СОЕДИНЕНИЕ, ЦЕЛЕНАПРАВЛЕННО ВОЗДЕЙСТВУЮЩЕЕ НА ПРОСТАТСПЕЦИФИЧЕСКИЙ МЕМБРАННЫЙ АНТИГЕН, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C07K5/62 C07K1/06 C07K1/107 A61K51/08 A61K103/30 A61P35/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области медицинской радиологии и молекулярной визуализации, в частности к соединению, целенаправленно воздействующему на простатспецифический мембранный антиген, а также к его получению и применению.

Уровень техники

Рак предстательной железы является вторым по распространенности видом рака среди мужчин во всем мире и шестым по распространенности видом рака среди мужчин в Китае. За последнее десятилетие частота заболеваемости раком предстательной железы в Китае быстро возросла, среднегодовой прирост уже достиг 12,07%. Рак предстательной железы описывают как «тихий убийца», его трудно обнаружить на ранних стадиях, и около двух третей пациентов к моменту постановки диагноза уже находятся на последней стадии. Экспрессия простатспецифического мембранного антигена (PSMA) в клетках рака предстательной железы в 100-1000 раз выше, чем в здоровых клетках, при этом его экспрессия еще выше в раковых клетках на поздних стадиях рака при антиандрогенной терапии. Эти характеристики делают PSMA идеальной мишенью для таргетной диагностики и терапии рака предстательной железы.

В декабре 2020 г. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США одобрило меченный галлием 68 PSMA-11 (⁶⁸Ga-PSMA-11), который является первым диагностическим средством для PET-визуализации, предназначенным для диагностики PSMA-положительных поражений у пациентов с раком предстательной железы. Впоследствии PSMA617, меченный с помощью 177-Lu, начали применять для терапевтического исследования PSMA-положительных поражений. Будучи низкомолекулярным препаратом ¹⁷⁷Lu-PSMA617 быстро выводится из крови. Из-за таких метаболических характеристик доза поглощения в опухоли является низкой, и время удерживания слишком коротко. Приблизительно 30% пациентов не реагируют на терапию с использованием ¹⁷⁷Lu-PSMA617. Для увеличения дозы, доставляемой к опухолям, были проведены исследования по соединению модифицированного малеимидом, усеченного производного синего Эванса с сульфгидрилсодержащим PSMA (¹⁷⁷Lu-EB-PSMA617). Благодаря связыванию с альбумином в крови период полувыведения зонда, нацеленного на PSMA, из кровотока значительно продлевается. Хотя стратегия модификации увеличила поглощение дозы опухолями и продлила время удерживания в опухолях, в последующих исследованиях были обнаружены новые проблемы. Среди пациентов, получающих терапию с использованием ¹⁷⁷Lu-EB-PSMA617 (3,52±0,58 ГБк), у 37,5% пациентов наблюдается анемия 3-4 степени, у 12,5% пациентов снижены лейкоциты, у 37,5% пациентов наблюдаются тромбоцитопения (Journal of Nuclear Medicine December 2020, 61 (12): 1772–1778). Данная ситуация указывает на то, что слишком длительный период полураспада ¹⁷⁷Lu-EB-PSMA617 в крови приводит к гематотоксичности и миелосупрессии и особенно имеет более серьезные побочные эффекты у пациентов, страдающих раком предстательной железы с тяжелым метастазированием в кости и функцией костного мозга в критическом состоянии. Из-за таких тяжелых побочных эффектов ценность таргетного препарата в клиническом применении будет значительно снижена. Благодаря этим исследованиям было признано, что нацеленный зонд, имеющий более длительный период полувыведения из кровотока, не лучше для терапии опухолей, а наоборот, позволяет контролировать время в кровотоке в разумных пределах, обеспечивая при этом высокий уровень поглощения в опухолях.

Следовательно, необходимо дополнительно оптимизировать зонд, нацеленный на PSMA, а время нахождения в кровотоке отрегулировать в соответствующем диапазоне, при этом обеспечивается высокое поглощение в опухолях, чтобы удовлетворить потребности нуклидной терапии и достичь максимального терапевтического эффекта.

Сущность изобретения

На основании вышеизложенного основной целью настоящего изобретения является разработка соединения, целенаправленного воздействующего на простатспецифический мембранный антиген. Соединение характеризуется высокой степенью поглощения в опухолях и соответствующим временем нахождения в кровотоке. Что позволит преодолеть не только недостатки в виде слишком быстрого метаболизма и слишком короткого времени удерживания в органе-мишени существующей малой молекулы ¹⁷⁷Lu-PSMA617, но также позволит избежать гематотоксичности и миелосупрессии, вызванных слишком длительным периодом полувыведения из крови молекулы, такой как ¹⁷⁷Lu-EB-PSMA617. Таким образом, нуклидная диагностика и терапевтические эффекты целенаправленного воздействия на PSMA улучшаются, и представленное соединение имеет действительную ценность и потенциал для клинического применения и популяризации.

Другой целью настоящего изобретения является создание меченного радиоактивным изотопом комплекса, целенаправленного воздействующего на простатспецифический мембранный антиген. Комплекс также характеризуется высоким поглощением в опухолях и соответствующим временем нахождения в кровотоке и может иметь такие преимущества, как высокий терапевтический эффект в отношении опухолей и низкие побочные эффекты.

Другая цель настоящего изобретения состоит в обеспечении способа получения меченного радиоактивным изотопом комплекса, целенаправленного воздействующего на простатспецифический мембранный антиген.

Другая цель настоящего изобретения состоит в обеспечении применения комплекса для нуклидной визуализации и терапии рака предстательной железы.

