Способ повышения эффективности культивирования в условиях in vitro каллусной культуры Базилика Обыкновенного (Ocimum basilicum) Российский патент 2023 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в пищевой и фармацевтической промышленности для культивирования в условиях in vitro каллусной культуры Базилика Обыкновенного (Ocimum basilicum). Базилик (Ocimum basilicum L. Var. thyrsiflorum) - лекарственное растение. Оно является источником биологически активных соединений: эвгенола, розмариновой и цикориевой кислоты, цианидина и пеонидина.

Проблема Промышленной биотехнологии является приоритетной в «Программе фундаментальных исследований в Российской Федерации до 2030 года». В последнее десятилетие наблюдается заметный рост в области биоинженерии. В связи с этим возрастает биотехнологическое применение каллусных культур.

Каллусная культура представляет собой массу дифференцированных клеток на поверхности поврежденной растительной ткани. Многочисленные исследования показали, что каллусные клетки генерируют вторичные метаболиты. Вторичные метаболиты обладают лечебной ценностью для человека. В настоящее время промышленная биотехнология культивирования каллусных культур и получения вторичных метаболитов в Российской Федерации ограничена.

Из существующего уровня техники известен способ получения биологически активных веществ - адаптогенов в клеточной культуре родиолы розовой (Rhodiolarosea L.) (патент РФ №2726067 С1, опубл. 08.07.2020). Способ заключается в культивировании клеток растения Rhodiolarosea L. на модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей нитрат аммония 1,65 г, хлорид кальция 0,44 г, сульфат магния 0.37 г гидрофосфат калия 0,17 г, нитрат калия 1,90 г, борную кислоту 6,2 мг, хлорид кобальта 0,025 мг, сульфат меди (II) 0,025 мг, сульфат железа (II) 27,8 мг, сульфат марганца (II) 22,3 мг, йодид калия 0,83 мг, молибдат натрия 0,25 мг, сульфат цинка 8,6 мг, натрий железную соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 5 мл/л для стокового раствора, содержащего 5,57 г FeSO₄⋅H₂O и 7,45 г Na2-ЭДТА на литр воды, сахарозу 30,0 г, инозит 100,0 мг, тиамин 1,0 мг, пиридоксин 1,0 мг, Ca-пантетонат 10,0 мг, кинетин 0,05 г, α-нафтилуксусную кислоту 0,1 г, 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту 0,5 г, воду до 1 л, при культивировании дополнительно вводят в питательную среду хитозан в количестве 1,0 г/л, а культивированию предшествует кратковременное в течение 15 минут облучение выращиваемых растительных клеток ультрафиолетовым светом с длиной волны 315 нм.

Недостатком данного способа является отсутствие данных об индексе роста биомассы каллуса, вследствие чего сложно утверждать о достаточной эффективности способа и целесообразности применения ультрафиолетового света.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ повышения эффективности культивирования in vitro культуры лимонника китайского (патент РФ №2757463, опубл. 18.10.2021). Суть метода заключалась в культивировании каллусной культуры лимонника китайского (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.). На первом этапе произведена стерилизация посадочного материала, приготовление питательной среды на минеральной основе Мурасиге-Скуга (MS) или Гамборга (В-5) с добавлением или без гормонов - 6-бензиламинопурина (6-БАП) и нафтилуксусной кислоты (НУК), культивирование в стерильных условиях при фотопериоде (свет/темнота) 16/8 часов, температуре 25±2°С и влажности 60-70%. Техническим результатом, полученным при реализации заявленного способа, являлось получение биомассы каллусной культуры лимонника китайского с большим выходом и высоким содержанием биологически активных веществ фенольной природы.

Недостатками данного способа является использование гидролизата казеина в питательной среде, что значительно повышает себестоимость культивирования каллусной культуры, а также использование фотопериода (свет / темнота) вместо непрерывного светового потока, что влияет на эффективность способа.

Предполагаемое изобретение направлено на разработку нового эффективного способа культивирования в условиях in vitro каллусной культуры Базилика Обыкновенного (Ocimum basilicum) с целью получения метаболических соединений с антимикробной, антидиабетической, антиоксидантной, противоопухолевой и противовоспалительной активностью.

