ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ, НЕСУЩИХ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2010 года по МПК A61K38/19 A61K31/7105 A61P35/00 

Изобретение относится к противоопухолевым средствам и может быть использовано в области медицины и фармацевтики.

Как известно, заболеваемость злокачественными новообразованиями во многих странах мира продолжает неуклонно увеличиваться. Рост числа онкологических заболеваний обусловлен рядом факторов, важнейшими из которых являются увеличение числа лиц пожилого возраста и неблагоприятная экологическая обстановка. За последние 25-30 лет темп прироста частоты заболеваний данного типа превысил годовой темп прироста населения в развитых странах. К 2010 году число заболевших в мире прогнозируется до 12,5 млн человек. В РФ первичная заболеваемость злокачественными новообразованиями в 2004 г. составила 473 тыс. человек (326,3 на 100 тыс. населения) и продолжает неуклонно расти. Серьезной является и проблема ухудшения эпидемической обстановки во многих странах мира, что связано с прогрессирующим ослаблением иммунореактивности населения этих стран, увеличением частоты и выраженности приобретенных иммунодефицитов, обусловленных экологическими и социальными причинами, хроническими инфекционными заболеваниями.

В связи с этим актуальность поиска новых средств и способов лечения злокачественных новообразований в нашей стране чрезвычайно велика. Это обусловлено как особенностями течения данного заболевания (гистологической гетерогенностью опухолей, их разной чувствительностью к химиопрепаратам, индивидуальными характеристиками функционирования иммунной системы больных, степенью развития заболевания), так и ограниченностью современного арсенала эффективных химиотерапевтических средств.

В последние годы значительное внимание с точки зрения терапевтического применения уделяется цитокинам - биологически активным факторам пептидной природы, которые вырабатываются клетками иммунной системы и являются одновременно и продуктами жизнедеятельности этой системы, и ее основными регуляторами. В настоящее время ряд цитокинов, таких как интерфероны и интерлейкины, применяются в онкологии в качестве иммуномодуляторов и противоопухолевых средств [1].

К числу перспективных противоопухолевых препаратов относятся представители семейства факторов некроза опухолей, в частности фактор некроза опухолей альфа (ФНО-α). Как известно, факторы некроза опухолей представляют собой полипотентные белки-цитокины, играющие ключевую роль во многих физиологических и патологических процессах организма. Фактор некроза опухолей альфа отличается способностью оказывать прямое цитотоксическое действие на опухолевые клетки разных типов, активировать противоопухолевый иммунный ответ и вызывать повреждение клеток эндотелия сосудов опухоли, результатом чего является ее геморрагический некроз [2-4].

В настоящее время препараты ФНО-α производства фармацевтических компаний Asahi, Knoll, Genentech, Wadley Inst. Cetus, Dainippon и др. проходят клинические испытания в разных странах мира. Клинические исследования рекомбинантного ФНО-α человека за рубежом показали положительный эффект препарата на более, чем 10 видах опухолей, таких как меланома, липосаркома, нейробластома, рак легких и ряде других [5]. В 2000 г. в Европе был зарегистрирован препарат на основе ФНО-α и мелфалана для лечения неоперабельной мягкотканой саркомы конечностей методом региональной перфузии [6].

Технология получения рекомбинантного ФНО-α человека была разработана и в России, в частности, в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора [7, 8]. В настоящее время завершена вторая фаза клинических испытаний лекарственной формы ФНО-α, препарата Альнорин. Исследования, выполненные в ВОНЦ РАМН (г.Москва), свидетельствуют о том, что введение Альнорина с последующей химиотерапией улучшает лечебный эффект у больных с диссеминированной меланомой кожи (до 59%), что проявляется в полной или частичной ремиссии метастазов либо стабилизации процесса [9]. Эти данные свидетельствуют о перспективности использования препарата ФНО-α в качестве современного средства для иммунотерапии онкологических заболеваний.

Однако следует отметить, что по-прежнему нерешенной остается проблема быстрой деградации ФНО-α в кровеносном русле, а также ограниченная селективность накопления цитокина в ткани опухоли, что обуславливает необходимость его многократных инъекций для поддержания необходимой эффективной дозы. При этом установлено, что длительное введение ФНО-α в высоких дозах сопровождается разнообразными побочными эффектами и служит препятствием для внедрения этого препарата в медицинскую практику [10-12].

В связи с этим, в течение ряда лет предпринимались многочисленные попытки снижения системной токсичности ФНО-α как за счет непосредственного ослабления его провоспалительных свойств, так и опосредованным образом, через повышение протеолитической устойчивости либо противоопухолевой активности. Одним из наиболее распространенных методических приемов, используемых для этих целей, является создание химерных форм ФНО-α либо композиционных препаратов с веществами-модификаторами биологических реакций.