Технические решения для реализации вышеуказанной основной цели настоящего изобретения включают следующие два аспекта: синтез следующих лигандов и введение радиоактивных изотопов в них.

В первом аспекте в настоящем изобретении предусмотрено соединение, целенаправленно воздействующее на простатспецифический мембранный антиген, характеризующееся высоким поглощением в опухолях и соответствующим временем нахождения в кровотоке. Соединение имеет следующую структуру, показанную формулой (I),

Формула (I),

где

L₁ представляет собой -(X)_n-(CH₂)_m-(Y)_q-, где n представляет собой целое число от 0 до 12 (предпочтительно целое число от 0 до 6), X и Y независимо выбраны из лизина, глутаминовой кислоты или производной структуры, содержащей лизин и глутаминовую кислоту, m представляет собой целое число от 0 до 60 (предпочтительно целое число от 0 до 30), q представляет собой целое число от 0 до 12 (предпочтительно целое число от 0 до 6), при этом каждый CH₂ может быть независимо замещен -O-, -NH(CO)- или -(CO)-NH-;

L₂ представляет собой -(CH₂)_p-, где p представляет собой целое число от 0 до 30 (предпочтительно целое число от 0 до 12), при этом каждый CH₂ может быть независимо замещен -O-, -NH(CO)- или -(CO)-NH-, при условии, что отсутствует замещение двух смежных групп CH₂;

R₁ происходит из соединения, целенаправленно воздействующего на простатспецифический мембранный антиген, и имеет любую из следующих структур:

или ;

и R₂ представляет собой хелатирующую нуклиды группу и выбран из любой из следующих структур:

или

В решении настоящего изобретения R₁ в формуле (I) предпочтительно выбран из:

или

В предпочтительном решении настоящего изобретения R₁ в формуле (I) представляет собой:

, и R₂ представляет собой . То есть соединение имеет следующую структуру, показанную формулой (II):

Формула (II),

где L₁ предпочтительно выбран из:

-Lys-(CO)-CH₂CH₂-(CO)-NH-CH₂-(CO)-, -Lys-(CO)-CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)-(CO)-NH-CH₂-(CO)-, -Lys-(CO)-CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₂-(CO)-NH-CH₂-(CO)-, -Lys-(CO)-CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₄-(CO)-NH-CH₂-(CO)-, -(CO)-CH₂CH₂-(CO)-Lys-, -(CO)-CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)-(CO)-Lys-, -(CO)-CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₂-(CO)-Lys-, -(CO)-CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₄-Lys-, -Lys-(CO)-CH₂-(CO)-NH-CH₂-(CO)-, -Lys-(CO)-CH₂-(OCH₂CH₂)-O-CH₂(CO)-NH-CH₂-(CO)-, -Lys-(CO)-CH₂-(OCH₂CH₂)₃-O-CH₂(CO)-NH-CH₂-(CO)-, -(CO)-CH₂-(CO)-Lys-, -(CO)-(OCH₂CH₂)-O-CH₂(CO)-Lys- или -(CO)-CH₂-(OCH₂CH₂)₃-O-CH₂(CO)-Lys-.

В следующем предпочтительном решении настоящего изобретения соединение имеет следующую структуру, показанную формулой (II-1):

Формула (II-1).

В предпочтительном решении настоящего изобретения соединение также может иметь любую из следующих структур, показанных формулами (II-2) - (II-8):

Формула (II-2),

Формула (II-3),

Формула (II-4),

Формула (II-5)

или

Формула (II-6).

На основании вышеизложенного в настоящем изобретении дополнительно представлен способ получения соединения, представленного формулой (II-1). Представленный способ включает следующие стадии:

введение защитной Boc-группы на один конец 4,4'-диамино-3,3'-диметилбифенила с последующим обеспечением реакции с 4,6-диамино-5-гидрокси-1,3-нафталиндисульфоновой кислотой с получением усеченного производного синего Эванса; удаление защитной Boc-группы с обеспечением последующей реакции амидной конденсации с Nα-Fmoc-Nε-Boc-L-лизином; затем удаление защитной Boc-группы под воздействием TFA (трифторуксусной кислоты) с последующим обеспечением реакции с COOH-PEG₂-COOH и реакции с PSMA-617 в присутствии EDC (1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида) и NHS (N-гидроксисукцинимида); затем удаление защитной группы Fmoc с помощью пиперазина и, наконец, осуществление реакции с DOTA-NHS с получением соединения, имеющего следующую структуру, представленную формулой (II-1).

Предпочтительный способ получения соединения, представленного формулой (II-1), по настоящему изобретению, в частности, включает следующие стадии:

осуществление реакции 4,4'-диамино-3,3'-диметилбифенила (соединение 1) с ди-трет-бутилдикарбонатом с получением соединения 2; осуществление реакции соединения 2 с 4,6-диамино-5-гидрокси-1,3-нафталиндисульфоновой кислотой и нитритом натрия с получением усеченного производного синего Эванса (соединение 3); удаление защитной Вос-группы из соединения 3 с получением соединения 4; осуществление реакции соединения 4 с Nα-Fmoc-Nε-Boc-L-лизином в присутствии HATU и DIPEA посредством конденсации с получением соединения 5; растворение соединения 5 в растворе трифторуксусной кислоты для удаления защитной группы с получением соединения 6; растворение соединения 6 в N,N-диметилформамиде и осуществление реакции с COOH-PEG₂-COOH в присутствии HATU с получением соединения 7; затем осуществление реакции с PSMA-617 в присутствии EDC и NHS с получением соединения 8; затем удаление Fmoc-защитной группы с помощью пиперазина с получением соединения 9 и, наконец, осуществление реакции с DOTA-NHS с получением соединения 10, имеющего следующую структуру, показанную формулой (II-1).

