ПРОТИВОАЛЛЕРГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2019 года по МПК C12P19/00 A61P17/04 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии, фармакологии и медицине, в частности к способам предупреждения развития аллергического воспаления и астматического состояния.

Аллергическое воспаление развивается при поступлении в организм из окружающей среды антигенов, содержащихся в пыльце растений, перхоти животных и продуктах жизнедеятельности клещей бытовой пыли (HDM) [10]. Dermatophagoides pteronyssinus (Der р) и Dermatophagoid.es farinae (Der f) являются наиболее распространенными клещами бытовой пыли. Клещи бытовой пыли могут продуцировать более 20-ти групп разных аллергенов [23]. Представителям рода Dermatophagoides принадлежит ведущая роль в развитии круглогодичного аллергического ринита [9]. Главными аллергенами клещей бытовой пыли являются Der р группы 1 (цистеиновая протеаза) и Der р группы 2 (семейство NPC2) [7]. Аллергены 2-ой группы представлены белками с молекулярной массой 15 кДа, относящимися к семейству белков NPC2 (белки Нимана-Пика типа С2). Структурная гомология между Der р 2 и Der f 2 достигает 88%. Гомология также обнаружена между аллергенами клещей бытовой пыли и аллергенами амбарных клещей: Der р 2 и Lep d 2 (37%), Der р 2 и Туг р 2 (40%) [11]. Der р 2 является термостабильной молекулой и выдерживает температуры до 100°С без денатурации [16].

Основные аллергены клещей бытовой пыли могут активировать систему врожденного иммунитета, которая является первой защитой в иммунной системе человека с относительно быстрым ответом на антиген. При аллергии, вызванной продуктами жизнедеятельности клещей бытовой пыли, антигены, поступающие в организм человека, взаимодействуют с рецепторами клеток врожденной иммунной системы, распознающими молекулярный паттерн антигена. Активация этих клеток приводит к продукции цитокинов и хемокинов, которые активируют дополнительные клетки иммунной системы, тем самым расширяя и усиливая ответ на антиген. Основные аллергены бытовой пыли активируют как врожденную, так и приобретенную иммунную систему [26]. Так, через 6 ч инкубации РВМС или дифференцированных ТНР-1 клеток с Der р 2 (1.5 ug/мл) наблюдалось высвобождение IL-1β, IL-6 и IL-8 [25]. Назначение этих цитокинов и хемокинов - усиливать пролиферацию Т-клеток и продукцию цитокинов, которые в свою очередь активируют ответ клеток адаптивного иммунитета [21].

Механизм активации клеток аллергеном Der р 2 связан с его структурной гомологией с MD-2 - кофактором Toll-подобного рецептора 4 (TLR4), участвующего в развитии воспаления [22]. Der р 2, выделенный из клещей бытовой пыли и содержащий примеси липополисахаридов (ЛПС), стимулирует клетки к синтезу провоспалительных цитокинов через TLR4 в отсутствии MD-2. Это указывает на то, что комплекс Der р 2•ЛПС имитирует комплекс MD-2•JIITC, активирующий TLR4, т.о. обнаруживая адъювантные свойства [25].

Прогноз аллергии, вызванной продуктами жизнедеятельности клещей бытовой пыли, в случае применения лекарственной терапии в виде антигистаминных, кортикостероидных препаратов, и назальных средств не является положительным, поскольку эти препараты только снимают симптомы заболевания. Пациент на некоторое время избавляется от проявлений аллергии, но вскоре вынужден опять обратиться к врачу за новым курсом терапии.

При отсутствии лечения проявления аллергии на продукты жизнедеятельности клещей бытовой пыли будут беспокоить больных постоянно, особенно в осенне-зимний период. При этом будет наблюдаться не только симптоматика аллергического заболевания, но и общее ухудшение состояния больного, которое будет влиять на его работоспособность, качество жизни и эмоционально-психологический настрой.

В связи с актуальной проблемой лечения аллергии, современной задачей биомедицины является разработка противоаллергических средств, снижающих аллергенную нагрузку на организм человека, вызванную продуктами жизнедеятельности клещей бытовой пыли. Эти средства не должны быть токсичными и должны иметь продолжительный период действия.

Проблемой, решаемой изобретением, является расширение арсенала противоаллергических средств за счет создания физиологического, нетоксичного средства на основе нетоксичного липополисахарида из фотогетеротрофной бактерии Rhodobacter capsulatus PG [1], подавляющего развитие иммунного ответа на аллергены клеща бытовой пыли Dermatophagoides pteronyssinus.

