Противоопухолевое средство на основе биодеградируемых наночастиц, несущих рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа человека Российский патент 2019 года по МПК A61K31/7105 A61K38/00 A61K47/26 A61P35/00 B82B1/00 

Изобретение относится к противоопухолевым средствам и может быть использовано в области медицины и фармацевтики.

Поиск средств и способов лечения злокачественных новообразований продолжает оставаться актуальным направлением современной фармацевтики. Особым направлением в области совершенствования противоопухолевой терапии являются исследования, касающиеся применения иммунотерапевтических средств, в частности, цитокинотерапия.

Фактор некроза опухолей альфа (ФНО-альфа, TNF-α) в течение многих лет привлекает внимание исследователей, фармакологов и клиницистов как потенциальное противоопухолевое средство, что связано с его комплексным воздействием на опухоль: избирательной способностью тормозить рост и вызывать лизис злокачественных клеток, геморрагический некроз опухолей, активировать иммунный противоопухолевый ответ, оказывать повреждающее действие на сосуды [1].

Однако основной проблемой и камнем преткновения многочисленных попыток создания лекарственных препаратов ФНО-альфа для системного применения является его нестабильность в кровеносном русле, недостаточная селективность накопления в опухолевых клетках и как следствие, высокий уровень эффективных доз и широкий спектр побочных эффектов. Результаты доклинических и клинических исследований ФНО-альфа при системном введении показали наличие серьезных побочных эффектов, которые служат препятствием для широкого применения препаратов ФНО в онкологии, таких как: гипотензия, почечная недостаточность, повышение свертываемости крови, нарушения сосудистой системы внутренних органов, индукция коллапса сосудов, лихорадка, тахикардия, головная боль и т.д. [2, 3].

Среди разнообразных методических приемов, которые используются в настоящее время для решения данной проблемы, можно выделить разработку средств адресной доставки ФНО-альфа к клеткам-мишеням [4-6]. В литературных источниках есть сведения о создании транспортных форм ФНО-альфа на основе неорганических наночастиц, синтетических полимеров, липосом [7-12]. Использование этих систем позволяет повысить противоопухолевую активность, накопление белков в ткани опухоли, обеспечить их стабилизацию.

Так, Vander Veen А.Н. с соавт. [13] показали, что инкапсулирование ФНО-альфа в стерически стабилизированные липосомы приводило к увеличению накопления белка в опухоли и уменьшению общей токсичности. В ходе исследования ПЭГилированных липосом, содержащих ФНО-альфа совместно с липосомальным доксорубицином, на крысах с подкожной саркомой BN175, установлено, что введение липосомального ФНО-ПЭГ в дозе 15 мкг/кг существенно увеличивало противоопухолевую активность доксорубицина. Ранее было показано, что совместное использование высоких доз липосомального ФНО-альфа в комбинации с мелфаланом или доксорубицином оказывало синергичный ингибирующий эффект на рост экспериментальной опухоли [14-16].

Группой исследователей был создан удачный вариант наночастиц, содержащих ФНО-альфа [17, 18]. Проведенное ими инкапсулирование рекомбинантного ФНО-альфа человека в полицианоакрилатную наночастицу приводило к удлинению времени полужизни ФНО-альфа в 7 раз. Содержащие ФНО-альфа наночастицы накапливались преимущественно в опухолевых тканях и ингибировали рост опухоли на 78%, в то время как свободный ФНО-альфа в той же дозе тормозил опухолевый процесс лишь на 15%. Существенным достижением являлось то, что полученные частицы при хранении при температуре +2°÷+8°С были стабильны в течение 4 недель [19, 20].

Китайская компания BEIJING SHENGYIYAO SCIENCE & T запатентовала противоопухолевое средство, содержащее биодеградируемый носитель [21]. Липосомальные микросферы, содержащие ФНО-альфа или интерферон или другие цитокины, выполнены из полисахарида (натриевая соль гиалуроновой кислоты или желатина), который извлекается из водорослей, обеспечивает биоразлагаемость и биосовместимость с инкапсулированными веществами. Липосомы рекомендованы для лечения гепатокарциномы и рака шейки матки, а также для терапии на поздней стадии рецидивирующего рака печени, почек, рака мочевого пузыря и прямой кишки.

Было показано, что биосовместимые пористые кремниевые наночастицы могут служить безвредным для организма агентом для тераностики многих онкологических заболеваний. Они не только легко проникают в опухолевую клетку, но и при насыщении противоопухолевым средством способны дозированно высвобождать его в опухоли в процессе своего распада [22].

Messerschmidt S.K. с соавт.[8] были созданы кремниевые частицы, содержащие ФНО-альфа, с функциональными аминогруппами, названные наноцитами (TNF nanocytes®). Такие частицы способны активировать рецепторы TNFR1 и TNFR2, результатом чего является усиление процессов апоптоза. В ходе дальнейшего усовершенствования были получены модифицированные липид-покрытые частицы, состоящие из одной цепи белка ФНО (scTNF) с функциональными аминогруппами, окруженными липидным слоем с полиэтиленгликольными концами для стерической стабилизации и одноцепочечным фрагментом Fv (scFv) для целевой доставки [8]. Липидное покрытие уменьшало неспецифическое связывание частиц и медиируемую ФНО-альфа цитотоксичность в отношении FAP (fibroblast activation protein) - негативных клеток и увеличивало цитотоксичность в отношении FAP-позитивных клеток.

В экспериментах на животных была продемонстрирована возможность использования наночастиц коллоидного золота, покрытых полиэтиленгликолем, в качестве систем доставки ФНО-альфа для терапии опухолей. Наночастицы золота увеличивали противоопухолевый эффект и минимизировали системную токсичность ФНО. Было показано, что введение наночастиц данного типа мышам-опухоленосителям с трансплантированной карциномой толстой кишки МС-38 и последующим локальным нагреванием до температуры +42,5°С, приводило к существенному ослаблению кровоснабжения опухоли. Кроме того, было установлено, что коллоидное золото, связанное с ФНО, аккумулировалось преимущественно в опухоли [7, 23].

Израильская фирма БАР-ИЛАН ЮНИВЕРСИТИ (IL) и американская компания ГЕНРИ ФОРД ХОСПИТАЛ (US) разработали дизайн наночастицы для доставки лекарственного средства [24], состоящей из полимера, хелатирующего металл, покрытия из оксида магнитного металла и, по меньшей мере, одного активного агента, ковалентно связанного с полимером, где, по меньшей мере, один активный агент представляет собой родственный TNF-лиганд, индуцирующий апоптоз (TRAIL). Указанный полимер включает желатин, полиметиленимин, хитозан или полилизин, а указанный оксид магнитного металла представляет собой оксид железа или феррит, происходящий из оксида железа, где указанный оксид железа представляет собой магнетит, оксимагнетит или их смеси, и указанный феррит представляет собой оксид формулы (Fe,M)₃O₄, где М представляет собой ион переходного металла. TRAIL связан напрямую или опосредованно с оксидом магнитного металла. Наночастица содержит дополнительное средство, представляющее собой пептид или пептидомиметик cRGD. В экспериментах были продемонстрированы цитотоксические эффекты конъюгированных с TRAIL магнитных композитных наночастиц желатин/оксид железа (NP-TRAIL) на различные опухолевые клетки, отличные от клеток глиомы. Линии опухолевых клеток представляли собой клетки карциномы мочевого пузыря TSU-PR1 и клетки рака молочной железы MDA-MB, в качестве контроля использовали нормальные клетки молочной железы MCF10A. Кроме того, было изучено действие на эти клетки NP-TRAIL в комбинации с ингибитором протеасом (PS), мультикаталитического протеазного комплекса, ответственного за большую часть внутриклеточного разрушения белка.

Сотрудниками Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН создана самособирающаяся конструкция для диагностики и онкотерапии, содержащая, по меньшей мере, два модуля, где каждый из модулей независимо представляет собой ядро, несущее на поверхности молекулы белки барназу либо барстар [25]. Изобретение решает задачу получения структур, собранных из частиц разных размеров, опосредующих различные функции (магнитные частицы, флуоресцентные, обладающие поверхностным-плазмонным резонансом и др.), а также различной природы (неорганические кристаллы, ДНК, углеводы, бактерии, вирусы и др.), в которых обеспечено удерживание составных компонентов с повышенной силой и специфичностью. Такие структуры могут быть востребованы в качестве как диагностических, так и терапевтических агентов, а их многофункциональность позволит обеспечить возможность комбинированного воздействия на патологические ткани с помощью агентов различного механизма действия.