Путь синтеза согласно вышеуказанным конкретным стадиям выглядит следующим образом:

Способы получения других соединений в растворах по настоящему изобретению аналогичны способу получения соединения 10, и получение может быть осуществлено в основном исходя из существующих традиционных способов со ссылкой на путь синтеза соединения 10.

В другом аспекте в настоящем изобретении дополнительно представлен меченный радиоактивным изотопом комплекс. Комплекс получают путем использования соединения, представленного формулой (I) по настоящему изобретению, в качестве лиганда и мечения лиганда радионуклидом. Меченный радиоактивным изотопом комплекс может быть использован в качестве нового радиоактивного диагностического и терапевтического зонда для опухолей, а именно радионуклидного диагностического зонда или радионуклидного терапевтического зонда. Нуклид может быть выбран из любого из ¹⁷⁷Lu, ⁹⁰Y, ¹⁸F, ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ⁶²Cu, ⁶⁷Cu, ⁸⁶Y, ⁸⁹Zr, ^99mTc, ⁸⁹Sr, ¹⁵³Sm, ¹⁴⁹Tb, ¹⁶¹Tb, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ²¹²Pb, ²¹³Bi, ²²³Ra, ²²⁵Ac, ²²⁶Th, ²²⁷Th, ¹³¹I, ²¹¹At или ¹¹¹In и представляет собой Bi, ²²³Ra, ²²⁵Ac, ²²⁶Th, ²²⁷Th, ¹³¹I, ²¹¹At или ¹¹¹In и предпочтительно представляет собой ⁶⁸Ga, ¹⁷⁷Lu или ⁹⁰Y.

Комплекс по настоящему изобретению предпочтительно имеет следующую структуру, показанную формулой (III),

Формула (III),

где

L₁ представляет собой -(X)_n-(CH₂)_m-(Y)_q-, где n представляет собой целое число от 0 до 12 (предпочтительно целое число от 0 до 6), X и Y независимо выбраны из лизина, глутаминовой кислоты или производной структуры, содержащей лизин и глутаминовую кислоту, m представляет собой целое число от 0 до 60 (предпочтительно целое число от 0 до 30), q представляет собой целое число от 0 до 12 (предпочтительно целое число от 0 до 6), при этом каждый CH₂ может быть независимо замещен -O-, -NH(CO)- или -(CO)-NH-;

L₂ представляет собой -(CH₂)_p-, где p представляет собой целое число от 0 до 30 (предпочтительно целое число от 0 до 12), при этом каждый CH₂ может быть независимо замещен -O-, -NH(CO)- или -(CO)-NH-, при условии, что отсутствует замещение двух смежных групп CH₂;

R₁ представляет собой структуру соединения, целенаправленно воздействующего на простатспецифический мембранный антиген, которая предусматривает структуру:

или и предпочтительно выбрана из:

или

и М представляет собой радионуклид, выбранный из любого из ⁶⁸Ga, ¹⁷⁷Lu или ⁹⁰Y.

Меченный радиоактивным изотопом комплекс согласно настоящему изобретению можно получить из соединения, содержащего радионуклид, и соединения, представленного формулой (I) по настоящему изобретению, с помощью множества существующих способов мечения. Способ мечения согласно настоящему изобретению предпочтительно включает следующий влажный способ или способ лиофилизации.

Схема мечения влажным способом включает: растворение соответствующего количества соединения, представленного формулой (I) по настоящему изобретению, в буферном растворе или деионизированной воде и добавление раствора радионуклида к полученному раствору для осуществления реакции в закрытых условиях в течение 5-40 мин с получением меченного радионуклидом комплекса;

или схема мечения по способу лиофилизации включает: растворение соответствующего количества соединения, представленного формулой (I) по настоящему изобретению, в буферном растворе или деионизированной воде; обработку полученного раствора посредством асептической фильтрации с последующей загрузкой в контейнер, лиофилизацией и укупориванием пробкой с получением лиофилизированного набора; а затем добавление соответствующего количества раствора уксусной кислоты или буферного раствора в лиофилизированный набор для растворения и добавление соответствующего раствора радионуклида для осуществления реакции в закрытых условиях в течение 5-40 минут с получением меченного радионуклидом комплекса. При этом контейнер для дополнительной упаковки предпочтительно представляет собой пробирку для криоконсервации или флакон с контрольным антибиотиком. Также в набор можно добавить вспомогательное вещество, такое как маннит, аскорбиновая кислота, в соответствии с условиями формирования лиофилизированного порошка в наборе, и набор может обеспечить оптимальный эффект формования путем регулирования дозы соединения, представленного формулой (I) по настоящему изобретению, и вспомогательного вещества.

Продукты, получаемые по схеме мечения влажным способом и схеме мечения лиофилизацией, могут быть дополнительно подготовлены для инъекций посредством традиционной обработки (например, хроматографического разделения и очистки, ротационного испарения для удаления растворителя, растворения остатков PBS, воды или физиологического раствора и асептической фильтрации).

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, где соединение 10, показанное формулой (II-1), используется в качестве лиганда, предпочтительным способом получения меченного радиоактивным изотопом соединения 10 является способ влажного мечения. Способ включает следующие стадии: растворение соединения 10 в буферном растворе или деионизированной воде; добавление свежего радиоактивного раствора для осуществления реакции в закрытых условиях при температуре 37-90°С в течение 5-40 мин с последующим охлаждением; добавление воды для разбавления реакционного раствора с последующим разделением и очисткой на хроматографической колонке Sep-Pak C18; промывка хроматографической колонки буферным раствором или водой для удаления непрореагировавших радиоактивных ионов, и осуществление промывки раствором хлористоводородной кислоты в этаноле или раствором этанола, и осуществление разведения физиологическим раствором или PBS с последующей асептической фильтрацией с получением инъекционного препарата на основе меченого радиоактивным изотопом комплекса, имеющего структуру, показанную формулой (IV), где радионуклид M представляет собой ⁶⁸Ga, ¹⁷⁷Lu или ⁹⁰Y.

