ПОЛИВАЛЕНТНАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ АНАЭРОБНОЙ ЭНТЕРОТОКСЕМИИ МОЛОДНЯКА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СПОСОБ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2019 года по МПК A61K39/08 A61K39/116 A61P31/00 

Изобретение относится к области ветеринарной медицины и биотехнологии.

Инфекционная анаэробная энтеротоксемия (Entertoxaemia infectiosa anaerobica) - острая, неконтагиозная токсикоинфекция, характеризующаяся общей интоксикацией, расстройством деятельности желудочно-кишечного тракта, поражением почек и нервными явлениями. Возбудителем анаэробной энтеротоксемии являются анаэробные, спорообразующие, неподвижные, крупные (4-6×1,5 мкм) грамположительные палочки из группы Cl. perfringens, располагающиеся одиночно, реже цепочками и группами. Различают шесть типов Cl. perfringen - A, B, C, D, E и F, сходные по культурально-морфологическим свойствам, но отличающиеся по патогенным особенностям и антигенной культуре образуемого ими токсина (Нестеров И.А. Эпизоотологический анализ факторов патогенеза возбудителя перфрингеоза животных / Вестник ветеринарии. 2011/2. №57. С. 23-27.). Согласно литературным данным, а также результатам собственных исследований, у молодняка анаэробную энтеротоксемию вызывают Cl. perfringen типов A, C и D.

Болезнь широко распространена на территории нашей страны и за рубежом. Заболевание проявляется спорадическими случаями, но имеют четкое постоянство. Характеризуется высокой летальностью, что приводит к значительному экономическому ущербу для хозяйств (Ветеринария Кубани / Болоцкий И.А., Васильев А.К., Семнцов В.И., и др. 2009. №4. С. 12-15; Ferrarezi М.С., Cardoso Т.С., Dutra I.S. Genotyping of Clostridium perfringens isolated from calves with neonatal diarrhea. // Anaerobe. 2008. №14. 328-331; Lebrun M., Filee P., Mousset В., Desmecht D., Galleni M., Mainil J.G., Linden A. The expression of Clostridium perfringens consensus beta2 toxin is associated with bovine enterotoxaemia syndrome. // Vet. Microbiol. 2007. №120. 151-157.).

Ликвидация анаэробной энтеротоксемии молодняка крупного рогатого скота осуществляется двумя направлениями: специфической профилактикой и лечением, вакцинация обеспечивает невосприимчивость к заболеванию иммунизированных животных за счет образующегося иммунитета после введения препарата на достаточно длительный срок, лечение при данном заболевании мало эффективное и трудоемкое. В связи с этим основным методом борьбы является вакцинация стельных коров, которая обеспечивает сохранность новорожденных телят за счет колострального иммунитета.

Исследование по совершенствованию специфической профилактики ведется с 1936 г, но вопрос по разработке эффективной вакцины против анаэробной энтеротоксемии молодняка крупного рогатого скота остается актуальным.

В настоящее время для иммунизации крупного рогатого скота против анаэробной энтеротоксемии предложен широкий спектр препаратов, как зарубежного, так и отечественного производства, например:

- вакцина «Ван Шот Ультра 8», состоящей из двух компонетов: лиофилизированного - лейкотоксин Mannhemia (Pasteurella) haemolytica, и жидкого - бактерин-токсоиды Cl. chauvoei, Cl. septicum, Cl. haemolyticum, О. novyi, Cl. sordellii, Cl. perfringens типов C и D, инактивированные формальдегидом, с добавлением адъюванта Стимуген. Иммунитет против клостридиозов ипневмоний, вызванных М. haemolytica, формируется у животных через 3 недели после двукратной вакцинации и сохраняется не менее 12 месяцев. Иммунизируют только клинически здоровых животных с 45-дневного возраста. Вакцину вводят подкожно двукратно с интервалом 4-6 недель в объеме 2 см³.

- вакцина «Токсипра Плюс» состоит избактерин-токсоидов Cl. perfringens типов B, C и D, Cl. novi тип B, Cl. septicum, Cl. chauvoei, Cl. tetani. Препарат вызывает формирование иммунного ответа у животных к клостридиозам через 21 день после двукратного введения, который сохраняется 12 месяцев.

