СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА БИОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2019 года по МПК A61K35/12 B01D11/02 B01J19/10 

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к технологии получения тканевых препаратов, конкретнее биогенных препаратов из субпродуктов и боенских отходов от сельскохозяйственных животных.

Известен способ приготовления агаротканевого препарата (АТП) при котором используют селезенку крупного рогатого скота от здорового, только что убитого животного, которую помещают в холодильник на 4-5 дней при температуре от 0 до +4°С. Затем измельчают в стерильной мясорубке и разводят изотоническим раствором поваренной соли в соотношении: 1 часть ткани и 2 части раствора. Получаемую массу кипятят 1-1,5 ч, затем оставляют при комнатной температуре на 2-3 ч. Выкипевшую жидкость восполняют стерильным физиологическим раствором и вносят стерильный расплавленный агар-агар из расчета 0,1% к массе препарата. Агар-агар добавляют для придания тканевому препарату пролонгированных свойств. Затем жидкость фильтруют через двойной марлевый фильтр, разливают в стерильные флаконы и герметично закупоривают. Препарат проверяют на стерильность, безвредность и активность.

Недостатком способа следует считать наличие высокотемпературного режима (кипячение в течении 1,0-1,5 часов) в процессе экстракции, что ведет к коагуляции белков. В процессе изготовления АТП для пролонгированного действия требуется агар-агар, за счет его расплавления увеличивается время и себестоимость конечного продукта, средняя цена 1 кг агар-агар составляет 4586 рублей.

Известен способ получения средства с адаптогенной и противолучевой активностью из селезенки путем воздействия на нее водным экстрагирующим агентом при последующем отделении экстракта диализом и лиофилизацией. Воздействие водным экстрагентом дополняют одновременным воздействием низкочастотным ультразвуком 20-70 кГц, после чего осуществляют диализ (очистка) водного экстрагента, то есть вывод экстрагента из препарата путем использования мембран с величиной прохода для молекулярной массы 25000-50000. Весовое соотношение селезенки и экстрагента составляет селезенка : экстрагент 1:6-1:3. Использование ультразвука в процессе экстракции позволяет увеличить выход препарата (патент РФ №2152219 А61К 35/28).

Однако, данный способ характеризуется наличием использования экстрагента от которого необходимо избавиться по окончании экстракции в виду его вредного воздействия на организм. Кроме этого, данный способ удлиняет и усложняет процесс и затрудняет организацию производства биогенных лекарственных препаратов непосредственно на сельскохозяйственных предприятиях.

Известен способ получения биогенных лекарственных стимуляторов (тканевых препаратов) по В.П. Филатову. Для приготовления экстракта берут паренхиматозные органы или другие ткани от только что убитых здоровых животных и помещают их в холодильник, где выдерживают их в течение 5-7 дней при температуре +2- +4°С. Затем органы (ткани) измельчают в стерильной мясорубке и разводят изотоническим раствором хлорида натрия из расчета сырье : раствор 1:2. Смесь кипятят 1-1,5 часов, настаивают при комнатной температуре 2-3 часа, фильтруют, фасуют во флаконы, стерилизуют в автоклаве в течение часа при температуре 120°С (И.Е. Мозгов Фармакология. - 8-е изд., доп. и перераб. - М.: Агропромиздат, 1985. С. 261-266).

Недостатком способа следует считать наличие высокотемпературного режима (кипячение в течении 1,5 часов) в процессе экстракции, что ведет к коагуляции белков, сопровождающейся изменением важнейших свойств белка: потерей биологической активности (инактивация ферментов), способности белков к гидратации (при изменении конформации на поверхности белковой глобулы появляются гидрофобные группы, а гидрофильные оказываются блокированными в результате образования внутримолекулярных связей), повышенным агрегированием белковых молекул. Внешне агрегирование выражается по-разному: в малоконцентрированных белковых растворах - образование пены (хлопья на поверхности бульонов), в более концентрированных белковых растворах - образование сплошного геля при их одновременном уплотнении и отделении жидкости в окружающую среду (дегидратации). Это и обусловливает не высокую степень извлечения биологически активных веществ.

