НАБОР ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 2019 года по МПК A61K49/04 A61K49/06 

Уровень техники изобретения

Данное изобретение относится к содержащему стабилизированные компоненты набору для получения радиоафармацевтического препарата. В частности данное изобретение относится к использованию неводного растворителя для стабилизации входящего в набор компонента, выступающего в роли лиганда.

Радиоафармацевтические препараты следует получать и вводить в организм в течение ограниченного промежутка времени в связи с коротким периодом полураспада большинства радионуклидов, используемых на практике. Обычно их получают из наборов, полученных в условиях надлежащей медицинской практики (GMP). Набор, как правило, содержит подходящий лиганд, с которым радионуклид, такой как ^99mTc, дложен образовывать комплекс, достаточное количество восстановителя, буферы для регулирования pH с целью обеспечения оптимальных условий введения меченых атомов, стабилизаторы и вспомогательные вещества. Наборы получают в лиофилизированной или высушенной сублимацией форме, что увеличивает стабильность и срок хранения. Наборы можно легко транспортировать и хранить перед восстановлением с использованием указанного радионуклида. Высушенные сублимацией наборы упрощают введение меченых атомов и обеспечивают более стабильные условия для введения меченых атомов.

Доступность высушенного сублимацией состава для получения в форме набора является выгодной для персонала больницы, обязанного легко приготавливать радиоафармацевтический препарат для введения в организм, поскольку это включает только добавление радионуклида и, при необходимости, нагревание. Таким образом, указанные стадии получения находятся в рамках компетенции ответственного лица в больнице.

Примером радиоафармацевтического препарата является ^99mТехнеций-этилендицистеиндезоксиглюкозамин (^99mTc-ECDG) 1. ^99mTc-ECDG представляет собой визуализирующее средство для однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (SPECT)/компьютерной томографии (CT) (SPECT/CT), которое в настоящее время находится на третьей фазе клинических испытания в США на его способность к обнаружению первичных очагов рака легких¹. Визуализирующие способности ^99mTc-ECDG сопоставимы со способностями ¹⁸F-фтордезоксиглюкозы (¹⁸F-FDG) 2, визуализирующего средства для позитронно-эмиссионной томографии (PET)/CT, которое широко используется (более 95% сканограмм) для обнаружения гибернирующего миокарда и метаболически активной раковой ткани². Главная непосредственная причина, обуславливающая потенциальное применение ^99mTc-ECDG вместо ¹⁸F-FDG, заключается в значительно более низких затратах, связанных с использованием радиоактивного индикатора для SPECT, по сравнению с использованием радиоактивного индикатора для PET, а также в достижении такого же уровня качества и эффективности при визуализации рака легких³.

Предложено, что механизм действия ^99mTc-ECDG реализуется через гексозаминовый путь метаболизма в результате содержания двух глюкозаминовых заместителей. Глюкозамин проникает в клетки посредством гексозаминового биосинтетического пути, и его регуляторные продукты глюкозамин-6-фосфата служат посредниками в нисходящем сигнальном пути активации инсулином и передают сигнал гликозилирования и роста злокачественной опухоли². В гексозаминовом пути метаболизма транспортеры глюкозы с повышенным уровнем экспрессии способствуют сверхэкспрессии глутамин:фруктозо-6-фосфатамидотрансферазы (GFAT). Фосфорилированный глюкозамин связывается с уридиндифосфатом (UDP) с образованием UDPN-ацетилглюкозамина (UDP-GLcNAc). Гликозилирование остатков серина и треонина в ядерных и цитозольных белках посредством O-связанного белка N-ацетилглюкозаминтрансферазы (о-GlcNAc) обычно встречается у всех многоклеточных эукариотов. Гликозилирование является частью посттрансляционной модификации и, по всей видимости, модифицирует большое число ядерно-цитоплазматических белков. Активность O-GlcNAc трансферазы сильно восприимчива к внутриклеточным концентрациям UDP-GLcNAc и UDP, которые в свою очередь являются высокочувствительными к концентрациям глюкозы и другим стимулам. Внутри ядра клетки убиквитарный транскрипционный фактор Sp1 в высокой степени модифицируется O-GlcNAc. Sp1 подвергается гипергликозилированию при гипергликемии или повышенном уровне содержания глюкозамина. Поскольку O-GlcNAc вовлечена в гексозаминовый путь метаболизма и активность ядра, она становится привлекательным визуализирующим средством для дифференциального диагноза при опухолях.

Обзор литературы касательно опубликованных синтезов (ссылки [5], [6], [7] и [8]) дает общее представление о нескольких экспериментальных способах в отношении получения ECDG 3. К сожалению, ни одна из указанных опубликованных методик не была успешно воспроизведена, поскольку эти синтезы включают подвергание ECDG воздействию водной среды, что оказалось нецелесообразным, поскольку было показано, что ECDG является чувствительным к воздуху, свету, воде и температуре⁹. Было описано, что синтез ECDG является сложной задачей с учетом очень нестабильной природы указанного лиганда⁹. Так как ECDG предназначен для использования в качестве визуализирующего средства, вещество должно иметь фармацевтическую степень чистоты, что означает, что потребуется выполнить стадии очистки без значительного снижения выхода. Это окажется очень трудным из-за низкой стабильности ECDG.

Вторым фактором, осложняющим проблему получения ^99mTc ECDG, подходящего для использования в качестве радиоафармацевтического препарата в условиях ядерной медицины, является его присутствие в составе для получения в форме набора.