Другим предпочтительным способом получения меченного радиоактивным изотопом соединения 10 согласно настоящему изобретению является способ лиофилизации. Способ включает: растворение соединения 10 и других необходимых реагентов в буферном растворе и обработку полученного раствора асептической фильтрацией с последующей загрузкой в пробирку для криоконсервации, лиофилизацией и герметизацией с получением лиофилизированного набора; добавление соответствующего количества буферного раствора в лиофилизированный набор для растворения и добавление свежеприготовленного радиоактивного раствора для осуществления реакции в закрытых условиях при температуре 37-120°С в течение 5-40 мин с последующим охлаждением; добавление воды для разбавления реакционного раствора с последующим разделением и очисткой на хроматографической колонке Sep-Pak C18; промывку хроматографической колонки буферным раствором или водой для удаления непрореагировавших радиоактивных ионов, и осуществление промывки раствором хлористоводородной кислоты в этаноле или раствором этанола, и осуществление разведения физиологическим раствором или PBS с последующей асептической фильтрацией с получением инъекционного препарата на основе меченого радиоактивным изотопом комплекса, имеющего структуру, показанную формулой (IV), где радионуклид M представляет собой ⁶⁸Ga, ¹⁷⁷Lu или ⁹⁰Y.

Формула (IV)

Другие химические вещества, используемые на вышеуказанных стадиях синтеза, являются коммерчески доступными продуктами.

Буферный раствор представляет собой вещество для стабилизации значения pH реакционного раствора и может представлять собой ацетат, лактат, тартрат, малат, малеат, сукцинат, аскорбат, карбонат, фосфат и их смесь.

В другом аспекте в настоящем изобретении также предусмотрено применение соединения, представленного формулой (I), или его фармацевтически приемлемой соли при получении препаратов для нуклидной терапии или средств визуализации опухолей у млекопитающих с высокой экспрессией PSMA.

В настоящем изобретении также предусмотрено применение меченного радиоактивным изотопом комплекса, представленного формулой (III), в нуклидной терапии и визуализации опухолей с высокой экспрессией PSMA у млекопитающих.

В предпочтительном применении по настоящему изобретению комплекс составляют в виде инъекционного препарата и затем вводят внутривенно пациентам-людям или млекопитающим с опухолями с высокой экспрессией PSMA.

В настоящем изобретении предусмотрены соединение, целенаправленно воздействующее на простатспецифический мембранный антиген, характеризующееся высоким поглощением в опухолях и соответствующим временем нахождения в кровотоке, и меченный радионуклидами комплекс на его основе, а также предусмотрен способ получения и способ мечения такого соединения. Результаты биологических испытаний показывают, что соединение характеризуется соответствующим периодом полувыведения из кровотока, высоким поглощением в опухолях и долгим периодом времени удерживания. Такая превосходная эффективность в настоящее время недоступна другим средствам, целенаправленно воздействующим на PSMA, и соединение подходит для нуклидной терапии и визуализации опухолей с высокой экспрессией PSMA.

Описание графических материалов

На фиг. 1 показаны результаты поглощения в опухолях через 24 часа после инъекции различных препаратов мышам с раком предстательной железы на модели с подкожной трансплантацией опухоли.

На фиг. 2 показано сравнение поглощения в крови в разные моменты времени после инъекции здоровым мышам соединения из примера 31, ¹⁷⁷Lu PSMA и ¹⁷⁷Lu EB PSMA 617.

На фиг. 3 показаны результаты распределения в тканях через 24 часа после инъекции соединения из примера 31 мышам с раком предстательной железы на модели с подкожной трансплантацией опухоли.

На фиг. 4 показаны результаты распределения в тканях через 24 часа после инъекции ¹⁷⁷Lu-EB-PSMA 617 мышам с раком предстательной железы на модели с подкожной трансплантацией опухоли.

На фиг. 5 представлена диаграмма, демонстрирующая визуализацию SPECT-CT в различные моменты времени после инъекции соединения из примера 31 здоровым мышам.

На фиг. 6 представлена диаграмма, демонстрирующая визуализацию SPECT-CT в различные моменты времени после инъекции здоровым мышам соединения (II-2), меченного с помощью ¹⁷⁷Lu, из примера.

На фиг. 7 показаны результаты поглощения в крови в различные моменты времени после инъекции здоровым мышам соединения (II-2), меченного с помощью¹⁷⁷Lu.

На фиг. 8 представлена диаграмма, демонстрирующая масс-спектр соединения 10, полученного в примере 1.

На фиг. 9 представлена диаграмма, демонстрирующая масс-спектр соединения (II-3), полученного в примере 3.

На фиг. 10 представлена HPLC-хроматограмма соединения 5, полученного в примере 1.

На фиг. 11 представлена HPLC-хроматограмма соединения 6, полученного в примере 1.

На фиг. 12 представлена HPLC-хроматограмма соединения 7, полученного в примере 1.

На фиг. 13 представлена HPLC-хроматограмма соединения 8, полученного в примере 1.

На фиг. 14 представлена HPLC-хроматограмма соединения 9, полученного в примере 1.