Это достигается тем, что в способе повышения эффективности культивирования в условиях in vitro каллусной культуры Базилика Обыкновенного (Ocimum basilicum), включающем стерилизацию посадочного материала, приготовление питательной среды, культивирование в стерильных условиях при температуре 25+2°С и влажности 60-70% воздуха, субкультирование каллусной культуры после 28 дней, причем он включает в себя стерилизацию листовых пластин Базилика Обыкновенного (Ocimum basilicum) 10% раствором пероксида водорода в течение 5 минут, троекратным промыванием дистилированной водой в течение 10 минут, сегментирование листовых пластинок Базилика Обыкновенного размером 5×5 мм, культивирование на питательной среде следующего состава (мас. %): нитрат аммония - 4,75, нитрат калия - 5,47, кальций хлористый 2 - водный - 1,27, сульфат магния 7 - водный - 1,06, дигидроортофосфат калия - 0,49, ЭДТА динатриевая соль - 0,1, сульфат железа 7 - водный - 0,08, борная кислота - 0,02, сульфат магния 4 - водный - 0,06, сульфат цинка 7 - водный - 0,02, йодид калия - 0,002, молибдат натрия 2 - водный - 0,001, сульфат меди 5 - водный - 0,001, кобальт хлористый 2 - водный - 0,001, глицин - 0,01, мезоинозит - 0,3, никотиновая кислота - 0,001, пиридоксин - 0,001, сахароза - 86,35, бензиламинопурин - 0,01, нафтилуксусная кислота - 0,003 в стерильных условиях климатической камеры при непрерывном синем свете интенсивностью 1500 люкс светодиодов Quantum Line Samsung 281b в режиме (свет / темнота) 24/24 часов, субкультирование каллусной культуры Базилика Обыкновенного после 28 дней и инокуляцию каллусной культуры Базилика Обыкновенного салициловой кислотой 10 мкМ концентрацией (0,64 мг/л) на той же гормональной питательной среде.

В настоящее время из патентной и научно-технической литературы не известен эффективный способ культивирования в условиях in vitro каллусной культуры Базилика Обыкновенного (Ocimum basilicum) с использованием данных условий культивирования в заявляемой совокупности признаков.

Способ иллюстрируется следующим примером.

На первом этапе производят стерилизацию первичного экспланта. Для этого листовые пластины Базилика Обыкновенного (Ocimum basilicum) помещают в марлевые мешочки, опускают в стерильный стаканчик в ламинар-боксе и накрывают стерильной фольгой. В стакан с растительным материалом Базилика Обыкновенного наливают стерилизующее вещество: 10% раствор пероксида водорода и выдерживают в течение 5 минут. По окончании времени стерилизации растительный материал Базилика Обыкновенного заливают стерильной дистилированной водой и выдерживают в течение 10 минут. Процедура промывки троекратно повторяется. Затем марлевый мешочек вынимают из стаканчика, листовые пластинки Базилика Обыкновенного разрезают скальпелем на сегменты размером 5×5 мм и переносят в чашку Петри (диаметр 60 мм) для дальнейшего культивирования.

На втором этапе готовят жидкую питательную среду при следующем соотношении компонентов, мас. %, представленной в таблице 1.

Все компоненты, кроме витаминов и гормонов, разводят в 1,0 л дистиллированной воды, доводят до кипения, автоклавируют при температуре 120°С в течение 20 мин. После остывания среды в стерильных условиях через мембранный фильтр добавляют витамины и гормоны. Готовую питательную среду разливают по чашкам Петри с подготовленным на первом этапе эксплантом.

На третьем этапе проводят культивирование каллусной культуры Базилика Обыкновенного в стерильных условиях климатической камеры при непрерывной синей интенсивности 1500 люкс светодиодов Quantum Line Samsung 281b в режиме (свет / темнота) 24-24 часов при температуре 25±2°С и влажности 60-70% воздуха. Каллус при пересеве делят на 3-7 частей в зависимости от прироста. Для оптимального производства биомассы каллуса после 28 дней производится субкультивирование.

На четвертом этапе после субкультивирования производят инокуляцию каллусной культуры Базилика Обыкновенного салициловой кислотой 10 мкМ концентрацией 0,64 мг/л на той же гормональной питательной среде.