Получение наборов на основе ECDG, неустойчивого в водной среде лиганда, является проблематичным, поскольку стандартная методика работы с набором включает стадию лиофилизации в водной фазе, где чистый активный фармацевтический ингредиент (API) в виде лиганда растворяется в воде/солевом растворе, содержащем по меньшей мере один вариант каждого компонента из восстановителя, добавки и буфера, распределяется по флаконам и подвергается сублимационной сушке. В больнице к набору добавляется ^99mTc в солевом растворе и осуществляется восстановление. Затем ^99mTc хелатируется лигандом ECDG, и радиоафармацевтический препарат ^99mTc-ECDG готов для инъекции. Авторы изобретения обнаружили, что ECDG практически сразу разрушается в воде. Он является стабильным в воде только тогда, когда ион металла хелатирован ECDG, как в случае ^99mTc-ECDG.

Таким образом, существует потребность в системе в форме набора, которая включает стабильные компоненты, которая позволяет осуществлять простую, воспроизводимую и устойчивую процедуру введения меченых атомов, подходящую для диагностических, терапевтических или других областей применения изотопного индикатора. Кроме того, существует потребность в эффективном мечении радиоактивным изотопом лигандов при уровнях радиохимической чистоты, которые являются приемлемыми для разрешения контролирующего органа, и в то же время при поддержании высокой стабильности, чистоты и выхода.

Сущность изобретения

Согласно первому аспекту изобретения предлагается набор для получения радиоафармацевтического препарата, при этом набор содержит:

a) лиганд, растворенный в неводном растворителе, при этом лиганд способен связываться с радионуклидом, и где растворитель выбирают исходя из относительной полярности в диапазоне от гексана до глицерина;

b) восстановитель;

c) буферный раствор;

d) и необязательно добавки, такие как слабый хелатирующий агент, антиокислитель, солюбилизатор или наполнитель,

и где каждый из компонентов a), b), c) и d) находится в лиофилизированной форме.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения восстановитель представляет собой смесь SnCl₂, или SnF₂, или тартрата олова (II)_, соляной кислоты и воды, а буферный раствор представляет собой фосфатный, или лимоннокислый, или ацетатный буферный раствор. В соответствии с другим вариантом буфер представляет собой комбинацию из любых вариантов, включающих фосфатный, лимоннокислый или ацетатный буферный раствор.

Предпочтительно, слабый хелирующий агент выбирают из DTPA, глюкогептоната, тартрата и медроната, или комбинации из любых указанных вариантов. Антиокислитель выбирают из гентизиновой кислоты, аскорбиновой кислоты и пара-аминобензойной кислоты, или их комбинации. Солюбилизатор выбирают из желатина, или циклодекстрина, или их комбинации, а наполнитель выбирают из маннита, инозита, глюкозы и лактозы, или их комбинации.

Компоненты a), b), c) и d) могут содержаться в одном флаконе. В соответствии с другим вариантом компоненты b), c) и d) содержатся в первом флаконе, и компонент a) содержится во втором флаконе.

Лиганд можно выбирать из ECD, HMPAO, MAG3 и MIBI, или их солей с щелочными металлами или с щелочноземельными металлами. Предпочтительно лиганд представляет собой ECDG или его соль с щелочным металлом. Растворитель выбирают из метанола, этанола, этилацетата, гексана, хлороформа, дихлорметана, толуола, диэтилового эфира, тетрагидрофурана и ацетонитрила, или их комбинации. Предпочтительно, растворитель выбирают из метанола или этанола. Более предпочтительно, растворитель представляет собой метанол.

Радионуклид металла можно выбирать из ^99mTc, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ⁹⁰Sr, ⁹⁰Y, ⁸⁹Sr, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ¹¹¹In, ¹⁵³Gd, ⁵⁹Fe, ⁵²Fe, ²²⁵Ac, ²¹²Bi, ⁴⁵Ti, ⁶⁰Cu, ⁶¹Cu, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ^195mPt, ^191mPt, ^193mPt, ^117mSn, ¹⁰³Pd, ^103mRh, ⁸⁹Zr, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁹Er, ⁴⁴Sc, ¹⁵⁵Tb, ¹⁴⁰Nd, ¹⁴⁰Pr, ¹⁹⁸Au, ¹⁰³Ru, ¹³¹Cs, ²²³Ra, ²²⁴Ra и ⁶²Zn.

Предпочтительно радионуклид представляет собой ^99mTc, ¹⁰³Pd, ^103mRh, ^195mPt, ^193mPt, ¹⁹¹Pt. Более предпочтительно радионуклид представляет собой ^99mTc.

Набор также содержит инструкции по применению.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 представляет собой масс-спектр полученного ECDG

Описание предпочтительных вариантов осуществления

Наборы были получены согласно следующему способу.

Следующие растворы были получены в условиях атмосферы Ar(г), чтобы обеспечить отсутствие CO₂ или O₂:

a) Необходимый объем ECDG или его соли растворяют в неводном растворителе при относительной полярности в диапазоне от гексана до глицерина.

b) Буферные растворы фосфата/лимонной кислоты при подходящем значении pH для оптимальных условий введения меченых атомов.

c) Раствор соли олова (II) в нейтральной или кислой среде, который выполняет функцию восстановителя пертехнетат-иона (^99mTcO₄^-), находящегося в степени окисления, соответствующей валентности VII, до степени окисления, соответствующей валентности IV, чтобы обеспечить реакционную способность ^99mTc для связывания с лигандом, ECDG.

