Конъюгат, содержащий фолиевую кислоту и индол-3-карбинол, для медицинского применения Российский патент 2019 года по МПК A61P35/00 A61P29/00 A61P9/00 C07D207/46 C07D209/12 

Настоящее изобретение относится к конъюгату индол-3-карбинола для медицинского применения, и, в частности, для профилактики и лечения неопластических заболеваний, воспалительных заболеваний, сердечнососудистых заболеваний и других заболеваний, в частности заболеваний, которые могут быть отнесены к метаболическому синдрому.

Предпосылки создания изобретения

Противоопухолевые лекарственные средства, используемые в настоящее время в терапии, представляют собой гетерогенную группу соединений, ингибирующих рост неоплазмы, имеющих очень разную структуру и механизм действия. Тем не менее, общий элемент можно найти в высокой цитотоксичности, особенно на тканях, характеризующихся высокой пролиферацией клеток. Ограниченный успех фармакотерапии, в которой используются традиционные соединения, также является следствием плохой селективности по отношению к раковым клеткам, что значительно снижает терапевтическое действие и создает нежелательное побочное действие на другие ткани. Еще одной проблемой является ограниченный период полураспада соединений из-за быстрого выведения почек и быстрой инактивации и ферментативной деструкции.

Следовательно, существует необходимость разработки новых лекарственных средств, обладающих противоопухолевой активностью, которые более селективны, менее токсичны и которые характеризуются улучшенными фармакологическими свойствами.

Индол-3-карбинол

Индол-3-карбинол (сокращенно I3C) является природным веществом, содержащимся в овощах семейства крестоцветных, особенно в брокколи, белокочанной капусте, брюссельской капусте и цветной капусте. В 1997 году была продемонстрирована его способность останавливать развитие рака молочной железы за счет положительного действия на метаболизм эстрогенов и остановки, как например тамоксифен, клеточного цикла.

Кроме того, индол-3-карбинол способен регулировать зависимость многих видов рака от гормонов, так как он связывается с ядерным эстрогенным рецептором, предотвращая пролиферацию клеток, индуцированную последними.

В ряде исследований in vitro и in vivo оказалось возможным показать, что это соединение ингибирует до 90% развитие опухолевых клеток, положительных по отношению к эстрогенному рецептору. Кроме того, в карциномах молочной железы, отрицательных по отношению к эстрогенному рецептору, введение индол-3-карбинола ингибирует рост клеток. Однако в этом типе опухолей тамоксифен не действует. В других исследованиях индол-3-карбинол показал способность подавлять рост различных опухолевых клеток, в том числе опухолевых клеток толстой кишки путем остановки клеточного цикла в G1/S и индуцирования апоптоза in vitro.

I3C действует как антагонист рецептора андрогена, он способен ингибировать пролиферацию опухолевых клеток в случаях рака простаты. Кроме того, он является мощным индуктором цитохрома Р450 и вмешивается в метаболизм эстрогенов. Он, оказывается, также вмешивается в патогенез рецидивирующего респираторного папилломатоза.

Были проведены клинические исследования с использованием чистого I3C в качестве пищевой добавки с хорошими результатами для этого заболевания.

В других исследованиях была определена противовоспалительная активность I3C in vivo и in vitro. Было показано, что индол-3-карбинол ингибирует экспрессию и активность индуцибельной синтетазы окиси азота (iNos) в клетках, стимулированных с помощью LPS, путем оценки продуцирования нитритов и ингибирования высвобождения NO. Фактически, постоянное продуцирование окиси азота связано с воспалительным процессом, и, следовательно, с процессом канцерогенеза.

I3C уменьшает продуцирование других провоспалительных медиаторов, таких как IL-6 и IL-β, показывая, что он может обеспечить терапевтическую стратегию, которая пригодна в лечении некоторых воспалительных заболеваний.

Результатом лечения с помощью I3C была потеря веса тела и уменьшение накопления жира и макрофагов, пропитавших жировую ткань эпидидимиса страдающих ожирением мышей, которых держали на богатом жирами рационе. Эти уменьшения были связаны с лучшей толерантностью к глюкозе.

Кроме того, антиагрегационное действие I3C в отношении тромбоцитов было проверено путем оценки ингибирования агрегации, вызванной АДФ, коллагеном, адреналином, арахидоновой кислотой, на образцах крови человека. Было показано, что I3C ингибирует дозозависимым образом коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов. In vivo I3C подавляет гибель крыс с легочным тромбозом, индуцированным внутривенной инъекцией коллагена и адреналина.

Носитель

Поли(этиленгликоль) (PEG) представляет собой линейный синтетический полимер, имеющий низкую полидисперсность, состоящий из повторов оксиэтиленовых единиц.

Благодаря своей биосовместимости и нетоксичности он находит широкое применение в области пищевых продуктов, в косметической и фармацевтической областях.

Рецептор фолиевой кислоты

Рецептор витаминной фолиевой кислоты (FR), иначе известный как мембранный белок, обладающий высокой аффинностью к фолату, представляет собой гликопротеин с молекулярной массой примерно 38 кДа. Были идентифицированы три изоформы у человека, получившие название α, β, γ/γ'. В то время как высокая экспрессия FR часто отмечается в различных типах рака человека, рецептор, как правило, отсутствует в большинстве нормальных тканей, за исключением сосудистого сплетения, плаценты и, в меньшей степени, в легких, щитовидной железе и почках. FR часто сверхэкспрессируется в опухолевых клетках в культуре и в эпителиальных опухолях, в частности, в карциноме яичников (в 90% случаев), для которых он также является подходящим маркером. Другие типы опухоли сверхэкспрессируют этот рецептор, в частности рак эндометрия, головного мозга, легких, молочной железы и почек. Изоформа FR-α сверхэкспрессируется в злокачественных эпителиальных опухолях, в то время как изоформа FR-β в саркомах и миелоидных лейкозах, таким образом, обеспечивая нацеливание на большое количество неоплазм. Кроме того, FR-β сверхэкспрессируется в моноцитах и активированных макрофагах, что делает нацеливание очень полезным и при воспалительных процессах.