Известен способ производства биогенных лекарственных препаратов включающий использование сырья из отходов боенской продукции, выдержку сырья в холодильнике в течение 5-7 дней при температуре +2- +4°С, измельчение сырья при последующем его смешивании с экстрагентом, экстракцию, фильтрацию, фасовку и стерилизацию в автоклаве в течение часа при температуре 120°С, в качестве экстрагента используют активный раствор гипохлорита натрия в концентрации 300,0-600,0 мг/л в соотношении сырье: гипохлорит натрия 1:2-1:3, а экстракцию проводят при температуре +2- +4°С в течение 18-24 часов. Патент РФ №2682641 А61К 35/12-(прототип).

Задачей, на решение которой направлен заявленный способ является повышение выхода терапевтической эффективности биогенного препарата путем оптимизации технологических режимов и времени его производства.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе производства биогенных препаратов включающем использование сырья из субпродуктов и боенских отходов, выдержку сырья в условиях холодильника в течение 5-7 дней при температуре +2 -+4°С, измельчение сырья, разведение его активным раствором гипохлорита натрия в соотношении сырье: гипохлорит натрия 1:2-1:3 при последующей экстракции сырья в условиях холодильника при температуре +2 -+4°С, фильтрацию, фасовку и стерилизацию в автоклаве в течение часа при температуре 120°С, согласно заявленному изобретению, экстракцию в условиях холодильника проводят в течение 8-10 часов при последующем разведении экстракта до соотношения сырье: гипохлорит натрия 1:4-1:5 и экстракцией раствора под воздействием ультразвука частотой 20 кГц в течение 2,5-3 часов при температуре не выше 50°С. Активный раствор гипохлорита натрия используется в концентрации 300,0-600,0 мг/л.

Водный раствор гипохлорита натрия (NaOCI), является сильным окислителем и вступает в многочисленные реакции, независимо от кислотно-щелочного характера среды, этим самым проявляет свою бактерицидную активность. Это средство убивает микроорганизмы очень быстро даже при достаточно низких концентрациях и используется в регламентированных разведениях 300,0-600,0 мг/л (см. Наставление по применению активного раствора гипохлорита натрия, протокол №2 от 23 апреля 1999, утвержденного ветфармсоветом Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ). В процессе экстрагирования сырья, полученного из субпродуктов и боенских отходов, активность гипохлорита натрия теряется в связи с его фармакологическими свойствами и окончательно разрушается при нагревании, поэтому после термической стерилизации (автоклавирования), он превращается в обычный физиологический раствор, никаких токсических продуктов при этом не образуется, поэтому нет никаких противопоказаний использовать биогенный препарат, полученный данным способом для подкожных и внутримышечных введений животным.

Для разработки технических параметров заявленного способа было проведено ряд исследований. В первом опыте выявлялся оптимальный момент включения в технологическую цепочку ультразвукового воздействия на экстрагируемую субстанцию. В опыте было задействовано сырье: печень, селезенка, лимфоузлы, матки с плодом (2-3 мес.) и определялось содержание сухого вещества в экстрактах каждые 2 часа при соотношении сырье: гипохлорит натрия: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 при температуре +2-+4°С в условиях холодильника т.е по прототипу при расширенной степени разведения. Результаты опыта представлены в таблице 1.

Как показали исследования процесс экстракции значительно замедлялся после 8-10 часов экстрагирования в условиях холодильника (сотые доли процента в час), в отличии от интенсивности процесса в течение первых восьми часов, где в среднем прибавка составляла 0,17% в час. Следует отметить так же динамику снижения выхода сухого вещества по мере увеличения степени разведения (минимальное значение выхода продукта при разведении 1:4-1:5). Следовательно, целесообразным приемом следует считать ввод в технологическую цепочку ультразвукового воздействия с 8-10 часов экстрагирования, то есть начиная с момента падения интенсивности процесса, когда исчерпан потенциал экстрагента.

