Способ детекции штаммов Mycobacterium bovis BCG в формате реального времени Российский патент 2019 года по МПК G01N33/569 C12Q1/6876 

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для лабораторного выявления изолятов Mycobacterium bovis BCG.

Туберкулез остается одним из наиболее значимых социальных заболеваний в мире и России, а вакцинация против туберкулеза вакциной БЦЖ представляет значимый и неотъемлемый компонент программ по борьбе с туберкулезом. Микобактерии туберкулезного комплекса (М. tuberculosis complex (Mtbc)) объединяют генетически близкородственные виды, фактически составляющие один геновид, но по экологическим и клиническим основаниям называемые «видами». В Mtbc входят как виды, вызывающие заболевание туберкулезом только у людей (М. tuberculosis sensu strcto, М. africanum), так и различные экотипы характерные для определенных видов животных (М. caprae, М. pinnipedii и др.) (Smith et al., 2006).

Вакцина БЦЖ (сокр. От Бацилла Кальметта-Герена, фр. Bacillus BCG) представляет собой живой штамм Mycobacterium bovis BCG, полученный в 1924 в Институте Пастера в Лилле А. Кальметом и К. Гереном посредством последовательных пересевов штамма Mycobacterium bovis. В результате лабораторной эволюции произошло аттенуирование штамма в результате утраты факторов вирулентности и соответствующих кодирующих участков генома. В дальнейшем, исходный штамм BCG был субкультивирован и передан в лаборатории в разных странах мира (Oettinger et al., 1999) для децентрализованного производства вакцины против туберкулеза. Применение разных культуральных сред и различия в графиках пассирования привели к генетической диверсификации исходного штамма в ряд генетически различных субштаммов БЦЖ (дочерние штаммы) (Liu et al., 2009). Первым документированным дочерним штаммом был штамм, переданный в Россию в 1924 году (BCG-Russia) (Dubos and Pierce, 1956).

В настоящее время установлено наличие крупной и стабильной геномной делеции RD1 (9,5 тпн) во всех дочерних штаммах BCG. RD1 содержит гены, кодирующие факторы вирулентности (Mahairas 1996; Behr and Small, 1999; Pym et al., 2002). В геноме референтного штамма H37Rv участок RD1 содержит гены Rv3871-Rv3879c, составляет 9458 п. н. (позиции 4350266 - 4359722, GenBank Sequence ID NC_000962.3). В геноме вакцинного штамма Mycobacterium bovis BCG Russia 368 эта делеция находится между позициями 4318330 и 43183301 (GenBank Sequence ID СР009243.1).

Также известно, что штаммы BCG могут быть выявлены методом сполиготипирования для выявления профиля, характерного для штамма БЦЖ (Bauer et al., 1999) (Фиг. 1).

Побочные эффекты вакцинации БЦЖ (БЦЖиты) включают как локализованные осложнения, так и диссеминированную инфекцию (Azzopardi et al., 2009; Леви и соавт., 2010; Севостьянова и соавт., 2016). В России частота осложнений, связанных с БЦЖ, в 2003 году составила 28,1 на 100000 новорожденных детей, тогда как лимфаденит и холодные абсцессы были наиболее часто встречающимися осложнениями - 16,7 и 7,3 на 100000, соответственно (Аксенова и соавт., 2009). Начиная с 2001 года отмечался рост числа туберкулезных оститов у детей, преимущественно БЦЖ этиологии (Анисимова Н.А. 2009 г). В структуре костно-суставного туберкулеза у детей в РФ туберкулезные оститы, включая специфические костные осложнения противотуберкулезной вакцинации (БЦЖ-оститы), составляют до 75% (Казьмина, 2007). Частота БЦЖ-оститов в регионах в среднем составляет от 6,4 до 11,2 на 100 тыс.вакцинированных, что в абсолютных цифрах соответствует не более 2 случаев заболевания в год на регион с населением около 1 млн. человек (Мушкин 2006).

Быстрая и правильная идентификация штамма Mycobacterium bovis BCG является клинически и этически значимой поскольку (1) штамм БЦЖ чувствителен к противотуберкулезным препаратам, что определяет более простой режим лечения, чем в случае зачастую резистентного клинического штамма М. tuberculosis, и (2) чувствительные этические и юридические аспекты неизбежно возникают в случае развития клинического туберкулеза как прямого осложнения вакцинации БЦЖ.