Так, было показано, что получение химерных вариантов ФНО-α с α₁-тимозином [13], лейкокинином [14] позволяет повысить противоопухолевую активность препарата за счет усиления его иммуномодулирующей активности. Конъюгат белка с монометоксиполиэтиленгликолем отличался более длительным, по сравнению с ФНО-α, периодом выведения из крови экспериментальных животных, что обусловило повышение противоопухолевой активности препарата в отношении трансплантированных опухолей Meth фибросаркомы и снижение интенсивности токсических проявлений [15]. Конъюгация ФНО-α с полимерами, такими как полиглюкин, поливинилпирролидон, дивиниловый эфир, позволило повысить устойчивость белка к протеолизу и противоопухолевую активность [16-20]. Получен ряд положительных результатов, касающихся изменения фармакокинетики препарата и усиления его противоопухолевых свойств в случае конъюгации ФНО-α с фрагментами антител против антигенов опухоли [21], а также лигандами опухолевых рецепторов, таких как лиганд интегринового рецептора V типа [22] либо трансферрин [23].

Среди соединений, которые использовались в качестве биологически активных добавок при создании композиционных препаратов, можно выделить две группы соединений, различающихся по механизму их действия на организм.

Первую группу образуют вещества-синергисты ФНО-α. К ним относятся, например, интерфероны разных типов (α, β- и γ) [24, 25], трансформирующий ростовой фактор бета [26]. Предложен препарат для ингибирования роста опухолей, действующим началом которого, помимо ФНО-α, является соединение, блокирующее систему белка C (антитела против белка C и S, C4δ-связывающий белок) [27]. О'Conner с соавторами [28] был разработан противоопухолевый препарат, содержащий эффективное количество фактора некроза опухоли человека и C-реактивного белка, усиливающего антибластоидную активность ФНО-α.

Препараты второй группы характеризуются наличием в своем составе биологически активных соединений, снижающих побочные эффекты ФНО-α. Для предотвращения повреждений клеток, вызванных цитотоксическим действием лимфокинов, используются акцеторы свободных радикалов или метаболические ингибиторы (мочевая кислота, бутионинсульфоксиамин, витамин C и др.) [29]. Для снижения или подавления токсического действия высоких доз ФНО, применяемых при лечении злокачественных новообразований, предложено введение в состав комплексного препарата нестероидных противовоспалительных средств, таких как индометацин, ибупрофен [30].

Известна противоопухолевая композиция, включающая интерлейкин-2, альфа-2-интерферон и двунитевую РНК (дн-РНК) [47]. Было показано, что добавление в композицию дн-РНК в качестве «катализатора», повышающего активность цитокинов, позволило снизить дозы ИЛ-2 и ФНО, необходимые для достижения терапевтического эффекта. Однако следует отметить, что для получения положительного эффекта введения композиционного препарата при использовании такой дн-РНК/цитокинотерапии проводили с использованием доз порядка 10³-10⁴ ME на кг массы тела, т.е. доз, которые, как известно [1], уже способны вызывать токсические реакции.

При всех несомненных достоинствах данного подхода следует отметить, что введение в состав комплексного или композиционного препарата биологического модификатора направлено, как правило, на решение лишь какой-либо одной из проблем: повышения протеолитической устойчивости, усиления противоопухолевой активности ФНО либо снижения выраженности его побочного действия.

Попыткой комплексного решения проблемы протеолитической устойчивости ФНО-α и усиления накопления в ткани опухоли является создание препаратов, содержащих ФНО-α в составе наночастиц. Как известно, патологическая сосудистая стенка опухоли, в отличие от нормальной, проницаема для крупных молекул с молекулярной массой 40 kDa и выше и мелких частиц, которые накапливаются в межклеточном пространстве опухоли [31]. При онкопатологии накоплению также способствует недостаточность лимфатической системы, ответственной за дренаж макромолекул в нормальных тканях. Размер пор эндотелия кровеносных сосудов большинства опухолей колеблется в пределах от 200 до 600 нм в диаметре, что позволяет частицам соответствующего размера проникать непосредственно в опухолевую ткань.

В настоящее время созданы и исследованы два типа наночастиц, несущих ФНО-α: наночастицы, содержащие в качестве носителя неорганические компоненты, и липосомы.

Visaria R.K. с соавторами была продемонстрирована возможность использования наночастиц, состоящих из покрытых полиэтиленгликолем частиц коллоидального золота, в качестве систем доставки ФНО-α для термальной терапии опухолей [32]. Было показано, что данная конструкция тормозит как скорость кровотока в сосудистой системе опухоли, так и ее рост. Повышение накопления ФНО-α в составе частиц золота, покрытых модифицированным полиэтиленгликолем, в опухоли и снижение - в органах, обогащенных клетками РЭС (печень, селезенка и др.), отмечали и авторы работы [33]. Наночастицы, ядро которых было образовано частицами кремния, а органическая оболочка содержала малеимидные группы для связывания ФНО-α, инициировали иммунный ответ, который по интенсивности был характерен для мембраносвязанного ФНО-α [34].