Для состава для получения в форме набора с распределением компонентов по двум флаконам способ сублимационной сушки при использовании вышеописанных растворов включает следующее:

a) Флакон 1: достаточный объем раствора ECDG добавляют во флакон 1, замораживают и затем высушивают сублимацией в условиях атмосферы Ar(г).

b) Флакон 2: заданный объем полученного буферного раствора фосфата/лимонной кислоты добавляют в заполненный Ar(г) флакон 2, замораживают и высушивают сублимацией в течение ночи, после чего добавляют раствор Sn (60-100 мкг Sn(II)) и затем замораживают и высушивают в условиях атмосферы Ar(г).

Все флаконы хранятся в темных условиях в морозильной камере. Протокол введения меченых атомов предусматривает восстановление или растворение содержимого флакона 1, добавление содержимого флакона 1 к содержимому флакона 2, за которым немедленно следует добавление требуемого количества радиоактивного компонента ^99mTc. Реакционную смесь нагревают (60-80°C) в течение ограниченного промежутка времени, чтобы обеспечить введение меченых атомов. Контроль качества с помощью методов TLC и HPLC должен регистрировать введение меченых атомов на уровне >90% и радиохимическую чистоту более 95%.

Для состава для нанесения в форме набора с содержанием компонентов в одном флаконе способ сублимационной сушки при использовании вышеописанных растворов включает следующее:

a) Сначала заданный объем полученного фосфатного/лимоннокислого буфера замораживают и высушивают сублимацией. Затем в заполненный Ar(г) флакон добавляют раствор Sn (60-100 мкг Sn (II)) и замораживают, после чего высушивают сублимацией в условиях атмосферы Ar(г).

b) В конце чистый ECDG растворяют в неводном растворителе на верхней поверхности высушенного сублимацией материала согласно пункту a), замораживают и высушивают сублимацией. Данный протокол введения меченых атомов предусматривает восстановление только путем добавления достаточного количества радиоактивного компонента ^99mTc. Реакционную смесь нагревают (60-80°C) в течение ограниченного промежутка времени, чтобы обеспечить введение меченых атомов. Контроль качества с помощью методов TLC и HPLC должен регистрировать введение меченых атомов на уровне >90% и радиохимическую чистоту более 95%. После добавления в набор радиоактивного компонента составленный препарат готов для инъекции.

При получении наборов ECDG был получен Заявителем синтетическим путем. Способ синтеза для получения ECDG был успешно осуществлен при пяти стадиях синтеза, исходя из коммерчески доступного L-тиазолидин-4-карбоновой кислоты. Способ синтеза можно кратко изложить следующим образом.

Со структурной точки зрения можно считать, что ^99mTc-ECDG состоит из трех компонентов, а именно: (i) L,L- этилендицистеинового (EC) лиганда в его центре, (ii) двух D-глюкозаминовых групп, нацеленных на злокачественную опухоль, и (iii) радионуклида ^99mTc. EC можно получить посредством реакции димеризации по радикальному механизму коммерчески доступной L-4-тиазолидинкарбоновой кислоты [10]. Тиольные и вторичные аминные функциональные группы EC представляют собой реакционноспособные центры и, как показано, успешно и эффективно защищаются бензильной (Bn) [11] и бензилхлорформиатной (Cbz) защитными группами соответственно. Две D-глюкозаминовые группы теоретически могут быть присоединены к кислотным фрагментам EC путем реакции сочетания с участием смешанного ангидрида при использовании этилхлорформиата в качестве реагента. Затем ECDG можно получить путем полного снятия защитных групп у продукта реакции сочетания в растворе натрия/аммиака [8]. Эту реакцию можно гасить фенилацетатом аммония, который должен давать растворимую в 2-пропаноле натриевую соль фенилуксусной кислоты, что может создать возможность для достаточной очистки ECDG от побочных продуктов реакции. Указанный синтезированный ECDG можно затем пометить радиоактивным изотопом ^99mTc и использовать по назначению.

Синтез EC 4

из L-тиазолидин-4-карбоновой кислоты проводили точно в соответствии с условиями, указанными в литературе [10], и получили целевой продукт с выходом 38%. По завершении реакции аммиак быстро испаряется (температура кипения -33°C), и полученный остаток растворяется в воде с получением сильноосновного (pH=12,0) раствора. По этой причине добавляют 5M HCl для протонирования превращенного в основание лиганда EC и осаждения молекулы в виде ее дигидрохлоридной соли, что достигается при pH 3,0-2,0. Исходное вещество, L-тиазолидин-4-карбоновая кислота, является растворимым в кислой среде и остается в растворе, и поэтому данная стадия служит в качестве первой стадии очистки EC 4. Осажденный EC 4 затем отфильтровывают, и было обнаружено, что непосредственная перекристаллизация указанного неочищенного EC 4 в кипящем этаноле, за которой следует сушка вещества под высоким вакуумом, приводит к получению чистого EC 4 в виде порошкообразного белого твердого вещества. Анализ ЯМР для EC 4 проводили в D₂O при необходимости добавления 6,0 эквивалентов K₂CO₃ для (i) нейтрализации дигидрохлоридной соли и (ii) депротонирования тиольных и кислотных функциональны групп, что позволяет растворить и проанализировать EC 4. Данные протонного и углеродного спектров ЯМР EC 4 точно соответствовали литературным данным, так же как и определенная температура плавления. Указанные данные также показали, что чистота EC 4 составляла более 99%.