Результаты анализа индекса роста каллусной биомассы Базилика Обыкновенного (Ocimum basilicum) представлена в таблице 2.

Использование предполагаемого способа культивирования в условиях in vitro каллусной культуры Базилика Обыкновенного (Ocimum basilicum) позволит реализовать коммерческий потенциал применения каллусных культур по важным направлениям. Во-первых, каллусные культуры лекарственных растений синтезируют биоактивные фитохимические вещества. Биоактивные фитохимические вещества используются в средствах для лечения широкого спектра заболеваний: сердечно - сосудистых, инфекционных и даже онкологических заболеваний. Во-вторых, большое значение приобретает синтез терапевтических антител и других рекомбинантных пептидов и белков. Преимущество производства из каллусных клеток заключается в экономической эффективности и безопасности по сравнению с производством из животных клеток микроорганизмов и млекопитающих. Также каллусные культуры тканей можно использовать в программах селекции растений. Путем селекции в условиях in vitro возможно получение мутаций растений с полезными агрохимическими признаками: устойчивость к засухе, солевому стрессу, микробным атакам и повышенной урожайностью.

Синергетический эффект действия салициловой кислоты и синего света доказан количественным содержанием вторичных метаболитов методом ВЭЖХ, антиоксидантной и гемолитической активностью каллусной культуры, а также ингибированием альфа-амилазы каллуса Базилика Обыкновенного и представлен в таблице 3.

Использование предлагаемого способа культивирования в условиях in vitro каллусной культуры Базилика Обыкновенного (Ocimum basilicum) обеспечивает по сравнению с известными способами следующие преимущества:

- калуссная культура Базилика Обыкновенного (Ocimum basilicum) содержит в своем составе розмариновую кислоту (РК) (кофеоил-3-4-дигидроксифенил молочная кислота). Соединение обладает доказанной противомикробной активностью в отношении условно-патогенной бактерии рода P. Aeruginosa. Бактерия является основным патогеном, инфицирующим людей с иммунодефицитом и легкие пациентов с муковисцидозом. Также розмариновая кислота обладает ингибирующей активностью в отношении грибкового патогенна A. Niger. Патоген является одним из наиболее плодовитых, широко распространенных и инвазивных известных грибковых патогенов растении и может вызывать тяжелые инфекции у людей;

- техническое удешевление биотехнологии, ввиду снижения себестоимости питательной среды за счет исключения гидролизата казеина;

- более высокое и эффективное накопление биомассы за счет воздействия непрерывного синего света интенсивностью 1500 люкс светодиодов Quantum Line Samsung 281b в режиме (свет / темнота) 24/24 часов, температуре 25±2°С и влажности 60-70% воздуха и инокуляцией салициловой кислотой 10 мкМ концентрацией (0,64 мг/л), благодаря чему выход биомассы увеличивается на 5,4% по сравнению с прототипом (см. табл. 2);

- большее содержание биологически активных веществ по сравнению с прототипом, обладающих биосовместимостью с эритроцитами человека, что указывает на их нетоксичность и умеренность потенциала в отношении ингибирования альфа-амилазы в каллусной культуре Базилика Обыкновенного (Ocimum basilicum), экспериментальные данные об антиоксдантной и гемолитической активности, а также активности каллусных клеток по отношению ингибирования альфа-амилазы в прототипе отсутствуют (см. табл. 3);

- крупномасштабное производство вторичных метаболитов в биоферментаторах на основе каллусной культуры Базилика Обыкновенного (Ocimum basilicum) высокого качества и независимости от различных факторов окружающей среды, сезонных изменений и микробных заболеваний, вредителей и географических ограничений для фармацевтической промышленности, в частности, производства противомикробных препаратов.

Источники информации

1) Патент RU 2726067 С1, C12N 5/04. Способ повышения эффективности культивирования каллусной культуры лимонника китайского (Schisandra chinensis (Turcz.) Ball.), в условиях in vitro / Бабич О.А. Опубл. 18.10.2021, Бюл. №29. (прототип).