- вакцина «Мультиклос» изготовлена из анатоксинов, полученных при культивировании штаммов Cl. septicum, Cl. novyi тип B, Cl. sordellii, Cl. perfringens типов C и D, а также инактивированных культур Cl. chauvoei и Cl. haemolyticum, с добавлением 25 мг алюмокалиевых квасцов в качестве адъюванта и 5 мг фенола в качестве консерванта.

Недостатком представленных зарубежных вакцин является многокомпонентность и высокая стоимость, а также не полное соответствие антигенного состава этиологической структуре клостридиозов в РФ. Отсутствием антигена Cl. perfringens типа A - одного из основных возбудителей, вызывающих анаэробную энтеротоксемию у молодняка крупного рогатого скота, делает их малоэффективными в хозяйствах, где превалирует возбудитель этого типа.

В Российской Федерации существуют похожие препараты против клостридиозов крупного рогатого скота:

- вакцина «Антокс-9» состоящая из смеси токсинов штаммов Cl. perfringens типов В (С) и Д, Cl. oedematiens и бактериальных клеток штамма Cl. septicum инактивированных формалином и осажденных гидратом окиси алюминия.

- известная вакцина «Клостбовак-8» изготовлена из штаммов Cl. chauvoei, Cl. septicum, анатоксинов Cl. novyi (oedematiens) тип В, Cl. perfringens типов A, C и D, Cl. tetani, инактивированных формальдегидом (0,5%), с добавлением гидрата окиси алюминия - 15%.

Иммунизируют крупный рогатый скот и овец в возрасте от 45 дней. Вакцину вводят подкожно: овцам в бесшерстный участок под локтевым суставом, крупному рогатому скоту в заднюю треть шеи двукратно с интервалом 21-28 дней в объеме 3 мл.

Ревакцинируют животных ежегодно однократно по аналогичной схеме. Телят и ягнят дополнительно однократно вакцинируют в возрасте 6 месяцев.

Все перечисленные отечественные вакцины предназначены для специфической профилактики животных с 1,5 месячного возраста, а также стельных коров.

Однако, несмотря на актуальность в настоящее время ассоциированных вакцин, следует отметить, что высокое содержание антигенов отрицательно влияет на безвредность применения препаратов, а также создает менее выраженный иммунитет к каждому из компонентов. Поэтому, в хозяйствах неблагополучных по анаэробной энтеротоксемии, для вакцинации стельных коров с целью создания колострального иммунитета у новорожденных телят, целесообразно применять вакцины против отдельных видов возбудителей. В настоящее время такие препараты отечественного производства отсутствуют, хотя их использование в стационарно неблагополучных хозяйствах очень эффективно.

Изобретение направлено на профилактику анаэробной энтеротоксемии молодняка крупного рогатого скота.

Вакцина против анаэробной энтеротоксемии молодняка крупного рогатого скота содержит следующие компоненты: анатоксины Clostridium perfringens типов A - №28, C - №3 и D - №91, формалин с содержанием 37% формальдегида и 3% раствора гидроокиси алюминия. Способ применения вакцины включает подкожное введение препарата для иммунизации нетелей и стельных коров с целью профилактики анаэробной энтеротоксемии у молодняка крупного рогатого скота. Вакцину вводят в дозе 5 см³. При первичной вакцинации животных иммунизируют двукратно с интервалом 21-28 дней. В последующем ранее вакцинированным животным препарат вводят однократно в дозе 5 см³. Изобретение повышает сохранность молодняка и защищает неблагополучные хозяйства от заболевания инфекционной анаэробной энтеротоксемии крупного рогатого скота.

Применение данной вакцины вызывает образования напряженного иммунитета у молодняка и взрослого поголовья крупного рогатого скота продолжительностью 12 месяцев после двукратной вакцинации. У телят, полученных от вакцинированных коров, формируется колостральный иммунитет, продолжительностью до 14 дней.