EC 4 подвергали бензилированию согласно информации по ссылке [10], при этом не наблюдались какие-либо отклонения от указанной информации. Данная стадия защиты была необходимой, поскольку тиольные группы также могут участвовать в запланированной реакции сочетания с глюкозамином и поэтому требуют наличия защиты. Однако отсутствуют какие-либо доступные литературные данные по данным протонного или углеродного спектров ЯМР для EC-Bn 5

и таким образом необходимо было определить систему растворителей и способ анализа. Экспериментально было обнаружено, что EC-Bn 5 полностью растворяется в смеси D₂O и дейтерированного ДМФА в соотношении 6:4 об./об. при добавлении 4,0 эквивалентов K₂CO₃, который служил для нейтрализации дигидрохлоридной соли EC-Bn 5 и депротонирования двух кислотных фрагментов. Это обеспечило получение данных ЯМР для EC-Bn 5, которые служили в качестве первых опубликованных протонного и углеродного ЯМР спектров для данного соединения. Протонный спектр в значительной степени совпадает со спектром исходного соединения EC 4, но содержит бензильные протоны CH₂ в виде синглета при 4,69 м.д. и десять ароматических протонов, проявляющихся при 7,16 м.д. в виде мультиплета. Углеродный спектр ЯМР согласуется с результатами протонного спектра ЯМР, поскольку атомы углерода CH₂ наблюдаются при 35,9 м.д., а сигналы при 127,1 м.д., 128,6 м.д., 128,8 м.д. и 138,6 возникают в результате наличия ароматического кольца. Указанные данные наряду с определенной температурой плавления, которая вписывается в ожидаемый согласно литературным данным диапазон, подтверждают, что было успешно достигнуто введение бензильной защитной группы.

Вторичные аминные фрагменты EC-Bn 5 были защищены бензилхлорформиатными защитными группами. Так же как и тиольные группы, указанные вторичные аминные группы также могут реагировать при запланированной реакции сочетания с глюкозамином, и поэтому их тоже необходимо защитить. Защиту EC-Bn Cbz изначально проводили в течение 2 ч при 0°C, а затем в течение 16 ч при комнатной температуре (RT). Для удаления всего непрореагировавшего CbzCl требовалась стадия промывки диэтиловым эфиром, за которой следовало подкисление водной среды до pH 3,0 для протонирования карбоксигруппы EC-Bn-Cbz 6,

которое привело к осаждению продукта в виде белого твердого вещества. Было обнаружено, что растворение продукта в большом объеме органического растворителя и экстракция подкисленного раствора этилацетатом позволяет выделить EC-Bn-Cbz 6. Разделение и последующее удаление растворителя из органической фазы привело к получению целевого продукта в виде аморфного твердого вещества. Необходимо было полностью высушить EC-Bn-Cbz 6 при высоком вакууме, чтобы обеспечить то, чтобы вещество совсем не содержало следов растворителя или воды. Продукт в виде EC-Bn-Cbz 6 быстро разлагался на силикагеле и поэтому не представлялось возможности для его дополнительной очистки, что, как обнаружено, противоречило опубликованным данным [12]. Невозможно было определить систему растворителей для анализа ЯМР EC-Bn-Cbz 6, и это также не соответствовало информации в литературе, в которой указаны данные ЯМР в CDCl₃. LC-MS анализ данного продукта также оказался неудачным из-за бензильных защитных групп, которые, как известно, являются проблематичными для определения с помощью метода MS. Таким образом неочищенный EC-Bn-Cbz 6 сразу использовали на следующей стадии.

Реакцию сочетания EC-Bn-Cbz 6 и тетра-ацетилглюкозамина проводили при использовании этилхлорформиата в качестве связующего реагента. Условия реакции и обработки соответствовали условиям, найденным в предшествующем уровне техники, но была установлена новая система растворителей для очистки с помощью колоночной хроматографии. Было обнаружено, что комбинация из трех растворителей, состоящая из метанола (MeOH), этилацетата (EtOAc) и гексана при соотношении в диапазоне (1-5):(10-90):(10-80), позволяет выделить полностью защищенный ECDG 7 при более высокой степени чистоты.

Последняя стадия представляла собой стимулируемое натрием/аммиаком полное снятие защиты у полностью защищенного ECDG 7 с получением ECDG 3. Полностью защищенный ECDG 7 реагировал с 20,0 эквивалентами металлического натрия, чтобы полностью удалить ацетатные, Cbz и Bn защитные группы. Затем реакцию гасили путем добавления 12,0 эквивалентов фенилацетата аммония, что привело к образованию фенилацетата натрия в качестве побочного продукта. После того как жидкий аммиак был выпарен в атмосфере газообразного аргона, фенилацетат натрия был удален из реакционной смеси посредством стадии промывки 2-пропанолом. Фенилацетат натрия хорошо растворим в 2-пропаноле, в то время как ECDG 3 не имеет такого свойства, поэтому органическую среду отфильтровали в инертной атмосфере с получением ECDG 3 в виде сильно пахнущего твердого вещества кремового цвета. Затем указанный ECDG 3 промыли диэтиловым эфиром, после чего сушили под высоким вакуумом в течение 1ч при отсутствии света. Идентификация и определение чистоты указанного ECDG были осуществлены с помощью MS (фигура 1), при этом требуемый пик MS для ECDG 3 наблюдался при 591,1 единицах. ECDG 3 хранили под аргоном при отсутствии света при -20°C.