Однако при всех несомненных достоинствах и разнообразии данных подходов у каждого из них есть свои недостатки. К ним можно отнести: отсутствие в организме систем деградации компонентов транспортных систем и возможность их кумуляции (средства доставки на основе неорганических частиц либо полученные с использованием синтетических полимеров); быструю элиминацию из организма клетками-фагоцитами (липосомы), биологическую инертность, нестабильность.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является противоопухолевое средство на основе биодеградируемых наночастиц, несущих рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа человека (патент РФ №2386447, МПК А61К 38/19, опубл. 20.04.2010 г.) [26], содержащее сферические наночастицы, имеющие размер порядка 50-70 нм, имеющее ядро, состоящее из полинуклеотидного комплекса, представляющего собой двуспиральную РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae - индуктор интерфероногенеза, и покрытое слоем конъюгата спермидина с полиглюкином, удерживаемого за счет ионного взаимодействия между отрицательно заряженным полинуклеотидным комплексом и положительно заряженным спермидином и рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа человека, ковалентно связанный с активированным периодатом натрия полиглюкином, причем, на одну молекулу двуспиральной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae приходится 60-80 молекул рекомбинантного человеческого ФНО-альфа с цитолитической активностью не ниже 10⁶ МЕ/мг белка, 60-80 молекул полиглюкина и 1000-1300 молекул спермидина. Данная конструкция разработана коллективом авторов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Введение в ядро конструкции дсРНК, с одной стороны, позволило решить задачу самосборки частицы, а с другой, потенцировать активность белкового компонента за счет противоопухолевой и иммуномодулирующей активности полинуклеотидного комплекса. Достоинством конструкции является биодеградируемость и наличие биологической активности у всех ее компонентов (дсРНК, полиглюкин, спермидин). В экспериментах на интактных мышах и мышах-опухоленосителях показано, что ФНО-альфа в составе наночастицы является менее токсичным соединением, чем ФНО-альфа [26].

При изучении противоопухолевой активности ФНО-альфа, включенного в наночастицы, установлено, что торможение роста аденокарциномы Эрлиха при введении ФНО-альфа в составе наночастиц наблюдается в дозах в 10-100 раз более низких, чем после инъекций препарата сравнения [27]. Анализ динамики изменения содержания ФНО-альфа в крови мышей показал, что введение ФНО-альфа в составе наночастиц приводило к удлинению периода его циркуляции в кровеносном русле и более интенсивному накоплению в ткани опухоли, что, по-видимому, и обуславливает его повышенную противоопухолевую активность. Сравнительный анализ полученных данных позволил сделать заключение о том, что препарат ФНО-альфа в составе наночастицы отличается улучшенными терапевтическими свойствами по сравнению с ФНО-альфа.

Однако в ходе дальнейших исследований было обнаружено, что полученные в результате сборки конструкции наночастицы, содержащие ФНО-альфа, отличаются высокой агрегационной способностью (неопубликованные данные). Следствием этого является неоднородность белкового раствора и сложность его дозирования при получении лекарственной формы. Помимо этого, гетерогенность препаратов наночастиц может приводить к усилению их токсических свойств, в частности, развитию иммунотоксических реакций [28, 29].

Аналогичные данные о способности частиц, используемых в качестве средств доставки различных биологически активных веществ, к агрегации были получены и другими исследователями. Так, в обзоре Kim Y. с соавторами приводится описание значительного экспериментального материала, подтверждающего тот факт, что белки, сорбированные на поверхности наночастиц, преимущественно, неорганического происхождения играют ключевую роль в образовании кластеров [30]. Способность индуцировать кластерообразование в результате взаимодействия с другими белками и формирование центров агрегации продемонстрирована для амилоидогенных пептидов и лизоцима, сорбированных на наночастицах золота [31, 32].

В статье Ault А.Р. с соавторами содержатся сведения о том, что внесение в раствор, содержащий наночастицы серебра, белка пепсина приводит к образованию белковой «короны» за счет сорбции белка на поверхности частиц, способствует изменению их заряда и морфологии, вызывает агрегацию наночастиц [33-35]. Продемонстрирована возможность конформационных изменений вторичной структуры белков при их связывании с наночастицами [36, 37], нередко ассоциированных со снижением биологической активности [33]. При этом пептиды с частично разрушенной вторичной структурой (partially unfolded) на поверхности частиц превращались в центры дальнейшей агрегации [38].

Встречаются сведения и относительно возможности агрегации наноразмерных средств доставки органической природы. Так, авторами патента [39] для снижения агрегационных процессов при получении липидных микросфер на основе производных глицерина и жирных кислот предложено введение в состав композиций антикоагулянтов.

Агрегационные процессы могут быть следствием и замораживания/высушивания препаратов наночастиц в ходе лиофилизации [40], при этом механизмы этих процессов изучены пока слабо [41].

Поскольку процессы агрегации существенным образом отражаются на качестве лекарственных препаратов, действующим началом которых являются терапевтические белки в наноразмерных формах доставки, вопрос поиска способов ослабления агрегационной способности белок-содержащих конструкций весьма актуален.

Следует отметить, что сведений о способах снижения агрегационных свойств наночастиц, несущих белки и, в частности, ФНО-альфа, в доступных источниках не обнаружено. Немногочисленные данные касаются предотвращения разрушения структуры липосом и fusing-эффекта в результате кристаллизации воды и дегидратации с помощью дисахаридов [42]. В патенте РФ 2563997 С2 предложен способ стабилизации липосом, содержащих противоопухолевый агент оксицисплатин, где в качестве антиагрегантов использовались сахара: моно- (глюкоза, фруктоза), ди-(лактоза, сахароза, трегалоза, мальтоза) и полисахариды (маннитол, декстран) [39].

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание такой биодеградируемой противоопухолевой наноконструкции, содержащей ФНО-альфа человека, которая сохраняет свою структуру без агломерации наночастиц и сохраняет специфическую цитолитическую активность фактора некроза опухоли альфа в ее составе при введении в организм.

Указанный технический результат достигается тем, что в противоопухолевом средстве на основе биодеградируемых наночастиц, несущих рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа человека, содержащем сферические наночастицы размером порядка 50-70 нм, имеющие ядро, состоящее из полинуклеотидного комплекса, представляющего собой двуспиральную РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae - индуктор интерфероногенеза, и покрытое слоем конъюгата спермидина с полиглюкином, удерживаемого за счет ионного взаимодействия между отрицательно заряженным полинуклеотидным комплексом и положительно заряженным спермидином и рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа человека, ковалентно связанный с активированным периодатом натрия полиглюкином, причем, на одну молекулу двуспиральной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae приходится 60-80 молекул рекомбинантного человеческого ФНО-альфа с цитолитической активностью не ниже 10⁶ МЕ/мг белка, 60-80 молекул полиглюкина и 1000-1300 молекул спермидина, согласно изобретения, средство содержит полисахарид маннитол, молекулы которого расположены между биодеградируемыми наночастицами в лиофилизате, содержащими ФНО-альфа с активностью не менее 10⁶ ME, при следующем количественном содержании компонентов в 1 дозе сухого противоопухолевого средства:

Маннитол 30,0-50,0 мг Лиофилизат, содержащий наночастицы, несущие ФНО-альфа с цитолитической активностью не менее 10⁶ МЕ 37,5-61,5 мг

Маннитол (Д-маннит) - шестиатомный спирт C₆H₈(ОН)₆. Применяется в медицине в инъекционной форме в качестве диуретика. Используется при производстве лекарственных препаратов в качестве наполнителя, стабилизатора и криоконсерванта, в том числе, в препаратах интерферона альфа [43-45]. Показано, что маннитол при определенных условиях лиофилизации образовывает только аморфную форму [46]. Использование маннитола в более высоких концентрациях приводило к его переходу в кристаллическую форму, что деструктивно воздействует на структуру белков и как следствие, ограничивает возможность его применения [47].