2) Патент RU 2726067 С1, C12N 5/04. Способ получения биологически активных веществ - адаптогенов в клеточной культуре родиолы розовой (Rhodiolarosea L.) / Просеков А.Ю. Опубл. 08.07.2020, Бюл. №19. Реферат.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ повышения эффективности культивирования в условиях in vitro каллусной культуры Базилика Обыкновенного (Ocimum basilicum), включающий стерилизацию посадочного материала, приготовление питательной среды, культивирование в стерильных условиях при температуре 25±2°С и влажности 60-70% воздуха, субкультирование каллусной культуры после 28 дней, отличающийся тем, что включает в себя стерилизацию листовых пластин Базилика Обыкновенного (Ocimum basilicum) 10% раствором пероксида водорода в течение 5 минут, троекратным промыванием дистилированной водой в течение 10 минут, сегментирование листовых пластинок Базилика Обыкновенного размером 5×5 мм, культивирование на питательной среде следующего состава (мас.%): нитрат аммония - 4,75, нитрат калия - 5,47, кальций хлористый 2-водный - 1,27, сульфат магния 7-водный - 1,06, дигидроортофосфат калия - 0,49, ЭДТА динатриевая соль - 0,1, сульфат железа 7-водный - 0,08, борная кислота - 0,02, сульфат магния 4-водный - 0,06, сульфат цинка 7-водный - 0,02, йодид калия - 0,002, молибдат натрия 2-водный - 0,001, сульфат меди 5-водный - 0,001, кобальт хлористый 2-водный - 0,001, глицин - 0,01, мезоинозит – 0,3, никотиновая кислота - 0,001, пиридоксин - 0,002, сахароза - 86,35, бензиламинопурин - 0,01, нафтилуксусная кислота - 0,003 в стерильных условиях климатической камеры при непрерывном синем свете интенсивностью 1500 люкс светодиодов Quantum Line Samsung 281b в режиме (свет, темнота) 24/24 часов, субкультирование каллусной культуры Базилика Обыкновенного после 28 дней и, наконец, инокуляцию каллусной культуры Базилика Обыкновенного салициловой кислотой 10 мкМ концентрацией (0,64 мг/л) на той же гормональной питательной среде. Изобретение позволяет получить биомассу каллусной культуры лимонника китайского с большим выходом и высоким содержанием биологически активных веществ фенольной природы. 3 табл.

Способ повышения эффективности культивирования в условиях in vitro каллусной культуры Базилика Обыкновенного (Ocimum basilicum), включающий стерилизацию посадочного материала, приготовление питательной среды, культивирование в стерильных условиях при температуре 25±2°С и влажности 60-70% воздуха, субкультирование каллусной культуры после 28 дней, отличающийся тем, что включает в себя стерилизацию листовых пластин Базилика Обыкновенного (Ocimum basilicum) 10% раствором пероксида водорода в течение 5 минут, троекратным промыванием дистилированной водой в течение 10 минут, сегментирование листовых пластинок Базилика Обыкновенного размером 5×5 мм, культивирование на питательной среде следующего состава (мас.%): нитрат аммония - 4,75, нитрат калия - 5,47, кальций хлористый 2-водный - 1,27, сульфат магния 7-водный - 1,06, дигидроортофосфат калия - 0,49, ЭДТА динатриевая соль - 0,1, сульфат железа 7-водный - 0,08, борная кислота - 0,02, сульфат магния 4-водный - 0,06, сульфат цинка 7-водный - 0,02, йодид калия - 0,002, молибдат натрия 2-водный - 0,001, сульфат меди 5-водный - 0,001, кобальт хлористый 2-водный - 0,001, глицин - 0,01, мезоинозит – 0,3, никотиновая кислота - 0,001, пиридоксин - 0,002, сахароза - 86,35, бензиламинопурин - 0,01, нафтилуксусная кислота - 0,003 в стерильных условиях климатической камеры при непрерывном синем свете интенсивностью 1500 люкс светодиодов Quantum Line Samsung 281b в режиме (свет, темнота) 24/24 часов, субкультирование каллусной культуры Базилика Обыкновенного после 28 дней и, наконец, инокуляцию каллусной культуры Базилика Обыкновенного салициловой кислотой 10 мкМ концентрацией (0,64 мг/л) на той же гормональной питательной среде.