Диагноз БЦЖ-ассоциированного поражения считается «доказанным» в случаях, когда в материале из патологического очага (зоны деструкции кости/сустава, абсцесса, свища) любым бактериологическим методом выделяют микобактерии туберкулезного комплекса с последующей идентификацией. Культуральная диагностика с использованием плотных яичных питательных сред (ПС) Левенштейна-Йенсена и Финн-II и посев в жидкую питательную среду с использованием набора реагентов для работы с автоматизированной системой BACTEC™ MGIT™ 960 (Becton Dickinson, США) отличаются высокой специфичностью (до 100%) и относительно низкой чувствительностью (в среднем 25-27%).

Выделение штаммов требует значительного времени 47,9±5,6 дней культивирования для плотных питательных сред и 27,9±2,9 дней при использовании жидкой питательной среды системы ВАСТЕС™ MGIT™. Окончательная идентификация проводится по результатам комплекса ферментативной идентификации, включавшего ниациновый тест, тест восстановления нитратов (нитратредуктазная активность), а также рост на среде с никотинамидом и циклосерином.

Все вышеизложенное определяет актуальность применения экспрессных молекулярно-генетических методов.

В настоящее время известны следующие генетические методы детекции штаммов БЦЖ на основе выявления делеции RD1:

- лимитированное секвенирование (Behr et al., 1999);

- ДНК-гибридизация на микрочипах/биочипах или стрипах (Behr et al., 1999, «HAIN-GenoType DRMTBC» Hain Lifescience, Германия, «Сполиго-Биочип» ООО «Биочип-ИМБ», Россия);

- полногеномное секвенирование с последующим выравниванием коротких нуклеотидных прочтений на геном референтного штамма ( et al., 2014) (Фиг. 2).

Их основным недостатком является дороговизна и/или необходимость дополнительного биоинформационного анализа и оборудования (методы на основе секвенирования и использования ДНК-чипов).

Известен способ детекции RD1 методом мультиплексной ПЦР с последующим электрофорезом в агарозном геле (Talbot et al., 1997) (прототип). Его недостатком является относительная трудоемкость и длительность проведения ПЦР и электрофорез в геле.

Таким образом, разработка быстрого и простого способа детекции изолятов Mycobacterium bovis BCG является актуальной задачей программы контроля туберкулеза в России и мире.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа быстрой и надежной детекции Mycobacterium bovis BCG посредством амплификации и флуоресцентного выявления специфической для этого штамма делеции геномного участка RD1, соответствующей позициям в геноме референтного штамма H37Rv 4350266-4359722 (GenBank Sequence ID: NC_000962.3).

Задача реализуется за счет того, что применяют ПЦР в формате реального времени с использованием специфических праймеров и флуоресцентно-меченых зондов, и при экспоненциальном накоплении сигнала флуоресценции между 25-40 циклами ПЦР по каналу FAM с длиной волны 510 нм и отсутствии сигнала по контрольному каналу HEX с длиной волны 555 нм судят о принадлежности изолята к Mycobacterium bovis BCG.

Мультиплексная ПЦР основана на использовании сконструированных нами: (1) трех праймеров - двух внешних (по отношению к специфической делеции RD1 в геноме BCG, фланкирующих ее и выступающих в качестве прямого и обратного) и одного внутреннего (расположенного внутри RD1 в штаммах не-BCG и действующего как обратный праймер) и (2) двух флуоресцентно-меченых зондов для выявления наличия или отсутствия специфической делеции RD1 в геноме штамма BCG (между позициями 4318330 и 43183301 (GenBank Sequence ID СР009243.1) (Фиг. 3).

Преимущества предлагаемого способа: (1) быстрота (меньше одного дня от момента выделения ДНК); (2) простая и однозначная интерпретация результатов; (3) возможность быстрого анализа больших коллекций штаммов микобактерий для выявления Mycobacterium bovis BCG.

Изобретение поясняется чертежами, где

Фиг. 1. Примеры профилей сполготипирования штаммов М. tuberculosis complex. Профиль сполиготипа BCG отмечен звездочкой. Международный номер сполиготипа (spoligotype international type, SIT) и название семейства даны согласно базе данных SITVIT_WEB (http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_ONLINE/).