В результате экспериментальных исследований авторами установлено, что маннитол в концентрации 30-50 мг на дозу при лиофилизации образовывает только аморфную форму, что благоприятно влияет на указанный процесс сушки. Использование маннитола в более высоких концентрациях приводит к его переходу в кристаллическую форму, что деструктивно воздействует на структуру белков (ФНО-альфа). В концентрации менее 30 мг не обеспечивается существенная дезагрегация наночастиц.

Электронно-микроскопическое исследование показало, что введение в состав композиции маннитола приводило к стабилизации структуры наночастиц и снижению их агрегационной способности.

Добавление маннитола не оказывало влияния на цитолитическую активность рекомбинантного ФНО-альфа человека, определенную в культуре L929.

Изучение противоопухолевой активности препарата, содержащего в качестве вспомогательного вещества маннитол, на двух опухолевых моделях, мышиной опухоли меланомы B16-F10 и ксенографтах карциномы ротовой полости человека КВ-3.1, показало, что препарат обладал выраженной способностью ингибировать рост экспериментальных опухолей. Диапазон эффективных доз составлял 10⁴-10⁵ ME на мышь. Наиболее выраженный эффект препарата был отмечен на модели карциномы ротовой полости человека КВ-3.1 (ТРО 67%) при внутривенном введении в дозе 1×10⁵ ME на мышь пятикратно с интервалом в одни сутки.

В культуре клеток меланомы мыши B16-F10 продемонстрированы цитолитическая и апоптогенная активность композиции, содержащей ФНО-альфа в средстве доставки и маннитол. На мышах с трансплантированной меланомой B16-F10 установлено, что композиционный препарат обладал способностью вызывать деструкцию сосудистой системы опухоли и усиливал активность клеток иммунной системы, участвующих в реализации противоопухолевого иммунного ответа. Эти данные в совокупности свидетельствуют о том, что противоопухолевые свойства композиционного препарата реализуются через механизмы, характерные для ФНО-альфа.

Обоснование критерия «изобретательский уровень».

Одним из способов решения проблемы агрегации наночастиц является введение в состав препаратов вспомогательных веществ, обеспечивающих сохранение структурной стабильности как наночастиц, так и белков в их составе, и препятствующих образованию комплексов.

Исходя из данных, приведенных выше, проблема ослабления агрегационных процессов имеет два аспекта: сохранение конформационных свойств и предотвращение агломерации белков в составе средств доставки при получении белковых растворов и предотвращение их агрегации в процессе лиофилизации.

Надо сказать, что нестабильность активных компонентов является существенной проблемой и при производстве белковых препаратов, не содержащих наноносители. Исследованию механизмов лабильности белковых растворов, поиску способов их эффективной стабилизации и веществ, способных ее обеспечить, посвящен ряд обзорных работ [48, 49]. Показано, что лимитирующим звеном в процессе необратимой инактивации и агрегации белков является изменение их нативной структуры [50]. В настоящее время известно, что для обеспечения конформационной стабильности белков могут быть использованы так называемые «сорастворители», к которым относят многоатомные спирты или полиолы (соединения, несущие множественные гидроксильные группы, сахара, осмолиты и т.д.). Так, сравнительно недавно установлено, что некоторые осмолиты органической природы способствуют правильному фолдингу неверно свернутых белковых молекул и, как следствие, препятствуют агрегации белков [51]. Среди сахаров с множественными гидроксильными группами, которые используют для предотвращения белковой агрегации, чаще всего применяют дисахариды (сахароза, трегалоза) и многоатомные сахара маннитол, сорбитол и т.д. Механизмы стабилизации белковых смесей с помощью полиолов (повышение поверхностного натяжения, упорядочение структуры воды, стерическое разобщение и др.) до сих пор неясны и являются предметом активного обсуждения [48].

Другим важным фактором, который существенным образом влияет на интактность структуры белков, приводя к их конформационным изменениям, нарушению фолдинга, агрегации, и как следствие, потере биологической активности, является процесс лиофилизации. Критическими факторами, вызывающими эти нарушения, являются дегидратация (феномен «blow-out») и кристаллизация воды [40, 52]. Веществами, которые, наряду с функцией наполнителя, используются для предотвращения этих негативных последствий, являются ди- и полисахариды (сахароза, трегалоза, маннитол и др.) [52]. Введение в состав композиций производных декстрана (полиглюкин, реополиглюкин) способствует созданию защитной матрицы, снижающей возможность контакта белка с поверхностью ледяных кристаллов. Эти полисахариды применяются при получении лекарственных препаратов цитокинов, например, лиофилизированной формы интерферона альфа [43]. Маннитол и сахароза, наряду с глицином, глицерином и хлористым натрием, используются в фармацевтических композициях как изотонические модификаторы [52].

На основании вышеизложенного можно заключить, что среди разных классов вспомогательных веществ особый интерес в качестве стабилизатора, наполнителя и криопротектора при лиофилизации белков представляет полисахарид маннитол (маннит).

Таким образом, создание биодеградируемой противоопухолевой наноконструкции, содержащей ФНО-альфа человека, которая сохраняет свою структуру без агломерации наночастиц и сохраняет специфическую цитолитическую активность фактора некроза опухоли альфа в ее составе при введении в организм является неочевидным для специалиста в области медицины и биотехнологии, поскольку потребовались продолжительные научные исследования для выбора из многообразия стабилизирующих добавок полисахарида маннитола, обладающего антикоагулянтными свойствами в отношении конкретной заявляемой наноконструкции. Неочевидным является и количественное содержание заявляемых компонентов, входящих в состав наночастиц.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. На Фиг. 1 представлена схема внешнего вида наночастиц, несущих ФНО-альфа, между которыми расположены молекулы полисахарида маннитола. На Фиг. 2 представлена электрофореграмма препаратов ФНО-альфа в средстве доставки, содержащих в качестве вспомогательного вещества маннитол (образцы 1, 2). В качестве препарата сравнения (контроль) использован препарат исходной дсРНК (К, дорожка 2), в качестве маркера - препарат ДНК, 1Кb (М, дорожки 1, 5). Электрофорез в 1% агарозном геле, окрашивание этидиум бромидом. На Фиг. 3 представлены электронно-микроскопические фотографии препарата ФНО-альфа в средстве доставки без вспомогательного вещества (субстанция) либо содержащего маннитол (5%). Обозначения: А-субстанция (0,08 мг/мл); Б-ФНО-альфа в средстве доставки с маннитолом (0,03 мг/мл). Контрастирование 1% раствором уранилацетата.

На Фиг. 4 представлена динамика изменения объема опухоли меланомы B16-F10, привитой мышам линии С57В 1/6, на фоне внутривенного введения препарата ФНО-альфа в составе средства доставки, содержащего маннитол, в дозе 10⁵ МЕ при разной кратности введения. Обозначения: белые столбики - введение трехкратно, с интервалом в сутки; столбики со штриховкой - пятикратно, с интервалом в сутки; темные столбики - введение физиологического раствора (контроль); * - различия с контролем в соответствующий срок достоверны, p≤0,05.

На Фиг. 5 приведены результаты измерения объема ксенографта карциномы ротовой полости человека КВ-3.1, привитой мышам линии SCID, на фоне внутривенного введения препарата ФНО-альфа в средстве доставки, содержащего маннитол, при разной кратности введения. Обозначения: белые столбики - введение в дозе 5*10⁴ ME трехкратно, с интервалом в сутки; столбики со штриховкой - пятикратно, с интервалом в сутки, в дозе 10⁵ ME; темные столбики - введение физиологического раствора (контроль); * - различия с контролем в соответствующий срок достоверны, p≤0,05. На Фиг. 6 представлены результаты определения цитотоксической активности препарата ФНО-альфа в средстве доставки, содержащего маннитол, в культуре клеток меланомы мыши B16-F10 после 72 часов культивирования. На Фиг. 7 приведены результаты исследования апоптогенной активности препарата ФНО-альфа в средстве доставки, содержащего маннитол, в культуре клеток меланомы B16-F10. По оси ординат - количество опухолевых клеток в состоянии раннего, позднего апоптоза или некроза, %. Обозначения: темные столбики - физиологический раствор (контроль), столбики со штриховкой - препарат ФНО-альфа в средстве доставки, содержащий маннитол, в концентрации 0,46 мкг/мл. На Фиг. 8 приведены изображения гистологических срезов ткани меланомы B16-F10 через сутки после окончания трехкратного внутривенного введения препарата ФНО-альфа в средстве доставки, содержащего маннитол, в дозе 1×10⁵ МЕ/мышь. А - митозы в ткани опухоли (выделено кружками). Б - внеклеточные структуры, сходные с хромосомами, окрашенные базофильно (выделены кружками). В - кровеносные сосуды с поврежденными стенками, агрегацией и лизисом эритроцитов (стрелки) в окружении поврежденных клеток опухоли (зона деструкции). Г - коллагеновые волокна в опухоли (синего цвета), показан кровеносный сосуд с агрегировавшими эритроцитами (стрелка). Световая микроскопия, окраска гематоксилин-эозином (А-В) и Пикро-Маллори (Г).