Кроме того, следует отметить, что рецептор физиологически присутствует только в апикальной мембране эпителиальных клеток, следовательно, он недоступен для кровотока, клетка защищена действием лекарственных средств, дериватизированных фолиевой кислотой. После злокачественного преобразования полярность клеток теряется и рецептор становится доступным для кровотока.

Краткое изложение сущности изобретения

Недостатки известных противоопухолевых лекарственных средств и некоторые ограничения применения индол-3-карбинола, в частности, низкая молекулярная масса, нестабильность в воде и в кислой среде желудка, преодолеваются с помощью фармацевтических соединений в соответствии с настоящим изобретением, которые оказались особенно эффективными в профилактике и лечении рака, воспалительных и сердечнососудистых заболеваний и других заболеваний.

Цель изобретения

Первой целью настоящего изобретения, следовательно, являются новые фармацевтические соединения, представленные конъюгатами индол-3-карбинола.

В соответствии с еще одним аспектом такие соединения применяются для лечения и профилактики рака у человека и животных.

В предпочтительном аспекте конъюгаты в соответствии с изобретением применяются для лечения и профилактики карциномы, саркомы, лимфом, меланом, мезотелиом, лейкозов, миелом и других опухолевых заболеваний неопластических заболеваний.

В частности, конъюгаты в соответствии с изобретением применяются для лечения и профилактики рака молочной железы, толстой кишки, простаты, легких, носа, горла, мозга и яичника.

В другом аспекте конъюгаты в соответствии с изобретением находят применение при лечении воспалительных заболеваний за счет супрессии, оказываемой на активность активированных макрофагов.

В другом аспекте конъюгаты в соответствии с изобретением могут найти применение, за счет стабилизации I3C, в области как первичной, так и вторичной профилактики сердечнососудистых заболеваний.

В другом аспекте конъюгаты в соответствии с изобретением находят применение в качестве антиоксидантов, которые способны предупреждать ряд заболеваний, ассоциированных с окислительным стрессом.

В качестве цели настоящего изобретения представлен способ получения конъюгатов индол-3-карбинола или его производных.

Кроме того, представлена фармацевтическая или нутрицевтическая композиция, содержащая один или несколько конъюгатов по изобретению.

Подробное описание изобретения

В соответствии с первой целью настоящего изобретения описаны конъюгаты индол-3-карбинола или его производной с общей формулой:

где:

В представляет собой целенаправленное вещество, выбранное из витаминов, пептидов, опухоль-специфических пептидов, опухолевые клетки-специфических аптамеров, опухолевые клетки-специфических углеводов, моноклональных или поликлональных антител, фрагментов антител, белков, экспрессированных на метастатических опухолевых клетках, малых органических молекул, полученных из комбинаторных библиотек. В предпочтительном аспекте настоящего изобретения В представлен фолиевой кислотой (F);

х может быть равно 0 или 1, или 2, и предпочтительно 0 или 1;

S предпочтительно представлен лизином (Lys), который может иметь функцию спейсера, когда L представляет собой гомобифункциональный носитель, или S представляет собой бифункциональный носитель, содержащий две поддающиеся активированию или дериватизации функциональные группы, как например L-2-аминоадипиновая кислота (AD);

y равно 0 или 1, когда L представляет собой гомобифункциональный носитель, или 2;

L представляет собой носитель. В предпочтительном аспекте L представляет собой дериватизированную форму полиэтиленгликоля (здесь далее сокращенно PEG или (PEG)_n), или его производное, как например, монометокси полиэтиленгликоль (mPEG). L может быть гомобифункциональным (например, HOOC-(PEG)_n-COOH) или гетеробифункциональным (например, H₂N-(PEG)_n~СООН) в зависимости от того, несет он или нет на своем конце такую же реакционноспособную группу (карбоксильную, защищенную сложным эфиром или нет или амином), необязательно надлежащим образом активированную. Носитель может иметь разную степень полимеризации и предпочтительно характеризуется молекулярной массой в диапазоне 100-200000 (г/моль). Предпочтительными примерами PEG являются PEG_20,000, PEG_4.800, PEG₆₀₀ и PEG₅₅₀.

S' представляет собой монофункциональный или бифункциональный спейсер, содержащий одну или две поддающиеся активированию или дериватизации функциональные группы (например, две карбоксильные функциональные группы), соответственно; он предпочтительно является бифункциональным носителем, выбранным из L-2-аминоадипиновой кислоты (AD) и β-глутаминовой кислоты (β-Glu);

z представляет собой число спейсеров, связанных с носителем, и равен 0 (в том случае, когда D непосредственно связан с носителем) или 1 или 2;

D представляет собой активный ингредиент, выбранный из индол-3-карбинола (I3C) или его производного. В частности, предпочтительные производные включают N-ацильные производные, содержащие линейную или разветвленную карбонильную цепь С1-С6, и предпочтительно представлены N-ацетильными производными; N-алкокси производные, содержащие линейную или разветвленную С1-С6 карбонильную цепь, и предпочтительно представленные как: N-метокси, N-этокси, N-пропокси, N-бутокси; N-арильные или N-гетероарильные производные, содержащие один или несколько гетероатомов, выбранных из азота, кислорода и серы, или N-бензильные, N-алкильные, содержащие линейную или разветвленную С1-С6 карбонильную цепь, необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, выбранных из азота, кислорода и серы, N-алкенильные, или N-алкинильные производные, содержащие линейную или разветвленную С2-С6 карбонильную цепь, содержащую одну или несколько ненасыщенных связей и, необязательно, дополнительно содержащую один или несколько гетероатомов, выбранных из азота, кислорода и серы;

n представляет собой число молекул D и равно 1 или 2 или 3 или 4.

В соответствии с предпочтительным аспектом конъюгат по настоящему изобретению представляет собой соединение, имеющее формулу:

отличающееся тем, что F представляет собой фолиевую кислоту; Lys представляет собой лизин; PEG, как определено выше, поэтому он представляет собой полиэтиленгликоль или его производное, как например, монометокси полиэтиленгликоль (mPEG), или он является гомобифункциональным (например, HOOC-(PEG)_n-COOH) или гетеробифункциональным (например, H₂N-(PEG)_n-COOH) PEG; отличающееся тем, что AD представляет собой L-2-аминоадипиновую кислоту, а β-Glu представляет собой β-глютаминовую кислоту, и отличающееся тем, что I3C представляет собой индол-3-карбинол (I3C) или его производное, как описано выше.