Фиг. 2. Делеция RD1 в штамме BCG, визуализированная посредством выравнивания коротких нуклеотидных прочтений полногеномного севенирования (MiSeq/Ilumina) клинического штамма BCG на полный геном референтного штамма H37Rv (GenBank Sequence ID: NC 000962.3). Использована программа Geneious 9.0.4.

Фиг. 3. Геномный локус RD1 и схема ПЦР. Стрелки показывают позиции праймеров (острые стрелки) и зондов (тупые стрелки) в геномах референс-штамма H37Rv и штамма BCG.

Фиг. 4. Накопление сигнала флуоресценции во время ПЦР в реальном времени по специфическому (FAM) каналу детекции, на М. bovis BCG и контрольному (HEX) каналу детекции, на штамм другого генотипа М. tuberculosis complex. Вода служит отрицательным контрольным образцом. Вакцинный штамм BCG получен из ГИСК им. Тарасевича (Москва).

Способ осуществляется следующим образом. Выделение ДНК из культуры микобактерий, выращенной на среде Левенштейна-Йенсена, проводят по van Embden et al. [1993]: суспендируют 1 стандартную бактериологическую петлю культуры в 400 мкл буфера ТЕ xl и инкубируют 20 мин при 85°С. Дальнейшую обработку проводят с использованием лизоцима, протеиназы К, додецилсульфата натрия и цетилтриметиламмонийбромида. Полученный клеточный лизат обрабатывают смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1), центрифугируют, осаждают изопропанолом, промывают 70% этанолом, осадок высушивают и растворяют в 30-50 мкл TE x1.

Были использованы следующие сконструированные нами праймеры и зонды (Фиг. 3) для проведения реакции ПЦР и детекции флуоресценции по двум каналам в одной пробирке одновременно: праймеры RD1F (5'-TTCTGGTCGACGATTGGCA), RD1R (5'-AGGGGATGAGTATTACCAGGCC), RD1Ri (5'-CAACCCGATATCTGCCGC) и флуоресцентно-меченые зонды RD1P (FAM-5'-CGCCCGGATCCAGCATCTGTC-3'-BHQ-1), RD1Pi (HEX-5'-ATGCCGCCGATGGCACCG-3'-BHQ-l).

Для детекции BCG служили праймеры RD1F, RD1R и зонд RD1P-FAM; детекцию сигнала проводили по FAM-каналу детекции (длина волны 510 нм) (Фиг. 3 и 4).

Для детекции штамма не-BCG (т.е., любого другого генотипа М. tuberculosis complex) служили праймеры RD1F, RD1Ri и зонд RD1Pi-HEX; детекцию сигнала проводили по НЕХ-каналу (длина волны 555 нм) (Фиг. 3 и 4).

Очищенная ДНК (0.1-0.5 мкл) добавляется к смеси ПЦР (конечный объем 30 мкл) содержащей 1,5 mM MgCl₂, 1 U Taq ДНК полимеразы для ПЦР в реальном времени в режиме «горячего старта», 200 μМ каждого из дезоскирибонуклеотидтрифосфатов, праймеры (по 5 пмоль), зонды (по 2 пмоль). ПЦР проводили в термоциклере RotorGene6000 (Corbette Research) в следующих условиях: 95°С, 10 мин; далее 45 циклов 94°С, 15 с; 60°С, 40 с. Считывание сигнала флуоресценции - при 60°С по каналам 510 и 555 нм.

Оценка результатов.

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала между 15-40 циклом по двум каналам - анализируют с помощью программного обеспечения прибора, используемого для проведения ПЦР в формате реального времени. По каналу FAM (длина волны 510 нм) -регистрируется накопление продукта амплификации фрагмента ДНК, специфического для штамма BCG, по каналу HEX (длина волны 555 нм) - фрагмента ДНК, специфического для любого другого генотипа М. tuberculosis complex (Фиг. 4).

При отсутствии сигнала флуоресценции по обоим каналам делается вывод о недостаточном количестве и/или качестве ДНК или ингибировании реакции ПЦР и невозможности какого-либо вывода о наличии или отсутствии ДНК штамма BCG в образце.