Однако следует отметить, что общим недостатком конструкций [32-34], содержащих неорганические частицы, является отсутствие систем их биодеградации, в результате чего кумуляция данных частиц в организме приводит к развитию серьезных токсических эффектов, в частности цитотоксичности [35].

Другим вариантом наноконструкций, которые были разработаны для защиты ФНО-α от деградации, являются липосомы [36-40]. К сожалению, выяснилось, что существенным недостатком липосомальных форм является их быстрая опсонизация при внутривенном введении и последующий захват клетками ретикулоэндотелиальной системы [41]. Липосомы, содержавшие ФНО-α, быстро узнавались клетками мононуклеарной фагоцитирующей системы, имели малое время циркуляции и селективно разрушались в ретикуло-эндотелиальной системе опухоли.

Для преодоления захвата липосом мононуклеарами крови и опухоли были разработаны так называемые «липосомы-невидимки», содержащие полиэтиленгликоль (ПЭГ), что приводило к повышению осмотического давления вокруг липосом и препятствовало их сближению с клеткой [42-45]. Пегилированные липосомы невидимы для клеток ретикулоэндотелиальной системы и долгое время циркулируют в крови, но при этом имеют существенный недостаток - плохо накапливаются в клетках-мишенях. Помимо этого, выяснилось, что «липосомы-невидимки», содержащие ФНО-α, нестабильны при хранении. И, наконец, известно, что абсолютное большинство типов липосом накапливается в печени (в гепатоцитах, в частности, до 97% фосфатидилхолиновых липосом) и селезенке [46]. Поэтому использование липосом в качестве носителя ФНО-α имеет серьезный недостаток, связанный с тем, что ФНО-α, благодаря своим провоспалительным свойствам, может способствовать развитию гепатотоксичности.

Приведенные литературные данные свидетельствуют о возможности изменения фармако-токсических свойств ФНО-α в результате его конъюгирования, включения в состав композиционного препарата либо введения в наноконструкцию (наночастицу). Как тот, так и другой подходы имеют свои достоинства и недостатки. Создание химерных форм и композиций ФНО-α направлено на повышение протеолитической устойчивости, усиление антибластоидной активности либо снижение токсичности белка, но при этом не ставится задача повышения накопления ФНО-α в ткани опухоли. Введение ФНО-α в состав наноконструкций позволяет приблизиться к решению проблемы селективности накопления вещества в ткани опухоли, однако компоненты наноконструкций являются, преимущественно, биологически инертными веществами, и нередко существует проблема их биодеградации.

Для комплексного решения проблемы необходимо получить биодеградируемую наноконструкцию, повышающую протеолитическую устойчивость ФНО-α, его накопление в опухоли и содержащую в своем составе, помимо ФНО-α, вещество-синергист, обладающее противоопухолевыми и иммуномодулирующими свойствами.

Ранее в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» были созданы двухслойные молекулярные конструкции, содержащие в центральной части нуклеотидный материал (двуспиральные дрожжевые РНК), покрытый оболочкой из спермидин-полиглюкина, а на поверхности - антигены инфекционного агента. На основе этих конструкций были получены экспериментальные образцы кандидатных вакцин против ВИЧ, туберкулеза, клещевого энцефалита, показана их высокая эффективность при иммунизации лабораторных животных [48-50]. Созданная конструкция, содержащая полинуклеотидный и полисахаридный материал, в физиологических условиях имели сферическую вирусоподобную форму, в связи с чем получила название «вирусоподобная частица» (ВПЧ), и размеры от 25 до 40 нм, что позволяет отнести ее к категории наноматериалов.

Наиболее близким аналогом (прототипом), по мнению заявителя, является конструкция наночастиц, содержащих ФНО-α, предложенная Ya-Ping LI с соавторами [53]. Осуществленное ими инкапсулирование рекомбинантного ФНО-α человека в полицианоакрилатные нанокапсулы (poly(methoxypolyethyleneglycol cyanoacry-late-co-n-hexadecyl cyanoacrylate, PEG-PHDCA) приводило к удлинению времени полужизни ФНО-α в 7 раз. Содержащая ФНО-α наночастица накапливалась преимущественно в опухолевых тканях и ингибировала рост опухоли на 78,3%, в то время как свободный ФНО-α в той же дозе вызывал ингибирование опухоли лишь на 15,4%.

Однако в данной публикации отсутствуют сведения о возможности деградации данного типа полимерных материалов в биологической среде организма, возможности их кумуляции и, как следствие, отсутствуют данные об отдаленной специфической токсичности данной препаративной формы.

Сведения об известных наноконструкциях, содержащих в своем составе полинуклеотидный комплекс (двуспиральную РНК, дсРНК) и ФНО-α, в литературных источниках в настоящее время отсутствуют.