Примеры

Пример 1 - набор с содержанием компонентов в двух флаконах.

Протокол лиофилизации

a) К раствору двухосновного фосфата натрия (0,284 г, 0,002 моль) в воде (бескислородной) добавили лимонную кислоту (0,201 г, 0,001 моль), для получения Фосфатного/лимоннокислого буферного раствора с pH 5,5. 855 мкл полученного фосфатного/лимоннокислого буферного раствора добавили в первый заполненному аргоном флакон, закрыли и заморозили перед сублимационной сушкой в течение ночи.

b) К раствору дигидрата хлорида олова (II) (0,01 г, 0,04 ммоль) добавили соляную кислоту (0,10 мл, 0,1 M) и разбавили водой (бескислородной) до 10 мл. Затем 100 мкл раствора Sn (=60 мкг Sn (II)) добавили во флакон 1, заморозили и затем подвергли сублимационной сушке.

c) Метанол (1,5 мл) добавили во второй заполненный аргоном флакон, содержащий ECDG (10 мг, 0,017 ммоль). Флакон погрузили в жидкий азот для заморозки раствора и сублимационной сушки. Флакон необходимо хранить в темноте и в морозильной камере.

Необходимо отметить, что все флаконы должны быть заполнены Ar для обеспечения отсутствия CO₂ или O₂.

Протокол введения меченых атомов

a) Добавляют 355 мкл H₂O во флакону с высушенным сублимацией ECDG.

b) Переносят во флакон, содержащий высушенный сублимацией буфер/Sn, и добавляют небольшой якорь для магнитного перемешивающего устройства. Перемешивают для растворения буферных солей.

c) Затем следует немедленное добавление 500 мкл TcO^4-(или эквивалентного объема для получения активности, составляющей приблизительно 40 мКи).

d) Помещают на электрическую плитку и перемешивают в течение 15 мин при 70°C.

e) Проводят TLC и HPLC-QC.

Пример 2 - Набор с содержанием компонентов в одном флаконе

Протокол лиофилизации

a) К раствору двухосновного фосфата натрия (0,284 г, 0,002 моль) в воде (бескислородной) добавили лимонную кислоту (0,201 г, 0,001 моль) для получения фосфатного/лимоннокислого буферного раствора с pH 5.5. 855 мкл полученного фосфатного/лимоннокислого буферного раствора добавили в первый заполненный аргоном флакон, закрыли и заморозили перед сублимационной сушкой в течение ночи.

b) К раствору дигидрата хлорида олова (II) (0,01 г, 0,04 ммоль) добавили соляную кислоту (0,10 мл, 0,1 M) и разбавили водой (бескислородной) до 10 мл. Затем 100 мкл раствора Sn (=60 мкг Sn (II)) добавили во флакон 1, заморозили и затем высушили сублимацией.

c) Во второй заполненный аргоном флакон с ECDG (10 мг, 0,017 ммоль) добавили метанол (1,5 мл). Данную смесь количественно перенесли во флакон 1, содержащий Sn/буфер. Флакон погрузили в жидкий азот, чтобы заморозить растворитель и осуществили сублимационную сушку. Флакон должен храниться в темноте и в морозильной камере.

Необходимо отметить, что все флаконы должны быть заполнены Ar для обеспечения отсутствия CO₂ или O₂.

Протокол введения меченых атомов

a) Добавляют 500 мкл TcO^4-(или эквивалентный объем для получения активности, составляющей приблизительно 40 мКи) во флакон, содержащий ECDG, Sn и буфер.

b) Помещают на электрическую плитку и перемешивают в течение 15 мин при 70°C.

c) Проводят TLC и HPLC-QC.

Пример 3 - Синтез ECDG

Синтез L,L-этилендицистеина^.2HCl

L-Тиазолидин-4-карбоновую кислоту (30,0 г, 225 ммоль) медленно добавили к жидкому аммиаку (150 мл) в двухгорлой круглодонной колбе, оборудованной обратным холодильником (заполненным жидким азотом), впуском газообразного аргона и заполненной маслом ловушкой на выпуске. Смесь интенсивно перемешивали до полного растворения всего L-тиазолидин-4-карбоновой кислоты, после чего порциями в течение 15 минут добавляли очищенный металлический натрий (8,00 г, 349 ммоль, 1,50 эквивалента). По завершении добавления металлического натрия наблюдался темно-синий цвет, и данный раствор перемешивали в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем аккуратно добавляли хлорид аммония порциями, помещенными на кончике шпателя, пока смесь не стала иметь белый цвет, и погасили весь непрореагировавший металлический натрий. Затем аммиаку, использованному в качестве растворителя, дали испариться, и полученный остаток реакционной смеси растворили в воде (200 мл) и довели pH до уровня 3,0 с помощью концентрированной HCl, что привело к осаждению дигидрохлоридной соли этилендицистеина в виде белого твердого вещества. Продукт собрали путем вакуумной фильтрации, перекристаллизовали из кипящего этанола и высушили под высоким вакуумом с получением 14,7 г (38%) этилендицистеина^.2HCl 4.

Т.пл.: 252-254°C (в литературе указано 251-253°C [10]);

ЯМР-¹H (400 МГц, D₂O и 6,0 эквивалентов K₂CO₃):

δ_H=3,27 (2H, т, 2×CH-COOH), 2,70-3,00 (8H, м, перекрывающиеся сигналы 2×CH₂-N и 2×CH₂-SH), 2,62 (2H, м, 2×NH)².

