммунное заболевание" также относится к инфекции, устойчивой инфекции и к пролиферативному расстройству, такому как рак, опухоль и ангиогенез. Термин "раковое заболевание" включает, например, рак, раковые клетки, опухоль, ангиогенез и предраковое поражение, например, дисплазию.
Используемый в настоящем документе термин "полимеразная цепная реакция" или "ПЦР" относится к методу амплификации или к методу, описанному, например, в патенте США №4,683,195. Как правило, для того, чтобы разработать олигонуклеотидные праймеры, необходимо получить информацию о последовательности концевых участков интересующей области или участков, окружающих интересующую область. Последовательность этих праймеров будет идентичной или подобной противоположной нити амплифицируемой матрицы.
Термин "необязательный" или "необязательно" означает, что описанное впоследствии событие или ситуация необязательно происходит, и данное описание включает в себя случаи, в которых это событие или обстоятельство либо происходит, либо не происходит. Например, термин "необязательно содержит 1-3 вариабельных участка тяжелой цепи антитела" означает, что вариабельный участок тяжелой цепи антитела может присутствовать, но необязательно присутствует. Если они присутствуют, их количество может составлять 1, 2 или 3.
Термин "фармацевтическая композиция" относится к смеси, содержащей одно или более соединений в соответствии с настоящим изобретением или его физиологически/фармацевтически приемлемой соли или пролекарства вместе с другими химическими компонентами, а также дополнительными компонентами, такими как физиологически/фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты. Фармацевтическая композиция способствует стимуляции введения активного ингредиента в организм, облегчает его всасывание и за счет этого проявление биологического действия.
Трансформация клетки-хозяина рекомбинантной ДНК может быть выполнена традиционными методами, хорошо известными специалистам в данной области техники. Полученные трансформанты культивируют с использованием традиционных способов экспрессии полипептида, кодируемого геном по изобретению. Среда для культивирования может быть выбрана из различных традиционных культуральных сред на основании используемых клеток-хозяев. Клетки-хозяева выращивают в соответствующих условиях.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг. 1 показана кристаллическая структура комплекса ИЛ-15 и рецепторов α, β, γ.
На Фиг. 2 показаны остатки на поверхности ИЛ-15 и ИЛ-15Rα (рецептор α).
На Фиг. 3 показаны относительные положения остатков-кандидатов мутанта, расположенных на ИЛ-15 и ИЛ-15Rα.
На Фиг. 4 показана схема модели образования дисульфидной связи между L52C на ИЛ-15 и S40C на ИЛ-15Rα.
На Фиг. 5 показан анализ методом Вестерн-блоттинга для обнаружения His-метки на коэкспрессируемых молекулярных продуктах 1-9 по настоящему изобретению.
На Фиг. 6 показан анализ методом Вестерн-блоттинга для обнаружения участка Fc на коэкспрессируемых молекулярных продуктах 1-18 по настоящему изобретению.
На Фиг. 7 показана схема структуры белковых комплексов 1, 2, 3, 4 по настоящему изобретению.
На Фиг. 8 показано действие белкового комплекса по настоящему изобретению на метастатические опухоли легких у мышей, "*" на фигуре представляет собой р меньше 0,05 по сравнению с ФСБ (фосфатно-солевой буфер).
На Фиг. 9 показано действие белкового комплекса на относительную массу легкого (масса легкого/масса тела) у мышей.
На Фиг. 10 показано действие белкового комплекса на массу тела мышей.
На Фиг. 11 показан период полувыведения белкового комплекса 3 у крыс.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее в настоящем документе настоящее изобретение дополнительно описано со ссылкой на примеры; однако объем изобретения не ограничен ими.
В примерах настоящего изобретения, если конкретные условия не описаны, эксперименты обычно проводят в стандартных условиях или в условиях, предложенных изготовителями материалов или препаратов. См. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al, Greene Publishing Associates, Wiley Interscience, NY. Если источник реагентов специально не приведен, реагенты представляют собой стандартные реагенты, имеющиеся в продаже.
Пример 1. Выбор и проверка мутантов
ИЛ-15 является перспективным цитокином для лечения рака и вирусных заболеваний. Он может презентироваться рецептору β/γ ИЛ-15, локализованном на поверхности Т-лимфоцитов и клеток NK посредством ИЛ-15Rα (рецептор α ИЛ-15), стимулируя таким образом пролиферацию Т-лимфоцитов. Следовательно, повышение связывающей способности ИЛ-15 и рецептора α ИЛ-15 приведет к значительному усилению функции ряда лимфоцитов, что очень важно для иммунотерапии.
Видно, что три рецептора ИЛ-15 в трех различных ориентациях, соответственно, образуют кристаллическую структуру комплекса ИЛ-15 и рецептора α, β, γ (PDB ID: 4GS7) (Фиг. 1). Поэтому в случае присутствия на границе между ИЛ-15 и рецептором α модифицированных остатков это не повлияет на связывание ИЛ-15 с рецепторами β и γ.
В качестве исходной структуры авторами изобретения была выбрана сокристаллическая структура (PDB ID: 2Z3Q) ИЛ-15 и рецептора а (кристаллическая структура рецептора α в этой структуре немного длиннее, чем 4GS7). Сводные данные об остатках, расположенных на границе ИЛ-15 и рецептора α, представлены на основании структуры (Таблица 1). Предельное значение расстояния от противоположной молекулы было установлено как 
(Фиг. 2).
Было проведено сканирование дисульфидных связей на границе ИЛ-15 и рецептора а путем использования дисульфидного сканирования в программном обеспечении Simulation МОЕ. Основной принцип сканирования состоит в поиске комбинации остатков, расположенных в ИЛ-15 и рецепторе α ИЛ-15, соответственно, на всем интервале длины дисульфидной связи, с получением в результате приведенной ниже комбинации остатков (Таблица 2) и относительных положений остатков-кандидатов мутанта (Фиг. 3).
Выбор комбинации мутаций осуществляли в соответствии со следующими принципами: 1. Не выбирать остатки вблизи внутримолекулярной дисульфидной связи, чтобы избежать ошибок совпадения и, таким образом, избежать неправильного спаривания исходной внутримолекулярной дисульфидной связи. 2. Стараться выбирать остатки, которые не влияют на трехмерную структуру белка, полученного в результате мутации. 3. Выбирать остатки, которые сводят к минимуму воздействие энергии на всю структуру, полученную в результате мутации.
В соответствии с приведенным выше требованием 1 из кристаллической структуры комплекса видно, что на структуре ИЛ-15 внутримолекулярные дисульфидные связи образовывались между С35 и С85 и между С42 и С88, соответственно. Поэтому можно исключить возможность использования Е87 и Е89 выше и ниже С88, соответственно, в качестве остатков-кандидатов на ИЛ-15 и исключить возможность использования Р67 и К34 на соответствующем рецепторе а в качестве остатков-кандидатов. Кроме того, необходимо исключить возможность использования дисульфидной связи, образуемой остатком С88 в ИЛ-15 с остатком А37 в рецепторе α. На структуре рецептора а С29 и С63 образуют дисульфидную связь. Вблизи этой пары остатков-кандидатов не было обнаружено.
С целью соответствия приведенному выше требованию 2 проводили анализ комплекса кристаллизации. Во-первых, все остатки L45, Q48, V49, L52 и Е53 были расположены на альфа-спирали структуры ИЛ-15. Кроме того, L45, Q48 и V49 были расположены в середине альфа-спирали. При изменении этих остатков на Cys путем мутации изгиб боковой цепи, вызванный образованием дисульфидной связи, может оказывать влияние на структуру исходной альфа-спирали, и, таким образом, влиять на структуру белка в целом. Поэтому остатки L52 и Е53 на ИЛ-15 считали предпочтительными. Во-вторых, на структуре рецептора альфа ИЛ-15 L42 был расположен в бета-складке, А37, G38 и S40 были расположены в петле. Поэтому присутствие А37, G38 и S40 на рецепторе альфа ИЛ-15 считали предпочтительным. В свете этих двух структур L52 из ИЛ-15 и S40 из рецептора альфа ИЛ-15 считали предпочтительными для мутаций с образованием Cys, которые, в конечном счете, приводили к образованию межмолекулярной дисульфидной связи.
С целью соответствия приведенному выше требованию 3 на всех приведенных выше остатках проводили аланиновое сканирование с использованием компьютерного программного обеспечения Discovery Studio. Результаты рассчитанного обмена энергии в мутациях (Таблица 3) показывают, что L52A, присутствующий на ИЛ-15, оказывал минимальное влияние на стабильность структуры, и S40A, присутствующий на рецепторе α ИЛ-15, оказывал минимальное влияние на стабильность структуры. Таким образом, из приведенных выше результатов видно, что L52 из ИЛ-15 и S40 из рецептора альфа ИЛ-15 можно считать предпочтительными кандидатами для мутации с образованием Cys, и, в конечном счете, для образования межмолекулярной дисульфидной связи (Фиг. 4).