Техническим результатом заявляемого технического решения является создание такого противоопухолевого средства на основе наночастиц, несущих рекомбинантный фактор некроза опухолей альфа человека, которое представляет собой биодеградирумые наночастицы, обладающие противоопухолевым действием при более низких эффективных дозах ФНО-α и пониженной токсичностью, по сравнению с известными выше приведенными аналогами.

Указанный технический результат достигается тем, что в противоопухолевом средстве на основе наночастиц, несущих рекомбинантный фактор некроза опухолей альфа, согласно изобретению, каждая наночастица содержит ядро, состоящее из полинуклеотидного комплекса, представляющего собой двуспиральную РНК (дсРНК) - индуктор интерфероногенеза, и покрытое слоем конъюгата спермидина с полиглюкином, удерживаемого за счет ионного взаимодействия между отрицательно заряженным полинуклеотидным комплексом и положительно заряженным спермидином, а рекомбинантный фактор некроза опухолей альфа человека ковалентно связан с активированным полиглюкином. Полиглюкин активирован периодатом натрия.

В качестве двуспиральной РНК противоопухолевое средство содержит двуспиральную РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Наночастицы имеют сферическую форму с размером порядка 50-70 нм, что позволяет избежать захвата их клетками ретикуло-эндотелиальной системы. Причем на одну молекулу двуспиральной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae приходится 60-80 молекул рекомбинантного человеческого ФНО-α с цитолитической активностью не ниже 106 МЕ/мг белка, 60-80 молекул полиглюкина и 1000-1300 молекул спермидина.

Лечебное действие средства заключается в том, что дсРНК и ФНО-α в составе наночастиц взаимно потенцируют эффекты на злокачественные клетки, что позволяет снизить эффективную дозу ФНО-α и ослабить токсические эффекты цитокина.

Исследование образца препарата наночастиц с ФНО-α методом сканирующей зондовой микроскопии показало, что наночастицы имеют сферическую форму с размером частиц порядка 50-70 нм.

Исследование противоопухолевой активности препарата наночастиц с ФНО-α в экспериментах на мышах с трансплантированной карциномой Эрлиха показало, что препарат обладает повышенной способностью ингибировать рост опухоли, по сравнению с монопрепаратом ФНО-α. Эффективная доза ФНО-α в составе наночастиц в 10-100 раз ниже эффективной дозы входящего в его состав ФНО-α.

Оценка токсических свойств препарата наночастиц с ФНО-α, в сравнении с препаратом ФНО-α, на мышах-опухоленосителях с трансплантированной карциномой Эрлиха показала, что максимально переносимая доза для наночастиц с ФНО-α в 1,5 раза превышала значения, полученные для ФНО-α.

Следовательно, наночастица, представляющая композицию из двух биологически активных веществ дсРНК и ФНО-α, обладает более высокой противоопухолевой активностью и сниженной токсичностью, по сравнению с ФНО-α.

Обоснование критерия «изобретательский уровень»

Создание заявляемой конструкции наночастиц в качестве средства депонирования и доставки ФНО-α с повышенным противоопухолевым и пониженным токсическим действием является неочевидным для специалиста в области медицины и биотехнологии, поскольку потребовались дополнительные научные исследования и получение следующих данных:

1) может ли введение ФНО-α в состав заявляемой наноконструкций обеспечить повышение его накопления в ткани опухоли, что, в свою очередь, обусловлено как размерами, так и особенностями проникновения заявляемых наночастиц через сосуды опухоли;

2) известно, что препарат двуспиральной РНК из дрожжей S. cerevisiae, образующий ядро наночастицы, обладает противоопухолевыми и иммуномодулирующими свойствами [51], однако требовалось установить и экспериментально обосновать, может ли дсРНК привести к модуляции и усилению противоопухолевых свойств ФНО-α и как следствие, снижению токсических свойств цитокина;

3) в качестве оболочки, окружающей ядро наночастицы и обеспечивающей экспонирование ФНО-α на ее поверхности, предлагается использовать полиглюкин. С одной стороны, известно его применение для депонирования и защиты от деградации терапевтических средств [15], а также стимуляции иммунного ответа [52], а с другой стороны, необходимо было установить возможность создания конъюгата полиглюкин-спермидин- ФНО-α и возможность создания всей наноконструкции с требуемыми фармакологическими свойствами. Неочевидным является и количественное содержание заявляемых компонентов, входящих в состав наночастиц.

Изобретение иллюстрируется следующими чертежами.

Фиг.1. Внешний вид наночастицы, несущей ФНО-α, где:

А - схема конструкции наночастицы;

Б - изображение частицы, полученное методом сканирующей зондовой микроскопии. Образец наночастиц с ФНО-α, 10 мкг/мл. Условия сканирования: кантиливер NSG10, площадь сканирования 2,5×2,5 мкм.