ЯМР-¹³C (400 МГц, D₂O и 6,0 эквивалентов K₂CO₃):

δ_C=177,9 (COOH), 65,6 (CH-N), 44,8 (CH₂-Н), 26,8 (CH₂-SH).

Синтез S,Sʹ-дибензилэтилендицистеина^.2HCl 5

Этилендицистеин^.2HCl 4 (2,0 г, 6,0 ммоль) растворили в 2M NaOH (30 мл) при комнатной температуре и добавили этанол (40 мл), и полученный раствор интенсивно перемешивали в течение 20 мин. Бензилхлорид (1,48 г, 11,7 ммоль, 2,0 эквивалента) в диоксане (20 мл) добавили по каплям в раствор этилендицистеина, после чего перемешивали еще 30 мин по завершении добавления. Затем этанол и диоксан удалили под вакуумом, после чего значение pH полученной водной смеси было доведено до уровня pH 3,0 путем подкисления 5M HCl. Это привело к осаждению гидрохлоридной соли S,Sʹ-дибензилэтилендицистеина 5, которую отфильтровали под вакуумом и высушил под высоким вакуумом с получением выхода 85% (2,7 г).

Т.пл.: 227-228°C (в литературе указано 251-253°C);

ЯМР-¹H (400 МГц, D₂O/DMF (соотношение 6:4 об./об.) и 4,0 эквивалента K₂CO₃):

δ_H=7,16 (10H, м, 2×CH₂-C₆H₅), 3,8 (4H, c, 2×CH₂-C₆H₅), 3,14 (2H, т, CH-COOH), 2,44-2,85 (10H, м, перекрывающиеся сигналы 2×CH₂-Н, 2×CH2-SH и 2×NH);

ЯМР-¹³C (400 МГц, D₂O/DMF (соотношение 6:4 об./об.) и 4,0 эквивалента K₂CO₃):

δ_C=179,5 (COOH), 138,6 (Ar-C), 128,0 (Ar-C), 128,6 (Ar-C), 127,1 (Ar-C), 62,7 (CH-N), 46,6 (CH₂-Н), 35,9 (CH₂-C₆H₅), 34,4 (CH₂-SH).

Синтез полностью защищенного этилендицистеиндезоксиглюкозамина 7

S,S'-дибензилэтилендицистеин 5 (6,0 г, 11,5 ммоль) растворили в 10% растворе K₂CO₃ (150 мл) и охладили до 0°C в ледяной бане. После этого смесь бензилхлорформиата в диоксане (150 мл) быстро добавили в раствор, который затем перемешивали в течение 2 часов при 0°C. Затем охлаждающую баню удалили, и смесь перемешивали в течение 16 ч при комнатной температуре перед экстракцией диэтиловым эфиром (2×50 мл). Затем водный слой аккуратно подокислили до pH 3,0 с помощью 1 М HCl, что привело к осаждению белого соединения. Добавили этилацетат (200 мл), и осажденное твердое вещество растворили в указанном органическом слое при интенсивном перемешивании. Органический слой отделили, высушили над безводным сульфатом магния, отфильтровали, и удалили растворитель на роторном испарителе. Полученный бесцветный остаток затем высушили под высоким вакуумом с получением 5,75 г (выход 70%) неочищенного N,Nʹ-дибензилоксикарбонил-S,S'-дибензилэтилендицистеина 6 в виде аморфного твердого вещества. Это соединение являлось нестабильным для очистки и нерастворимым в испытанных растворителях для ЯМР и поэтому сразу использовалось в следующей реакции.

EC-Bn-CBz 6 (1,34 г, 1,87 ммоль) растворили в сухом хлороформе (30 мл) с триэтиламином (0,378 г, 3,74 ммоль, 2,0 эквивалента), и раствор охладили до -15°C в охлаждающей бане, содержащей суспензию хлорид натрия/лед, в атмосфере аргона. Добавили по каплям этилхлорформиат (0,406 г, 3,74 ммоль, 2,0 эквивалента), и перемешивали полученную смесь еще 15 мин. К указанной реакционной смеси добавили раствор тетраацетилглюкозамина (1,58 г, 4,11 ммоль, 2,2 эквивалента) и триэтиламина (0,416 г, 4,11 ммоль, 2,0 эквивалента) в сухом хлороформе (30 мл), при этом объединенную реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при 0°C, а затем 12 ч при комнатной температуре. Затем раствор последовательно промыли 1М HCl. (2×25 мл), 5% раствором K₂CO₃ (2×25 мл), H₂O (50 мл), высушили над безводным сульфатом магния, отфильтровали и удалили растворитель под вакуумом. Остаток очистили с помощью колоночной хроматографии (силикагель 60; подвижная фаза: MeOH/EtOAc/гексан) с получением 1,80 г (выход 70%) полностью защищенного этилендицистеиндезоксиглюкозамина 7 в виде белого кристаллического твердого вещества.

ЯМР-¹H (400 МГц, CDCl₃):

δ_H=8,62 (2H, с, 2×NH), 7,48-7,40 (20H, м, 2×OCH₂-C₆H₅, 2×SCH₂-C₆H₅), 6,04 (2H, д, тетрагидропирановый протон), 5,45-5,20 (6H, м, 2×OCH₂-C₆H₅, 2× перекрывающихся сигнала протонов тетрагидропирана), 4,48-4,07 (6H, м, 2×CH-CONH, 4× перекрывающихся сигнала протонов тетрагидропирана), 3,72-3,48 (12H, перекрывающиеся сигналы 4× протонов тетрагидропирана, 4× CH₂-N-, 2× CH₂-S-), 2,20-1,92 (24H, 8× OCH₃).