В итоге были сконструированы мутации в общей сложности 8 пар остатков. Среди них L52 из ИЛ-15 и S40 из рецептора альфа ИЛ-15 считают предпочтительными для мутации с образованием Cys, и, в конечном счете, для образования дисульфидной связи.
На основании описанного выше для проверки экспрессии в клетке были сконструированы мутации 8 пар остатков. Получили две формы. Одна представляет собой слитую молекулу ИЛ-15-Fc с мутацией Cys, коэкспрессируемую с ИЛ-15Rα с мутацией Cys (комбинации 10-18), а другая представляет собой ИЛ-15-6his с мутацией Cys, коэкспрессируемую со слитой молекулой ИЛ-15Rα-Fc с мутацией Cys (комбинации 1-9). Супернатант клеток, полученных в результате коэкспрессии, подвергали анализу методом Вестерн-блоттинга. Участок продукта коэкспрессии комбинаций 1-9, меченый His-меткой, можно обнаружить с помощью мышиного антитела к His (первичное антитело, abeam, аМ4923) и козьего антитела к мыши, меченого пероксидазой хрена (HRP) (вторичное антитело, Jackson, 115-035-062); и участок Fc продукта коэкспрессии комбинаций 1-18 обнаруживали с помощью козьего антитела к человеческому Fc-HRP (Jackson, 109-035-098). Конкретные комбинации коэкспрессии представлены в Таблице 4.
Анализ методом Вестерн-блоттинга показал, что в результате коэкспрессии молекулы, образованные в результате спаривания слитого с Fc ИЛ-15 и ИЛ-15Rα, были склонны к неправильному спариванию и к уменьшению количества целевого продукта с правильным спариванием. Однако после слияния с Fc спаривание слитого с Fc ИЛ-15Rα и ИЛ-15 может привести в результате к молекуле с правильным спариванием. Среди них наиболее высокими были уровни экспрессии комбинации коэкспрессии 5, 6 и 7, продукт обладал высокой гомогенностью, и размер полос соответствовал ожидаемому (Фиг. 5-6). Результаты хорошо согласовывались с прогнозируемыми на основании моделирования. С учетом результатов обоих вариантов компьютерного моделирования и свойств продуктов, экспрессируемых клетками, были выбраны положения мутации аминокислоты до Cys на ИЛ15 в L45, Q48, V49, L52, Е53, С88 или Е89, предпочтительно L52, Е53 или Е89, более предпочтительно L52. Были выбраны положения мутации аминокислоты до Cys на ИЛ-15Rα К34, L42, А37, G38 или S40, предпочтительно А37, G38 или S40, более предпочтительно S40. Наиболее предпочтительными является мутация L52C на ИЛ-15, которая спаривается с S40C на ИЛ-15Rα. Кроме того, стабильность белкового комплекса ИЛ-15 можно улучшить путем выбора двух или более пар дисульфидных связей или введения других мутаций, отличающихся от цистеина, между ИЛ-15 и ИЛ-15Rα.
Пример 2. Конструирование сопряженных векторов
Материалы:
Эукариотический экспрессионный вектор pcDNA3.1 (+) (Life technologies, кат. No. V790-20); ИЛ-15 (последовательность 1 ДНК), ИЛ-15Rα ECD, ИЛ15Rα-sushi+(73) и фрагмент ДНК IgG1Fc были синтезированы компанией синтеза генов (GENEWIZ, Inc., Suzhou);
Праймеры были синтезированы компанией синтеза генов (GENEWIZ, Inc., Suzhou).
Методика:
1. Лигирование фрагмента
Фрагмент ИЛ-15Rα-ECD-Fc: использовали ПЦР с перекрывающимися праймерами для образования фрагмента ИЛ-15Rα-ECD-Fc путем соединения трех фрагментов ДНК в следующем порядке: ИЛ-15Rα-ECD, линкерный пептид Fc (последовательность 2 ДНК).
Фрагмент Fc-ИЛ-15Rα-ECD: использовали ПЦР с перекрывающимися праймерами для образования фрагмента Fc-ИЛ-15Rα ECD путем соединения трех фрагментов ДНК в следующем порядке: Fc, линкерный пептид и ИЛ-15Rα-ECD (последовательность 3 ДНК).
Фрагмент ИЛ-15Rα-sushi+-Fc: использовали ПЦР с перекрывающимися праймерами для образования фрагмента ИЛ-15Rα-sushi+-Fc путем соединения трех фрагментов ДНК в следующем порядке: ИЛ-15Rα-sushi+, линкерный пептид и Fc (последовательность 4 ДНК).
Фрагмент Fc-ИЛ-15Rα-sushi+: использовали ПЦР с перекрывающимися праймерами для образования фрагмента Fc-ИЛ-15Rα-sushi+ путем соединения трех фрагментов ДНК в следующем порядке: Fc, линкерный пептид и ИЛ-15Rα sushi+ (последовательность 5 ДНК).
Генные фрагменты, содержащие мутацию Cys, были получены путем точечной мутации, например:
ИЛ-15 (L52C): в положении 52 L мутирован с образованием С (последовательность 6 ДНК)
ИЛ15Rα-ECD (S40C)-Fc: в положении 40 S мутирован с образованием С (последовательность 7 ДНК)
Фрагмент Fc-ИЛ-15Rα ECD (S40C): (последовательность 8 ДНК)
Фрагмент ИЛ-15Rα-sushi+ (S40C)-Fc: (последовательность 9 ДНК)
Фрагмент Fc-ИЛ-15Rα-sushi+ (S40C): (последовательность 10 ДНК).
2. Введение сайта рестрикции и последовательности сигнального пептида:
Сайт рестрикции эндонуклеазы KpnI, последовательность Козака и последовательность сигнального пептида вводили на 5-конце генного фрагмента с помощью ПЦР. Последовательность между сайтом Kpnl и генным фрагментом показана ниже: 
(подчеркнутая последовательность представляет собой сайт рестрикции KpnI, выделенная курсивом последовательность представляет собой сигнальный пептид); кодон терминации TGA и сайт фермента рестрикции NotI вводили на 3'-конце трех фрагментов, соответственно.
3. Конструирование экспрессионных векторов
Описанные выше генные фрагменты встраивали в вектор pcDNA3.1 (+) посредством сайтов рестрикции KpnI и NotI для конструирования экспрессионных векторов, таких как pcDNA3.1-ИЛ-15, pcDNA3.1-ИЛ-15Rα-ECD-Fc, pcDNA3.1-Fc-ИЛ-15Rα-EC, pcDNA3.1-ИЛ-15Rα-sushi+-Fc, pcDNA3.1-Fc-ИЛ-15Rα-sushi+ и т.д. Были получены соответствующие экспрессионные плазмиды.
4. Сайт-направленные мутации в гене
Набор KOD (TOYOBO, кат. № KOD-201) использовали для сайт-направленной мутации в 25 мкл системы, содержащей 2,5 мкл 10× буфера KOD, 2,5 мкл 2 мМ dNTP (динуклеотидфосфаты), 1 мкл праймера 1 (10 мкМ), 1 мкл праймера 2 (10 мкМ), 0,5 мкл KOD plus, 1 мкл 25 мМ MgSO4 и 16 мкл ddH2O. Использовали следующую методику синтеза: 94°С в течение 2 мин, 25 циклов амплификации: 94°С в течение 30 сек, 55°С в течение 30 сек, 68°С в течение 11 мин, амплификацию ПЦР останавливали в течение еще 11 мин при 68°С. Продукт ПЦР подвергали расщеплению 1 мкл DpnI (NEB, кат. № R0176L) в течение 5 часов, а затем трансформировали им компетентные клетки DH5a. Затем клон отбирали для секвенирования с получением желаемых плазмид pcDNA3.1-ИЛ-15(L52C), pcDNA3.1-ИЛ-15Rα-ECD(S40C)-Fc, pcDNA3.1-Fc-ИЛ-15Rα-ECD(S40C), pcDNA3.1-ИЛ-15Rα-sushi+(S40C)-Fc, pcDNA3.1-Fc-ИЛ-15Rα-sushi+(S40C) и другие мутантные гены. Белковый комплекс 1, задействованный в примере по настоящему изобретению, был получен путем экспрессии экспрессионного вектора, содержащего последовательности 6 и 7 ДНК. Белковый комплекс 3, задействованный в примере по настоящему изобретению, был получен путем экспрессии экспрессионного вектора, содержащего последовательности 6 и 9. Белковый комплекс 4, задействованный в примере по настоящему изобретению, был получен путем экспрессии экспрессионного вектора, содержащего последовательности 6 и 10. Белковый комплекс 2, задействованный в примере по настоящему изобретению, был получен путем экспрессии экспрессионного вектора, содержащего последовательности 6 и 8.