В соответствии со второй целью настоящего изобретения представлен способ получения конъюгатов по изобретению.

Получение таких конъюгатов включает первый этап I) активации носителя, в свою очередь, включающий следующие этапы:

Ia) введение в носитель подходящей, поддающейся активированию реакционноспособной группы (gr):

Ib) активацию носителя путем активации реакционноспособной группы:

На втором этапе II) выполняется активация лиганда В:

На третьем этапе III) получения конъюгатов в соответствии с изобретением активированный лиганд конъюгируется с носителем:

На последнем этапе IV) происходит конъюгация с активным ингредиентом:

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения активация носителя (этап Ia) сначала включает его обработку с подходящим основанием, таким как калий трет-бутилат, в подходящем растворителе с последующей обработкой трет-бутилбромацетатом с обеспечением вставки реакционноспособной группы, которая может быть активирована, например, -CH₂COOH, на носителе.

Этап Ia) не может быть осуществлен, если используется носитель, который уже содержит подходящую поддающуюся активированию реакционноспособную группу; также, или только, этап Ib) может быть исключен, исходя из носителя, содержащего подходящую активированную реакционноспособную группу.

На этапе Ib) карбоксильная группа дериватизируется, например, путем обработки N-гидроксисукцинимидом (NHS) в присутствии N,N'-дициклогексилкарбодиимида (DCC).

Этапы Ia) и Ib) могут повторяться в случае, если необходима вставка большего числа реакционноспособных групп.

Вместо этого, в отношении активации лиганда (этап II), это достигается, например, путем этерификации N-гидроксисукцинимидом (NHS) в присутствии N,N'-дициклогексилкарбодиимида (DCC).

В предпочтительном аспекте изобретения этап III) конъюгирования лиганда с носителем достигается путем формирования амидной связи между сукцинимидным эфиром лиганда и аминной группой носителя (например, носителем может быть гетерофункциональный PEG).

Описанные выше этапы II) и III) не могут быть выполнены в случае, если соединение по изобретению не содержит целенаправленно группу, как например, когда y и x - 0.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения на этапе III) используется молярное соотношение носитель: лиганд 1:4.

Этап IV) получения конъюгата по изобретению включает следующее формирование связи, например, сложноэфирной связи, между активированной реакционноспособной группой носителя и реакционноспособной группой активного ингредиента (например, -ОН группа индол-3-карбинола).

Такой этап может повторяться в зависимости от числа реакционноспособных групп, которые вставлены и активированы.

В соответствии с предпочтительным аспектом изобретения, на этапе IV) используется мольное соотношение носитель: активный ингредиент в диапазоне от примерно 1:1 до 1:5, и предпочтительно примерно 1:3.

В случае если связь между носителем и активным ингредиентом осуществляется с помощью спейсера S', в способе получения конъюгатов в соответствии с изобретением предусматривается использование гетеробифункционального носителя (несущего две реакционноспособные группы: gr и gr', которые отличаются друг от друга), и способ включает следующие этапы:

Ia') защиты одной из реакционноспособных групп носителя:

с последующим этапом Ib') активации свободной реакционноспособной группы (gr'):

Далее выполняется этап Ic') конъюгации со спейсером S':

и этап Id') снятия защиты с защищенной реакционноспособной группы носителя:

На следующем этапе Ie') происходит конъюгация с лигандом с помощью имеющейся gr:

Далее выполняется этап If') активации реакционноспособной группы спейсера:

а затем этап Ig') конъюгации с активным ингредиентом:

Описанный выше способ может быть адаптирован и модифицирован в соответствии с потребностями согласно методикам, известным специалистам в данной области техники.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения гетеробифункциональный носитель представлен H₂N-(PEG)_n-COOH, который может быть соответствующим образом блокирован на аминном конце трет-бутилоксикарбонилом (Boc). Что касается другой реакционноспособной группы (карбоксильной), она может быть предпочтительно активирована N-гидроксисукцинимидом.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения используемые спейсеры S' выбирают из (L)-2-аминоадипиновой кислоты и β-глутаминовой кислоты.

Что касается снятия защиты с носителя, то это достигается в случае защитной группы Boc предпочтительно с помощью трифторуксусной кислоты.

Активация карбоксильной группы спейсеров S' достигается посредством реакции с N-гидроксисукцинимидом в присутствии DCC.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения в случае, когда связь между активным ингредиентом и носителем достигается с помощью спейсера S', используется мольное соотношение носитель: активный ингредиент в диапазоне примерно от 1:1 до 1:5 и предпочтительно примерно 1:3.

В случае, когда спейсер представляет собой бифункциональный носитель, например, L-2-аминоадипиновую кислоту (AD), и, следовательно, x=2, больше единиц лиганда В будут конъюгироваться с носителем.

Такая конъюгация может происходить с подходящей дериватизацией и/или активацией реакционноспособных групп спейсера S и/или лиганда В и/или носителя, согласно способам, известным специалистам в данной области техники.

Как описано выше, конъюгаты в соответствии с изобретением находят применение в качестве лекарственного средства.

В частности, они могут применяться для лечения и профилактики рака.

Под термином «лечение» подразумевается возможность вводить фармакологически эффективное количество пациенту, имеющему рак, с целью обеспечения восстановления или улучшения состояния пациента.

С другой стороны, также можно использовать конъюгаты по изобретению для «профилактики» заболевания, чтобы предотвратить развитие опухоли у пациента, особенно если присутствуют наследственные, генетические или экологические факторы.

В рамках настоящего изобретения под «первичной профилактикой» подразумевается профилактическое лечение здорового субъекта, в то время как под «вторичной профилактикой» подразумевается лечение субъекта, который болен или был болен, чтобы не допустить нового рецидива заболевания.

Опухолевые формы, по отношению к которым соединения в соответствии с настоящем изобретению эффективны, предпочтительно включают рак молочной железы, толстой кишки, предстательной железы, яичника, эндометрия, головного мозга, легких, почек, носа, горла, злокачественные эпителиальные опухоли, саркомы, лимфомы, такие как лимфома Беркитта, болезнь Ходжкина, мезотелиомы, меланомы, лейкозы и миеломы.