Синтез этилендицистеиндезоксиглюкозамина 3

Полностью защищенный этилендицистеиндезоксиглюкозамин 7 (1,00 г, 0,73 ммоль) растворили в жидком аммиаке (100 мл) в атмосфере аргона и добавили небольшими порциями очищенный металлический натрий (0,334 г, 14,5 ммоль, 20,0 эквивалентов). Реакционная смесь стала темно-синей, и ее перемешивали в течение 15 мин при комнатной температуре перед добавлением небольших количеств фенилацетата аммония, чтобы погасить непрореагировавший металлический натрий. Полученный молочно-белый раствор высушили в потоке газообразного аргона с получением сильно пахнущего твердого вещества кремового цвета. Неочищенный продукт обрабатывали в инертной атмосфере при отсутствии света. К веществу добавили 2-пропанол (200 мл) и интенсивно перемешивали в течение 10 мин перед вакуумной фильтрацией. Полученный осадок кремового цвета промыли диэтиловым эфиром и затем сушили в течение 2 часов под высоким вакуумом с получением 0,230 г (выход 53%) натриевой соли этилендицистеиндезоксиглюкозамина (ECDG) 3. Строение продукта было подтверждено данными ЯМР-¹H, HPLC и MS анализов, которые соответствовали литературным данным. C₂₀H₃₈O₁₂N₄S₂ требует наличия пика 590,665, в отношении которого наблюдался пик 591,1.

Список литературы

1. http://clinicaltrials.gov/show/NCT01394679, 20/08/2013

2. Zhang, Y.H., Bryant, J., Kong, F.L., Yu, D.F., Mendez, R., Kim, E.E. & Yang, D.J., 2012, Molecular Imaging of Mesothelioma with ^99mTc-ECG and ⁶⁸Ga-ECG, Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2012.

3. Zaman, M., 2007, ^99mTc-EC-deoxyglucose - a poor manʹs ¹⁸F-FDG: what will be the future of PET in molecular imaging?, European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, 34, 427-428.

4. http://www.health24.com/Medical/Cancer/Facts-and-figures/South-Africa-78-increase-in-cancer-by-2030-20120721, 20/08/2013.

5. Yang, D., Kim, C., Schechter, N.R., Azhdarinia, A., Yu, D., Oh, C., Bryant, J.L., Won, J., Kim, E. & Podoloff, D.A., 2003, Imaging with ^99mTc-ECDG targeted at the multifunctional glucose transport system: feasibility study with rodents, Radiology, 226, 465-473.

6. Zhang, Y., Mendez, R., Kong, F., Bryant, J., Yu, D., Kohanim, S., Yang, D. & Kim, E., 2011, Efficient synthesis of ^99mTc-ECDG for evaluation of mesothelioma, Journal of Nuclear Medicine, 52 (Suppl. 1), 1532

7. Ebrahimabadi, H., Lakouraj, M.M., Johari, F., Charkhlooie, G.A., Sadeghzadeh, M., 2006, Synthesis, characterization and biodistribution of ^99mTc-(EC-DG), a potential diagnostic agent for imaging of brain tumors, Iranian Journal of Nuclear Medicine, 14 (Suppl. 1), 36-37

8. Yang, D.J., 2008, US Patent Application US20080107598

9. Blondeau, P., Berse, C., Gravel, D., 1967, Dimerization of an intermediate during the sodium in liquid ammonia reduction of L-thizolidine-4-carboxylic acid, Canadian Journal of Chemistry, 45, 49-52

10. Assad, T., 2011, Synthesis and Characterization on novel benzovesamicol analogues, Turkish Journal of Chemistry, 35, 189-200.

11. Mangʹera, K.O & Verbruggen, A., 1999, Synthesis and Evaluation of β-Homocysteine Derivatives of ^99mTc-L,L-EC and ^99mTc-L,L-ECD, Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, 42, 683-699.

Настоящая группа изобретений относится к фармацевтической промышлености, а именно: к способу получения смеси для изготовления радиофармацевтического препарата и к способу получения набора для изготовления радиофармацевтического препарата. Способ получения смеси для изготовления радиофармацевтического препарата включает стадии: (i) предоставления флакона, содержащего буфер и восстановитель, при этом содержимое флакона находится в лиофилизированной форме; (ii) добавления лиганда к лиофилизированным компонентам флакона, при этом лиганд способен связываться с радионуклидом, где лиганд является растворимым в неводном растворителе, выбираемом из любого одного или более вариантов, включающих растворители с полярностью в диапазоне от гексана до глицерина; (iii) лиофилизация растворенного лиганда в условиях инертной атмосферы. Способ получения набора для изготовления радиофармацевтического препарата содержит стадии: (i) предоставления первого флакона, содержащего буфер и восстановитель, при этом содержимое флакона 1 находится в лиофилизированной форме; (ii) предоставления второго флакона, содержащего лиганд, при этом лиганд способен связываться с радионуклидом, где лиганд является растворимым в неводном растворителе, выбираемом из любого одного или более вариантов, включающих растворители с полярностью в диапазоне от гексана до глицерина; (iii) лиофилизация содержащегося во флаконе 2 растворенного лиганда в условиях инертной атмосферы. Предлагаемая группа решений поддерживает лиганд в стабильной форме до присоединения радионуклеотида. 2 н. и 17 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 пр.