Конструирование нуклеотидной последовательности экспрессионной плазмиды
Для конструирования вектора использовали приведенные ниже последовательности, одной горизонтальной линией показана последовательность ДНК сигнального пептида, пунктирной линией показана последовательность ДНК пептидного линкера, и двойной горизонтальной линией показана мутантная последовательность ДНК.
ИЛ-15 (последовательность 1 ДНК, SEQ ID NO: 10): 
ИЛ-15Rα-ECD-Fc (последовательность 2 ДНК, SEQ ID NO: 11): 
Fc-ИЛ-15Rα-ECD (последовательность 3 ДНК, SEQ ID NO: 12): 
ИЛ-15Rα-sushi+ (73)-Fc (последовательность 4 ДНК, SEQ ID NO: 13): 
Fc-ИЛ-15Rα-sushi+ (73) (последовательность 5 ДНК, SEQ ID NO: 14): 
ИЛ-15(L52C) (последовательность 6 ДНК, SEQ ID NO: 15): 
ИЛ-15Rα-ECD (S40C)-Fc (последовательность 7 ДНК, SEQ ID NO: 16): 
Fc-ИЛ-15Rα-ECD (S40C) (последовательность 8 ДНК, SEQ ID NO: 17): 
ИЛ-15Rα-sushi+ (73) (S40C)-Fc (последовательность 9 ДНК, SEQ ID NO: 18): 
Fc-ИЛ-15Rα-sushi+ (73)(S40C) (последовательность 10 ДНК, SEQ ID NO: 19): 
Фрагмент Fc: IgG1-Fc DNA (последовательность 11 ДНК, SEQ ID NO: 20): 
Пример 3. Характеристики белкового комплекса ИЛ-15
Белковый комплекс ИЛ-15, предложенный в настоящем изобретении, состоит из растворимого слитого белка (I) и растворимого слитого белка (II); где растворимый слитый белок (I) представляет собой полипептид ИЛ-15, ковалентно связанный с биологически активными полипептидом или его функциональным фрагментом; растворимый слитый белок (II) представляет собой полипептид ИЛ-ISR альфа, ковалентно связанный с биологически активными полипептидом или его функциональным фрагментом; где растворимый слитый белок (I) или растворимый слитый белок (II) имеет Cys, полученный в результате мутаций аминокислот в одном или более положений, дисульфидная связь образуется посредством спаривания соответствующих остатков Cys, присутствующих в растворимом слитом белке (II) и в растворимом слитом белке (I).
В настоящем изобретении стабильный белковый комплекс с очевидной противоопухолевой активностью и пролонгированным периодом полувыведения in vivo конструировали методом генной инженерии, и молекула комплекса содержит молекулу слитого белка Fc и ИЛ-15 или его производного и ИЛ-15Rα или его производного.
Молекула слитого белка обладает следующими признаками:
1) Слитый белок содержит две основные молекулярные группировки, одна из которых представляет собой молекулу, обладающую биологической активностью ИЛ-15, а другая представляет собой слитую молекулу Fc, содержащую ИЛ-15Rα (или его функциональный фрагмент.
2) Молекулярная группировка, обладающая биологической активностью ИЛ-15, имеет мутации цистеина в одном или более положений аминокислот на основе ИЛ-15 дикого типа или функциональных мутантов ИЛ-15, и эти положения мутаций до цистеина могут спариваться с соответствующими положениями мутаций до цистеина на ИЛ-15Rα или его функциональном фрагменте с образованием дисульфидной связи;
3) Группировка слитой молекулы Fc, имеющей ИЛ-15Rα или его функциональный фрагмент, имеет мутации цистеина в одном или более положений аминокислот на основе фрагмента полностью внеклеточного домена ИЛ-ISRa или функционального фрагмента ИЛ-15Rα, содержащего укороченную форму домена sushi. Эти остатки цистеина могут спариваться с соответствующими остатками цистеина на ИЛ-15 или его функциональном мутанте с образованием дисульфидной связи;
4) Слитый белок может стабильно экспрессироваться в результате котрансфекции или конструирования одной клеточной линии двумя плазмидами, и единая молекула может быть получена традиционным методом выделения.
ИЛ-15, используемый в примерах по настоящему изобретению, относится к зрелым молекулам интерлейкина 15 человека (SEQ ID NO: 1) или его вариантам. ИЛ-15Rα ECD, используемый в примерах по настоящему изобретению, относится к фрагменту внеклеточного домена рецептора альфа интерлейкина 15 человека (SEQ ID NO: 3). Его вариант предпочтительно представляет собой укороченный вариант, такой как ИЛ-15Rα-sushi + (SEQ ID NO: 4). Участок фрагмента Fc, используемый в примерах настоящего изобретения, может представлять собой фрагмент Fc антитела IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека или его вариант, предпочтительно фрагмент Fc IgG1 человека, более предпочтительно SEQ ID NO: 9.
В настоящем изобретении ИЛ-15Rα или его производное слиты с фрагментом Fc или вариантом Fc посредством линкерного пептида с образованием растворимого слитого белка (II), где порядок присоединения каждого белкового компонента не ограничен. Линкерный пептид может представлять собой гибкий линкер, обычно используемый в данной области техники. Предпочтительно он представляет собой (GGGGS)n, где n может быть равно от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 5 и наиболее предпочтительно 2. Кроме связывания ИЛ-15 с ИЛ-15R альфа, растворимый слитый белок (II) и растворимый слитый белок (I) могут быть также объединены посредством дисульфидной связи, образованной посредством спаривания цистеинов в сайтах мутации. Последнее свойство может повышать стабильность молекулы.
Последовательности соответствующих белков приведены ниже:
ИЛ-15 (SEQ ID NO: 1): (аминокислотная последовательность интерлейкина 15 человека, а также референсная последовательность ИЛ-15) 
ИЛ-15(L52C) (SEQ ID NO: 2): (аминокислотная последовательность интерлейкина 15 человека с мутацией L52C в положении 52) 
ИЛ-15Rα-ECD (SEQ ID NO: 3): (аминокислотная последовательность внеклеточного домена рецептора альфа интерлейкина 15 человека) 
ИЛ-15Rα-sushi+ (SEQ ID NO: 4): (укороченная форма фрагмента рецептора интерлейкина 15, содержащая 73 аминокислоты) 
ИЛ-15Rα-ECD (S40C)-Fc (SEQ ID NO: 5): (слитый полипептид внеклеточного домена ИЛ-15Rα, слитого с Fc, который содержит мутацию в положении S40C) 
Fc-ИЛ-15Rα-ECD (S40C) (SEQ ID NO: 6): (слитый полипептид Fc, слитого с внеклеточной областью ИЛ-15Rα, которая содержит мутацию S40C) 
ИЛ-15Rα-Sushi+ (S40C)-Fc (SEQ ID NO: 7): (укороченная форма рецептора α интерлейкина 15 человека, содержащая домен sushi, слитый с Fc посредством линкера, где sushi+ содержит мутацию S40C, и sushi+ локализован на N-конце) 
Fc-ИЛ-15Rα-sushi+ (S40C) (SEQ ID NO: 8): (укороченная форма рецептора a интерлейкина 15 человека, содержащая домен sushi, слитый с Fc посредством линкера, где sushi+ содержит мутацию S40C, и sushi+ локализован на С-конце) 
Фрагмент Fc, IgG1-Fc (белок) (SEQ ID NO: 9) 
В эксперименте исследуемые молекулы были пронумерованы следующим образом: белковые комплексы 1, 2, 3 и 4, где белковый комплекс 1 был получен путем коэкспрессии SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 5. Белковый комплекс 2 был получен путем коэкспрессии SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 6. Белковый комплекс 3 был получен путем коэкспрессии SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 7. Белковый комплекс 4 был получен путем коэкспрессии SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 8. Схематическая диаграмма приведена на Фиг. 7. Стабильность комплексной молекулы увеличивалась за счет увеличения образования дисульфидной связи путем спаривания цистеинов в сайтах мутации.