В другом аспекте изобретения описанные соединения обладают противовоспалительной активностью, поэтому их можно применять для лечения и профилактики заболеваний, характеризующихся или вызванных воспалением, как например, ревматоидный артрит, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, псориаз, остеомиелит, множественный склероз, атеросклероз, фиброз легких, саркоидоз, системный склероз, отторжение трансплантата и хронические воспалительные процессы.

В дополнительном аспекте, соединения в соответствии с изобретением показали, что они обладают значительными антиоксидантными свойствами, следовательно, они способны уменьшить продуцирование свободных радикалов. Такое свойство особенно полезно для таких субъектов, как пожилые люди, курильщики, пациенты с текущими заболеваниями или в период восстановления от болезней, у которых генерация химических радикалов значительно возрастает. Таким образом, конъюгаты в соответствии с изобретением могут успешно применяться для лечения, излечения и профилактики хронических заболеваний, таких как ишемическая болезнь или воспалительное тромбозное заболевание.

В другом аспекте представленные конъюгаты обладают значительной антиагрегационной активностью в отношении тромбоцитов.

В еще одном аспекте конъюгаты в соответствии с изобретением могут применяться для лечения, профилактики и лечения метаболического синдрома, ожирения, сахарного диабета, для уменьшения веса тела и накопления жира и макрофагов, пропитавших жировую ткань, за счет более высокой, индуцированной толерантности к глюкозе.

В соответствии с другим аспектом конъюгаты по изобретению могут применяться для лечения и первичной и вторичной профилактики (в определенном выше понимании) сердечнососудистых заболеваний.

В отношении еще одной цели, соединения, описанные в настоящей заявке на патент, применяются в качестве пищевых добавок.

Что касается целей настоящей заявки на патент, применение описанных соединений предназначено как для человека, так и в ветеринарии, и предпочтительно для человека.

Одно или несколько конъюгированных соединений в соответствии с изобретением в подходящей эффективной дозе могут быть приготовлены в виде подходящих фармацевтических препаратов и, предпочтительно, такие соединения составляются для перорального или парентерального введения.

Указанные фармацевтические препараты могут, в конкретном аспекте настоящего изобретения, также включать один или несколько фармацевтически активных ингредиентов.

Кроме того, капсулы, таблетки, пастилки, пилюли и другие аналогичные фармакологические препараты могут быть приготовлены как для быстрого, так и для замедленного высвобождения благодаря использованию подходящих эксципиентов.

Вместо этого, для парентерального введения это означает, что соединения в соответствии с настоящим изобретением могут вводиться внутрикожным, подкожным, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутривенным или интратекальным путем.

Для этой цели, например, может быть приготовлен подходящий водный раствор для инъекций, как например, 5% изотонический раствор глюкозы; в качестве альтернативы могут использоваться другие фармацевтически приемлемые жидкие носители.

В конкретном аспекте может быть получен лиофилизированный продукт, который можно восстанавливать, используя соответствующий носитель.

Один или несколько конъюгатов в соответствии с изобретением можно, кроме того, составлять надлежащим образом с получением продукта для применения в качестве пищевых и нутрицевтических добавок для одной или нескольких вышеуказанных профилактических или терапевтических целей благодаря способности высвобождать I3C и фолиевую кислоту, соединения, полезные для защиты здоровья человека и животных.

ПРИМЕР 1

1а - функционализация mPEG-OH

Реакция дериватизации проводилась, начиная с монометокси-поли(этиленгликоль) линейного mPEG-OH с молекулярной массой 5 и 20 кДа. В реакции с использованием mPEG_20,000-OH, 2,5 г (0,125 ммоль, РМ 20 Да) полимера сушат путем дистилляции воды в присутствии примерно 40 мл толуола, в дистиллят добавляют до выпаривания примерно 30-32 мл растворителя. При непрерывном перемешивании добавляют 250 μл (0,25 ммоль) 1 М раствора калий трет-бутилата в трет-бутаноле. Проводят дефлегмацию в течение 1 часа при 50°С и добавляют 37 ил (0,25 ммоль, РМ 195,06 Да, d=1,321 г/мл) трет-бутилбромацетата. Реакция протекает в течение 1 часа при 50°С при дефлегмации и 18 часов при комнатной температуре; фильтруют через тигель Гуча с пористостью 4 с целитом®, чтобы удалить образовавшийся KBr, добавив сначала в реакционную колбу несколько мл CH₂Cl₂ для содействия фильтрации. Уменьшение до небольшого объема выполняется с помощью роторного испарителя, при перемешивании добавляют 15 мл смеси TFA (45,4%), CH₂Cl₂ (54,5%) и воды (0,1%) и реакция протекает в течение 3 часов. TFA удаляют с помощью роторного испарителя, отбирая остаток с помощью CH₂Cl₂ 6-7 раз, до полного исчезновения TFA, и осаждают по каплям в примерно 250 мл этанола; получают осадок, состоящий из mPEG-COOH, который оставляют отдыхать при -20°С в течение 4-5 часов. Затем фильтруют через тигель Гуча с пористостью 3 и помещают в сушилку. Такая же процедура выполняется для mPEG₅₀₀₀-OH.

1b - дериватизация mPEG_20.000-COOH

Дериватизация активного сложного эфира достигается путем реакции с N-гидроксисукцинимидом (NHS) в присутствии N,N'-дициклогексилкарбодиимида (DCC). 800 мг (0,04 ммоль, РМ 20058 Да) mPEG_20,000-COOH растворяют в 5-6 мл сухого CH₂Cl₂ при перемешивании и добавляют 9,21 мг (0,08 ммоль, РМ 115,09 Да) N-гидроксисукцинимида (NHS). После растворения добавляют 16,51 мг (0,08 ммоль, РМ 206,33 Да), Ν,N'-дициклогексилкарбодиимида (DCC) и реакция протекает в течение 18 часов. Фильтруют через тигель Гуча с пористостью 4, чтобы удалить образовавшуюся диклогексилмочевину, и раствор добавляют по каплям к примерно 250 мл диэтилового эфира и ставят осаждаться при -20°С в течение 4-5 часов. Образовавшийся осадок mPEG-NHS фильтруют через тигель Гуча и помещают в сушилку. Полимеры mPEG₅₀₀₀-COOH и mPEG₂₂₀₀₀₀-COOH активируют до сукцинимидного эфира с помощью такого же способа.