Ниже приведены примеры 1-9 конкретного выполнения получения противоопухолевого средства в виде композиции, содержащей рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа человека в составе наночастицы, ядро которой образовано дрожжевой двуспиральной РНК, и вспомогательное вещество маннитола.

Пример 1. Получение противоопухолевого препарата ФНО-альфа в составе наночастиц

Препарат ФНО-альфа в составе наночастиц, являющихся средством доставки, получали согласно процедуре, описанной в патенте РФ №2386447 [26].

1.1. Описание конструкции наночастицы с ФНО-альфа

Каждая наночастица 1 (фиг. 1) содержит ядро 2, состоящее из полинуклеотидного комплекса, представляющего собой двуспиральную РНК (дсРНК) - индуктор интерфероногенеза, покрытое слоем 3 конъюгата спермидин/полиглюкин и прикрепленных к нему молекул 4 рекомбинантного фактора некроза опухолей альфа человека (ФНО-альфа), удерживаемого за счет ионного взаимодействия между отрицательно заряженным полинуклеотидным комплексом и положительно заряженным спермидином. В качестве двуспиральной РНК противоопухолевое средство содержит двуспиральную РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Наночастицы имеют сферическую форму размером порядка 50-70 нм, что позволяет избежать захвата их клетками ретикуло-эндотелиальной системы организма. Причем, на одну молекулу двуспиральной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae приходится 60-80 молекул рекомбинантного человеческого ФНО-альфа с цитолитической активностью не ниже 10⁶ МЕ/мг белка, 60-80 молекул полиглюкина и 1000-1300 молекул спермидина. В лиофилизате, между биодеградируемыми наночастицами 1, несущими ФНО-альфа с цитолитической активностью не менее 10⁶ ME, расположены молекулы полисахарида маннитола 5.

1.2. Синтез конъюгата полиглюкин-спермидин-ФНО-альфа

Для синтеза конъюгата 60 мг (1,2 мкМ) полиглюкина с молекулярной массой 50000 Д растворяют в 0,5 мл 50 мМ раствора периодата натрия и инкубируют 50 мин при комнатной температуре. Активированный полисахарид отделяют от периодата натрия гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-50 (V=2 мл) в 50 мМ бикарбонатном буфере, рН 8,6 и добавляют раствор 50 мМ бикарбонатного буфера, рН 8,6 (4-6 мл), содержащий 17 мг рекомбинантного ФНО-альфа. После инкубации в течение 3 ч при 6°С в раствор вносят 0,05 мл раствора, содержащего 2,25 мг (15 мкМ) спермидина, тщательно перемешивают. Еще через 5 ч добавляют 0,1 мл свежеприготовленного 10 мМ раствора периодата натрия. После инкубации в течение часа при 6°С непрореагировавшие компоненты удаляют гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-50 (V=20 мл) в фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,15 М NaCl, рН 7,2. Затем дополнительно образец диализуют против двух смен того же буфера, по 200 мл каждая. Препарат стерилизуют фильтрованием (0,2 мкМ).

При анализе полученного конъюгата на электрофореграмме в 10% полиакриламидном геле наблюдалось «облако» с кажущейся молекулярной массой в районе 120 кДа. При гель-фильтрации на сефадексе G-50 конъюгат элюировался в районе молекулярных масс 40-45 кДа.

1.3. Сборка наночастиц с ФНО-альфа

Для получения наночастиц, содержащих дсРНК и ФНО-альфа, к раствору дрожжевой дсРНК добавляли раствор конъюгата полиглюкин/спермидин/ФНО-альфа в соотношении: 1 мг дсРНК- 2 мг (по белковой компоненте) конъюгата. Для формирования частиц раствор инкубировали при 4°С в течение 2 часов. Анализ полученных наночастиц проводили гель-фильтрацией на колонке с сефарозой CL-6B и электрофорезом в 1%-ном геле агарозы.

Количественный состав наночастиц, содержащих фактор некроза опухоли альфа и двуспиральные РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae (в центральной части): на одну молекулу двуспиральной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae приходится 60-80 молекул рекомбинантного человеческого ФНО-альфа с цитолитической активностью не ниже 10⁶ МЕ/мг белка, 60-80 молекул полиглюкина и 1000-1300 молекул спермидина.

Теоретическая схема молекулярной конструкции, несущей ФНО-альфа, представлена на Фиг. 1.

1.4. Получение противоопухолевого средства

1.4.1. Приготовление раствора лекарственного средства ФНО-альфа в средстве доставки, содержащего 5% маннитола и 0,9% хлорида натрия

Навеску массой (3,1±0,1) г Д-маннитола (фирмы «Panreac», Испания, с содержанием основного вещества 95%) и навеску хлорида натрия массой (0,45±0,05) г взвешивали на весах и переносили количественно в стакан вместимостью 50 мл, содержащий (30±0,5) мл воды для инъекций. Раствор тщательно перемешивали на магнитной мешалке (250 об/мин., 20 мин.) до полного растворения, затем вносили раствор препарата ФНО-альфа в средстве доставки в объеме, содержащем белок с активностью не менее 5*10⁷ ME, и объем раствора доводили до 50 мл водой для инъекций. Смесь перед лиофильной сушкой имела следующее количественное содержание в 1 мл раствора:

Маннитол 50 мг Изотонический водный раствор, содержащий наночастицы, несущие ФНО-альфа с цитолитической активностью, не менее 10⁶ ME до 1 мл

1.4.2. Приготовление раствора лекарственного средства ФНО-альфа в средстве доставки, содержащего 3% маннитола и 0,9% хлорида натрия

Навеску массой (1,86±0,1) г Д-маннитола и навеску хлорида натрия массой (0,45±0,05) г взвешивали на весах и переносили количественно в стакан вместимостью 50 мл, содержащий (40±0,5) мл воды для инъекций. Раствор тщательно перемешивали на магнитной мешалке (250 об/мин., 20 мин.) до полного растворения, затем вносили раствор препарата ФНО-альфа в средстве доставки в объеме, содержащем белок с активностью не менее 5*10⁷ ME, и объем раствора доводили до 50 мл водой для инъекций. Смесь перед лиофильной сушкой имела следующее количественное содержание в 1 мл раствора:

Маннитол 30 мг Изотонический водный раствор, содержащий наночастицы, несущие ФНО-альфа с цитолитической активностью не менее 10⁶ ME до 1 мл

Смесь тщательно перемешивали на магнитной мешалке (250 об/мин в течение 10 минут), стерильно фильтровали и лиофильно высушивали.

Растворы образцов композиций разного состава (п.п. 1.4.1 и 1.4.2.) лиофилизировали в камере лиофильной сушки «FreeZone» в автоматическом режиме с опцией пневматической укупорки. Композиционные препараты разливали по 1 мл во флаконы объемом 3 мл и лиофильно высушивали в течение 24 часов при температуре 22±2°С. Процесс лиофилизации вели в стандартных условиях: заморозка образцов до минус 73±2°С в течение 6 часов, лиофилизация образцов при плюс 22±2°С в течение остального времени. Лиофильно высушенная масса представляла собой таблетку белого цвета. Образцы лиофилизированных препаратов хранили до испытаний при температуре 2-8°С. Ниже приведены примеры 1-2 составов противоопухолевого средства в сухом виде.

1.5. Примеры составов противоопухолевого средства

Пример 1.

Маннитол 30,0 мг Лиофилизат, содержащий наночастицы, несущие ФНО-альфа с цитолитической активностью не менее 10⁶ ME 37,5 мг

Пример 2.

