СРЕДСТВО ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА И ПОВЫШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ К БОЛЕЗНЯМ РАСТЕНИЙ ГОРОХА Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 A01N63/02 C12R1/38 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается новой культуры микроорганизмов, способных стимулировать рост и повышать устойчивость к болезням растений гороха.

На сегодняшний день в списке биофунгицидов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации [1], зарегистрирован единственный препарат, рекомендованный для защиты гороха от болезней - Фитоспорин-М на основе штамма Bacillus subtilis 26 Д. Применение штамма Bacillus subtilis 26 Д способствует снижению заболеваний и положительно сказывается на продуктивности растений гороха [2, 3]. Недостатком штамма является неспособность к фиксации атмосферного азота и синтезу веществ, стимулирующих рост растений, цитокининовой природы.

Технической задачей предлагаемого изобретения является расширение ассортимента средств для стимуляции роста и повышения устойчивости к болезням растений гороха.

Поставленная задача решается применением в качестве средства для стимуляции роста и повышения устойчивости к болезням растений гороха штамма бактерий Pseudomonas koreensis ИБ-4 (прежнее название Pseudomonas sp.ИБ-4), и запатентованного ранее в качестве штамма бактерий для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых фитопатогенными грибами, и повышения урожайности [4]. Штамм выделен из образца пахотной почвы Республики Башкортостан и характеризуется следующими признаками.

1. Культурально-морфологические признаки.

1.1. На агаризованной питательной среде, имеющий состав, г/л. КН₂РО₄ - 0,3; СаНРO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,3; K₂SO₄ - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl₃ - 0,01; СаСО₃ - 5,0; сахароза - 20,0; агар - 1,5%; смесь микроэлементов - 1 мл; дистиллированная вода до 1000 мл, рН 6,8-7,2 культура образует круглые колонии диаметром 3-4 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, прозрачные, с гладкими краями, мягкой тягучей консистенции. На 24 часу роста клетки - мелкие палочки 0,5×1,5 мкм, подвижные.

1.2. На жидкой питательной среде Федорова с мелассой, имеющей состав, г/л: К₂НРO₄ - 0,3; СаНРO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,3; K₂SO₄ - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl₃ - 0,01; СаСО₃ - 5,0; меласса - 40,0; смесь микроэлементов - 1 мл; рН 6,8-7,0, выращивание при температуре 28°С и режиме аэрации-перемешивания 180 об/мин в течение 48 часов. Круглые колонии диаметром 0,5 см, выпуклые с ровными краями, слизистой консистенции.

1.3. На питательной среде КГА колонии круглые диаметром 6 мм, выпуклые, белого полупрозрачного цвета, консистенция тягучая мягкая. Пигмента не образуют. На 24 часу роста - мелкие подвижные палочки.

2. Физиолого-биохимические признаки.

Штамм является аэробным микроорганизмом, оптимальная температура роста 28°С.

Отношение к источникам углерода: очень хорошо усваивает глюкозу, сахарозу; хорошо усваивает маннит, мальтозу, ксилозу, сорбит, рамнозу, лактозу, декстрин, галактозу, маннозу, глицерин, фруктозу, этанол; слабо усваивает арабинозу, мезоинозитол.

Отношение к источникам азота: растет на безазотистых средах, сохраняя высокую продуктивность.

Штамм хранится на косяках со средой Федорова в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца, а также в лиофильно высушенном состоянии.

По нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК наиболее близок к штамму Pseudomonas koreensis Ps 9-14 (уровень сходства 99,71%).

Предлагаемое изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Pseudomonas koreensis ИБ-4 при выращивании в течение 48 ч в ферментере объемом 10 литров при коэффициенте заполнения 0,7 на среде Федорова с добавлением мелассы в качестве источника углерода проявляет высокую продуктивность. При температуре процесса, составляющей 28-30°С, числе оборотов перемешивающего устройства 350 об/мин, расходе воздуха 100 л/час число жизнеспособных клеток в культуральной жидкости достигает 5 млрд/мл.

Пример 2. Некоторые микроорганизмы, обитающие в ризосфере растений, способны синтезировать цитокинины. Цитокинины представляют собой природные соединения, участвующие в гормональной регуляции онтогенеза растений, характеризующиеся способностью индуцировать деление растительных клеток и являющиеся наиболее активными среди открытых рострегулирующих веществ. Наличие цитокининов в культуральной жидкости обуславливает наличие способности микроорганизма к стимуляции роста растений. Определение ростстимулирующей активности проводят для культуральной жидкости предлагаемого штамма Pseudomonas koreensis ИБ-4, полученной по примеру 1, методом непрямого конкурентного иммуноферментного анализа [5]. Обнаружено образование цитокининов с концентрацией 280 нг/мл культуральной жидкости.