1с - синтез и очистка конъюгатов mPEG-I3C.

Конъюгаты mPEG-I3C с различной молекулярной массой и различной структурой получают за счет эфирной связи между активированной карбоксильной группой mPEG и гидроксильной группой I3C.

Полученные продукты изучают с помощью УФ-вид (UV-Vis) спектрофотометрии, 1H-ЯМР-спектроскопии в ДМСО-d6, высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (ОФ-ВЭЖХ).

Id - синтез конъюгатов фолат-PEG-COOH

Производное фолат-NHS получают путем этерификации карбоксильной группы в γ фолиевой кислоты с N-гидроксисукцинимидом (NHS) в безводном диметилсульфоксиде в присутствии Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимида (DCC) и триэтиламина.

К 500 мг (1,133 ммоль, РМ 441,40 Да) фолиевой кислоты, растворенных в 10 мл сухого ДМСО, добавляют 240 μл (1,699 ммоль, РМ 101,19 Да, d=0,726 г/мл) триэтиламина, затем 260,79 мг (2,266 ммоль РМ 115,09 Да) NHS и 467,54 мг (2,266 ммоль, РМ 206,33 Да) DCC, реакцию выполняют при перемешивании вдали от света в течение ночи. Фильтруют через тигель Гуча с пористостью 4, чтобы удалить образовавшуюся диклогексилмочевину, и раствор по каплям добавляют к 200 мл простого этилового эфира и ставят осаждаться при -20°С в течение 4 часов. Осадок фолат-NHS фильтруют через тигель Гуча с пористостью 3, несколько раз промывают этиловым эфиром, чтобы удалить остаточный ДМСО, и помещают в сушилку. Продукт фолат-PEG-COOH получают за счет образования амидной связи между карбоксильной группой в γ фолиевой кислоты, активированной до сукцинимидного эфира, и аминной группы гетеробифункционального PEG. 359,7 мг (0,668 ммоль, РМ 538,47 Da) фолат-NHS растворяют в 6 мл сухого ДМСО, добавляют по каплям к 800 мг (0,167 ммоль, РМ 4800 Да) NH₂-PEG-COOH, предварительно растворенного в 6 мл сухого ДМСО. Значение рН реакционного раствора доводят до 9, и реакцию выполняют в течение ночи при комнатной температуре и при перемешивании. К реакционной смеси добавляют 5 мл воды, значение рН доводят до примерно 7,5, а затем добавляют 5 мл DMF и 2-3 мл насыщенного раствора NaCl, для облегчения разделения фаз; продукт фолат-PEG-COOH очищают от избытка фолиевой кислоты путем извлечения из водной фазы с помощью СНСЬ (8×80 мл). Собранную органическую фазу сушат с Na₂SO₄, фильтруют через тигель Гуча для удаления соли и по каплям добавляют к 200 мл этилового эфира при перемешивании. Через 4 часа при -20°С осадок фолат-PEG-COOH собирают фильтрацией через тигель Гуча с пористостью 4 и помещают в сушилку.

1e - синтез и очистка фолат-PEG-I3C

Конъюгат фолат-PEG-I3C получают путем формирования эфирной связи между активированной карбоксильной группой PEG и гидроксильной группой I3C, как изложено выше.

ПРИМЕР 2

Синтез конъюгатов фолат-PEG₄₈₀₀-(I3C)₂

2а - синтез и очистка NH₂-PEG-AD-(СООН)₂

и NH₂-PEG βGlU-(СООН)₂

Для реакции конъюгации L-2-аминоадипиновой (AD) или β-глутаминовой (β-Glu) кислоты используют гетеробифункциональный PEG, Boc-PEG₄₈₀₀-NHS, имеющий защищенную аминогруппу на одном конце и активированную карбоксильную группу на другом конце. Конъюгация происходит за счет формирования амидной связи между активированной карбоксильной группой PEG и аминной группой аминокислоты.

100,56 мг (0,624 ммоль, РМ 161,16 Да) L-2-аминоадипиновой кислоты растворяют примерно в 10 мл Н₂О/ACN (3:2 об/об) и добавляют 87,21 μл (0,624 ммоль, РМ 101,19 Да, d=0,726 г/мл) триэтиламина (TEA), так что рН реакции составляет 8-9. Затем добавляют 1 г (0,208 ммоль, РМ 4800 Да) Boc-PEG-NHS и проводят реакцию при перемешивании в течение 3 часов, контролируя, чтобы значение рН поддерживалось равным примерно 8. Затем реакционную смесь подкисляют до рН=4,0 с помощью 1Н HCl, ацетонитрил удаляют с помощью ротационного испарителя и продукт Boc-PEG-AD-(COOH)₂ очищают от избытка аминоадипиновой кислоты путем экстракций с помощью CHCl₃ (8×80 мл). Собранную органическую фазу сушат с помощью Na₂SO₄, фильтруют через тигель Гуча с пористостью 3, чтобы удалить соль, концентрируют до небольшого объема в роторном испарителе и выпускают по капле примерно в 300 мл этилового эфира при сильном перемешивании. Через 4 часа при -20°С осадок Boc-PEG-AD-(COOH)₂ собирают фильтрацией через тигель Гуча с пористостью 4 и помещают в сушилку. Такой же способ используют в синтезе Boc-PEG-PGlu-(COOH)₂. Количество аминокислоты, связанной с цепью PEG, определяют титрованием карбоксильных групп с 0,01 Н и 1H-ЯМР- спектроскопической характеризацией. После этого защитную группу Boc удаляют посредством кислотного гидролиза с TFA.

2b - активация карбоксильных групп фолат-PEG-AD-(СООН)₂ и фолат-PEG-βGlu-(СООН)₂ с DCC и NHS

Карбоксильные группы производной фолат-PEG-AD-(СООН)₂ и фолат-PEG-βGlu-(COOH)₂ активируют до сукцинимидного эфира с помощью NHS и DCC, как описано выше.