Используемые штаммы характеризуются следующими свойствами:

Культуральные свойства - на среде Китт-Тароцци производственные штаммы Cl. perfringens дают бурный рост с сильным равномерным помутнением бульона и обильным газообразованием; на глюкозо-кровяном агаре образуют крупные, гладкие, серо-белого цвета, выпуклые колонии с ровными краями, окруженные зоной гемолиза.

Морфологические свойства: в мазках из культуры бактерии представляют собой грамположительные, неподвижные, прямые, короткие, толстые палочки, с округленными концами. Размер 4-6×1,0-1,5 мкм. Образуют большие овальные споры, располагающиеся центрально или субтерминально. В процессе лабораторного и производственного культивирования споры и капсулы обычно не образуются.

Ферментативные свойства: ферментирует глюкозу, лактозу, сахарозу с образованием кислоты и газа, не ферментирует маннит и дульцит. Культуры токсичны, вызывают гибель белых мышей в течение 12 часов.

Пример 1. При изготовление вакцины использовали наиболее иммуногенные производственные штаммы Cl. perfringens типов A - №28, C - №3 и D - №91, которые выращивали на мясо-казеиновой среде в реакторе при +37°C в течение 4-16 часов в зависимости от времени токсинообразования конкретного штамма. Токсичность культур определяли на белых мышах, которым внутривенно вводили культуральную жидкость в объеме 0,5 см³, при наличии токсина гибель животных должна была произойти в течение 24 часов.

Для изготовления вакцины использовали культуры, образующие в течение установленного требованиями промышленных регламентов времени, высокоактивные токсины с накоплением: Cl. perfringens тип D не менее 2000 ДЛМ/см³; тип А не менее 100 ДЛМ/см³ и тип C не менее 6000 ДЛМ/см³ для белых мышей массой 16-18 гр. После проведенного культивирования, в реактор с культурой добавили формалин с содержанием 37% формальдегида, предварительно установив pH 7,2. Инактивацию проводили при +37°C в течение 7 суток с ежедневным перемешиванием 3-4 раза. Инактивированные культуры центрифугировали для удаления бактериальных клеток, а надосадок использовали для получения антигена.

Для осаждения антигенов в культуральную жидкость добавили 18% трехпроцентного стерильный раствор гидроокиси алюминия, тщательно перемешали и оставили при температуре +20°C на 2-5 суток до полного просветления надосадочной жидкости, затем декантировали около 70% надосадочной жидкости. Полученную инактивированную вакцину против анаэробной энтеротоксемии молодняка крупного рогатого скота расфасовывали во флаконы емкостью 100-200 см³, контролировали внешний вид, наличие посторонних примесей, стерильность, безвредность и иммуногенную активность.

Пример 2. Проведения контроля лекарственного средства в лабораторных условиях по следующим показателям: внешний вид, наличие посторонних примесей, стерильность, остаточную токсичность, безвредность и иммуногенную активность.

Внешний вид вакцины - представляет собой суспензию желто-серого цвета, при хранении которой образуется светло-серый осадок, легко разбивающийся в равномерную взвесь. Во флаконах отсутствует плесень и механические примеси.

Для определения контроля стерильности вакцины проводили в соответствии с ГОСТом 28085-2013 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности». Посев вакцины производилина питательные среды - МПБ, МПА, агар Сабуро, Китт-Тароцци. Инкубировали посевы на среде Сабуро при +22°C, а остальные среды при +37°C. Наличие роста определяли визуально. Вывод вакцина стерильная, рост бактериальной и грибной микрофлоры на питательных средах отсутствовал в течение 14 суток наблюдения.

Остаточную токсичность проверяли путем подкожного введения 10 белым мышам инактивированной вакцины в разведении 1:10 физиологическим раствором, в дозе 0,5 см³. Срок наблюдения за животными составил 10 дней. После окончания опыта все белые мыши живы и клинически здоровы. Отсюда следует вывод, что разработанная вакцина не токсичная для лабораторных животных.

Определение безвредности препарата проводили на 2 морских свинках массой 350-400 гр. Вакцину вводили подкожно в дозе 1 см³. Препарат считали безвредным, если морские свинки в течение 10 суток после введения вакцины оставались живы и клинически здоровы. Результат, вакцина безвредная, не вызывает поствакцинальные осложнения на лабораторных животных.