На фиг. 15 представлена HPLC-хроматограмма соединения 10, полученного в примере 1.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Технические решения по настоящему изобретению будут дополнительно проиллюстрированы и описаны ниже посредством конкретных вариантов осуществления вместе с прилагаемыми графическими материалами.

Пример 1. Получение соединения 10, представленного формулой (II-1)

Синтез соединения 2

В колбу объемом 100 мл по отдельности помещали 4,4'-диамино-3,3'-диметилбифенил (соединение 11) (2,12 г, 10,0 ммоль), ди-трет-бутилдикарбонат (2,2 г, 10,0 ммоль), N,N-диизопропилэтиламин (1,3 г, 10,0 ммоль) и 20 мл дихлорметана и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. После контроля завершения реакции посредством HPLC (время удерживания составляло 10,13 мин) осуществляли перегонку при пониженном давлении для удаления растворителя с получением неочищенного продукта. Затем осуществляли очистку на колонке с силикагелем (соотношение петролейного эфира и этилацетата составляло 5:1) с получением соединения 2 в виде белого твердого вещества с выходом 59%.

Синтез соединения 3

Соединение 2 (0,31 г, 1,0 ммоль) и 4 мл ацетонитрила по отдельности помещали в колбу объемом 50 мл на ледяной бане, в реакционную колбу по каплям добавляли 1,5 мл 2 М раствора хлористоводородной кислоты для осуществления реакции в течение 15 мин, к 2 мл воды добавляли нитрит натрия (0,068 г, 1,0 ммоль) для растворения и затем добавляли по каплям в реакционную колбу для осуществления реакции в течение получаса с получением раствора А для последующего использования. В другую реакционную колбу емкостью 50 мл на ледяной бане добавляли 4,6-диамино-5-гидрокси-1,3-нафталиндисульфоновую кислоту (0,33 г, 1,0 ммоль), карбонат натрия (0,105 г, 1,0 ммоль) и 5 мл воды с получением раствора B, раствор A медленно по каплям добавляли к раствору B и перемешивали для осуществления реакции в течение 2 ч на ледяной бане. Затем проводили очистку на колонке с обращенной фазой с последующей лиофилизацией с получением чистого соединения 3 с выходом 47%.

Синтез соединения 4

В условиях ледяной бани соединение 3 (0,52 г, 1,0 ммоль) растворяли в трифторуксусной кислоте. Систему нагревали до комнатной температуры для осуществления реакции в течение 2 ч, а после завершения реакции осуществляли перегонку при пониженном давлении для удаления растворителя с получением неочищенного продукта. Затем проводили очистку неочищенного продукта на колонке с обращенной фазой с последующей лиофилизацией с получением чистого соединения 4 с выходом 73%.

Синтез соединения 5

В колбу объемом 100 мл по отдельности помещали соединение 4 (0,54 г, 1,0 ммоль), Nα-Fmoc-Nε-Boc-L-лизин (0,46 г, 1,0 ммоль), HATU (0,38 г, 1,0 ммоль), N,N-диизопропилэтиламин (0,26 г, 2,0 ммоль) и 10 мл N,N-диметилформамида. Реакционную смесь перемешивали до завершения реакции и осуществляли перегонку при пониженном давлении для удаления растворителя с получением неочищенного продукта. Затем проводили очистку неочищенного продукта на колонке с обращенной фазой с последующей лиофилизацией с получением чистого соединения 5 с выходом 57%.

Синтез соединения 6

трет-Бутильную и Boc-защитные группы из соединения 5 удаляли с помощью смеси тиоанизола, 1,2-этандитиола, анизола и TFA (в соотношении 5:3:2:90) при комнатной температуре с получением соединения 6. После завершения реакции TFA удаляли потоком аргона и полученный продукт растворяли в 10 мл N,N-диметилформамида для дальнейшего использования.

Синтез соединения 7

К N,N-диметилформамидному раствору соединения 6 по отдельности добавляли COOH-PEG₂-COOH (0,23 г, 1,10 ммоль), HATU (0,38 г, 1,0 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламин (0,39 г, 3,0 ммоль). Систему перемешивали в течение ночи при комнатной температуре и завершение реакции контролировали по данным HPLC (время удерживания составляло 10,84 мин). Осуществляли перегонку при пониженном давлении для удаления растворителя с получением неочищенного продукта. Затем проводили очистку неочищенного продукта на колонке с обращенной фазой с последующей лиофилизацией с получением чистого соединения 7 с выходом 50% за две стадии.

Синтез соединения 8

В колбу объемом 50 мл по отдельности помещали соединение 7 (0,21 г, 0,2 ммоль), гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (0,04 г, 0,2 ммоль), NHS (0,02 г, 0,2 ммоль) и 10 мл N,N-диметилформамида. После осуществления реакции в течение 4 ч добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,06 г, 0,5 ммоль) и PSMA-617 (0,13 г, 0,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали и завершение реакции контролировали по данным HPLC (время удерживания составляло 12,16 мин). Осуществляли перегонку при пониженном давлении для удаления растворителя с получением неочищенного продукта. Затем проводили очистку неочищенного продукта на колонке с обращенной фазой с последующей лиофилизацией с получением чистого соединения 8 с выходом 59%.

Синтез соединения 9

В колбу объемом 25 мл с 5 мл DMF по отдельности помещали соединение 8 (0,16 г, 0,1 ммоль) и пиперидин (0,08 г, 10,0 ммоль). Процесс удаления защитных групп контролировали посредством HPLC до завершения реакции (время удерживания составляло 10,47 мин). Осуществляли перегонку при пониженном давлении для удаления растворителя с получением неочищенного продукта. Затем проводили очистку неочищенного продукта на колонке с обращенной фазой с последующей лиофилизацией с получением чистого соединения 9 с выходом 63%.