2с - синтез и очистка фолат-PEG-AD-(I3C)₂ и фолат-PEG-βGlu-(I3C)₂

Конъюгация I3C в полимерную цепь происходит за счет формирования эфирной связи между активированными карбоксильными группами PEG-связанной аминокислоты и гидроксильной группой I3C с помощью способа, аналогичного способу, который выполнялся для вышеизложенного синтеза фолат-PEG-I3C.

ПРИМЕР 3

Оптимизированный синтез I3CPEG₆₀₀I3C

Синтез 3а - NHS-OOC-PEG₆₀₀-COO-NHS

PEG₆₀₀ (1,200 г, 2 ммоль) растворили в 30 мл толуола и удалили влагу путем дистилляции методом Дина-Старка. В оставшийся раствор PEG (5 мл) добавили безводный CH₂Cl₂ (70 мл), N-гидроксисукцинимид (NHS) (552,432 мг, 4,8 ммоль) и N,N'-дициклогексилкарбодиимид (DCC) (990,384 мг, 4,8 ммоль). Смесь перемешивали в течение 18 часов при комнатной температуре. После фильтрации N,N'-дициклогексилмочевины растворитель удалили в вакууме с получением продукта (выход: 1,16 г, 73%).

3b - синтез индол-3-карбинол-PEG600-индол-3-карбинола

Индол-3-карбинол (706,464 мг, 4,8 ммоль) растворили в 70 мл сухого CH₂Cl₂,: к раствору добавили сухой Et3N (667,2 мл, 4,8 ммоль) и NHS-OOC-PEG₆₀₀-COO-NHS (1 г, 2 ммоль), и смесь перемешивали в течение 72 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрировали в вакууме.

ПРИМЕР 4

Оптимизированный синтез PEG₅₅₀I3C

4а - синтез PEG₅₅₀-O-CH₂-COOH

PEG₅₅₀ (1,106 мг, 2 ммоль) добавили к 30 мл толуола и удалили воду путем дистилляции методом Дина-Старка. К оставшемуся раствору PEG (5 мл), добавили трет-бутанол (10 мл) и калий трет-бутоксид (224,42 мг, 2 ммоль) и раствор оставили при 50°С на 1 час при перемешивании. Добавили трет-бутил бромацетат (295,2 мл, 2 ммоль) и смесь нагревали до дефлегмации в течение 1 часа, проводили реакцию в течение 18 часов при комнатной температуре. KBr удалили фильтрованием через целит, растворитель выпарили в вакууме с получением mPEG-O-CH₂-COOtBu (выход: 1,33 г, 98%). Эфир гидролизовали путем обработки с помощью 15 мл TFA, 20 мл CH₂Cl₂ и 3 мл Н₂О в течение 3 часов. Реакционную смесь концентрировали в вакууме и TFA удалили при пониженном давлении с получением mPEG₅₅₀-O-CH₂-COOH (выход: 1,12 г, 92%).

4b - синтез PEG₅₅₀-O-CH₂-COO-NHS

PEG550-(OR-CH₂-COOH)₂ (0,900 г, 1,48 ммоль) растворили в 75 мл сухого CH₂Cl₂. К раствору добавили N-гидроксисукцинимид (NHS) (204,4 мг, 1,77 ммоль) и N,N'-дициклогексилкарбодиимид (DCC) (366,44 мг, 1,77 ммоль). Смесь перемешивали в течение 5 часов при комнатной температуре. После фильтрации N,N'-дициклогексилмочевины раствор добавили по каплям в 250 мл этилового эфира, чтобы осадить избыточный NHS, далее выполнили центрифугирование и фильтрацию. Растворитель удалили с получением PEG₅₅₀-O-CH₂-COO-NHS (выход: 0,987 г, 94,6%).

3с - синтез PEG₅₅₀-индол-3-карбинола

Индол-3-карбинол (273,75 мг, 1,86 ммоль) растворяют в 50 мл сухого CH₂Cl₂; к раствору добавили Et₃N (258,53 мл, 1,86 ммоль) и PEG₅₅₀-O-CH₂COO-NHS (0,987 г, 1,4 ммоль). Смесь перемешивали в течение 72 часов при комнатной температуре. Растворитель и Et₃N удалили в вакууме.

Исследования биологического действия на конъюгатах F-PEG-I3C

ПРИМЕР 5

Цитотоксическая активность и целенаправленная способность конъюгатов фолата

Исследования цитотоксической активности были проведены на трех клеточных линиях человека: НТ-29 (аденокарцинома толстой кишки человека), MCF-7 (аденокарцинома молочной железы человека) и KB-3-1 (ротоглоточная карцинома человека), клетки которых характеризуются сверхэкспрессией рецепторов фолиевой кислоты (FR+) [17-18]. Испытаниям подвергли I3c, конъюгаты без фолиевой кислоты (PEG-I3C), и конъюгаты фолата F-PEG-I3C, F-PEG-AD-(I3C)₂ и F-PEG-βGlu-(13C)₂. В Таблице 1 приведены данные, выраженные IC50, т.е., концентрация (μМ), которая ингибирует рост клеток на 50% по сравнению с контрольными культурами.

Как видно из указанных значений IC50, во всех трех клеточных линиях активность свободного I3C сравнима со всеми рассматриваемыми конъюгатами. С другой стороны, цитотоксическая активность конъюгатов F-PEG-I3C возрастает при переходе от клеток FR^- к клеткам Fr⁺, что указывает на реальное целенаправленное действие молекул фолиевой кислоты. Таким образом, конъюгаты оказываются сильными ингибиторами клеток FR⁺, и такая активность связана с более высокой селективностью.

Далее, при сравнении различных конъюгатов друг с другом отмечается, что F-PEG-AD-(I3C)₂ и F-PEG-βGlu-(I3C)₂ имеют сопоставимую активность, а это означает, что другой используемый аминокислотный спейсер не влияет на цитотоксическую активность. И, наконец, различия в активности этих производных является весьма существенными по сравнению с конъюгатом фолат-PEG-I3C, при только одной связанной молекуле лекарственного средства, особенно при рассмотрении значений IC50, выраженных в виде концентрации конъюгата.