Пример 3. Штамм Pseudomonas koreensis ИБ-4 обладает способностью к фиксации атмосферного азота (определяли ацетиленовым методом), сопоставимой по величине с активностями азотфиксирующих микроорганизмов (табл.1), предлагаемых для использования под различные сельскохозяйственные культуры [6-9].

Пример 4. Повышение устойчивости растений гороха к возбудителям корневых гнилей гороха оценивают по биологической эффективности штамма Pseudomonas koreensis ИБ-4 и испытывают в полевых условиях на горохе сорта Чишминский 229 с естественным уровнем заражения посевного материала. Семена гороха обрабатывают культуральной жидкостью штамма Pseudomonas koreensis ИБ-4, полученной по примеру 1, из расчета 10⁵ КОЕ на семя непосредственно перед посевом. В контрольных опытах обработку семян осуществляют водопроводной водой. Эффективность штамма определяют при сопоставлении распространения корневых гнилей фузариозной этиологии в фазе цветения растений гороха в опыте и контроле. Результаты приведены в табл. 2.

Как свидетельствуют результаты эксперимента, повышение устойчивости растений гороха к возбудителям корневых гнилей у штамма Pseudomonas koreensis ИБ-4 составляет 48,0%, при 47,3% у выбранного аналога.

Пример 5. Повышение устойчивости растений гороха к возбудителю мучнистой росы (Erysiphe communis Grev. f. pisi Dietrich) оценивают, как описано в примере 4. Эффективность штамма определяют при сопоставлении распространения мучнистой росы в фазе цветения растений гороха в опыте и контроле. Результаты приведены в табл. 3.

Как свидетельствуют результаты эксперимента, повышение устойчивости растений гороха к возбудителю мучнистой росы (Erysiphe communis Grev. f. pisi Dietrich) у штамма Pseudomonas koreensis ИБ-4 составляет 47,8%, при 43,7% у выбранного аналога.

Пример 6. Стимуляцию роста растений гороха штаммом Pseudomonas koreensis ИБ-4 оценивают в полевых условиях на горохе сорта Чишминский 229. Семена гороха обрабатывают культуральной жидкостью штамма Pseudomonas koreensis ИБ-4, полученной по примеру 1, из расчета 10⁵ КОЕ на семя непосредственно перед посевом. В контрольных опытах обработку семян осуществляют водопроводной водой.

Результаты эксперимента показывают, что применение штамма Pseudomonas koreensis ИБ-4 усиливает ростовые процессы растений гороха (табл. 4): в опытных вариантах формируются более длинные стебли, большее число бобов, семян, масса 1000 семян 178,8 г при 175,8 г в варианте с аналогом против 157,3 г в контроле. Урожайность гороха при этом возрастает на 13,6%, при 13% у аналога.

Таким образом, предлагаемый штамм Pseudomonas koreensis ИБ-4 обладает высокой продуктивностью, способностью к фиксации атмосферного азота, способен одновременно повысить устойчивость растений гороха к таким заболеваниям, как корневые гнили и мучнистая роса, и стимулировать рост растений.

Список литературы

1. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. М.: "Минсельхоз России", 2018. 1017 с.

2. Иванчина Н.В., Гарипова СР., Шавалеева Д.В., Уразбахтина Н.А., Захарова Р.Ш., Хайруллин P.M. Влияние штаммов Bacillus subtilis на продуктивность растений гороха при автономной и совместной инокуляции со штаммом Rhizobium leguminosarum bv. viceae 1078 // Агрохимия. 2008. № 10. C. 34-39.

3. Фомина Н.Ю. Применение регуляторов роста, биопрепаратов, микроудобрений и фунгицидов на горохе посевном в Южной лесостепи Зауралья // Аграрный вестник Урала. 2009. № 3(57). С. 61-63.

4. Патент RU № 2529958, кл. С12N 1/20, 2014.

5. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каравайко Н.Н., Гюли-заде В.З., Чередова Е.П., Мустафина А.Р., Мошков И.Е., Кунаева О.Н. Иммуноферментная система для определения цитокининов // Физиология растений. 1990. Т. 37, вып. 1. С. 193-199.

6. Патент RU № 2074159, кл. С05F 11/08, 1997.

7. Патент RU № 2074158, кл. С05F 11/08, 1997.

8. Патент RU № 2074157, кл. С05F 11/08, 1997.

9. Патент RU № 2076088, кл. С05F 11/08, 1997.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Pseudomonas koreensis ИБ-4 используют в качестве средства для стимуляции роста и повышения устойчивости к болезням растений гороха. Изобретение позволяет расширить ассортимент средств для стимуляции роста и повышения устойчивости к болезням растений гороха, способных одновременно повысить устойчивость растений гороха к таким заболеваниям, как корневые гнили и мучнистая роса, и стимулировать рост растений. 4 табл., 6 пр.

Применение штамма бактерий Pseudomonas koreensis ИБ-4 в качестве средства для стимуляции роста и повышения устойчивости к болезням растений гороха.