Обязательная амплификация одного или другого продукта ПЦР является контролем качества: при отсутствии сигнала судят о деградированной ДНК или ингибировании реакции, при наличии сигнала по обоим каналам делают вывод о микс-образце (контаминация на каком-либо из этапов исследования или выделение двух штаммов от одного больного).

Пример 1. Сравнение разработанного метода с результатами сполиготипирования.

Нами были протестированы в общей сложности 55 штаммов биохимически идентифицированных как М. bovis БЦЖ, выделенных в СПб НИИ фтизиопульмонологии от 55 ВИЧ-отрицательных детей с клиническим туберкулезом.

Сполиготипирование проводили согласно стандартному протоколу (Kamerbeek et al., 1997), с использованием мембраны с иммобилизованными олигонуклеотидами на 43 спейсера локуса CRISPR М. tuberculosis, изготовленной в лаборатории молекулярной микробиологии НИИЭМ им. Пастера. Профили сполиготипирования сравнивали с международной базой данных SITVITWEB (http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVITONLINE/).

Все 55 штаммов имели сполигопрофиль штамма BCG (SIT482) (Фиг. 1). В качестве контрольного вакцинного штамма BCG использовали штаммы BCG, полученные из Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л. А. Тарасевича (г.Москва) и Национальной референс-лаборатории по микобактериям (KTL, г. Турку, Финляндия).

Анализ локуса RD1 проводили с применением разработанной ПЦР в реальном времени с использованием термоциклера Rotorgene6000 (Corbette Research) как описано выше.

В результате было установлено, что участок генома RD1 был делетирован во всех изученных клинических и вакцинных штаммах BCG.

Пример 2. Сравнение разработанного способа с результатами полногеномного секвенирования.

Полногеномное секвенирование 6 клинических штаммов БЦЖ, выделенных в СПб НИИ фтизиопульмонологии, проводили с использованием платформы MiSeq (Illumina), используя реагенты для получения парных прочтений длиной по 300 нуклеотидов (Illumina, New England Biolabs). Полученные файлы fastq использовали для выравнивания на референсный геном М. tuberculosis H37Rv (NC_000962.3) с использованием программы Geneious 9.0.4 (Biomatters Ltd).

Экспериментальный анализ локуса RD1 проводили с помощью разработанной ПЦР в реальном времени с использованием термоциклера Rotorgene6000 (Corbette Research) как описано выше.

В результате применения полногеномного секвенирования с последующим биоинформационным анализом и разработанного нами метода ПЦР в реальном времени наличие делеции RD1 было согласованно выявлено во всех изученных клинических штаммах BCG.

Пример 3. Применение разработанного метода для детекции штаммов BCG, выделенных в Китае.

Нами были протестированы в общей сложности 12 штаммов микобактерий, выделенных в Детской больнице Пекина и биохимически идентифицированных как М. bovis БЦЖ.

Сполиготипирование проводили согласно стандартному протоколу (Kamerbeek et al., 1997). Профили сполиготипирования сравнивали с международной базой данных SITVIT_WEB (http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_ONLINE/).

Все штаммы, определенные биохимически как BCG, имели сполигопрофиль SIT482 характерный для BCG (Фиг. 1).

Анализ локуса RD1 проводили с помощью разработанной ПЦР в реальном времени с использованием термоциклера CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Biorad) как описано выше.

В результате было установлено, что участок генома RD1 был делетирован во всех изученных штаммах BCG.

Литература

Аксенова В.А., Леви Д.Т., Фонина Е.В. и др. Вакцинопрофилактика туберкулеза: значение и проблемы // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2009. - №1. - С.10-16.

Анисимова Н.А. Патоморфология туберкулезных оститов у детей: автореф. дис. канд. мед. наук. - Челябинск, 2009.

Казьмина Е.А. Особенности эпидемиологии, диагностики и хирургического лечения БЦЖ-оститов у детей: автореф. дис .канд. мед. наук. - СПб., 2007.

Леви Д.Т., Александрова Н.В., Рухамина М.Л., Подлипаева И.В. Осложнения вакцинации БЦЖ // Всероссийская науч.-практ. конференция «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». - М, 2010. - С. 67-68.

Мушкин А.Ю. Диагностика и учет костных осложнений противотуберкулезной вакцинации (усовершенствованная медицинская технология). - СПб., 2006. - С. 5-8.