Фиг.2. Электрофореграмма препарата наночастиц с ФНО-α и его компонентов в 1%-ном геле агарозы, где дорожки:

И - исходная двуспиральная РНК (дсРНК);

1 - дсРНК в оболочке из конъюгата «спермидин-полиглюкин»;

2 - дсРНК в оболочке из конъюгата "спермидин-полиглюкин-ФНО-α.

Фиг.3. Влияние препаратов наночастиц с ФНО-α и ФНО-α на рост перевивной опухоли карциномы Эрлиха.

По оси абсцисс - доза препаратов, Е/мышь; по оси ординат - торможение роста опухоли, %, при введении ФИО-α (темные столбики) или наночастиц с ФНО-α (столбики со штриховкой), * - различия с контролем статистически достоверны, р≤0,05.

Фиг.4. Гибель животных с перевивной карциномой Эрлиха после введения препаратов наночастиц с ФНО-α и ФНО-α.

По оси абсцисс - доза препаратов, мг/кг; по оси ординат - гибель животных, %, при введении ФНО-α (темные столбики) или наночастиц с ФНО-α (столбики со штриховкой).

Описание конструкции наночастицы с ФНО-α

Каждая наночастица (фиг.1) содержит ядро 1, состоящее из полинуклеотидного комплекса, представляющего собой двуспиральную РНК (дсРНК) - индуктор интерфероногенеза, покрытое слоем 2 конъюгата спермидин/полиглюкина и прикрепленных к нему молекул 3 рекомбинантного фактора некроза опухолей альфа человека (ФНО-α), удерживаемого за счет ионного взаимодействия между отрицательно заряженным полинуклеотидным комплексом и положительно заряженным спермидином. В качестве двуспиральной РНК противоопухолевое средство содержит двуспиральную РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Наночастицы имеют сферическую форму с размером порядка 50-70 нм, что позволяет избежать захвата их клетками ретикуло-эндотелиальной системы организма. Причем на одну молекулу двуспиральной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae приходится 60-80 молекул рекомбинантного человеческого ФНО-α с цитолитической активностью не ниже 106 МЕ/мг белка, 60-80 молекул полиглюкина и 1000-1300 молекул спермидина.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры получения наночастиц с ФНО-α.

Пример 1. Синтез конъюгата полиглюкин-спермидин-ФНО-α

Для синтеза конъюгата 60 мг (1,2 мкМ) полиглюкина с молекулярной массой 50 000 Да растворяют в 0,5 мл 50 мМ раствора периодата натрия и инкубируют 50 мин при комнатной температуре. Активированный полисахарид отделяют от периодата натрия гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-50 (V=2 мл) в 50 мМ бикарбонатном буфере, pH 8,6 и добавляют раствор 50 мМ бикарбонатного буфера, pH 8,6 (4-6 мл), содержащий 17 мг рекомбинантного ФНО-α. После инкубации в течение 3 ч при 6°C в раствор вносят 0,05 мл раствора, содержащего 2,25 мг (15 мкМ) спермидина, тщательно перемешивают. Еще через 5 ч добавляют 0,1 мл свежеприготовленного 10 мМ раствора периодата натрия. После инкубации в течение часа при 6°C непрореагировавшие компоненты удаляют гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-50 (V=20 мл) в фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,15 М NaCl, pH 7,2. Затем дополнительно образец диализуют против двух смен того же буфера, по 200 мл каждая. Препарат стерилизуют фильтрованием (0,2 мкМ).

При анализе полученного конъюгата на электрофореграмме в 10% полиакриламидном геле наблюдалось «облако» с кажущейся молекулярной массой в районе 120 кДа. При гель-фильтрации на сефадексе G-50 конъюгат элюировался в районе молекулярных масс 40-45 кДа.

Пример 2. Сборка наночастиц с ФНО-α

Для получения наночастиц, содержащих дсРНК и ФНО-α, к раствору дрожжевой дсРНК добавляли раствор конъюгата полиглюкин/спермидин/ФНО-α в соотношении: 1 мг дсРНК - 2 мг (по белковой компоненте) конъюгата. Для формирования частиц раствор инкубировали при 4°C в течение 2 часов. Анализ полученной наночастицы проводили гель-фильтрацией на колонке с сефарозой CL-6B и электрофорезом в 1%-ном геле агарозы.

Количественный состав наночастиц, содержащей фактор некроза опухоли альфа и двуспиральные РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae (в центральной части): на одну молекулу двуспиральной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae приходится 60-80 молекул рекомбинантного человеческого ФНО-α с цитолитической активностью не ниже 106 МЕ/мг белка, 60-80 молекул полиглюкинаи 1000-1300 молекул спермидина.