ПРИМЕР 6

Противовоспалительная активность

I3C, производные конъюгата без фолиевой кислоты (PEG-I3C), и конъюгаты фолата F-PEG-I3C, F-PEG-AD-(I3C)₂ и F-PEG-βGlu-(I3C)₂ подвергли испытанию на их противовоспалительную активность по сравнению с активностью адаптивной синтетазы окиси азота (iNos) в клетках макрофага J774A.1, стимулированных LPS с оценкой продуцирования нитритов и высвобождения NO.

Как показано в Таблице 2, активность конъюгатов сравнима с или чуть выше, чем у свободного I3C. Конъюгаты PEG-I3C без фолиевой кислоты демонстрируют более низкую активность, что указывает на реальное целенаправленное действие молекулы фолиевой кислоты на активированные клетки макрофага. Кроме того, в этом случае F-PEG-AD-(I3C)₂ и F-PEG-βGlu-(I3C)₂ имеют сравнимую активность, указывая на то, что другой используемый аминокислотный спейсер не способен повлиять на активность. Данные представлены как процент ингибирования + s.e.m. [стандартная погрешность среднего] против продуцирования нитритов в течение 24 часов клетками макрофага J774A.1, обработанными только LPS.

ПРИМЕР 7

Антиагрегационная активность по отношению к тромбоцитам

Антиагрегационное действие по отношению к тромбоцитам, индуцированное рядом медиаторов, испытали на образцах обогащенной тромбоцитами плазмы. Было показано, что I3C и конъюгат фолата F-PEG-I3C ингибируют сильным и зависимым от дозы образом агрегацию тромбоцитов, индуцированную коллагеном.

При испытании при концентрациях 3, 6, 12, 25 μМ они давали ингибирование агрегации тромбоцитов 70%, 73%, 78% и 79%, и 71%, 75%, 77%, 80%, соответственно.

ПРИМЕР 8 Антиоксидантная активность

Анализ на обесцвечивание катионного свободного радикала ABTS+° определяет активность захвата антиоксиданта против предварительно сформированного катионного радикала (ABTS+°) по сравнению с Trolox, водорастворимым аналогом витамина Е. ТЕАС определяется как концентрация Trolox, имеющего такую же антиоксидантную способность тестируемого соединения при концентрации 1 мМ. Конъюгаты фолата F-PEG-I3C показали антиоксидантную активность выше, чем у I3C и ряда полифенольных соединений, что подтверждает более высокую стабилизацию I3C. F-PEG-AD-(I3C)₂ и F-PEG-βGlu-(I3C)₂ имеют высшую и сравнимую активность, указывающую на то, что другой используемый аминокислотный спейсер не может повлиять на эту способность.

Из вышеизложенного описания очевидны многие преимущества, которые обеспечивает настоящее изобретение.

Фактически, описанные конъюгаты ликвидируют некоторые ограничения индол-3-карбинола в отношении его низкой молекулярной массы и его нестабильности в воде и в кислой среде, такой как в желудке.

В конъюгатах в соответствии с изобретением I3C ковалентно связан с полимером, действующим как носитель, и такая конъюгация позволяет улучшить его фармакокинетический профиль.

Следовательно, растворимость успешно повышается, а ферментативная и химическая деградация существенно снижается или полностью исключается.

Кроме того, соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют высокую селективность благодаря использованию целенаправленных молекул.

Такая целенаправленная молекула распознается специфическими рецепторами, которые сверхэкспрессируются в некоторых тканях и клетках, как например, отдельные опухолевые и воспалительные клетки.

Следовательно, успешно предотвращается токсичное и цитотоксическое действие на ткани, не подвергающихся действию опухолевого или воспалительного заболевания,.

Антиоксидантные свойства описанных выше соединений дают возможность применять их в качестве пищевых добавок.

Фактически, прием экзогенных антиоксидантов согласуется с восстановлением баланса между продуцированием свободных радикалов и потреблением эндогенных антиоксидантов, помимо предотвращения несоответствия, вызывающего так называемый «окислительный стресс клеток», который связан как с процессом физиологического старения, так и негативным воздействием окружающей среды.

Специалисты в данной области техники смогут вносить модификации или адаптации в настоящее изобретение, не отклоняясь от объема приведенной ниже патентной формулы.

Изобретение относится к соединению с общей формулой , в котором В представляет собой вещество, выбранное из витаминов, пептидов, опухоль-специфических пептидов, опухолевые клетки-специфических аптамеров, опухолевые клетки-специфических углеводов, моноклональных или поликлональных антител, фрагментов антител, белков, экспрессированных на метастатических опухолевых клетках; х равно 0, 1 или 2; S представляет собой лизин или является бифункциональным носителем; y равно 0, или 1, или 2; L представляет собой носитель - полиэтиленгликоль; S' представляет собой бифункциональный носитель, выбранный из L-2-аминоадипиновой кислоты (AD) и β-глутаминовой кислоты (β - Glu); z равно 0, или 1, или 2; D представляет собой индол-3-карбинол (I3C), причем упомянутое соединение выбрано из: B-Lys-PEG-I3C, B-Lys-PEG-AD-(I3C)₂, B-Lys-PEG-βGLU-(I3C)₂, F-PEG-I3C, F-PEG-AD-(I3C)₂, F-PEG-βGLU-(I3C)₂, F-Lys-PEG-I3C, F-Lys-PEG-AD-(I3C)₂, F-Lys-PEG-βGLU-(I3C)₂, F₂-AD-PEG-I3C, F₂-AD-PEG-βGLU-(I3C)₂, F₂-AD-PEG-AD-(I3C)₂, причем F представляет собой фолиевую кислоту; Lys представляет собой лизин; PEG представляет собой полиэтиленгликоль или монометокси-полиэтиленгликоль (mPEG), гомобифункциональный или гетеробифункциональный; AD представляет собой L-2-аминоадипиновую кислоту, β-GLU представляет собой β-глутаминовую кислоту и I3C представляет собой индол-3-карбинол (ВС). Также изобретение относится к вариантам способа получения соединения, применениям данного соединения, фармацевтическим или нутрицевтическим препаратам, способу лечения или профилактики опухоли, способу лечения или профилактики воспалительного заболевания. Предложенное соединение обладает противоопухолевой активностью, более селективно, менее токсично и характеризуется улучшенными фармакологическими свойствами. 10 н. и 11 з.п. ф-лы, 2 табл., 8 пр.