Севостьянова Т.А., Аксенова В.А., Белиловский Е.М. Осложнения после вакцинации БЦЖ/БЦЖ-М в мегаполисе // Туберкулез и болезни легких, 2016 - Т. 94, №6 - С. 20-24.

Azzopardi, Р., С.М. Bennett, S. М. Graham, and Т. Duke. 2009. Bacille vaccine-related disease in HIV-infected children: a systematic review. Int J Tuber Lung Dis. 13: 1331-1344.

Bauer J, Andersen AB, Kremer К, H. Usefulness of spoligotyping to discriminate IS6110 low-copy-number Mycobacterium tuberculosis complex strains cultured in Denmark. J Clin Microbiol. 1999;37(8):2602-2606.

Behr, M. A., and P. M. Small. 1999. A historical and molecular phylogeny of BCG strains. Vaccine. 17:915-922.

Behr MA, Wilson MA, Gill WP, Salamon H, Schoolnik GK, Rane S, Small PM. Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray. Science. 1999;284(5419): 1520-1523.

Kamerbeek J, Schouls L, Kolk A, et al. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. J Clin Microbiol 1997; 35: 907-914.

Mahairas, G.G., P.J. Sabo, M.J. Hickey, D.C. Singh, and С.K. Stover. 1996. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis. J Bacteriol. 178:1274-1282.

Pym, A. S., P. Brodin, R. Brosch, M. Huerre, and S. T. Cole. 2002. Loss of RD1 contributed to the attenuation of the live tuberculosis vaccines Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium microti. Mol Microbiol. 46:709-717.

A, Pang S, Bernard C, Brossier F, Veziris N, Capton E, Jarlier V, Sougakoff W. First Whole-Genome Sequence of a Clinical Isolate of Multidrug-Resistant Mycobacterium bovis BCG. Genome Announc. 2014;2(4). pii: e00611-14.

Smith NH, Kremer K, Inwald J, Dale J, Driscoll JR, Gordon SV, van Soolingen D, Hewinson RG, Smith JM. Ecotypes of the Mycobacterium tuberculosis complex. J Theor Biol. 2006;239(2):220-225.

Talbot EA, Williams DL, Frothingham R. PCR identification of Mycobacterium bovis BCG. J Clin Microbiol. 1997;35(3):566-569.

Изобретение относится к области медицины, в частности к фтизиатрии, и предназначено для детекции штаммов Mycobacterium bovis BCG путем лабораторного выявления геномной делеции RD1. Используют олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченые зонды для проведения ПЦР в формате реального времени с оценкой результатов между 25-40 циклами путем регистрации сигнала флуоресценции по FAM-каналу с длиной волны 510 нм и при экспоненциальном накоплении сигнала судят о принадлежности штамма микобактерий к Mycobacterium bovis BCG. При регистрации сигнала флуоресценции по контрольному HEX-каналу с длиной волны 555 нм судят о принадлежности штамма к другому генотипу М. tuberculosis complex. Изобретение обеспечивает быструю и надежную детекцию изолята Mycobacterium bovis BCG. 4 ил., 3 пр.

Способ детекции штаммов Mycobacterium bovis BCG в формате реального времени путем лабораторного выявления геномной делеции RD1, отличающийся тем, что используют олигонуклеотидные праймеры RD1F (5'-TTCTGGTCGACGATTGGCA), RD1R (5'-AGGGGATGAGTATTACCAGGCC), RD1Ri (5'-CAACCCGATATCTGCCGC) и флуоресцентно-меченые зонды RD1P (FAM-5'-CGCCCGGATCCAGCATCTGTC-3'-BHQ-1), RD1Pi (HEX-5'-ATGCCGCCGATGGCACCG-3'-BHQ-1) для проведения ПЦР в формате реального времени с оценкой результатов между 25-40 циклами путем регистрации сигнала флуоресценции по FAM-каналу с длиной волны 510 нм и при экспоненциальном накоплении сигнала судят о принадлежности штамма микобактерий к Mycobacterium bovis BCG, а при регистрации сигнала флуоресценции по контрольному HEX-каналу с длиной волны 555 нм судят о принадлежности штамма к другому генотипу М. tuberculosis complex.