Маннитол 50,0 мг Лиофилизат, содержащий наночастицы, несущие ФНО-альфа с цитолитической активностью не менее 10⁶ МЕ 61,5 мг

Изучение свойств композиционных составов осуществляли в соответствии с требованиями, изложенными в ГФ XIII, том 2, с. 867 (ОФС. 1.8.1.0002.15 «Иммунобиологические лекарственные препараты»). Результаты контроля подлинности препаратов рекомбинантного фактора некроза опухолей альфа человека в средстве доставки исследуемых составов после сушки представлены на Фиг. 2. Согласно данным электрофоретического анализа, оба образца содержали L- и М-формы дсРНК с измененной подвижностью, что подтверждает наличие в образцах молекулярных конструкций.

Полученные данные подтвердили тот факт, что маннитол в качестве вспомогательного вещества обеспечивает сохранность наноконструкций.

Пример 2. Анализ образцов противоопухолевого препарата методом электронной микроскопии.

Образцы композиционных препаратов, содержащих в качестве вспомогательного вещества маннитол, были исследованы методом просвечивающей электронной микроскопии с использованием негативного контрастирования (1% водный раствор уранилацетата). Образцы изучали при ускоряющем напряжении 80 кВ. Анализ электронных снимков с определением размеров частиц осуществляли при помощи программного пакета iTEM (Olympus, Германия).

На электронно-микроскопической фотографии препарата ФНО-альфа в средстве доставки (субстанция) четко визуализируются наночастицы размером 50-70 нм, склонные к агломерации (Фиг. 3А). В образце композиционного препарата с маннитолом обнаружены частицы размером от 50 до 70 нм (хотя встречались и более мелкие), преимущественно, одиночно расположенные (Фиг. 3Б). Таким образом, использование маннитола в качестве вспомогательного компонента способствовало стабилизации растворов наночастиц, несущих ФНО-альфа, и препятствовало их агломерации.

Пример 3. Оценка специфической цитолитической активности противоопухолевого средства

Специфическую цитолитическую активность композиционных препаратов ФНО-альфа в средстве доставки, содержащих маннитол, определяли в культуре мышиных фибробластов L929 в присутствии актиномицина D методом, описанным в [26]. В качестве стандарта использовали Отраслевой стандартный образец активности рчФНО-альфа (ОСО 42-28-400-08), специфическая активность которого установлена относительно Международного стандартного образца рчФНО-альфа (rhTNF-альфа) фирмы "Селтех" (Англия, номер по каталогу 1740/58).

Анализ цитолитической активности композиционных препаратов показал, что наиболее высоким уровнем активности отличался образец, содержащий в качестве стабилизатора 5% маннитол (1,17×10⁷ МЕ/мг).

Пример 4. Оценка противоопухолевой активности препарата ФНО-альфа в средстве доставки, содержащего маннитол, на модели меланомы B16-F10

В экспериментах использовали мышей линии C57BL/6, самок, массой 20-23 г. Клетки меланомы B16-F10 трансплантировали мышам внутримышечно в дозе 1×10⁶ клеток/мышь в объеме 0,1 мл. Композиционный препарат ФНО-альфа с маннитолом вводили мышам - опухоленосителям внутривенно в дозе 1×10⁵ ME на мышь в объеме 0,5 мл пятикратно, через день. Инъекции препарата начинали с 11 суток после перевивки опухоли (стадия сформировавшегося опухолевого узла) и проводили на 11, 13, 15, 17 и 19 сутки после перевивки. Контрольным мышам в те же сроки вводили внутривенно физиологический раствор. На 11, 14, 17, 20 и 22 сутки после перевивки проводили замер линейных размеров опухоли, рассчитывали объем опухолевого узла и процент торможения роста опухоли (ТРО).

Объем опухоли вычисляли по формуле:

где a, b и c - длина, ширина и высота опухоли, соответственно, в мм.

Процент торможения роста опухоли вычисляли по формуле:

где V_к - средний показатель объема опухоли в контрольной группе;

V_o - средний показатель опытной группы.

Экспериментальные данные обрабатывали методами вариационной статистики с помощью пакета программ "Statgraphics, Vers. 5.0" (Statistical Graphics Corp., USA). Для оценки значимости отличий использовали t-критерий Стьюдента.

В результате проведенного исследования показано, что пятикратное, с интервалом в один день, внутривенное введение композиционного препарата ФНО-альфа в дозе 1×10⁵ МЕ/мышь ингибировало рост опухоли (ТРО составлял 46-52%) (Фиг. 4). Эффект торможения был отмечен после второй инъекции препарата и сохранялся в течение всего периода лечения. Таким образом, препарат ФНО-альфа в средстве доставки, в который был введен в качестве стабилизатора маннитол, при пятикратном внутривенном введении в дозе 10⁵ МЕ на мышь обладал выраженной способностью тормозить рост экспериментальной опухоли меланомы B16-F10.

Пример 5. Оценка противоопухолевой активности препарата ФНО-альфа в средстве доставки, содержащего маннитол, на модели эпидермоидной карциномы ротовой полости человека КВ-3.1

В экспериментах использовали мышей иммунодефицитной линии SCID (Hairless Outbred SHO-Prkdcscid Hrhr Mouse), самок массой 23-25 г (Центр генетических ресурсов лабораторных животных ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск). Клетки карциномы КВ-3.1 перевивали мышам подкожно в дозе 8×10⁶ клеток/мышь в объеме 0,1 мл.

Препарат вводили внутривенно пятикратно, с интервалом в один день, в дозе 1×10⁵ МЕ/мышь, начиная инъекции на 10 сутки после перевивки. Контрольным мышам в те же сроки вводили внутривенно физиологический раствор. На 10, 13, 15, 17, 20, 22 и 24 сутки после перевивки проводили замер линейных размеров опухоли (перед введением препарата), рассчитывали объем опухолевого узла и процент торможения роста опухоли по формулам, приведенным выше.

Внутривенное введение композиционного препарата ФНО-альфа животным экспериментальных групп приводило к ингибированию развития опухолевых ксенографтов. Величина ТРО при пятикратном введении препарата ФНО-альфа в дозе 1×10⁵ ME составляла 67% (на вторые сутки после окончания курса введений) (Фиг. 5).

Полученные данные подтверждают способность препарата ФНО-альфа в средстве доставки, содержащего маннитол, тормозить рост ксенографтов карциномы человека КВ-3.1 при его пятикратном внутривенном введении в дозе 10⁵ ME.

Пример 6. Оценка цитотоксического действия препарата ФНО-альфа в средстве доставки, содержащего маннитол

Анализ цитотоксического действия композиционного препарата ФНО-альфа проводили с помощью МТТ-теста, который позволяет оценивать уровень жизнеспособности клеток по их метаболической активности, способности к восстановлению 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5 - дифенилбромидтетразолиевого (МТТ) [53]. Для определения цитотоксической активности тестируемый препарат в концентрациях от 30,5 до 6*10^-7 мкг/мл вносили в лунки плоскодонного микропланшета, содержащего клетки меланомы B16-F10 (10⁴/лунку), и инкубировали в CO₂-инкубаторе при температуре 37°С в атмосфере с 5% CO₂ в течение 72 часов. Число живых клеток определяли после инкубации с красителем 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромидом, измеряя оптическую плотность растворенного в диметилсульфоксиде МТТ-формазана. На основании средних значений оптической плотности в контрольных лунках и лунках с исследуемым препаратом рассчитывали процент живых клеток (индекс МТТ).

Исследование показало, что до 70% популяции клеток меланомы В16-F10 оказались чувствительными к действию композиционного препарата ФНО-альфа (Фиг. 6). Процент гибели клеток зависел от концентрации препарата. Достоверные различия индекса МТТ опухолевых клеток, инкубированных с препаратом ФНО-альфа, и контрольных клеток наблюдались в интервале концентраций от 30 до 0,002 мкг белка/мл. Полученные данные подтверждают наличие у препарата ФНО-альфа в средстве доставки, содержащего в качестве вспомогательного вещества маннитол, выраженной цитотоксической активности, характерной для препарата ФНО-альфа.