Перечень белковых комплексов приведен ниже:
Пример 4. Получение белкового комплекса ИЛ-15
1. Экспрессия белка
Белок ИЛ-15/ИЛ-15Rα транзитно трансфицировали и экспрессировали с использованием клеток Freestyle 293 (GIBCO, кат. № R79007). Клетки FreeStyle 293 культивировали в суспензии в питательной среде для экспрессии Freestyle 293 (GIBCO, кат. № 12338018) с добавлением фетальной бычьей сыворотки со сверхнизким содержанием IgG (FBS (эмбриональная бычья сыворотка) со сверхнизким содержанием иммуноглобулинов, GIBCO, кат. №16250078) в конечной концентрации 1%. Готовили экспрессионные плазмиды ИЛ-15/ИЛ-15Rα и реагент для трансфекции полиэтиленимин (ПЭИ) (Polysciences, кат. №239662), две плазмиды ИЛ-15 и ИЛ-15Rα котрансфицировали в соотношении в диапазоне от 1:1 до 9:1, общее количество плазмид составляло 100 мкг/100 мл клеток, отношение количества плазмиды к количеству ПЭИ составляло 1:2 по массе. Плотность клеток в день трансфекции составляла 1×106/мл. 1 л клеток FreeStyle 293 готовили для трансфекции. 50 мл среды Opti-MEM (GIBCO, кат. №11058021) смешивали с плазмидой, выдерживали в покое в течение 5 мин и фильтровали. Еще 50 мл среды Opti-MEM смешивали с ПЭИ, выдерживали в покое в течение 5 мин и фильтровали. Плазмиду смешивали с ПЭИ и выдерживали в покое в течение 15 мин. Смесь плазмиды и ПЭИ медленно добавляли к клеткам и культивировали в термостате при встряхивании при 130 об/мин при 37°С, 8% СО2. Через 5 дней супернатант собирали центрифугированием для очистки белка.
2. Очистка белка
Аффинная хроматография для слитого белка ИЛ-15:
Супернатант собирали из клеточной культуры после высокоскоростного центрифугирования и подвергали аффинной хроматографии с использованием колонки с белком А от компании GE. Для хроматографии использовали буфер для уравновешивания колонки 1×ФСБ (рН 7,4), после этого супернатант наносили и связывали с колонкой, промывая ФСБ до возвращения сигнала УФ к исходному уровню, а затем элюировали целевой белок буфером для элюирования (кислотность, рН 2,5-5). рН доводили до нейтрального с помощью Трис, и целевой белок хранили.
Ионообменная хроматография для слитого белка ИЛ-15:
рН продукта, полученного во время аффинной хроматографии, доводили до значения на 1-2 рН ниже или выше изоэлектрической точки (pI). Затем образец разводили соответствующим образом для регулирования проводимости образца менее 5 мс/см. Проводили элюирование градиентом NaCl в соответствующих условиях рН с использованием подходящего буфера, соответствующего по значению рН, такого как фосфатный буфер, ацетатный буфер и другие, с использованием традиционных способов хроматографии на ионообменной колонке, известных в данной области техники, таких как катионообмен или анионообмен. Целевые белки, соответствующие различным пикам поглощения, собирали с использованием электрофореза в ДСН-ПААГ и хранили.
Эксклюзионная хроматография для слитого белка ИЛ-15:
Продукт, полученный во время ионообменной хроматографии, концентрировали путем ультрафильтрации и наносили на колонку для эксклюзионной хроматографии с использованием такого геля, как, например, GE Superdex 200, чтобы удалить возможный полимер и другие компоненты, с целью получения желаемого продукта высокой чистоты. Чистоту полученного белка можно определить с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и эксклюзионной ВЭЖХ. Концентрацию белка определяли с помощью УФ спектрофотометрии.
Экспериментальные примеры
Экспериментальный пример 1. Анализ пролиферации МКПК in vitro
Свежие МКПК (мононуклеарные клетки периферической крови человека, шанхайский центр переливания крови) культивировали в питательной среде RPMI1640 (Thermo Fisher Chemical Products Co., Ltd (г. Пекин), кат. № SH30809.01B), содержащей 10% FBS, центрифугировали и ресуспендировали до плотности клеток 5×105 клеток/мл. В каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 90 мкл. Образцы разводили фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ) с определенной кратностью до различных концентраций. 10 мкл добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета и культивировали в инкубаторе при 37°С, 5% СО2 в течение 48 часов. Затем отбирали 50 мкл для определения клеточной пролиферации с помощью набора для люминесцентного определения жизнеспособности клеток CellTiter-Glo®.
В таблице 5 показаны результаты определения активности белковых комплексов 1 и 3 по настоящему изобретению по сравнению с контрольным ИЛ-15 в анализе пролиферации МКПК in vitro, показывающие, что белковые комплексы 1 и 3 настоящей заявки значительно усиливали активность пролиферации МКПК по сравнению с контрольным ИЛ-15. В данном эксперименте активность, стимулируемая белковым комплексом 1, возрастала примерно в 5 раз, тогда как активность, стимулируемая белковым комплексом 3, возрастала примерно в 66 раз.
Экспериментальный пример 2. Анализ пролиферации клеток Мо7е in vitro
1. Основные материалы
Клетки Мо7е (линия клеток мегакариоцитарного лейкоза человека) приобретали в Пекинском объединенном медицинском колледже;
ИЛ-15 приобретали у компании Novoprotein, кат. № С016, аналог ИЛ-15 был получен во внутренней лаборатории;
Набор для подсчета клеток (Cell Counting Kit-8, ССК-8) приобретали у компании WST, кат. № ЕХ660;
Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) приобретали у компании Novoprotein, кат. № СС79.
2. Методики
1) Клетки Мо7е культивировали в модифицированной питательной среде RPMI-1640 (содержащей 2,05 мМ L-глутамина, 10% FBS и 15 нг/мл GM-CSF) в инкубаторе при 37°С (5% CO2);
2) Клетки Мо7е в хорошем состоянии центрифугировали при комнатной температуре, 150×g в течение 5 мин. Супернатант отбрасывали;
3) Осадок клеток промывали средой, не содержащей GM-CSF, а затем считали;
4) Концентрацию клеток доводили до необходимой и высевали в 96-луночном планшете при количестве клеток 2×104/лунка и объеме 90 мкл (без GM-CSF) и выдерживали в инкубаторе для культивирования клеток;
5) ИЛ-15 и его аналог разводили в 4 раза ФСБ, 10 мкл/лунка добавляли в систему культивирования клеток после 2 часов инкубации клеток в 96-луночных планшетах. Каждую концентрацию повторяли в трех повторностях, в качестве контроля использовали лунки с холостой пробой (с добавлением только ФСБ);
6) Планшеты с клетками культивировали в инкубаторе в течение 3 дней;
7) Во все тестируемые лунки добавляли 10 мкл ССК-8 и инкубировали в инкубаторе в течение 3 часов;
8) Определяли оптическую плотность при 450 нм (OD450).
В таблице 6 приведено сравнение белковых комплексов 1-4 с контрольным ИЛ-15 в анализе пролиферации клеток Мо7е in vitro, которое показано, что белковые комплексы 1-4 значительно повышали активность пролиферации по сравнению с контрольным ИЛ-15, и активность пролиферации, стимулируемая комплексами 3 и 4, была значительно выше активности, стимулируемой комплексами 1 и 2.
Экспериментальный пример 3. Модель метастазов в легкое у мышей
1. Эксперименты с использованием животных
32 мыши C57BL/6 (SPF, Shanghai Super В&К Laboratory Animal Corp. Ltd.) делили на 4 группы, по 8 мышей в каждой группе. Мышам вводили внутривенно 1,5×105 клеток B16F10 через хвостовую вену (Cell Resource Center, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, TCM36). В день 1 мыши вводили интраперитонеально ФСБ, 2 мкг ИЛ-15 и 5 мкг или 15 мкг белкового комплекса 3. Взвешивание проводили один раз в 2-3 дня, одну мышь из каждой группы умерщвляли в день 14 и проводили наблюдение метастазов в легких. Всех мышей умерщвляли в день 16. Легкие всех мышей извлекали и взвешивали, наблюдали на наличие скоплений черного цвета и фотографировали, а затем легкое фиксировали в формальдегиде и подсчитывали число черных скоплений.
2. Результаты
В легких мышей группы ФСБ выявлено большое количество растущих метастатических меланом (73±43). В легких мышей группы ИЛ-15 выявлено большое количество скоплений клеток меланомы (65±29), составляющее около 90% от количества, выявленного в группе ФСБ. В легких группы белкового комплекса 3 (5 мкг) выявлены частичные метастазы в виде скоплений клеток меланомы (30±16), около 41% от количества, выявленного в группе ФСБ. В легких группы белкового комплекса 3 (15 мкг) выявлены частичные метастазы в виде скоплений клеток меланомы (24±13), около 33% от количества, выявленного в группе ФСБ.
В модели B16F10 с использованием мышей эффективность белкового комплекса 3 значительно превосходила эффективность ИЛ-15, как показано на Фиг. 8.
Относительная масса легкого в группе ФСБ была значимо больше, чем в группе белкового комплекса 3, как показано на Фиг. 9.
Во время введения препарата значимого уменьшения массы тела не наблюдали ни в одной группе, что позволяет предположить, что вводимая дозировка не обладает значительной токсичностью, как показано на Фиг. 10.