1. Способ получения смеси для изготовления радиофармацевтического препарата, при этом способ включает стадии:

(i) предоставления флакона, содержащего буфер и восстановитель, при этом содержимое флакона находится в лиофилизированной форме;

(ii) добавления лиганда к лиофилизированным компонентам флакона, при этом лиганд способен связываться с радионуклидом, где лиганд является растворимым в неводном растворителе, выбираемом из любого одного или более вариантов, включающих растворители с полярностью в диапазоне от гексана до глицерина;

(iii) лиофилизация растворенного лиганда в условиях инертной атмосферы.

2. Способ получения набора для изготовления радиофармацевтического препарата, при этом способ содержит стадии:

(i) предоставления первого флакона, содержащего буфер и восстановитель, при этом содержимое флакона 1 находится в лиофилизированной форме.

(ii) предоставления второго флакона, содержащего лиганд, при этом лиганд способен связываться с радионуклидом, где лиганд является растворимым в неводном растворителе, выбираемом из любого одного или более вариантов, включающих растворители с полярностью в диапазоне от гексана до глицерина;

(iii) лиофилизация содержащегося во флаконе 2 растворенного лиганда в условиях инертной атмосферы.

3. Способ по п. 1, в котором стадия (i) также включает предоставление флакона, содержащего буфер, при этом буфер лиофилизируют в условиях инертной атмосферы; добавление к лиофилизированному буферу восстановителя, при этом содержимое флакона затем дополнительно лиофилизируют в условиях инертной атмосферы.

4. Способ по п. 1, в котором стадия (i) также включает предоставление флакона, содержащего восстановитель, при этом восстановитель лиофилизируют в условиях инертной атмосферы; добавление к лиофилизированному восстановителю буфера, при этом содержимое флакона затем дополнительно лиофилизируют в условиях инертной атмосферы.

5. Способ по п. 2, в котором стадия (i) также включает предоставление первого флакона, содержащего буфер, при этом буфер лиофилизируют в условиях инертной атмосферы; добавление к лиофилизированному буферу восстановителя, при этом содержимое первого флакона затем дополнительно лиофилизируют в условиях инертной атмосферы.

6. Способ по п. 2, в котором стадия (i) также включает предоставление первого флакона, содержащего восстановитель, при этом восстановитель лиофилизируют в условиях инертной атмосферы; добавление к лиофилизированному восстановителю буфера, при этом содержимое флакона затем дополнительно лиофилизируют в условиях инертной атмосферы.

7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором способ осуществления стадии (i) по п. 1 или 2 также включает предоставление добавок, выбираемых из любого одного или более вариантов, включающих слабый хелирующий агент, антиокислитель, солюбилизатор или наполнитель, при этом указанные добавки также присутствуют в лиофилизированной форме.

8. Способ по п. 1 или 2, в котором восстановитель до лиофилизации содержит смесь SnCl₂, или SnF₂, или тартрата олова (II), соляную кислоту и воду.

9. Способ по любому из пп. 1 или 2, в котором буфер до лиофилизации выбирают из любого одного или более вариантов, включающих фосфатный, лимоннокислый и ацетатный буферные растворы.

10. Способ по п. 7, в котором слабый хелирующий агент выбирают из любого одного или более вариантов, включающих DTPA, глюкогептонат, тартрат и медронат.

11. Cпособ по п. 7, в котором антиокислитель выбирают из любого одного или более вариантов, включающих гентизиновую кислоту, аскорбиновую кислоту и пара-аминобензойную кислоту.

12. Способ по п. 7, в котором солюбилизатор выбирают из желатина, или циклодекстрина, или их комбинация.

13.Способ по п. 7, в котором наполнитель выбирают из любого одного или более вариантов, включающих маннит, инозит, глюкозу и лактозу.

14. Способ по любому из пп. 1 или 2, в котором в качестве лиганда выбирают любой вариант из ECDG, ECD, HMPAO, MAG3 и MIBI; или их солей со щелочными металлами или щелочноземельными металлами.

15. Способ по любому из пп. 1 или 2, в котором растворитель выбирают из любого одного или более вариантов, включающих метанол, этанол, этилацетат, гексан, хлороформ, дихлорметан, толуол, диэтиловый эфир, тетрагидрофуран и ацетонитрил.

16. Способ по п. 15, в котором растворитель представляет собой метанол.

17. Способ по любому из пп. 1 или 2, в котором радионуклид выбирают из ^99mTc, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ⁹⁰Sr, ⁹⁰Y, ⁸⁹Sr, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ¹¹¹In, ¹⁵³Gd, ⁵⁹Fe, ⁵²Fe, ²²⁵Ac, ²¹²Bi, ⁴⁵Ti, ⁶⁰Cu, ⁶¹Cu, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ^195mPt, ^191mPt, ^193mPt, ^117mSn, ¹⁰³Pd, ^103mRh, ⁸⁹Zr, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁹Er, ⁴⁴Sc, ¹⁵⁵Tb, ¹⁴⁰Nd, ¹⁴⁰Pr, ¹⁹⁸Au, ¹⁰³Ru, ¹³¹Cs, ²²³Ra, ²²⁴Ra и ⁶²Zn.

18. Способ по п. 17, в котором радионуклид представляет собой ^99mTc, ¹⁰³Pd, ^103mRh, ^195mPt, ^193mPt, ¹⁹¹Pt.

19. Способ по п. 18, в котором радионуклид представляет собой ^99mTc.