Во втором опыте было определено оптимальное время воздействия ультразвука частотой 20 кГц на выход сухого вещества при тех же степенях разведения (от 1:1 до 1:5) и составе сырья. После 8 часов экстракции в условиях холодильника, экстракт подвергали ультразвуковому воздействию (табл. 2). Механическая работа ультразвука усиливает диффузию растворителей в биологические ткани. Физико-биологическое действие ультразвука на биологические объекты прежде всего связано, с усилением проницаемости клеточных мембран и диффузные процессы изменяют концентрацию водородных ионов в тканях, вызывает расщепление высокомолекулярных соединений. В химическом отношении продукты распада ионизированных молекул воды в тканях крайне активны, именно их большой активностью обусловлен ряд общебиологических эффектов, проявляющихся под влиянием ультразвука. Кавитация приводит к разрыву молекулярных связей в биоматериале и развитию окислительно-восстановительных реакций.

Исследования показали, что оптимальным временем воздействия ультразвуком на ход процесса экстракции следует считать 2,5-3 часа при этом выход сухого вещества находится на уровне 3,29-3,94%. Кроме этого, оказалось, что ультразвук более эффективно воздействует на выход продукта в экстрактах со степенью разведения 1:4-1:5, что предопределило в дальнейшем, по ходу разработки способа, дополнительное разведение экстракта перед началом воздействия ультразвуком, так как процесс экстрагирования до 8-10 часа осуществлялся при степени разведения 1:2-1:3. Данное обстоятельство, на наш взгляд обусловлено тем, что к 8-10 часам экстрагирования экстракт становится более насыщенным, что затрудняет воздействие ультразвука на клеточные структуры. Следует отметить, что воздействие ультразвукового поля на биоматериал позволяет увеличить процентное содержание экстрагируемого вещества в экстракте при разведении 1:4-1:5, тем самым увеличивая и его концентрацию (сухое вещество) и количество (объем) экстракта, то есть выход продукта в целом из единицы сырья.

При распространении ультразвука в биологических средах происходит его поглощение и преобразование акустической энергии в тепловую. Биологическое воздействие ультразвуковых волн на биоматериал связывают в большей степени с явлением кавитации, то есть процесса образования в жидкой среде полостей, заполненных парами самой жидкости, которые возникают под действием больших разрывающих напряжений и в следующее мгновенье захлопываются, сопровождаясь большими давлениями и локальным нагревом среды. Импульсы давления, возникающие при смыкании кавитационных каверн, способны разрушать не только твердые и жидкие тела, но и многие биообъекты, в частности микроорганизмы, тем самым еще в процессе производства свести до минимума риск развития нежелательных последствий жизнедеятельности банальной микрофлоры. В заявленном способе, с целью предотвращения коагуляции белков при разогреве экстракта под воздействием ультразвука, процесс экстракции проводят при температуре не выше +50°С используя для охлаждения проточную водяную рубашку в период ультразвукового воздействия.

Способ осуществляется следующим образом:

Пример. Для приготовления биогенного препарата в асептических условиях брали печень, селезенку, лимфоузлы, матку с плодом (2-3 мес.) от убитых здоровых животных и помещали сырье в холодильник, где выдерживают 7 дней при температуре +2-+4°С. Затем органы измельчали на мясорубке и разводили раствором активного гипохлорита натрия в концентрации 370,0 мг/л в соотношении 1 кг биоматериала в 3 л гипохлорита натрия (соотношение сырье: гипохлорит натрия 1:3), тщательно перемешивали и помещали в бытовой холодильник на 8 часов при температуре +2-+4°С. По истечении указанного времени экстракт разбавляли одним литром гипохлорита натрия (соотношение сырье: гипохлорит 1:4) и переносили в ультразвуковую установку (ультразвуковой технологический аппарат серии «Волна» УЗТА- 0,63/22-ом) на 3 часа, охлаждая содержимое сосуда с экстрактом до +50°С, используя водяную рубашку. По истечению указанного срока полученный экстракт в асептических условиях фильтровали, фасовали в стерильные флаконы, и стерилизовали в автоклаве в течение часа при температуре 120°С.