Пример 3. Характеристика наночастиц с ФНО-α

Теоретическая схема молекулярной конструкции, несущей ФНО-α, представлена на Фиг.1А. Анализ образца, проведенный методом зондовой микроскопии, показал, что конструкция имеет сферическую форму с диаметром около 50-70 нм (Фиг.1Б.).

При анализе препарата гель-фильтрацией на колонке с сефарозой CL-6B показано, что собранная нанобиочастица элюируется ранее исходной РНК, в свободном объеме (свободный объем для сефарозы CL-6B, согласно паспортным характеристикам фирмы изготовителя, от 4 МДа и выше). Анализ наночастицы и ее компонента, дсРНК, покрытой оболочкой из полиглюкина, электрофорезом в 1%-ном геле агарозы показал, что в каждом образце присутствует два вида частиц, соответствующих L- и М-формам дсРНК (Фиг.2). Судя по размеру зон, частицы сохраняют компактную и однородную форму. Их подвижность в электрофорезе снижается, по сравнению с компонентами исходной дсРНК, что свидетельствует об увеличении их массы и объема, т.е. об образовании наноструктур.

После обработки препаратов РНКазой (0,05 мг/мл) методом гель-электрофореза было установлено, что если для исходной двуспиральной РНК полная деградация наблюдается уже через 30 мин инкубации, то в собранной конструкции нуклеотидный материал сохраняется интактным не менее суток. Это свидетельствует о полноте упаковки в оболочку и снижении доступности нуклеотидного материала для деградирующих факторов. Частицы в стерильном препарате сохраняют свою компактную структуру при хранении в условиях бытового холодильника не менее 6 мес.

Пример 4. Изучение противоопухолевой активности наночастиц с ФНО-α

Влияние препарата наночастиц с ФНО-α на развитие опухоли изучают на белых беспородных мышах ICR, самцах, с трансплантированной опухолью карциномы Эрлиха. Клетки опухоли перевивают внутримышечно, в дозе 105 клеток на животное. Препарат наночастиц с ФНО-α вводят внутрибрюшинно, в диапазоне доз от 10² до 10⁴ Е/мышь массой 20 г. В качестве препарата сравнения используют ФНО-α в эквивалентных дозах, контрольным животным вводят физиологический раствор. Инъекции тестируемых препаратов проводят трехкратно, с интервалом в один день, курс инъекций начинают на 7 день после трансплантации опухолевых клеток.

Эффект препаратов на развитие опухоли оценивают по изменению массы опухолевого узла по окончании эксперимента (15 сутки после трансплантации опухоли). Процент торможения роста опухоли на фоне введения препаратов рассчитывают по следующей формуле:

ТРО(%)=(Вк-Во)·100/Вк,

где Вк - средний показатель роста опухоли в контрольной группе;

Во - средний показатель опытной группы.

Данные экспериментов обрабатывают методами вариационной статистики с помощью пакета программ "Statgraphics, Vers. 5.0" (Statistical Graphics Corp., USA). Достоверность обнаруженных различий оценивают по t-критерию Стьюдента.

Результаты исследования противоопухолевой активности препарата наночастиц с ФНО-α, в сравнении с препаратом ФНО-α, представлены на фиг 3. Установлено, что введение ФНО-α ни в одной из использованных доз не оказывало достоверно выраженного ингибирования роста опухоли. Тенденция к снижению средней массы опухоли была отмечена лишь в группе мышей, которым препарат вводили в наибольшей дозе 10⁴ Е/20 г, при этом процент торможения роста опухоли не превышал 20%. Препарат наночастиц с ФНО-α ослаблял рост опухоли уже в дозе 10²Е/20 г (по ФНО-α, на 19%). Трехкратное введение препарата наночастиц с ФНО-α в дозах 10³-10⁴ Е/20 г вызывало статистически значимое ингибирование роста опухоли. Средний вес опухолевого узла в опытной группе животных в конце эксперимента был, соответственно, на 28 и 29% ниже контрольного показателя (различия достоверны, р<0,05) (фиг.3).

Таким образом, на экспериментальной опухолевой модели было показано, что торможение роста опухоли при введении наночастиц с ФНО-α наблюдалось в дозах, в 10-100 раз более низких, чем после инъекций препарата ФНО-α.

Пример 5. Исследование токсических свойств препарата наночастиц с ФНО-α

Уровень токсичности препарата определяют в экспериментах на белых беспородных мышах ICR, самцах, с перевивной опухолью Эрлиха, в сравнении с ФНО-α. Клетки опухоли перевивают внутримышечно, в дозе 5·10⁵ клеток на животное. Препараты наночастиц с ФНО-α и ФНО-α растворяют в 0,9% растворе хлористого натрия и вводят внутрибрюшинно однократно, в диапазоне доз от 50 до 750 мг/кг в объеме 0,2 мл на 20 г массы тела животных. Подсчет павших животных и появление клинических признаков отравления проводят в течение суток после введения препаратов.