В другом эксперименте на модели B16F10 у мышей с другой группой дозирования авторы изобретения наблюдали значимую противоопухолевую активность при уменьшении дозы белкового комплекса 3 до 0,5 мкг/мышь, при этом при максимально переносимой дозе 30 мкг/мышь очевидных патологических изменений не выявлено.
В заключение, белковый комплекс 3 может ингибировать метастаз клеток B16F10 в легких мышей, обладает дозозависимым действием и высоким пределом безопасности.
Экспериментальный пример 4. Модель подкожной опухоли у мышей
1. Эксперименты с использованием животных
1.1. Мышам необходимо было адаптироваться к условиям лаборатории в течение 5 дней.
1.2. Трансплантация опухолевых клеток
Мышам C57BL/6 mice (SPF, Shanghai Xi Puer Bei Kai Experimental Animal Co., Ltd.) инокулировали подкожно в правое ребро клетки B16F10 (5×106/мышь). Опухоль росла в течение 7 дней. Когда объем опухоли увеличивался до 160±40 мм3, животных делили случайным образом (день 0) на 4 группы, по 7 мышей в каждой группе.
1.3. Дбзировка и способ введения
Каждой группе инъецировали подкожно исследуемый препарат однократно в день 1 и в день 5, в общей сложности два раза, ФСБ, или ИЛ-15 (2 мкг), или белковый комплекс 3 (5 мкг), или белковый комплекс 3 (15 мкг). У мышей измеряли объем опухоли и массу тела один раз в 2 дня, и данные регистрировали.
1.4. Статистика
Статистическое программное обеспечение Excel: среднее арифметическое значение вычисляли как avg; SD (стандартное отклонение) вычисляли как STDEV; SEM (ошибку среднего) вычисляли как STDEV/SQRT; величину Р между различными группами вычисляли как TTEST.
Объем ОПУХОЛИ (V) вычисляли как: V=1/2×Lдлина×Lширина2
Относительный объем (RTV)=Vт/V0
Коэффициент ингибирования опухоли (%)=(CRTV-TRTV)/CRTV (%)
V0 и VT представляют собой объем опухоли в начале эксперимента и в конце эксперимента, соответственно. CRTV и TRTV представляют собой относительный объем опухоли в контрольной группе холостой пробы (ФСБ) и в подопытной группе в конце эксперимента, соответственно.
2. Результаты
Поскольку опухоли из трансплантированных клеток B16F10 вырастают очень быстро, эксперимент прекращали в день 9. Ингибирующее действие белка ИЛ-15 на опухоль B16F10 показано в таблице 1. После однократного введения дозы в дни 1 и 5, соответственно, ИЛ-15 не ингибировал рост опухолей из трансплантированных клеток B16F10 в день 9. Однако коэффициент ингибирования в группе введения белкового комплекса 3 (5 мкг) и в группе 3 (15 мкг) составлял 30% и 73% соответственно, где в группе белкового комплекса 3 (15 мг) можно было наблюдать значимое ингибирование роста опухоли.
В заключение, в данном исследовании белковый комплекс 3 обладал ингибирующим действием на рост ксенотрансплантатов B16F10 и обладал очевидным дозозависимым эффектом, см. таблицу 7.
**: р меньше 0,01, по сравнению с ФСБ; i.p. - перитонеально.
Экспериментальный пример 5. Определение метаболического периода полувыведения белковых комплексов
1. Эксперименты с использованием животных
Крысам линии Спрег-Доули (SD) (n=2, получены от Sipur-Bikai Experimental Animal Co., Ltd.) вводили путем интраперитонеальной инъекции дозу 188 мкг/кг и объем 5 мл после голодания в течение ночи. У крыс брали образцы крови по 0,2 мл через ретроорбитальное сплетение до и после введения и через 0,5 ч, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч, 11 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч. Образцы крови собирали в пробирку, и выдерживали в пробирке в течение 30 мин при 4°С, затем центрифугировали при 3500 об/мин в течение 10 мин, и сыворотку отделяли. Хранили при -80°С. Крыс кормили через 2 ч после введения.
2. Результаты
Белковый комплекс 3 в сыворотке крыс иммобилизовали на планшете для анализа ELISA, на который было нанесено антитело к ИЛ-15. Для определения использовали антитело к Fc IgG человека и строили кривую концентрации, измеренный период полувыведения белкового комплекса 3 in vivo составлял около 13,7 ч (Фиг. 10). Согласно литературным данным, период полувыведения ИЛ-15 in vivo составляет менее 1 ч (J Immunol 2006; 177:6072-6080), что указывает на то, что белковый комплекс 3 имеет значительно пролонгированный период полувыведения in vivo.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ЦЗЯНСУ ХЭНЖУЙ МЕДСИН КО., ЛТД.; ШАНХАЙ ХЭНЖУЙ ФАРМАСЬЮТИКАЛ КО., ЛТД.
<120> БЕЛКОВЫЙ КОМПЛЕКС ИНТЕРЛЕЙКИНА 15 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
<130> 750038CTCP
<160> 20
<170> Patent In версия 3.3
<210> 1
<211> 114
<212> ПРТ
<213> HOMO SAPIENS
<400> 1
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 2
<211> 114
<212> ПРТ
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> IL-15(L52C)
<400> 2
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Cys Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 3
<211> 175
<212> ПРТ
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> IL-15R альфа-ECD
<400> 3
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val
65 70 75 80
Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly
85 90 95
Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr
100 105 110
Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro
115 120 125
Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr
130 135 140
Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser
145 150 155 160
His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr
165 170 175
<210> 4
<211> 73
<212> ПРТ
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> IL-15R альфа-sushi+
<400> 4
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg
65 70
<210> 5
<211> 417
<212> ПРТ
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> IL-15R альфа-ECD(S40C)-Fc
<400> 5
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Cys Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val
65 70 75 80
Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly
85 90 95
Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr
100 105 110
Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro
115 120 125
Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr
130 135 140
Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser
145 150 155 160
His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys
180 185 190
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
195 200 205
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
210 215 220
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
225 230 235 240
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
245 250 255
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
260 265 270
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
275 280 285
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
290 295 300
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
305 310 315 320
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
325 330 335
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
340 345 350
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
355 360 365
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
370 375 380
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
385 390 395 400
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
405 410 415
Lys
<210> 6
<211> 417
<212> ПРТ
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> Fc-IL-15R альфа-ECD(S40C)
<400> 6
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile
245 250 255
Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn
260 265 270
Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Cys Ser Leu Thr Glu Cys Val
275 280 285
Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys
290 295 300
Cys Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser
305 310 315 320
Thr Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro
325 330 335
Ser Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala
340 345 350
Ala Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys
355 360 365
Ser Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His
370 375 380
Gly Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser
385 390 395 400
Ala Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr
405 410 415
Thr
<210> 7
<211> 315
<212> ПРТ
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> IL-15R альфа-(Sushi+,S40C)-Fc
<400> 7
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Cys Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
85 90 95
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
100 105 110
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
115 120 125
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
130 135 140
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
145 150 155 160
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
165 170 175
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
180 185 190
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
195 200 205
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
210 215 220
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
225 230 235 240
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
245 250 255
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
260 265 270
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
275 280 285
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
290 295 300
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
305 310 315
<210> 8
<211> 315
<212> ПРТ
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> Fc-IL-15R альфа-sushi+(S40C)
<400> 8
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile
245 250 255
Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn
260 265 270
Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Cys Ser Leu Thr Glu Cys Val
275 280 285
Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys
290 295 300
Cys Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg
305 310 315
<210> 9
<211> 232
<212> ПРТ
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> фрагмент Fc, IgG1-Fc
<400> 9
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 10
<211> 411
<212> ДНК
<213> HOMO SAPIENS
<400> 10
atggacatgc gggtgccagc ccagctgctg ggcctgttgc tgctgtggtt ccccggctct 60
cggtgcaact gggtgaatgt aattagtgat ttgaaaaaaa ttgaagatct tattcaatct 120
atgcatattg atgctacttt atatacggaa agtgatgttc acccgagttg caaagtaaca 180
gcaatgaagt gctttctctt ggagttacaa gttatttcac ttgagtccgg cgatgcaagt 240
attcatgata cagtagaaaa tctgatcatc ttagcaaaca acagtttgtc ttctaatggg 300
aatgtaacag aatctggatg caaagaatgt gaggaactgg aggaaaaaaa tattaaagaa 360
tttttgcaga gttttgtaca tattgtccaa atgttcatca acacttcttg a 411
<210> 11
<211> 1320
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> последовательность вектора IL-15R альфа-ECD-Fc
<400> 11
atggacatgc gggtgccagc ccagctgctg ggcctgttgc tgctgtggtt ccccggctct 60
cggtgcatca cctgccctcc acctatgtcc gtggaacacg cagacatctg ggtcaagagc 120
tacagcttgt actcccgcga gcgctacatt tgtaactctg gtttcaagcg taaagccggc 180
acctccagcc tgaccgagtg cgtgttgaac aaggccacca atgtcgccca ctggacaacc 240
ccaagtctca aatgcattcg cgaccctgcc ctggttcacc aacgcccagc gccaccatcc 300
acagtaacca ctgcaggcgt gaccccacag ccagagagcc tctccccttc tggcaaagag 360
ccagcagctt catctccaag ctcaaacaac acagcggcca caacagcagc tattgtcccg 420
ggctcccagc tgatgccttc aaaatcacct tccacaggca ccacagagat cagcagtcat 480
gagtcctccc acggcacccc atctcagaca acagccaaga actgggaact cacagcatcc 540
gcctcccacc agccgccagg tgtgtatcca cagggccaca gcgacaccac tggcggagga 600
ggctctgggg gcggaggaag cgaacctaag tcctctgata agacccacac atgtcccccc 660
tgcccagctc ctgagctctt gggcggacct tccgtgtttc tgttcccccc aaagcccaag 720
gataccctta tgatcagcag aacacccgaa gttacttgcg tggtcgtgga cgtttctcac 780
gaagatcctg aagtgaaatt caactggtac gtggatggcg tggaggtgca caatgctaag 840
actaagcccc gtgaagagca gtacaactct acctaccggg tcgtttcagt gctgactgtt 900
ctccatcagg actggctcaa cgggaaggag tataagtgca aggtgtctaa caaggcactg 960
cccgcaccca tcgagaagac catttctaag gccaagggtc aaccacggga gccacaggtt 1020
tacacattgc ctcccagtcg ggaggagatg acaaagaatc aagtgtcact tacatgtctt 1080
gtgaagggct tctacccctc agacatcgcc gtggagtggg agagcaacgg acaaccagaa 1140
aacaactaca agaccacacc tcctgtgctc gattcagatg gttccttttt cttgtacagc 1200
aaactcaccg ttgacaagag tcggtggcag caaggaaatg tgttcagctg ttctgtgatg 1260
cacgaggccc tgcacaacca ttatacccaa aaatctctca gcctttctcc cggcaagtga 1320
<210> 12
<211> 1350
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> последовательность вектора Fc-IL-15R альфа-ECD
<400> 12
atggacatgc gggtgccagc ccagctgctg ggcctgttgc tgctgtggtt ccccggctct 60
cggtgcgaac ctaagtcctc tgataagacc cacacatgtc ccccctgccc agctcctgag 120
ctcttgggcg gaccttccgt gtttctgttc cccccaaagc ccaaggatac ccttatgatc 180
agcagaacac ccgaagttac ttgcgtggtc gtggacgttt ctcacgaaga tcctgaagtg 240
aaattcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcacaatg ctaagactaa gccccgtgaa 300
gagcagtaca actctaccta ccgggtcgtt tcagtgctga ctgttctcca tcaggactgg 360
ctcaacggga aggagtataa gtgcaaggtg tctaacaagg cactgcccgc acccatcgag 420
aagaccattt ctaaggccaa gggtcaacca cgggagccac aggtttacac attgcctccc 480
agtcgggagg agatgacaaa gaatcaagtg tcacttacat gtcttgtgaa gggcttctac 540
ccctcagaca tcgccgtgga gtgggagagc aacggacaac cagaaaacaa ctacaagacc 600
acacctcctg tgctcgattc agatggttcc tttttcttgt acagcaaact caccgttgac 660
aagagtcggt ggcagcaagg aaatgtgttc agctgttctg tgatgcacga ggccctgcac 720
aaccattata cccaaaaatc tctcagcctt tctcccggca agggcggagg aggctctggc 780
ggtggtggca gtggtggcgg agggtcagga ggtggtggaa gcatcacctg ccctccacct 840
atgtccgtgg aacacgcaga catctgggtc aagagctaca gcttgtactc ccgcgagcgc 900
tacatttgta actctggttt caagcgtaaa gccggcacct ccagcctgac cgagtgcgtg 960
ttgaacaagg ccaccaatgt cgcccactgg acaaccccaa gtctcaaatg cattcgcgac 1020
cctgccctgg ttcaccaacg cccagcgcca ccatccacag taaccactgc aggcgtgacc 1080
ccacagccag agagcctctc cccttctggc aaagagccag cagcttcatc tccaagctca 1140
aacaacacag cggccacaac agcagctatt gtcccgggct cccagctgat gccttcaaaa 1200
tcaccttcca caggcaccac agagatcagc agtcatgagt cctcccacgg caccccatct 1260
cagacaacag ccaagaactg ggaactcaca gcatccgcct cccaccagcc gccaggtgtg 1320
tatccacagg gccacagcga caccacttga 1350
<210> 13
<211> 1015
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> последовательность вектора IL-15R альфа-shushi+(73)-Fc
<400> 13
atggacatgc gggtgccagc ccagctgctg ggcctgttgc tgctgtggtt ccccggctct 60
cggtgcatca cctgccctcc acctatgtcc gtggaacacg cagacatctg ggtcaagagc 120
tacagcttgt actcccgcga gcgctacatt tgtaactctg gtttcaagcg taaagccggc 180
acctccagcc tgaccgagtg cgtgttgaac aaggccacca atgtcgccca ctggacaacc 240
ccaagtctca aatgcattcg cgaccctgcc ctggttcacc aacgcggcgg aggaggctct 300
gggggcggag gaagcgaacc taagtcctct gataagaccc acacatgtcc cccctgccca 360
gctcctgagc tcttgggcgg accttccgtg tttctgttcc ccccaaagcc caaggatacc 420
cttatgatca gcagaacacc cgaagttact tgcgtggtcg tggacgtttc tcacgaagat 480
cctgaagtga aattcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcacaatgc taagactaag 540
ccccgtgaag agcagtacaa ctctacctac cgggtcgttt cagtgctgac tgttctccat 600
caggactggc tcaacgggaa ggagtataag tgcaaggtgt ctaacaaggc actgcccgca 660
cccatcgaga agaccatttc taaggccaag ggtcaaccac gggagccaca ggtttacaca 720
ttgcctccca gtcgggagga gatgacaaag aatcaagtgt cacttacatg tcttgtgaag 780
ggcttctacc cctcagacat cgccgtggag tgggagagca acggacaacc agaaaacaac 840