Пример 7. Оценка апоптогенного действия препарата ФНО-альфа в средстве доставки, содержащего маннитол

Оценку механизмов гибели клеток под действием композиционного препарата ФНО-альфа проводили с помощью диагностического набора для цитофлуорометрической оценки апоптоза FITC Annexin V Detection Kit 1 (BD Pharmingen, США). Для определения апоптогенной активности тестируемый препарат в концентрациях 0,46 и 0,046 мкг/мл вносили в лунки плоскодонного микропланшета, содержащего клетки меланомы B16-F10 (10⁶/лунку), и инкубировали в СО₂-инкубаторе при температуре 37°С в атмосфере с 5% СО₂ в течение 72 часов. Через 24, 48 и 72 часа от начала инкубации клетки снимали с подложки смесью трипсин-версен (1:1), промывали культуральной средой DMEM и концентрировали. В каждую пробирку с клетками вносили по 5 мкл аннексина V, коньюгированного с флуорохромом FITC, и 5 мкл красителя йодид пропидия (PI). По окончании окрашивания проводили анализ на цитофлуориметре BD FACS Aria (BD Pharmingen, США), определяя соотношение интактных клеток (отрицательные по аннексину V и PI); клеток, находящихся на стадии «раннего» апоптоза (положительные по аннексину V, отрицательные по PI); клеток, находящиеся в «позднем» апоптозе (положительные по аннексину V и PI) или в процессе некроза (положительные по PI). Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета статистических программ "Statgraphics, Vers. 5.0" (Statistical Graphic Corp., USA) способом, описанным выше.

Было показано, что клеточная линия мышиной меланомы при контакте с исследуемым препаратом уже через 24 часа вступала в апоптоз, и в дальнейшем наблюдалось развитие этого процесса. Дозовой зависимости апоптогенного эффекта не обнаружено. Соотношение клеток, находящихся на разных стадиях апоптоза или некроза после инкубации с препаратом в течение 72 часов, представлено на Фиг. 7. Видно, что к третьим суткам от начала инкубации клеток с препаратом ФНО-альфа до 70% клеточной популяции погибало через механизм апоптоза. Воздействие препаратом приводило и к увеличению количества клеток в состоянии некроза, однако число таких клеток в популяции было несравнимо более низким по сравнению с клеточной популяцией в апоптозе (5,4-5,9% и 62,3-70,2%, соответственно, после культивирования с препаратом в дозе 0,046 и 0,46 мкг/мл, 72 ч). Полученные данные свидетельствуют о том, что основным механизмом индуцируемой гибели опухолевых клеток под действием препарата ФНО-альфа в средстве доставки с маннитолом является апоптоз, и, следовательно, композиционный препарат сохраняет присущую ФНО-альфа апоптогенную активность.

Пример 8. Оценка влияния препарата ФНО-альфа в средстве доставки, содержащего маннитол, на сосудистую систему опухоли

Опухоль меланомы мыши В16 клон F10 трансплантировали мышам линии C57BL/6, самцам и самкам, массой 20-23 г., способом, описанным выше. Препарат ФНО-альфа вводили мышам-опухоленосителям внутривенно в дозе 1×10⁵ ME на мышь в объеме 0,5 мл трехкратно через день, начиная инъекции с 11 дня после перевивки. Эвтаназию животных и взятие образцов опухоли на гистологическое исследование проводили через сутки и 7 суток после окончания курса инъекций. Обработку образцов и изготовление гистологических срезов осуществляли стандартными методами. Полученные образцы исследовали с помощью светового микроскопа Leica DM 2500 при 10-, 20-, 40-, и 100-кратном увеличении объектива, фотосъемку проводили с помощью цифровой камеры Leica DFC420 С.

Изучение гистологических срезов опухолевых узлов меланомы B16-F10 через сутки после последнего введения препарата ФНО-альфа (1×10⁵ МЕ/мышь) показало наличие участков некроза и зон деструкции, которые занимали около 80-90% площади среза опухоли. Наблюдали детрит, измененные клетки меланомы, поврежденные сосуды и отек ткани. В ткани опухоли нередко встречались опухолевые клетки в состоянии митоза (Фиг. 8А). Между опухолевыми клетками, в участках некроза или зонах деструкции обнаружены структуры, по морфологии и размеру сходные с метафазными хромосомами опухолевых клеток, окрашенными базофильно при окраске срезов гематоксилин-эозином (Фиг. 8Б). По-видимому, введение препарата оказывало деструктивное действие на делящиеся клетки меланомы, в результате разрушения которых метафазные хромосомы оказывались в межклеточном пространстве. В опухолевом узле отмечено повреждение около 70% всех кровеносных сосудов, преимущественно, в участках некроза и зонах деструкции опухолевой ткани (Фиг. 8В). У 20% (одна из 5-ти) мышей повреждены все кровеносные сосуды опухоли. В ткани опухоли отмечали увеличение частоты встречаемости коллагеновых волокон по сравнению с другими анализируемыми группами (Фиг. 8Г). У 2-х из 5-ти мышей обнаружено замещение участка некроза соединительной тканью на площади около 5-7% от площади среза опухоли. По-видимому, разрушение опухолевых клеток приводило к «оголению» соединительно-тканной стромы.

Таким образом, гистологический анализ образцов опухоли меланомы B16-F10, взятой у мышей-опухоленосителей после воздействия композиционным препаратом ФНО-альфа, подтвердил наличие у препарата ФНО-альфа в средстве доставки с маннитолом выраженного деструктивного воздействия на опухоль. Эффект препарата затрагивал не только опухолевые клетки, но и кровеносные сосуды опухоли, что свидетельствует о сохранении сосудистых эффектов ФНО-альфа в составе композиции.

Пример 9. Оценка иммуномодулирующего действия препарата ФНО-альфа в средстве доставки, содержащего маннитол

Трансплантацию опухолевых клеток меланомы B16-F10 мышам линии C57BL/6 проводили методами, описанными выше. Препарат ФНО-альфа вводили мышам - опухоленосителям внутривенно в дозе 5×10⁴ ME на мышь трехкратно, через день, начиная с 12 суток после перевивки. На 10, 13 и 15 сутки после перевивки (через сутки после каждой инъекции препарата) животных подвергали эвтаназии мгновенной дислокацией шейных позвонков, извлекали и взвешивали лимфоидные органы (тимус, селезенка), забирали на исследование периферическую кровь, селезенку и перитонеальный экссудат. Спонтанную пролиферативную активность спленоцитов оценивали по уровню восстановления клетками 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенил тетразолиум бромида (МТТ-тест) [53]. Функцию макрофагов исследовали в краткосрочной культуре клеток по уровню восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) [54]. Оценку активности фагоцитов проводили в спонтанном тесте, либо в тесте с активатором метаболического дыхания макрофагов зимозаном (Zymosan А, «Sigma»), который добавляли на сформированный клеточный монослой в концентрации 3 мг/мл. Экспериментальные данные обрабатывали методами вариационной статистики с помощью пакета программ "Statgraphics, Vers. 5.0" (Statistical Graphics Corp., USA). Для оценки значимости отличий использовали t-критерий Стьюдента.

Оценка морфо-физиологических параметров иммунокомпетентных органов и их клеток у мышей с трансплантированной меланомой B16-F10 показала, что развитие опухолевого процесса приводило к увеличению массы селезенки и тимуса животных контрольной и опытной групп, по сравнению с показателями интактных мышей. При этом введение композиционного препарата ФНО-альфа вызывало более значительное, по сравнению с контрольным, повышение весового индекса селезенки (на 25%, 15 сутки после перевивки опухоли) у мышей опытной группы (62,6±2,65 и 78,5±4,24 мг/10 г, соответственно). Повышение весового индекса селезенки мышей опытной группы сопровождалось увеличением спонтанной пролиферативной активности спленоцитов этих животных (0,675±0,015 о.е.) по сравнению с показателями интактных мышей и контрольных мышей-опухоленосителей (0,459±0,057 и 0,544±0,022 о.е., соответственно).

Препарат ФНО-альфа в средстве доставки, содержащий маннитол, повышал активность перитонеальных клеток, по сравнению с показателями интактных (11, 13 и 15 сутки после перевивки) и контрольных животных (13 и 15 сутки после перевивки). Уровень НСТ, восстановленного зимозан-индуцированными макрофагами мышей опытной группы, по окончании курса инъекций препарата в 1,6 раза превышал контрольный показатель и показатель мышей интактной группы (19,9±2,6; 14,5±1,4 и 12,0±0,8 о.е. * 100, соответственно).

Таким образом, композиционный препарат ФНО-альфа вызывал повышение спонтанной пролиферативной активности спленоцитов и зимозан-индуцированной фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов, что свидетельствует об активации системного иммунного ответа, то есть, реализации механизма противоопухолевого действия, характерного для ФНО-альфа.