1. Соединение с общей формулой

,

отличающееся тем, что В представляет собой вещество, выбранное из витаминов, пептидов, опухоль-специфических пептидов, опухолевые клетки-специфических аптамеров, опухолевые клетки-специфических углеводов, моноклональных или поликлональных антител, фрагментов антител, белков, экспрессированных на метастатических опухолевых клетках;

х равно 0, 1 или 2;

S представляет собой лизин или является бифункциональным носителем;

y равно 0, или 1, или 2;

L представляет собой носитель - полиэтиленгликоль;

S' представляет собой бифункциональный носитель, выбранный из L-2-аминоадипиновой кислоты (AD) и β-глутаминовой кислоты (β - Glu);

z равно 0, или 1, или 2;

D представляет собой индол-3-карбинол (I3C), причем упомянутое соединение выбрано из:

B-Lys-PEG-I3C

B-Lys-PEG-AD-(I3C)₂

B-Lys-PEG-βGLU-(I3C)₂

F-PEG-I3C

F-PEG-AD-(I3C)₂

F-PEG-βGLU-(I3C)₂

F-Lys-PEG-I3C

F-Lys-PEG-AD-(I3C)₂

F-Lys-PEG-βGLU-(I3C)₂

F₂-AD-PEG-I3C

F₂-AD-PEG-βGLU-(I3C)₂

F₂-AD-PEG-AD-(I3C)₂,

причем F представляет собой фолиевую кислоту;

Lys представляет собой лизин;

PEG представляет собой полиэтиленгликоль или монометокси-полиэтиленгликоль (mPEG), гомобифункциональный или гетеробифункциональный;

AD представляет собой L-2-аминоадипиновую кислоту,

β-GLU представляет собой β-глутаминовую кислоту и

I3C представляет собой индол-3-карбинол (13С).

2. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что носитель представляет собой монометокси-полиэтиленгликоль.

3. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что носитель имеет молекулярную массу в диапазоне от 100 до 200000 (г/моль) и предпочтительно от 4800 до 40000 (г/моль).

4. Соединение по п. 3, отличающееся тем, что носитель имеет молекулярную массу 550, 600, 4800, или 20000.

5. Способ получения соединения по любому из пп. 1-4, включающий следующие этапы:

II) активация лиганда В:

В→В*;

III) конъюгация активированного лиганда с активированным носителем:

В*+L-gr*→B-L-gr*;

IV) конъюгация активного ингредиента D:

B-L-gr*+D→B-L-D.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что дополнительно к упомянутым этапам упомянутый способ перед этапом II) содержит также этапы Ia) и Ib):

Ia) введение в носитель подходящей реакционноспособной группы (gr):

L →L-gr;

Ib) активация указанной реакционноспособной группы носителя:

L-gr →L-gr*.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что этапы Ia) и Ib) могут повторяться.

8. Способ получения соединения по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что L представляет собой гетеробифункциональный PEG, несущий первую gr и вторую gr' реакционноспособные группы, a z=0, включающий следующие этапы:

Ia') защита первой аминной группы носителя:

gr-L-gr'→#L-gr'

Ib') активация свободной реакционноспособной группы (gr'):

#L-gr'→#L-gr'*

Ic') конъюгация спейсера S':

#L-gr*+S'→#L-S'

Id') снятие защиты с носителя:

#L-S→gr-L-S';

Ie') конъюгация лиганда:

gr-L-S'+В→B-L-S'

If') активация реакционноспособной группы спейсера:

B-L-S'→B-L-S'*

Ig') конъюгация активного ингредиента:

B-L-S'*+D→B-L-S'-D.

9. Способ по п. 6, или 7, или 8, отличающийся тем, что на этапе IV) или Ig') используется мольное соотношение носитель : активный ингредиент в диапазоне от 1:1 до 1:5, предпочтительно 1:3.

10. Способ по п. 5, или 6, или 7, отличающийся тем, что используется мольное соотношение носитель : лиганд примерно 1:4.

11. Соединение по любому из пп. 1-4 для медицинского применения в качестве цитотоксического, противовоспалительного, антиагрегационного и антиоксидантного агента.

12. Соединение по любому из пп. 1-4 для применения в лечении или профилактике опухоли.

13. Соединение по п. 12, отличающееся тем, что указанная опухоль представляет собой опухоль молочной железы, толстой кишки, предстательной железы, яичника, эндометрия, головного мозга, легких, почек, носа, горла, злокачественные эпителиальные опухоли, саркомы, лимфомы, как например лимфома Беркитта, болезнь Ходжкина, мезотелиомы, меланомы, лейкозы и миеломы.

14. Соединение по п. 10 для применения в профилактике и лечении воспалительных заболеваний, для применения в качестве антиагрегационного агента в отношении тромбоцитов, для применения в качестве антиоксиданта.

15. Фармацевтический или нутрицевтический препарат для перорального или парентерального введения, содержащий в эффективном количестве одно или несколько соединений по любому из пп. 1-4.

16. Фармацевтический или нутрицевтический препарат по п. 15, содержащий один или несколько фармацевтических активных ингредиентов.

17. Соединение по любому из пп. 1-4 для применения в качестве пищевой и нутрицевтической добавки, способной высвобождать I3C и/или фолиевую кислоту, которые полезны для здоровья человека и животных.

18. Способ лечения или профилактики опухоли, включающий введение в эффективном количестве соединения по любому из пп. 1-4.

19. Способ лечения или профилактики опухоли по предыдущему пункту, отличающийся тем, что указанная опухоль представляет собой опухоль молочной железы, толстой кишки, предстательной железы, яичника, эндометрия, головного мозга, легких, почек, носа, горла, злокачественные эпителиальные опухоли, саркомы, лимфомы, мезотелиомы, меланомы, лейкозы и миеломы.

20. Способ лечения или профилактики опухоли по п. 19, отличающийся тем, что указанная опухоль представляет собой лимфому Беркитта, болезнь Ходжкина.

21. Способ лечения или профилактики воспалительного заболевания, включающий введение в эффективном количестве соединения по любому из пп. 1-4.