tacaagacca cacctcctgt gctcgattca gatggttcct ttttcttgta cagcaaactc 900
accgttgaca agagtcggtg gcagcaagga aatgtgttca gctgttctgt gatgcacgag 960
gccctgcaca accattatac ccaaaaatct ctcagccttt ctcccggcaa gtgac 1015
<210> 14
<211> 1044
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> последовательность вектора Fc-IL-15R альфа-shushi+(73)
<400> 14
atggacatgc gggtgccagc ccagctgctg ggcctgttgc tgctgtggtt ccccggctct 60
cggtgcgaac ctaagtcctc tgataagacc cacacatgtc ccccctgccc agctcctgag 120
ctcttgggcg gaccttccgt gtttctgttc cccccaaagc ccaaggatac ccttatgatc 180
agcagaacac ccgaagttac ttgcgtggtc gtggacgttt ctcacgaaga tcctgaagtg 240
aaattcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcacaatg ctaagactaa gccccgtgaa 300
gagcagtaca actctaccta ccgggtcgtt tcagtgctga ctgttctcca tcaggactgg 360
ctcaacggga aggagtataa gtgcaaggtg tctaacaagg cactgcccgc acccatcgag 420
aagaccattt ctaaggccaa gggtcaacca cgggagccac aggtttacac attgcctccc 480
agtcgggagg agatgacaaa gaatcaagtg tcacttacat gtcttgtgaa gggcttctac 540
ccctcagaca tcgccgtgga gtgggagagc aacggacaac cagaaaacaa ctacaagacc 600
acacctcctg tgctcgattc agatggttcc tttttcttgt acagcaaact caccgttgac 660
aagagtcggt ggcagcaagg aaatgtgttc agctgttctg tgatgcacga ggccctgcac 720
aaccattata cccaaaaatc tctcagcctt tctcccggca agggcggagg aggctctggc 780
ggtggtggca gtggtggcgg agggtcagga ggtggtggaa gcatcacctg ccctccacct 840
atgtccgtgg aacacgcaga catctgggtc aagagctaca gcttgtactc ccgcgagcgc 900
tacatttgta actctggttt caagcgtaaa gccggcacct ccagcctgac cgagtgcgtg 960
ttgaacaagg ccaccaatgt cgcccactgg acaaccccaa gtctcaaatg cattcgcgac 1020
cctgccctgg ttcaccaacg ctga 1044
<210> 15
<211> 411
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> последовательность вектора IL-15(L52C)
<400> 15
atggacatgc gggtgccagc ccagctgctg ggcctgttgc tgctgtggtt ccccggctct 60
cggtgcaact gggtgaatgt aattagtgat ttgaaaaaaa ttgaagatct tattcaatct 120
atgcatattg atgctacttt atatacggaa agtgatgttc acccgagttg caaagtaaca 180
gcaatgaagt gctttctctt ggagttacaa gttatttcat gtgagtccgg cgatgcaagt 240
attcatgata cagtagaaaa tctgatcatc ttagcaaaca acagtttgtc ttctaatggg 300
aatgtaacag aatctggatg caaagaatgt gaggaactgg aggaaaaaaa tattaaagaa 360
tttttgcaga gttttgtaca tattgtccaa atgttcatca acacttcttg a 411
<210> 16
<211> 1320
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> последовательность вектора IL-15R альфа-ECD(S40C)-Fc
<400> 16
atggacatgc gggtgccagc ccagctgctg ggcctgttgc tgctgtggtt ccccggctct 60
cggtgcatca cctgccctcc acctatgtcc gtggaacacg cagacatctg ggtcaagagc 120
tacagcttgt actcccgcga gcgctacatt tgtaactctg gtttcaagcg taaagccggc 180
acctgcagcc tgaccgagtg cgtgttgaac aaggccacca atgtcgccca ctggacaacc 240
ccaagtctca aatgcattcg cgaccctgcc ctggttcacc aacgcccagc gccaccatcc 300
acagtaacca ctgcaggcgt gaccccacag ccagagagcc tctccccttc tggcaaagag 360
ccagcagctt catctccaag ctcaaacaac acagcggcca caacagcagc tattgtcccg 420
ggctcccagc tgatgccttc aaaatcacct tccacaggca ccacagagat cagcagtcat 480
gagtcctccc acggcacccc atctcagaca acagccaaga actgggaact cacagcatcc 540
gcctcccacc agccgccagg tgtgtatcca cagggccaca gcgacaccac tggcggagga 600
ggctctgggg gcggaggaag cgaacctaag tcctctgata agacccacac atgtcccccc 660
tgcccagctc ctgagctctt gggcggacct tccgtgtttc tgttcccccc aaagcccaag 720
gataccctta tgatcagcag aacacccgaa gttacttgcg tggtcgtgga cgtttctcac 780
gaagatcctg aagtgaaatt caactggtac gtggatggcg tggaggtgca caatgctaag 840
actaagcccc gtgaagagca gtacaactct acctaccggg tcgtttcagt gctgactgtt 900
ctccatcagg actggctcaa cgggaaggag tataagtgca aggtgtctaa caaggcactg 960
cccgcaccca tcgagaagac catttctaag gccaagggtc aaccacggga gccacaggtt 1020
tacacattgc ctcccagtcg ggaggagatg acaaagaatc aagtgtcact tacatgtctt 1080
gtgaagggct tctacccctc agacatcgcc gtggagtggg agagcaacgg acaaccagaa 1140
aacaactaca agaccacacc tcctgtgctc gattcagatg gttccttttt cttgtacagc 1200
aaactcaccg ttgacaagag tcggtggcag caaggaaatg tgttcagctg ttctgtgatg 1260
cacgaggccc tgcacaacca ttatacccaa aaatctctca gcctttctcc cggcaagtga 1320
<210> 17
<211> 1350
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> последовательность вектора Fc-IL-15R альфа-ECD(S40C)
<400> 17
atggacatgc gggtgccagc ccagctgctg ggcctgttgc tgctgtggtt ccccggctct 60
cggtgcgaac ctaagtcctc tgataagacc cacacatgtc ccccctgccc agctcctgag 120
ctcttgggcg gaccttccgt gtttctgttc cccccaaagc ccaaggatac ccttatgatc 180
agcagaacac ccgaagttac ttgcgtggtc gtggacgttt ctcacgaaga tcctgaagtg 240
aaattcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcacaatg ctaagactaa gccccgtgaa 300
gagcagtaca actctaccta ccgggtcgtt tcagtgctga ctgttctcca tcaggactgg 360
ctcaacggga aggagtataa gtgcaaggtg tctaacaagg cactgcccgc acccatcgag 420
aagaccattt ctaaggccaa gggtcaacca cgggagccac aggtttacac attgcctccc 480
agtcgggagg agatgacaaa gaatcaagtg tcacttacat gtcttgtgaa gggcttctac 540
ccctcagaca tcgccgtgga gtgggagagc aacggacaac cagaaaacaa ctacaagacc 600
acacctcctg tgctcgattc agatggttcc tttttcttgt acagcaaact caccgttgac 660
aagagtcggt ggcagcaagg aaatgtgttc agctgttctg tgatgcacga ggccctgcac 720
aaccattata cccaaaaatc tctcagcctt tctcccggca agggcggagg aggctctggc 780
ggtggtggca gtggtggcgg agggtcagga ggtggtggaa gcatcacctg ccctccacct 840
atgtccgtgg aacacgcaga catctgggtc aagagctaca gcttgtactc ccgcgagcgc 900
tacatttgta actctggttt caagcgtaaa gccggcacct gcagcctgac cgagtgcgtg 960
ttgaacaagg ccaccaatgt cgcccactgg acaaccccaa gtctcaaatg cattcgcgac 1020
cctgccctgg ttcaccaacg cccagcgcca ccatccacag taaccactgc aggcgtgacc 1080
ccacagccag agagcctctc cccttctggc aaagagccag cagcttcatc tccaagctca 1140
aacaacacag cggccacaac agcagctatt gtcccgggct cccagctgat gccttcaaaa 1200
tcaccttcca caggcaccac agagatcagc agtcatgagt cctcccacgg caccccatct 1260
cagacaacag ccaagaactg ggaactcaca gcatccgcct cccaccagcc gccaggtgtg 1320
tatccacagg gccacagcga caccacttga 1350
<210> 18
<211> 1015
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> последовательность вектора IL-15R альфа-shushi+(73)(S40C)-Fc
<400> 18
atggacatgc gggtgccagc ccagctgctg ggcctgttgc tgctgtggtt ccccggctct 60
cggtgcatca cctgccctcc acctatgtcc gtggaacacg cagacatctg ggtcaagagc 120
tacagcttgt actcccgcga gcgctacatt tgtaactctg gtttcaagcg taaagccggc 180
acctgcagcc tgaccgagtg cgtgttgaac aaggccacca atgtcgccca ctggacaacc 240
ccaagtctca aatgcattcg cgaccctgcc ctggttcacc aacgcggcgg aggaggctct 300
gggggcggag gaagcgaacc taagtcctct gataagaccc acacatgtcc cccctgccca 360
gctcctgagc tcttgggcgg accttccgtg tttctgttcc ccccaaagcc caaggatacc 420
cttatgatca gcagaacacc cgaagttact tgcgtggtcg tggacgtttc tcacgaagat 480
cctgaagtga aattcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcacaatgc taagactaag 540
ccccgtgaag agcagtacaa ctctacctac cgggtcgttt cagtgctgac tgttctccat 600
caggactggc tcaacgggaa ggagtataag tgcaaggtgt ctaacaaggc actgcccgca 660
cccatcgaga agaccatttc taaggccaag ggtcaaccac gggagccaca ggtttacaca 720
ttgcctccca gtcgggagga gatgacaaag aatcaagtgt cacttacatg tcttgtgaag 780
ggcttctacc cctcagacat cgccgtggag tgggagagca acggacaacc agaaaacaac 840
tacaagacca cacctcctgt gctcgattca gatggttcct ttttcttgta cagcaaactc 900
accgttgaca agagtcggtg gcagcaagga aatgtgttca gctgttctgt gatgcacgag 960
gccctgcaca accattatac ccaaaaatct ctcagccttt ctcccggcaa gtgac 1015
<210> 19
<211> 1044
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> последовательность вектора Fc-IL-15R альфа -shushi+(73)(S40C)
<400> 19
atggacatgc gggtgccagc ccagctgctg ggcctgttgc tgctgtggtt ccccggctct 60
cggtgcgaac ctaagtcctc tgataagacc cacacatgtc ccccctgccc agctcctgag 120
ctcttgggcg gaccttccgt gtttctgttc cccccaaagc ccaaggatac ccttatgatc 180
agcagaacac ccgaagttac ttgcgtggtc gtggacgttt ctcacgaaga tcctgaagtg 240
aaattcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcacaatg ctaagactaa gccccgtgaa 300