Данные, полученные в ходе исследования, приведены на Фиг.4. Видно, что доза 750 мг/кг как для препарата наночастиц с ФНО-α, так и ФНО-α была абсолютно летальной и приводила к 100% гибели животных в течение 4 часов после введения. Максимально переносимая доза для наночастиц с ФНО-α составила 150 мг/кг, для ФНО-α - 100 мг/кг веса тела. Таким образом, результаты токсикологических экспериментов свидетельствуют о том, что препарат наночастиц с ФНО-α отличается более низким уровнем токсичности, по сравнению с препаратом ФНО-α.

Литература

1. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А. Эндогенные иммуномодуляторы. Санкт-Петербург, 1992, «Гиппократ».

2. Carswell Е.А., Old L.J., Kassel R.L. et al.. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1975. - Vol.72. - P.3666-3670.

3. Nobuhara M., Kanamori Т., Ashida Y. et al. // Jpn. J. Cancer Res. - 1987. - Vol.78, No2. - P.193-201.

4. Debs R.J., Fuchs H.J., Philip R., et al. // Cancer Res. - 1990. - Vol.50, No2. - P.375-380.

5. van Horssen R., ten Hagen T.L., Eggermont A.M.M. TNF-α in cancer treatment: molecular sights, antitumor effects, and clinical utility // The Oncologist - 2006. - Vol.11,. No.4. - P.397-408.

6. Eggermont A.M., ten Hagen T.L.. // Curr. Oncol. Rep. - 2001. - Vol.3, No4. - P.359-367.

7. Патент РФ 2144958, МПК C12N 15/28, опубл. 27.01.2000.

8. Патент РФ 2158303, МПК С12N 1/21, опубл. 27.10.2000.

9. Абрамов М.Е., Гуторов С.Л., Масычева В.И. и др. // Биотехнология и онкология: Тез. докладов, 2005. - С.40-43.

10. Asher A., Mule J.J., Reichert СМ. et al. // J. Immunol. http://-1987.-Vol.138, http://No3.-P.963-974.

11. Lienard D., Ewalenko P., Delmotte J.J. et al. // J. Clin. Oncol. - 1992. - Vol.10, No1. - P.52-60.

12. Pfreundschuh M.G., Steinmetz H.T., Tuschen R. et al. // Eur. J. Cancer Clin. Oncol. - , No2. - P.379-388.

13. Патент РФ №2058390, МПК С12N 15/28, 1996 г.

14. Международная заявка (WO) №91/01998, МПК С07К 13/00, 1991 г.

15. Tsutsumi Y., Kihira Т., Tsunoda S. et al. // British J.Cancer. - 1995. - Vol.71. - P.963-968.

16. Kamada H. et al. // Cancer Res. - 1998. - Vol.58. - P.290-295.

17. Kamada H. et al. // http://BBRC.-1999.-Vol.257, No.2. - P.448-453.

18. Kamada H. et al. // Cancer Res. - 2000. - Vol.60. P.6416-6420.

19. Li Y.-P. et.al. // Acta Pharmacol. Sin. - 2001. - Vol.22, No.6. - P.549-555.

20. Li Y.-P. et.al. // Biol.Pharm. Bull. - 2001. - Vol.24, No.6. - P.666-670.

21. Cooke S.P. et al. // Bioconjugate http://Chemistry.-2002.-Vol. 13, No.1. - P.7-15.

22. Curnis F. et al. // Cancer Res. - 2000. - Vol.18. - P.1185-1190.

23. Jiang Y.Y. et al. // Bioconjugate http://Chemistry.-2007.-Vol.18, No.1. - P.41-91.

24. Kirsch M., Fisher H., Schackert G. // J.Neurooncol. - 1994. - Vol.20. - P.35-45.

25. Заявка Венгрии (HU) №1737891, кл.4 A61К 37/00, 1986 г.

26. Заявка ЕПВ (ЕР) №325471, МПК А61К 37/36, 1989 г.

27. Международная заявка (WO) №91/01753, МПК А61К 39/395, 1991 г.

28. Патент США (US) №4857314, МПК А61К 37/02, 1989 г.

29. Заявка ЕПВ (ЕР) №269017, МПК А61К45/06, 1988 г.

30. Международная заявка (WO) №8802632, МПК А61К 37/02, 1988 г.

31. Imoto Н., Sakamura Y., Ohkouchi К et al. // Cancer Res. - 1992 - vol.52. - P.4396-4401.

32. Visaria R.K. et al. // Mol.Cancer http://Ther.-2006.-Vol.5, No.4. - P. 1014-1020.

33. Paciotti G.F. et al. // Drug Deliv. - 2004. - Vol.11, No.3. - P. 169-183.

34.Bryde S. et al. // Bioconjugate Chemistry. - 2005. - Vol.l6, No.6. - P. 1459-1467.