Технический результат состоит в отсутствии токсичности и продолжительном действии.

Данный штамм Rhodobacter capsulatus PG депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ РАН [2].

ЛПС Rhodobacter capsulatus PG получен из сухой бактериальной массы, лишенной пигментов, методом Вестфаля [24] в модификации Кулыпина [8]. ЛПС Rhodobacter capsulatus PG представляет собой порошок от белого до светло-серого цвета, гигроскопичен, мало растворим в воде, практически не растворим в 96% спирте. УФ-спектр поглощения 0,1% водного раствора ЛПС Rhodobacter capsulatus PG не обнаруживает максимумов поглощения в области от 200 нм до 300 нм, что указывает на минимальное содержание в полученном ЛПС нуклеиновых кислот менее чем 5 нг/мл и белков менее чем 50 нг/мл [19]. Электрофорез ЛПС Rhodobacter capsulatus PG в ПААГ не обнаружил окрашенных зон в высокомолекулярной области геля [20], подтверждая чистоту получаемого ЛПС. На электрофореграмме ЛПС Rhodobacter capsulatus PG обнаруживается в области молекулярных масс 13-21 кДа [5]. Максимум поглощения комплекса ЛПС Rhodobacter capsulatus PG с карбоцианиновым красителем находится при 463±5 нм [4].

Пирогенность, способность химического вещества вызывать лихорадочное состояние, обусловлено, главным образом, наработкой провоспалительных цитокинов TNF-α, IL-1 и IL-6. Исследование пирогенности ЛПС Rhodobacter capsulatus PG показало, что он не индуцирует продукцию TNF-α, IL-1β и IL-6 клетками цельной крови человека ex vivo [3, 6]. Кроме того, ЛПС Rhodobacter capsulatus PG проявляет антагонистические свойства в отношении продукции TNF-α, IL-6 и IL-8, индуцированной высокотоксичными ЛПС из патогенных бактерий, таких как Escherichia coli или Salmonella enterica [6].

Исследовалась способность ЛПС Rhodobacter capsulatus PG подавлять синтез провоспалительных цитокинов TNF-α и IL-8 в ответ на аллергены клеща бытовой пыли Dermatophagoides pteronyssinus. Одновременно в исследованиях проводился контроль за уровнем противовоспалительного цитокина IL-1Ra.

Исследования проводились на крови условно здоровых доноров. Гепаринизированную кровь разводили средой RPMI-1640 в соотношении 1:4 и разносили по 1 мл в 24-луночные планшеты для культивирования. Кровь предварительно инкубировали в течение 30 мин с 400 нг/мл ЛПС Rhodobacter capsulatus PG в СО₂-инкубаторе при температуре 37°С и 5%-ом содержании CO₂. Затем, во все образцы (кроме контрольных) добавляли экстракт из Dermatophagoides pteronyssinus, в конечной концентрации 500 PNU/мл, ЛПС Escherichia coli 055:В5 (40 нг/мл) или одновременно оба агониста в указанных концентрациях. Кровь инкубировали 6 ч в CO₂-инкубаторе. Через 6 ч клетки крови осаждали центрифугированием (10 мин, 1000 rpm), супернатанты отбирали и замораживали при -20°С. Содержание, наработанных клетками крови цитокинов TNF-α, IL-8 и IL-1Ra, определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) по методике, предложенной производителем. Минимальная концентрация TNF-α, IL-8 и IL-1Ra, определяемая иммуноферментной тест-системой, составляет 1, 5 и 50 пкг/мл, соответственно.

Прединкубация клеток крови с ЛПС Rhodobacter capsulatus PG практически полностью ингибирует наработку TNF-α клетками цельной крови человека в ответ на сам экстракт из Dermatophagoides pteronyssinus и подавляет в среднем на 40% при совместном применении экстракта с ЛПС Е. coli 055:В5 (Таблица 1). ЛПС Rhodobacter capsulatus PG также подавляет продукцию клетками IL-8 при их активации самим экстрактом Dermatophagoides pteronyssinus в среднем на 35% и, в меньшей степени, при совместном применении экстракта с ЛПС Е. coli 055:В5 (Таблица 2). ЛПС Rhodobacter capsulatus PG не влияет на продукцию IL-1Ra клетками цельной крови, активированными как экстрактом Dermatophagoides pteronyssinus, так и экстрактом совместно с ЛПС Е. coli 055:В5 (Таблица 3). Особо необходимо отметить, что ЛПС Rhodobacter capsulatus PG активировал клетки цельной крови к продукции цитокина IL-1Ra (Таблица 3). При этом противовоспалительный цитокин IL-1Ra модулирует воспалительный ответ, влияя на баланс между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами [17].