Примеры 1-9, приведенные выше, подтверждают достижение заявляемого технического результата, а именно: создано противоопухолевое средство в виде конструкции, содержащей рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа человека в составе наночастицы, ядро которой образовано дрожжевой двуспиральной РНК, и в качестве вспомогательного вещества - маннитол, препятствующий агломерации, обеспечивающий сохранение структуры конструкции и специфической цитолитической активности фактора некроза опухоли альфа в ее составе. Композиция обладает высокой противоопухолевой активностью, подтвержденной на экспериментальных опухолевых моделях и наиболее выраженной при пятикратном, с интервалом в сутки, внутривенном введении в дозе 10⁵ МЕ, причем, противоопухолевый эффект заявляемого препарата реализуется через механизмы, характерные для фактора некроза опухоли альфа.

Список использованных источников научно-технической и патентной информации

1. Чубенко В.А. Иммунотерапия на основе цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ТНФ, КСФ, Интерфероны) // Практич. Онкология. 2016. Т. 17, №2. С. 99-109.

2. Podleska L.E., Schwindenhammer В., Grabellus F., Bauer S., Steinau H.U., Taeger G. Isolated limb perfusion for liposarcoma: Histopathological response and subgroup analysis after TNF melphalan-based ILP // Chirurg. 2017. Jan 12. doi: 10.1007/s00104-016-0362-3.

3. Lienard D., Ewalenko P., Delmotte J.J., Renard N., Lejeune F.J. High-dose recombinant tumor necrosis factor alpha in combination with interferon gamma and melphalan in isolation perfusion of the limbs for melanoma and sarcoma // J. Clin. Oncol. 1992. Vol. 10, No 1. P. 52-60.

4. Gong J., Tan G., Sheng N., You W., Wang Z. Targeted treatment of liver metastasis from gastric cancer using specific binding peptide // Am. J. Transl. Res. 2016. Vol. 8, N. 5. P. 1945-56. eCollection 2016.

5. Lebedev L.R., Danilenko E.D., Telegina Yu.V., Zaitsev B.N. An Antitumor Osteotropic Agent Based On Tumor Necrosis Factor // Biochemistry (Moscow) Suppl. Ser. B: Biomed. Chemistry. 2016. Vol. 10, N. 3. P. 287-291.

6. Xu G., Gu H., Hu В., Tong F., Liu D., Yu X., Zheng Y., Gu J. PEG-b-(PELG-g-PLL) nanoparticles as TNF-α nanocarriers: potential cerebral ischemia/reperfusion injury therapeutic applications // Int. J. Nanomedicine. 2017. Vol. 12. P. 2243-2254. doi: 10.2147/IJN.S130842. eCollection 2017.

7. Farma J.M., Puhlmann M., Soriano P.A., Cox D., Paciotti G.F., Tamarkin L., Alexander H.R. Direct evidence for rapid and selective induction of tumor neovascular permeability by tumor necrosis factor and a novel derivative, colloidal gold bound tumor necrosis factor // Int. J. Cancer. 2007. Vol. 120, N. 11. P. 2474-2480.

8. Messerschmidt S.K., Musyanovych A., Altvater M., Scheurich P., Pfizenmaier K., Landfester K., Kontermann R.E. Targeted lipid-coated nanoparticles: delivery of tumor necrosis factor-functionalized particles to tumor cells // J. Control. Release. 2009. Vol. 137, N 1. P. 69-77.

9. Международная заявка WO 2005117963, опубл. 20.07.2008 г.

10. Заявка США 2008019991, опубл. 24.01.2008 г.

11. Заявка Китая 102228437, опубл. 02.11.2011 г.

12. Заявка США 2009155344, опубл. 19.06.2009 г.

13. Van der Veen А.Н., Eggermont A.M., Seynhaeve A.L., van Tiel, ten Hagen T.L. Biodistribution and tumor localization of stealth liposomal tumor necrosis factor-alpha in soft tissue sarcoma bearing rats // Int. J. Cancer. 1998. Vol. 77, N. 6. P. 901-906.

14. Ten Hagen T.L., Seynhaeve A.L., van Tiel S.T., Ruiter D.J., Eggermont A.M. Pegylated liposomal tumor necrosis factor-alpha results in reduced toxicity and synergistic antitumor activity after systemic administration in combination with liposomal doxorubicin (Doxil) in soft tissue sarcoma-bearing rats // Int. J. Cancer. 2002. Vol. 97, N. 1. P. 115-120.

15. Ten Hagen T.L., Van Der Veen A.H., Nooijen P.T, Van Tiel S.T., Seynhaeve A.L. Eggermont A.M. Low-dose tumor necrosis factor-alpha augments antitumor activity of stealth liposomal doxorubicin (DOXIL) in soft tissue sarcoma-bearing rats // Int. J. Cancer. 2000. Vol. 87, N. 6. P. 829-837.

16. Li Y.P., Pei Y.Y., Zhou Z.H., Zhang X.Y., Gu Z.H., Ding J., Gao X.J., Zhu J.H. PEGylated recombinant human tumor necrosis factor alpha: pharmacokinetics and anti-tumor effects // Biol. Pharm. Bull. 2001. Vol. 24, N. 6. P. 666-670.

17. Li Y.P., Pei Y.Y., Zhou Z.H., Zhang X.Y., Gu Z.H., Ding J., Zhou J.J., Gao X.J., Zhu J.H. Stealth polycyanoacrylate nanoparticles as tumor necrosis factor-alfa carriers: pharmacokinetics and anti-tumor effects // Biol. Pharm. Bull. 2001. Vol. 24, N 6. P. 662-665.

18. Li Y.P., Pei Y.Y., Zhou Z.H., Zhang X.Y., Gu Z.H., Ding J., Zhou J.J., Gao X.J. PEGylated polycyanoacrylate nanoparticles as tumor necrosis factor-alpha carriers // J. Control. Release. 2001. Vol. 71, N. 3. P. 287-296.

19. Fang C, Shi В., Pei Y.Y. Effect of MePEG molecular weight and particle size on in vitro release of tumor necrosis factor-alpha-loaded nanoparticles // Acta Pharmacol. Sin. 2005. Vol. 26, N. 2. P. 242-249.

20. Fang C, Shi В., Pei Y.Y., Hong M.H., Wu J., Chen H.Z. In vivo tumor targeting of tumor necrosis factor-alpha-loaded stealth nanoparticles: effect of MePEG molecular weight and particle size // Eur. J. Pharm. Sci. 2006. Vol. 27, N. 1. P. 27-36.

21. Заявка США 2009155344, опубл. 19.06.2009 г.

22. Патент РФ 2504403, опубл. 20.01.2014 г.

23. Visaria R.K., Griffin R.J., Williams B.W., Ebbini E.S., Paciotti G.F., Song C.W., Bischof J.C. Enhancement of tumor thermal therapy using gold nanoparticle-assisted tumor necrosis factor-alpha delivery // Mol. Cancer Ther. 2006. Vol. 5, N. 4. P. 1014-1020.

24. Патент РФ 2472530, опубл. 20.01.2013 г.

25. Патент РФ 2480524, опубл. 27.04.2013 г.

26. Патент РФ 2386447, опубл. 20.04.2010 г, (прототип).

27. Гамалей С.Г., Батенева А.В., Сысоева Г.М., Даниленко Е.Д., Лебедев Л.Р., Масычева В.И. Фармакокинетика и противоопухолевые свойства препарата, содержащего ФНО-α в составе наночастицы // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2010. Т. 149, №3. С. 296-299.

28. Rosenberg A.S. Effects of protein aggregates: an immunologic perspective // AAPS Journal. 2006. Vol. 8, No. 3. P. E501-507.

29. Carpenter J.F., Randolph T.W., Jiskoot W., Crommelin D.J.A., Middaugh C.R., Winter G. et al. Overlooking subvisible particles in therapeutic protein products: gaps that may compromise product quality // J. Pharm. Sci. 2009. Vol. 98, No. 4. P. 1201-1205.

30. Kim Y., Ko S.M., Nam J-M. Protein nanoparticle interaction-induced changes in protein structure and aggregation // Chem. Asian. 2016. Vol. 11. P. 1869-1877.