35. Pan Y., Neuss S., Leifert A. et al. // Small. - 2007. - Vol.3, No 11. - P.1941-1949.

36. Utsumi Т., Mien-Chie Hung M-C, Klostergaard J. // Cancer Res. - 1991. - Vol.51. - P.3362-3366.

37. Weber F., Kremer C, Klinkhammer M. et al. // J. Neurooncol. http://-1994.-Vol.18, No3. - P.217-224.

38. Lodato R.F., Feig В., Akimaru K. et al. // J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. - 1995. - Vol.17, No1. - P.19-29.

39. Kedar E., Palgi O., Golod G., et al. // J. Immunother. http://-1997.-Vol.20, No3. - P.180-193.

40. Yasui K, Nakamura Y. // Biol Pharm Bull. - 2000. - Vol.23, No4. - P.461-465.

41. Безруков Д.А., Баландин Т.Г., Деев СМ. и др. // Вестник МИТХТ. - 2006. - т.1. - с.14-18.

42. Ten Hagen T.L., Seynhaeve A.L., van Tiel S.T. et al. // Int. J. Cancer. http://-2002.-Vol.97, Nol. - P.115-120.

43. Van der Veen A.H., Eggermont A.M., Seynhaeve A.L. et al // Int. J. Cancer. - 1998. - Vol.77, No6. - P.901-906.

44. Sawa M., Duda E., Huang http://~L.IIInt. J. Pharm. http://-1999.-Vol.184, No1. - P.45-51.

45. Yuyama Y., Tsujimoto M., Fujimoto Y. et al. // Cancer Lett. - 2000. - Vol.155,No1. - P.71-7.

46. Каплун А.П., Ле Банг Шон, Краснопольский Ю.М. и др. // Вопросы мед. химии - 1999. - Т.45, №1. -С.

47. Патент СССР №1836103, МПК А61К 37/66, опубл. 23.08.1993.

48.ПатентРФ №2242245, МПК А61К 31/713, опубл. 20.12.2004.

49. Патент РФ №2217162, МПК А61К 39/00, опубл. 20.05.2002.

50. Патент РФ №2190018, МПК C12N 15/87, 27.09.2002.

51. Масычева В.И., Даниленко Е.Д., Пустошилова Н.М., Белявская В.А. // Вестн. РАМН. - 1998. - №4. - С.13-17.

52. Закенфельд Г.К. Иммунологический механизм действия полисахаридов дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae. Рига: 1990; 152

53. Li Y.P., Pei Y.Y., Zhou Z.H. et al. // J. Control Release.- 2001. - Vol.71, No.3. - P.287-296 (прототип).

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и касается противоопухолевого средства на основе наночастиц, несущих рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа человека. Сущность изобретения включает противоопухолевое средство, представляющее наночастицы, каждая из которых содержит ядро, состоящее из полинуклеотидного комплекса, представляющего собой двуспиральную РНК (дсРНК) - индуктор интерфероногенеза, и покрытое слоем конъюгата спермидина с полиглюкином, удерживаемого за счет ионного взаимодействия между отрицательно заряженным полинуклеотидным комплексом и положительно заряженным спермидином, а рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа человека ковалентно связан с активированным полиглюкином. В качестве двуспиральной РНК противоопухолевое средство содержит двуспиральную РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Наночастицы имеют сферическую форму с размером порядка 50-70 нм, на одну молекулу двуспиральной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae приходится 60-80 молекул рекомбинантного человеческого ФНО-α, с цитолитической активностью не ниже 10⁶ МЕ/мг белка, 60-80 молекул полиглюкина и 1000-1300 молекул спермидина. Преимущество изобретения заключается в снижении дозы ФНО-α и снижении токсичности. 4 з.п. ф-лы, 4 ил.

1. Противоопухолевое средство на основе наночастиц, несущих рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа человека, отличающееся тем, что каждая наночастица имеет размер порядка 50-70 нм и содержит ядро, состоящее из полинуклеотидного комплекса, представляющего собой двуспиральную РНК - индуктор интерфероногенеза, и покрытое слоем конъюгата спермидина с полиглюкином, удерживаемого за счет ионного взаимодействия между отрицательно заряженным полинуклеотидным комплексом и положительно заряженным спермидином, а рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа человека ковалентно связан с активированным полиглюкином.

2. Противоопухолевое средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве двуспиральной РНК оно содержит двуспиральную РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

3. Противоопухолевое средство по п.1, отличающееся тем, что полиглюкин активирован периодатом натрия.

4. Противоопухолевое средство по п.1, отличающееся тем, что наночастицы имеют сферическую форму.

5. Противоопухолевое средство по п.1, отличающееся тем, что на одну молекулу двуспиральной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae приходится 60-80 молекул рекомбинантного человеческого ФНО-α с цитолитической активностью не ниже 10⁶ МЕ/мг белка, 60-80 молекул полиглюкина и 1000-1300 молекул спермидина.