Для проведения производственных испытаний были изготовлены опытные партии тканевых препаратов по прототипу и заявленному способу. Результаты испытаний представлены ниже.

Сравниваемые тканевые препараты вводили за 10-15 дней до предполагаемого отела сухостойным животным и первый день сразу после отела подкожно в область средней трети шеи в дозе 20 мл. В опытной группе находилось 90 коров, в контрольной (прототип) 80 животных. Результаты сравнительных испытаний заявленного способа получения биогенных препаратов и способа по прототипу приведены в таблице 3.

Считается оптимальной нормой, если отделение последа происходит в течение 2-6 часов после отела, иногда послед выходит позже, через 6-8 часов. Патологией считается, когда послед задерживается более 10-12 часов. Длительное пребывание его в утробе коровы сопряжено с риском заражения матки и родовых путей пагубной микрофлорой. В оптимальные сроки отделение последа от 5,0-56,2% отмечали после введения тканевого препарата, изготовленного по прототипу, а заявленным способом, соответственно от 7,8-68,9%. Задержание последа свыше 12 часов отмечали у 7 контрольных коров которым вводили тканевой препарат, приготовленный по прототипу, что в 2,6 раза превышает этот показатель в опытной группе.

В послеродовой период, сразу после отела тканевой препарат вводили с профилактической целью задержания последа в дозе 20 мл подкожно в. среднюю треть шеи, и через каждые 10 дней 3-4 раз в той же дозе для уменьшения сроков инволюции матки и времени восстановления половой цикличности. При этом учитывали сроки прихода в охоту и процент плодотворных осеменений, таблица 4.

Продолжительность сервис периода в норме не должно превышать 95 суток. Но следует стремиться к оптимальным срокам прихода в охоту и плодотворным осеменениям 45-60 дней, тогда интенсивность производства не страдает. По оптимальным срокам восстановления половой цикличности заявленный препарат превосходит прототип на 8,0%, по количеству плодотворных осеменений, соответственно на 6,5%.

Таким образом, использование заявленного способа получения биогенных препаратов позволяет повысить выход и терапевтическую эффективность препаратов при снижении времени его производства.

Изобретение относиться к фармацевтической промышленности, а именно к способу производства биогенных препаратов. Способ производства биогенного препарата включает использование сырья из субпродуктов и боенских отходов, выдержку сырья в условиях холодильника, измельчение сырья, разведение его активным раствором гипохлорита натрия в при последующей экстракции сырья в условиях холодильника, при этом экстракцию проводят в условиях холодильника при последующем разведении экстракта гипохлоритом натрия и обработкой полученного экстракта ультразвуком, далее осуществляют фильтрацию полученного экстракта, фасовку и стерилизацию в автоклаве при определенных условиях. Вышеописанный способ позволяет увеличить выход конечного продукта и повысить его терапевтическую эффективность. 1 з.п. ф-лы, 4 табл., 1 пр.

1. Способ производства биогенного препарата, включающий использование сырья из субпродуктов и боенских отходов, выдержку сырья в условиях холодильника в течение 5-7 дней при температуре +2 -+4°С, измельчение сырья, разведение его активным раствором гипохлорита натрия в соотношении сырье : гипохлорит натрия 1:2-1:3 при последующей экстракции сырья в условиях холодильника при температуре +2…+4°С, фильтрацию, фасовку и стерилизацию в автоклаве в течение часа при температуре 120°С, отличающийся тем, что экстракцию в условиях холодильника проводят в течение 8-10 часов при последующем разведении экстракта до соотношения сырье : гипохлорит натрия 1:4-1:5 и экстракцией раствора под воздействием ультразвука частотой 20 кГц в течение 2,5-3 часов при температуре не выше +50°С.

2. Способ по п. 1 отличающийся тем, что активный раствор гипохлорита натрия используется в концентрации 300,0-600,0 мг/л.