Синтез соединения 10

В колбу объемом 25 мл с 5 мл N,N-диметилформамида по отдельности помещали соединение 9 (0,13 г, 0,1 ммоль), DOTA-NHS (0,05 г, 0,1 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламин (0,04 г, 0,3 ммоль). Реакционную систему перемешивали для осуществления реакции при комнатной температуре и процесс удаления защитных групп контролировали посредством HPLC до завершения реакции (время удерживания составляло 11,35 мин). Осуществляли перегонку при пониженном давлении для удаления растворителя с получением неочищенного продукта. Затем проводили очистку неочищенного продукта на колонке с обращенной фазой с последующей лиофилизацией с получением чистого соединения 10 с выходом 61%. Описание характеристик структуры полученного соединения представлено на фиг. 8.

Путь синтеза согласно вышеуказанным стадиям выглядит следующим образом:

Примеры 2-6

Соединения в примерах 2-6 имеют структуры, показанные формулами (II-2)-(II-6) соответственно, и способы получения соединений могут ссылаться на способ получения в примере 1. Например, соединение COOH-PEG₂-COOH, реагирующее с соединением 6 в примере 1, было заменено на COOH-PEG₄-COOH, малоновую кислоту или другие подходящие соединения для получения соединений, представленных формулой (II-2) и формулой (II-3). Nα-Fmoc-Nε-Boc-L-лизин, реагирующий с соединением 4 в примере 1, заменяли Вос-глицином для получения соединений, представленных формулами (II-4)-(II-6), или PSMA-617, реагирующий с соединением 7 в примере 1, заменяли на PSMA-617-(Fmoc)Lys- с получением соответствующих структур следующим образом:

Формула (II-2),

Формула (II-3),

Формула (II-4),

Формула (II-5)

или

Формула (II-6).

Описание характеристик структуры соединения (II-3) представлено на фиг. 9.

Примеры 7-30

Обращаясь к способам получения примеров 1-6, получали соединение, представленное следующей формулой (I),

Формула (I).

Пример 31. Получение комплекса, меченного с помощью ¹⁷⁷Lu

Влажный способ. Раствор ацетата натрия, приблизительно 18,5-1,850 МБк ¹⁷⁷LuCl₃, добавляли к раствору уксусной кислоты-ацетата (1,0 г/л), содержащему 0,5 мл соединения 10 из примера 1, в центрифужной пробирке и реакцию осуществляли при 90°C в течение 20 мин. Небольшую колонку для разделения C18 сначала медленно промывали с помощью 10 мл безводного этанола, а затем промывали с помощью 10 мл воды. Полученный меченый раствор разбавляли с помощью 10 мл воды и затем отбирали образец в разделительную колонку. Немеченые ионы ¹⁷⁷Lu удаляли с помощью 10 мл воды и промывали с помощью 0,3 мл 10 мМ этанольного раствора HCl с получением комплекса, меченного с помощью ¹⁷⁷Lu. Промытый раствор разбавляли физиологическим раствором с последующей асептической фильтрацией с получением комплекса, меченного с помощью ¹⁷⁷Lu.

Способ лиофилизации. Раствор ацетата натрия, приблизительно 18,5-1,850 МБк ¹⁷⁷LuCl₃, добавляли в лиофилизированный набор, содержащий соединение 10 из примера 1, и равномерно перемешивали для осуществления реакции при 90°C в течение 20 мин. Небольшую колонку для разделения C18 сначала медленно промывали с помощью 10 мл безводного этанола, а затем промывали с помощью 10 мл воды. Полученный меченый раствор разбавляли с помощью 10 мл воды и затем отбирали образец в разделительную колонку. Немеченые ионы ¹⁷⁷Lu удаляли с помощью 10 мл воды и промывали с помощью 0,3 мл 10 мМ этанольного раствора HCl с получением промытого раствора комплекса, меченного с помощью ¹⁷⁷Lu. Промытый раствор разбавляли физиологическим раствором с последующей асептической фильтрацией с получением комплекса, меченного с помощью ¹⁷⁷Lu.

Экспериментальный пример. Анализ и эффект применения

1. HPLC-анализ и идентификация

HPLC-система была следующей. Для анализа использовали SHIMADZULC-20A и хроматографическую колонку C18 (YMC, 3 мкм, 4,6 × 150 мм). Детекцию выполняли при длине волны 254 нм и скорости потока 1 мл/мин в соответствии со следующим градиентом промывки: в промежутке 0-3 мин 10% ацетонитрила и 90% воды (50 мМ ацетат аммония) оставались неизменными; в промежутке 3-16 мин систему доводили до 90% ацетонитрила и 10% воды (50 мМ ацетат аммония); в промежутке 16-18 мин оставалось 90% ацетонитрила и 10% воды (50 мМ ацетат аммония); в промежутке 18-20 мин систему восстанавливали до 10% ацетонитрила и 90% воды (50 мМ ацетат аммония); в промежутке 20-22 мин удерживалось 10% ацетонитрила и 90% воды (50 мМ ацетат аммония).

В соответствии с вышеуказанной системой соединение 5, соединение 6, соединение 7, соединение 8, соединение 9 и соединение 10 из примера 1 были идентифицированы и проанализированы. Результаты идентификации и анализа показаны на фиг. 10, фиг. 11, фиг. 12, фиг. 13, фиг. 14 и фиг. 15 соответственно.

Меченный радиоактивным изотопом зонд, приготовленный в примере 31, использовали в качестве экспериментального средства ниже, а эксперименты по определению свойств зонда описаны следующим образом.