Полученный результат. Противоаллергическое средство на основе ЛПС Rhodobacter capsulatus PG подавляет воспалительный процесс, индуцированный аллергеном клеща бытовой пыли Dermatophagoides pteronyssinus или комбинированным действием с ЛПС Escherichia coli 055:В5.

Примечание. HDM - экстракт аллергена из клеща бытовой пыли Dermatophagoides pteronyssinus.

Примечание. HDM - экстракт аллергена из клеща бытовой пыли Dermatophagoides pteronyssinus.

Примечание. HDM - экстракт аллергена из клеща бытовой пыли Dermatophagoides pteronyssinus.

Список литературы:

1. Штамм Rhodobacter capsulatus PG - продуцент липополисахарида, антагониста эндотоксинов: пат. 2392309 С1 Рос. Федерация: МПК₅₁ C12N 1/20/ С12Р 19/00/ C12R 1/01/ И.Р. Прохоренко, С.В. Грачев, С.В Зубова.

2. Свидетельство о депонировании штамма Rhodobacter capsulatus PG. Регистрационный номер ВКМ В-2381 Д, 21.12.2005.

3. Волошина Е.В., Косякова Н.И., Прохоренко И.Р. Липополисахарид из Rhodobacter capsulatus обладает антагонистическим действием в отношении эффектов токсичных липополисахаридов и подавляет высвобождение TNF-α, IL-6 и IL-1β в цельной крови человека // Биологические мембраны. - 2013. - Т. 30. - №5. - С. 357-363.

4. Зубова С.В., Иванов А.Ю., Прохоренко И.Р. Связь хемотипа штаммов Rhodobacter capsulatus с электрофоретическими свойствами клеток // Микробиология. - 2007. - Т. 76. - №2. - С. 206-211.

5. Кабанов Д.С. Изменение поверхностных характеристик мембраны эритроцитов при встраивании липополисахаридов грамотрицательных бактерий. Дисс. канд. биол. наук. Пущино, 2006.

6. Кабанов Д.С., Серов Д.А., Зубова С.В., Грачев С.В., Прохоренко И.Р. Динамика подавления эффектов эндотоксинов липополисахаридом из Rhodobacter capsulatus PG // Биохимия. - 2016. - Т. 81. - №3. - С. 402-410.

7. Коровкина Е.С., Мокроносова М.А. Аллергия к клещам домашней пыли с позиции молекулярной аллергологии // Медицинская иммунология. - 2012. - Т. 14. - №12. - С. 279-288.

8. Кульшин В.А., Яковлев А.П., Аваева С.Н., Дмитриев Б.А. Улучшенный метод выделения липополисахаридов из грамотрицательных бактерий // Мол. Генетика. - 1987. - №5. С.44-46.

9. Akira S., Uematsu S., Takeuchi О. Pathogen recognition and innate immunity // Cell 2006. Vol. 124. №4. P. 783-801.

10. Asher M.I., Montefort S., Bjorksten В., Lai C.K., Strachan D.P., Weiland S.K., Williams H. ISAAC Phase Three Study Group.Worldwide time trends in the prevalence of symptoms of asthma, allergic rhinoconjunctivitis, and eczema in childhood: ISAAC phases one and three repeat multicountry crosssectional surveys // Lancet. 2006. Vol. 368. №9537. P. 733-743.

11. Gafvelin G., Johansson E., Lundin A., Smith A.M., Chapman M.D., Benjamin D.C, Derewenda U., van Hage-Hamsten M. Cross-reactivity studies of a new group 2 allergen from the dust mite Glycyphagus domesticus, Gly d 2, and group 2 allergens from Dermatophagoides pteronyssinus, Lepidoglyphus destructor, and Tyrophagus putrescentiae with recombinant allergens // J. Allergy Clin. Immunol. 2001. Vol. 107. №3. P. 511-518.

12. Jacquet A. Innate immune responses in house dust mite allergy // ISRN Allergy 2012. Vol. 2013. №2013. http://dx.doi.org./10.1155/2013/735031.