gagcagtaca actctaccta ccgggtcgtt tcagtgctga ctgttctcca tcaggactgg 360
ctcaacggga aggagtataa gtgcaaggtg tctaacaagg cactgcccgc acccatcgag 420
aagaccattt ctaaggccaa gggtcaacca cgggagccac aggtttacac attgcctccc 480
agtcgggagg agatgacaaa gaatcaagtg tcacttacat gtcttgtgaa gggcttctac 540
ccctcagaca tcgccgtgga gtgggagagc aacggacaac cagaaaacaa ctacaagacc 600
acacctcctg tgctcgattc agatggttcc tttttcttgt acagcaaact caccgttgac 660
aagagtcggt ggcagcaagg aaatgtgttc agctgttctg tgatgcacga ggccctgcac 720
aaccattata cccaaaaatc tctcagcctt tctcccggca agggcggagg aggctctggc 780
ggtggtggca gtggtggcgg agggtcagga ggtggtggaa gcatcacctg ccctccacct 840
atgtccgtgg aacacgcaga catctgggtc aagagctaca gcttgtactc ccgcgagcgc 900
tacatttgta actctggttt caagcgtaaa gccggcacct gcagcctgac cgagtgcgtg 960
ttgaacaagg ccaccaatgt cgcccactgg acaaccccaa gtctcaaatg cattcgcgac 1020
cctgccctgg ttcaccaacg ctga 1044
<210> 20
<211> 696
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> фрагмент Fc, IgG1-Fc
<400> 20
gaacctaagt cctctgataa gacccacaca tgtcccccct gcccagctcc tgagctcttg 60
ggcggacctt ccgtgtttct gttcccccca aagcccaagg atacccttat gatcagcaga 120
acacccgaag ttacttgcgt ggtcgtggac gtttctcacg aagatcctga agtgaaattc 180
aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcac aatgctaaga ctaagccccg tgaagagcag 240
tacaactcta cctaccgggt cgtttcagtg ctgactgttc tccatcagga ctggctcaac 300
gggaaggagt ataagtgcaa ggtgtctaac aaggcactgc ccgcacccat cgagaagacc 360
atttctaagg ccaagggtca accacgggag ccacaggttt acacattgcc tcccagtcgg 420
gaggagatga caaagaatca agtgtcactt acatgtcttg tgaagggctt ctacccctca 480
gacatcgccg tggagtggga gagcaacgga caaccagaaa acaactacaa gaccacacct 540
cctgtgctcg attcagatgg ttcctttttc ttgtacagca aactcaccgt tgacaagagt 600
cggtggcagc aaggaaatgt gttcagctgt tctgtgatgc acgaggccct gcacaaccat 660
tatacccaaa aatctctcag cctttctccc ggcaag 696
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА IL-15 И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ | 2018 |
|
RU2749342C1 |
| АНТИТЕЛО, СПОСОБНОЕ СВЯЗЫВАТЬСЯ С ТИМИЧЕСКИМ СТРОМАЛЬНЫМ ЛИМФОПОЭТИНОМ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2020 |
|
RU2825304C2 |
| ГЕТЕРОДИМЕРНЫЕ Fc-СЛИТЫЕ БЕЛКИ IL15/IL15Rα | 2017 |
|
RU2779938C2 |
| СЛИТЫЙ БЕЛОК, СОДЕРЖАЩИЙ РЕЦЕПТОР TGF-БЕТА, И ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ | 2018 |
|
RU2776204C1 |
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ СЛИТОГО БЕЛКА РЕЦЕПТОРА ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА БЕТА И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ | 2019 |
|
RU2791683C2 |
| АНТИТЕЛО К СКЛЕРОСТИНУ, ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ И МЕДИЦИНСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ | 2016 |
|
RU2716101C2 |
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ АНТИТЕЛА К PCSK-9, И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ | 2018 |
|
RU2782792C2 |
| ИММУНОЦИТОКИНЫ НА ОСНОВЕ IL-15 И IL-15Rα ДОМЕНА SUSHI | 2012 |
|
RU2763298C2 |
| ИММУНОЦИТОКИН, ВКЛЮЧАЮЩИЙ ГЕТЕРОДИМЕРНЫЙ БЕЛКОВЫЙ КОМПЛЕКС НА ОСНОВЕ IL-15/IL-15Rα, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2019 |
|
RU2753282C2 |
| АНТИТЕЛО К CD3 И ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ | 2019 |
|
RU2802272C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к белковому комплексу агонист ИЛ-15, состоящему из растворимого слитого белка (I) и растворимого слитого белка (II), где слитый белок (I) представляет собой ИЛ-15(L52C) с SEQ ID NO: 2, а слитый белок (II), выбран из ИЛ-15Rα-ECD(S40C)-Fc с SEQ ID NO: 5, Fc-ИЛ-15Rα-ECD(S40C) с SEQ ID NO: 6, ИЛ-15Rα-Sushi+(S40C)-Fc с SEQ ID NO: 7 или Fc-ИЛ-15Rα-sushi+(S40C) с SEQ ID NO: 8, и может быть использовано в медицине. Полученный белковый комплекс используется для эффективного лечения ИЛ-15-опосредованных заболеваний. 9 н. и 1 з.п. ф-лы, 11 ил., 7 табл., 5 пр.
1. Белковый комплекс агонист ИЛ-15 (интерлейкина-15), состоящий из растворимого слитого белка (I) и растворимого слитого белка (II); растворимый слитый белок (I) представляет собой полипептид ИЛ-15; и растворимый слитый белок (II) представляет собой полипептид ИЛ-15Rα или его функциональный фрагмент;
где растворимый слитый белок (I) или растворимый слитый белок (II) имеет остаток Cys в результате мутации одной или более аминокислот, и дисульфидная связь образуется в результате спаривания соответствующих остатков Cys, присутствующих в растворимом слитом белке (II) и растворимом слитом белке (I),
где на полипептиде ИЛ-15 мутация аминокислоты до остатка Cys происходит в положении L52; и на полипептиде ИЛ-15Rα или его функциональном фрагменте мутация аминокислоты до остатка Cys происходит в положении S40;
где белковый комплекс агонист ИЛ-15 выбран из комбинаций растворимого слитого белка (I), который представляет собой ИЛ-15(L52C) с SEQ ID NO: 2, и растворимого слитого белка (II), выбранного из ИЛ-15Rα-ECD(S40C)-Fc с SEQ ID NO: 5, Fc-ИЛ-15Rα-ECD(S40C) с SEQ ID NO: 6, ИЛ-15Rα-Sushi+(S40C)-Fc с SEQ ID NO: 7 и Fc-ИЛ-15Rα-sushi+(S40C) с SEQ ID NO: 8.
2. Нуклеиновая кислота, кодирующая растворимый слитый белок (I) белкового комплекса агониста ИЛ-15 по п. 1.
3. Нуклеиновая кислота, кодирующая растворимый слитый белок (II) белкового комплекса агониста ИЛ-15 по п. 1.
4. Эукариотический экспрессионный ДНК-вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 2, где эукариотический экспрессионный ДНК-вектор экспрессирует растворимый слитый белок (I), как определен в п. 1.
5. Эукариотический экспрессионный ДНК-вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 3, где эукариотический экспрессионный ДНК-вектор экспрессирует растворимый слитый белок (II), как определен в п. 1.
6. Эукариотическая клетка-хозяин для экспрессии ДНК-вектора по п. 4 и ДНК-вектора по п. 5, где эукариотическая клетка-хозяин экспрессирует растворимый слитый белок (I) и растворимый слитый белок (II), как определен в п. 1, и не является человеческой эмбриональной клеткой.
7. Способ получения белкового комплекса агониста ИЛ-15 по п. 1, включающий:
культивирование клетки-хозяина по п. 6 в условиях, достаточных для экспрессии белкового комплекса агониста ИЛ-15 по п. 1;
экспрессию и очистку белкового комплекса агониста ИЛ-15.
8. Фармацевтическая композиция для лечения ИЛ-15-опосредованных заболеваний, содержащая терапевтически эффективное количество белкового комплекса агониста ИЛ-15 по п. 1 и фармацевтически приемлемый эксципиент, разбавитель или носитель, где ИЛ-15-опосредованное заболевание выбрано из группы, состоящей из раков, инфекционных заболеваний, заболеваний крови и аутоиммунных заболеваний.
9. Применение белкового комплекса агониста ИЛ-15 по п. 1 или фармацевтической композиции по п. 8 при получении лекарственного средства для лечения ИЛ-15-опосредованных заболеваний, выбранных из группы, состоящей из рака, инфекционного заболевания, заболевания крови и аутоиммунного заболевания.
10. Применение по п. 9, где:
рак выбран из группы, состоящей из меланомы, колоректального рака, рака кожи, лимфомы, почечно-клеточной карциномы, рака печени, рака легкого, рака желудка и рака молочной железы;
инфекционное заболевание выбрано из группы, состоящей из инфекции вирусом натуральной оспы, ВИЧ-инфекции, бактериальной инфекции, грибковой инфекции и HBV-инфекции (вирус гепатита B);
заболевание крови выбрано из группы, состоящей из анемии, острого миелоидного лейкоза, миелодиспластического синдрома и Т-клеточного лейкоза из больших зернистых лимфоцитов;
аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из рассеянного склероза, псориаза, ревматоидного артрита, гастрита и мукозита.