2. Эксперимент по поглощению комплекса, меченного с помощью ¹⁷⁷Lu, в модели с подкожной трансплантацией опухоли у мышей c раком предстательной железы.

Соединение из примера 31 или другой предшествующий радиоактивный зонд, целенаправленно воздействующий на PSMA, вводили мышам с раком предстательной железы на модели с подкожной трансплантацией опухоли и сравнивали результаты поглощения в опухолях и результаты распределения в тканях. Конкретный план заключается в следующем.

Мышей с раком предстательной железы на модели с подкожной трансплантацией опухоли (22RV1) случайным образом разделяли на 3 группы, а именно экспериментальную группу, контрольную группу А и контрольную группу В, по 3 мыши в каждой группе.

В соответствии со способом из примера 31 получали комплекс ¹⁷⁷Lu с чистотой более 95%. Комплекс получали путем мечения соединения 10 из примера 1 с помощью ¹⁷⁷Lu, который использовался в качестве препарата B для экспериментальной группы в эксперименте.

¹⁷⁷Lu-PSMA 617 с чистотой более 95% получали согласно известному способу, который использовался в качестве препарата А для контрольной группы А в эксперименте.

¹⁷⁷Lu-EB-PSMA 617 с чистотой более 95% получали согласно способу по примеру 8 из WO 2019/165200, который использовался в качестве препарата C для контрольной группы B в эксперименте.

5 МБк препарата B, препарата A и препарата C вводили внутривенно в хвосты мышей экспериментальной группы, контрольной группы A и контрольной группы B соответственно. После завершения инъекции в течение 24 часов мышей в каждой группе умерщвляли и препарировали для получения опухолевых тканей, крови или других тканей. Полученные ткани взвешивали и измеряли с помощью γ-счетчика для получения результатов радиоактивности образцов в экспериментальной группе, контрольной группе A и контрольной группе B. Измеренные данные вычитались из фона, время распада корректировалось, а затем были получены средние значения. Данные выражали как процент введенной дозы на грамм ткани (% ID/г) от поглощения дозы в тканях на грамм введенной дозы. Результаты показаны на фиг. 1, фиг. 3 и фиг. 4.

Из фиг. 1 можно видеть, что поглощение в опухолях комплекса ¹⁷⁷Lu (B) из примера 31 по настоящему изобретению составляет 23,46±0,63% ID/г через 24 часа после инъекции, что намного выше, чем поглощение в опухолях ¹⁷⁷Lu-PSMA 617 (A), введенного в контрольной группе A (7,60±1,22% ID/г), и в то же время ниже, чем поглощение в опухолях ¹⁷⁷Lu-EB-PSMA 617 (C), введенного в контрольной группе B (48,97±7,77% ID/г).

На фиг. 3 и 4 соответственно показано распределение в основных тканях через 24 ч после инъекции комплекса ¹⁷⁷Lu (В) из примера 31 по настоящему изобретению в экспериментальной группе и инъекции ¹⁷⁷Lu-EB-PSMA 617 (С) в контрольной группе B. Можно заметить, что поглощение комплекса ¹⁷⁷Lu из примера 31 по настоящему изобретению (фиг. 3) в почках через 24 ч после инъекции намного ниже, чем в группе ¹⁷⁷Lu-EB-PSMA-617 (фиг. 4).

3. Эксперимент с использованием комплекса, меченного с помощью ¹⁷⁷Lu, в случае здоровых мышей

Здоровых мышей случайным образом разделяли на экспериментальную группу I, экспериментальную группу II, контрольную группу А и контрольную группу В по 3 мыши в каждой группе.

В соответствии со способом из примера 31 получали комплекс ¹⁷⁷Lu с чистотой более 95%. Комплекс получали путем мечения соединения 10 из примера 1 с помощью ¹⁷⁷Lu, который использовался в качестве препарата B для экспериментальной группы I в эксперименте.

Что касается способа из примера 31, меченное с помощью ¹⁷⁷Lu соединение (II-2) получали путем замены соединения 10 на соединение (II-2) из примера 2, которое использовали в качестве препарата D для экспериментальной группы II в эксперименте.

¹⁷⁷Lu-PSMA 617 с чистотой более 95% получали согласно известному способу, который использовался в качестве препарата А для контрольной группы А в эксперименте.

¹⁷⁷Lu-EB-PSMA 617 с чистотой более 95% получали согласно способу по примеру 8 из WO 2019/165200, который использовался в качестве препарата C для контрольной группы B в эксперименте.

5 МБк препарата B, препарата D, препарата A и препарата C вводили внутривенно в хвосты мышей первой экспериментальной группы, второй экспериментальной группы, контрольной группы A и контрольной группы B соответственно. Поглощение в крови измеряли через 1 ч, 4 ч и 24 ч после завершения инъекции. Результаты показаны на фиг. 2 и фиг. 7. Визуализацию SPECT-CT выполняли через 1 ч, 4 ч, 24 ч и 48 ч часов после завершения инъекции. Результаты показаны на фиг. 5 и фиг. 6.

Из фиг. 2 видно, что во всех тестируемых временных точках (1 ч, 4 ч и 24 ч) поглощение в крови комплекса ¹⁷⁷Lu (В) из примера 31 по настоящему изобретению было выше, чем таковое в группе ¹⁷⁷Lu-PSMA 617 (А), но намного ниже, чем таковое в группе ¹⁷⁷Lu-EB-PSMA 617 (С). Из сравнения фиг. 7 и фиг. 2 видно, что во всех тестируемых временных точках (1 ч, 4 ч и 24 ч) поглощение в крови меченного с помощью ¹⁷⁷Lu соединения (II-2) намного ниже, чем таковое в группе ¹⁷⁷Lu-EB-PSMA 617 (C).