13. Jacquet A. New insights into the molecular basis of the house dust mite-induced allergic responses // The Open Allergy Journal 2009. Vol. 2. P. 38-44.

14. Jia H.P., Kline J.N., Peni J.N., Penisten A., Apicella M.A., Gioannini T.L., Weiss J., McCray P.B. (Jr). Endotoxin responsiveness of human airway epithelia is limited by low expression of MD-2 // Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 2004. V. 287. №2. L. 428-437.

15. Liu C.-F., Drocourt D., Puzo G., Wang J.-Y., Riviere M. Innate immune response of alveolar macrophage to house dust mite allergen is mediated through TLR2/-4 co-activation // PLoS One. 2013. Vol. 8. №10. e75983. doi: org/10.137 l/journal.pone.0075983.

16. Lombardero M., Heymann P.W., Platts-Mills T.A., Fox J.W., Chapman M.D. Conformational stability of В cell epitopes on group I and group II Dermatophagoides spp.Allergens. Effect of thermal and chemical denaturation on the binding of murine IgG and human IgE antibodies // J. Immunol. 1990. Vol. 144. №4. P. 1353-1360.

17. Marie C., Pitton C., Fitting C., Cavaillon J.-M. IL-10 and IL-4 synergize with TNF-α to induce IL-1Ra production by human neutrophils // Cytokine. 1996. Vol. 8. №2. P. 147-151.

18. Pease J.E., Sabroe I. The role of interleukin-8 and its receptors in inflammatory lung disease: implications for therapy // Am. J. Respir. Med. 2002. Vol. 1. P. 19-25.

19. Sukumaran S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the Micro-volume Bio-spec Nano spectrophotometer // J. Vis. Exp. 2011. Vol. 48. P. 2699-2704.

20. Tan L., Grewal P.S. Comparison of two silver staining techniques for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels // J. Clin. Microbiol. 2002. Vol. 40. P. 4372-4374.

21. Tillack K., Breiden P., Martin R., Sospedra M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses // J. Immunol. 2012. Vol. 188. №7. P. 3150-3159.

22. Trompette A., Divanovic S., Visintin A., Blanchard C., Hegde R.S., Madan R., Thorne P.S., Wills-Karp M., Gioannini T.L., Weiss J.P., Karp C.L. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein // Nature 2009. Vol. 457. №7229. P. 585-588.

23. Weghofer M., Dall'Antonia Y., Grote M., Stocklinger A., Kneidinger M., Balic N., Krauth M.T., Fernandez-Caldas E., Thomas W.R., van Hage M., Vieths S., Spitzauer S., Horak F., Svergun D.I., Konarev P.V., Valent P., Thalhamer J., Keller W., Valenta R., Vrtala S. Characterization of Der p 21, a new important allergen derived from the gut of house dust mites // Allergy 2008. Vol. 63. №6. P. 758-767.

24. Westphal O., Luderitz O., Bister F. Uber die Extraction von Bakterien mit Phenol/Wasser // Z. Naturforschg. 1952. 7b. 148-155.

25. Yu S.-J., Liao E.-C, Sheu M.-L., Chang M.D.-T., Tsai J.-J. Cell-penetrating peptide derived from human eosinophil cationic protein inhibits mite allergen Der p 2 induced inflammasome activation // PLoS One. 2015. Vol. 10. №3. e0121393. doi: 10.1371/journal.pone.0121393. eCollection 2015.

26. Yu S.-J., Liao E.-C, Tsai J.-J. The stimulation of inflammasome activation and modulation of proinflammatory cytokine production by house dust mite major allergen in patients with SLE // Journal of Nature and Science 2015. Vol. 1. №7. E126.

Изобретение относится к биотехнологии, фармакологии и медицине, в частности к способам предупреждения развития аллергического воспаления и астматического состояния. Предложено противоаллергическое средство, содержащее в качестве действующего вещества липополисахарид (ЛПС) Rhodobacter capsulatus PG, специфично подавляющий активацию иммунных клеток к синтезу и высвобождению провоспалительных цитокинов TNF-α и IL-8, индуцированных аллергеном бытовой пыли Dermatophagoides pteronyssinus. Изобретение позволяет расширить арсенал нетоксичных противоаллергических средств. 3 табл.

Применение липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG в качестве противоаллергического средства, специфично подавляющего активацию иммунных клеток к синтезу и высвобождению провоспалительных цитокинов TNF-α и IL-8, индуцированных аллергеном клеща бытовой пыли Dermatophagoides pteronyssinus.