31. Ma Q., Wei G., Yang X. Influence of Au nanoparticles on the aggregation of amyloid-β-(25-35) peptides // Nanoscale. 2013. Vol. 5. P. 10397-10403.

32. Zhang D., Neumann O., Wang H., Yuwono V.M., Barhoumi A., Perham M., Hartgerink J.D., Wittung-Stafshede P., Halas N.J. // Nano Lett. 2009. Vol. 9. P. 666-671.

33. Ault A.P., Stark D.I., Axson J.L., Keeney J.N., Maynard A.D., Bergin I.L., Philbert M.A. Protein corona-induced modification of silver nanoparticle aggregation in stimulated gastric fluid // Environ Sci. Nano. 2016. Vol. 3, No. 6. P. 1510-1520.

34. Rogers K.R., Bradham K., Tolaymat Т., Thomas D.J., Hartmann Т., Ma L., Williams A. Alterations in physical state of silver nanoparticles exposed to synthetic human stomach fluid // Sci. Total Envirom. 2012. Vol. 420. P. 334-339.

35. Walczak A.P., Fokkink R., Peters R., Tromp P., Herrera Rivera Z.E., Rietjens I.M., Hendriksen P.J., Bouwmeester H. Behaviour of silver nanoparticles and silver ions in an in vitro human gastrointestinal digestion model // Nanotoxicology. 2013. Vol. 7. P. 1198-1210.

36. Kakinen A., Ding F., Chen P., Mortimer M., Kahru A., Ke P.C. Interaction of firefly luciferase and silver nanoparticles and its impact on enzyme activity // Nanotechnology. 2013. Vol. 24, No. 34. P. 345101.

37. Wang Y., Ni Y. New insight into protein-nanomaterial interactions with UV-visible spectroscopy and chemometrics: human serum albumin and silver nanoparticles // Analyst. 2014. Vol. 139. P. 416-424.

38. Yokoyama K., Welchons D. The conjugation of amyloid beta protein on the gold colloidal nanoparticles' surfaces // Nanotechnology. 2007. Vol. 18, N. 10. P. 105101

39. Патент РФ 2563997, опубл. 27.10.2013 г.

40. Hauptmann A., Podgorsek K., Kuzman D., Srcic S., Hoelzl G., Loerting T. Impact of buffer, protein concentration an sucrose addition on the aggregation and particle formation durin freezing and thawing // Pharm. Res. 2018. Vol. 35. P. 101. http:/doi.org/10.1007/s11095-018-2378-5

41. Roessl U., Hurni S., Leitgeb S., Nidetzky B. Design of experiments reveals critical parameters for pilot-scale freeze-and thaw processing of L-lactic dehydrogenase // Biotechnol. J. 2015. Vol. 10, No. 9. P. 1390-1399.

42. Crowe J.N., Crowe L.N., Carpenter J.F. Preserving dry bomaterials: the water replacement hypothesis // Bioparm. 1993. Vol. 6, No. 1. P. 28.

43. Патент РФ 2236866, опубл. 27.09.2004 г.

44. Маннитол PEARLITOL® - основа для создания фармацевтических препаратов высокого качества // Фармацевтическая отрасль. 2016. №1 (54). С. 66-70).

45. Березин И.В., Клячко Н.Л., Левашов А.В. и др., Иммобилизованные ферменты // Биотехнология. Уч. Пособие. Кн. 7. М.: Высшая школа. 1987. С. 159

46. Williams N.A., Dean Т. Vial breakage by frozen mannitol solutions: Correlation with thermal characteristics and effect of stersoisomerism, additives and vial configuration // J. Parenteral Science and Technology. 1991. Vol. 45. P. 94-100

47. Kett W.L., Fitzpatrick S., Cooper В., Craig D.Q.M. An investigation into the subambient behaviour of aqueous mannitol solutions using differential scanning colorimetry, cold stage microscopy and X ray diffraction // J. Pharm. Sci. 2003 Vol. 92, N. 9. P. 1919-1929.

48. Kumar V., Singh S.N., Kalonia D.S. Mechanism of stabilization of proteins by poly-hydroxy co-solvents: concepts and implications in formulation development / American Pharmaceutical Review. 2012. https://www.americanpharmaceuticalreview.com

49. Heljo P. Comparison of disaccharides and polyalcohols as stabilizers in freeze-dried protein formulations // Acadimic dissertation. Helsinki. 2013.

50. Prestrelski S.J., Pikal M.A., Arakawa T. Optimization of lyophilization conditions for recombinant human interleukin-2 by dried-state conformational analysis using Fourier-transform infrared spectroscopy // Pharm. Res. 1995. Vol. 12. P. 1250-1259

51. Шарма Г.С., Сингх Л.Р. По сравнению с осмолитами других классов, многоатомные спирты обладают уникальной способностью содействовать рефолдингу белков // Биохимия. 2017. №4. С. 634-643.

52. Bedu-Adda K.F. Understanding lyophilization formulation development // Pharmaceutical Technology Lyophilization. 2004. P. 10-18. www.pharmatech.com

53. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Meth. 1983. Vol. 65, N. (1-2). P. 55-63.

54. Rook G.A.W., Steel J., Umar S., Dockrell H.M. A simple method for the solubilisation of reduced NBT, and its use as a colorimetric assay for activation of human macrophages by gamma-interferon // J. Immunol. Meth. 1985. Vol. 82, №1. P. 161-167.

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики, а именно к противоопухолевому средству на основе биодеградируемых наночастиц, несущих рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа человека, содержащему сферические наночастицы, имеющие размер порядка 50-70 нм, имеющие ядро, состоящее из полинуклеотидного комплекса, представляющего собой двуспиральную РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae - индуктор интерфероногенеза, и покрытое слоем конъюгата спермидина с полиглюкином, удерживаемого за счет ионного взаимодействия между отрицательно заряженным полинуклеотидным комплексом и положительно заряженным спермидином, и рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа человека, ковалентно связанный с активированным периодатом натрия полиглюкином, причем на одну молекулу двуспиральной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae приходится 60-80 молекул рекомбинантного человеческого ФНО-альфа с цитолитической активностью не ниже 10⁶ МЕ/мг белка, 60-80 молекул полиглюкина и 1000-1300 молекул спермидина, отличающемуся тем, что средство содержит полисахарид маннитол, молекулы которого расположены в лиофилизате между биодеградируемыми наночастицами, несущими ФНО-альфа с цитолитической активностью не менее 10⁶ ME, при следующем количественном содержании компонентов в 1 дозе сухого противоопухолевого средства: маннитол 30,0-50,0 мг, лиофилизат, содержащий наночастицы, несущие ФНО-альфа с цитолитической активностьюне менее 10⁶ МЕ, 37,5-61,5 мг. Изобретение обеспечивает создание биодеградируемой противоопухолевой наноконструкции, содержащей ФНО-альфа человека, которая сохраняет свою структуру без агломерации наночастиц и сохраняет специфическую цитолитическую активность фактора некроза опухоли альфа в ее составе при введении в организм. 8 ил., 9 пр.

Противоопухолевое средство на основе биодеградируемых наночастиц, несущих рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа человека, содержащее сферические наночастицы, имеющие размер порядка 50-70 нм, имеющие ядро, состоящее из полинуклеотидного комплекса, представляющего собой двуспиральную РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae - индуктор интерфероногенеза, и покрытое слоем конъюгата спермидина с полиглюкином, удерживаемого за счет ионного взаимодействия между отрицательно заряженным полинуклеотидным комплексом и положительно заряженным спермидином, и рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа человека, ковалентно связанный с активированным периодатом натрия полиглюкином, причем на одну молекулу двуспиральной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae приходится 60-80 молекул рекомбинантного человеческого ФНО-альфа с цитолитической активностью не ниже 10⁶ МЕ/мг белка, 60-80 молекул полиглюкина и 1000-1300 молекул спермидина, отличающееся тем, что средство содержит полисахарид маннитол, молекулы которого расположены в лиофилизате между биодеградируемыми наночастицами, несущими ФНО-альфа с цитолитической активностью не менее 10⁶ ME, при следующем количественном содержании компонентов в 1 дозе сухого противоопухолевого средства:

Маннитол 30,0-50,0 мг Лиофилизат, содержащий наночастицы, несущие ФНО-альфа с цитолитической активностью не менее 10⁶ МЕ 37,5-61,5 мг