На фиг. 5 и фиг. 6 представлены диаграммы, демонстрирующие визуализацию SPECT-CT для здоровых мышей, которым вводили комплекс ¹⁷⁷Lu и меченное с помощью ¹⁷⁷Lu соединение (II-2) из примера 31 соответственно.

Таким образом, по сравнению с существующими зондами, целенаправленно воздействующими на PSMA, соединение, целенаправленно воздействующее на простатспецифический мембранный антиген, представленное в настоящем изобретении, характеризуется высокой степенью поглощения в опухолях и, что более важно, характеризуется соответствующим временем нахождения в кровотоке, таким образом, когда меченное радионуклидом соединение, целенаправленно воздействующее на простатспецифический мембранный антиген, по настоящему изобретению используется в терапии рака предстательной железы не только могут быть удовлетворены терапевтические потребности в поглощении в крови и в опухолях, но также значительно снижаются риски гематотоксичности и миелосупрессии. Соединение имеет большую ценность для клинического применения и популяризации и, как ожидается, будет применяться для нуклидной терапии и визуализации рака предстательной железы.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано с помощью общих описаний, конкретных вариантов осуществления и испытаний, приведенных выше, специалистам в данной области очевидно, что на основании настоящего изобретения могут быть сделаны некоторые модификации или улучшения. Следовательно, все модификации или улучшения, внесенные без отклонения от сущности настоящего изобретения, попадают в объем защиты настоящего изобретения.

В настоящем изобретении предложено соединение, целенаправленно воздействующее на простатспецифический мембранный антиген (PSMA), или его фармацевтическая соль. Указанное соединение имеет структуру, представленную формулой (II-1). В настоящем изобретении дополнительно предложены способ получения указанного соединения, меченный радиоактивным изотопом комплекс на основе соединения формулы (II-1) и способ его получения, а также фармацевтическая композиция. Указанное соединение и меченный радиоактивным изотопом комплекс характеризуются соответствующим временем нахождения в кровотоке, сравнительно высоким уровнем поглощения и удержания опухолью и подходят для использования в нуклидной терапии и визуализации опухолей с высокой экспрессией PSMA. 5 н. и 2 з.п. ф-лы, 15 ил., 32 пр. Формула (II-1)

1. Соединение, целенаправленно воздействующее на простатспецифический мембранный антиген, или его фармацевтически приемлемая соль, где молекулярная структура соединения, целенаправленно воздействующего на простатспецифический мембранный антиген, представлена формулой (II-1)

Формула (II-1).

2. Способ получения соединения, целенаправленно воздействующего на простатспецифический мембранный антиген, включающий следующие стадии:

введение защитной Boc-группы на один конец 4,4'-диамино-3,3'-диметилбифенила с последующим обеспечением реакции с 4,6-диамино-5-гидрокси-1,3-нафталиндисульфоновой кислотой с получением усеченного производного синего Эванса, представленного формулой:

;

удаление защитной Boc-группы с обеспечением последующей реакции амидной конденсации с Nα-Fmoc-Nε-Boc-L-лизином; затем удаление защитной Boc-группы под воздействием TFA с обеспечением последующей реакции амидной конденсации с COOH-PEG₂-COOH и реакции с PSMA-617 в присутствии EDC и NHS; затем удаление защитной группы Fmoc с помощью пиперидина и, наконец, осуществление реакции с DOTA-NHS с получением соединения, имеющего следующую структуру, представленную формулой (II-1):

Формула (II-1).

3. Меченное радиоактивным изотопом соединение, целенаправленно воздействующее на простатспецифический мембранный антиген, где соединение представляет собой комплекс, полученный посредством использования соединения, представленного формулой (I), по п. 1 в качестве лиганда и мечения лиганда радионуклидом,

при этом радионуклид представляет собой любой из ¹⁷⁷Lu, ⁹⁰Y, ¹⁸F, ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ⁶²Cu, ⁶⁷Cu, ⁸⁶Y, ⁸⁹Zr, ⁸⁹Sr, ¹⁵³Sm, ¹⁴⁹Tb, ¹⁶¹Tb, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ²¹²Pb, ²¹³Bi, ²²³Ra, ²²⁵Ac, ¹³¹I, ²¹¹At или ¹¹¹In.

4. Меченное радиоактивным изотопом соединение по п. 3, где радионуклид представляет собой ⁶⁸Ga, ¹⁷⁷Lu или ⁹⁰Y.

5. Способ получения меченного радиоактивным изотопом соединения, целенаправленно воздействующего на простатспецифический мембранный антиген, включающий следующие стадии: растворение соединения, представленного формулой (II-1), по п. 1 в буферном растворе или деионизированной воде и добавление раствора радионуклида к полученному раствору для осуществления реакции в закрытых условиях в течение 5-40 мин с получением меченного радионуклидом комплекса.

6. Фармацевтическая композиция для терапии рака предстательной железы, содержащая меченное радиоактивным изотопом соединение, целенаправленно воздействующее на простатспецифический мембранный антиген, по п. 3 или п. 4 и фармацевтически приемлемый носитель.

7. Композиция по п. 6, где фармацевтически приемлемый носитель выбран из адгезива, буфера, красителя, разбавителя, разрыхлителя, эмульгатора, ароматизатора, вещества, способствующего скольжению, смазывающего вещества, консерванта, стабилизатора, поверхностно-активного вещества, вспомогательного вещества для таблетирования, смачивающего средства или их комбинации.