Определение иммуногенной активности вакцины против анаэробной энтеротоксемии проверяли на 5 кроликах. Препарат вводили подкожно в дозе 2 см³, через 21 день вакцинацию повторили. На 14 дней после последнего введения препарата проводили взятия крови у иммунизированных кроликов из ушной вены. Полученную от вакцинированных кроликов сыворотку крови исследовали на наличие титра антитоксических антител в реакции нейтрализации токсинов Cl. perfringens. Сыворотку, разливали по пробиркам по 1 мл, а затем в нее добавляли токсины различных типов клостридий в равном по объему количестве с предварительно установленной активностью, оставили для связывания при +20°C на 45 минут, затем вводили внутривенно по 0,5 см³ пяти белым мышам на каждую смесь. Параллельно ставили контроль, белым мышам ввели оттитрованные смертельные дозы токсинов бактерий Cl. perfringens типов A, C и D. Вакцину считают активной против энтеротоксемии, если сыворотка крови от иммунизированных кроликов предохраняет не менее четырех мышей из пяти, взятых в опыт, при гибели всех мышей контрольной группы. Полученные нами данные указаны в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что вакцина обладает высокой антигенной активностью. Сыворотка крови кроликов, двукратно иммунизированных вакциной, предохраняет от гибели 80-100% подопытных белых мышей, при 100% гибели контрольных животных.

Полученная инактивированная вакцина отвечает современным требованиям качества, являясь полностью безопасной при введении животным и высокоэффективной, что позволяет индуцировать у животных иммунитет высокой степени напряженности.

Пример 3. Определение профилактической эффективности инактивированной вакцины против анаэробной энтеротоксемии молодняка крупного рогатого скота проводили в ЗАО «Племрепродуктор «Васильевское» Сергиев-Посадского района Московской области, стационарно неблагополучном по анаэробной энтеротоксемии. Подобрали две группы животных опытную и контрольную. Опытная группа состояла из 48 стельных коров и 70 телят 14-20 дневного возраста. Коровам вакцину вводили подкожно в заднюю треть шеи, в дозе 5 см³ двукратно с интервалом 3 недели, чтобы вторая доза вакцины была введена не позднее 3-6 недель до отела коров. Телят иммунизировали двукратно с интервалом 21 день в дозе 3 см³. Перед применением флакон с вакциной нагревали до комнатной температуры и тщательно встряхнули. Вакцину вводили с соблюдением правил асептики и антисептики. Контрольная группа сформирована из 40 глубокостельных коров и 63 голов телят, такого же возраста, что и в опытной группе, животных не вакцинировали и не проводили лечение. Результаты исследования указаны в таблице 2.

Из данной таблице видно, что в опытной группе состоящих из 48 стельных коров заболело 2 головы. От иммунизированных коров получили 43 здоровых новорожденных теленка, только у 2 телят наблюдали признаки диареи, снижения аппетита, повышения температуры тела, животные были угнетены. Падеж телят, от вакцинированных коров отсутствовал. В контрольной группе заболело 15 стельных коров, 3 головы пало. От стельных коров получили 24 теленка, из которых у 13 новорожденных телят наблюдали признаки анаэробной энтеротоксемии, здоровых было 7 голов и 4 теленка пало. Иммунизированные телята старшего возраста, живы и клинически здоровы, один теленок заболел, в то время как в контрольной группе из 63 телят, здоровых было 26, заболело 24 теленка, от анаэробной энтеротоксемии пало 13 голов.

Следовательно, вакцина против анаэробной энтеротоксемии молодняка крупного рогатого скота безвредная для животных, обладает высокой иммуногенной активностью, не вызывает осложнений после введения.

Применение данной вакцины в неблагополучном хозяйстве позволило снизить заболеваемость и гибель телят и тем самым повысить сохранность молодняка крупного рогатого скота.

Полученные для производства антигены отвечают современным требованиям качества, являясь полностью безопасными при введении животным и высокоэффективными, что позволяет индуцировать у животных иммунитет высокой степени напряженности.

Вакцина обеспечивает формирование иммунитета у вакцинированных коров, снижая тем самым возникновение случаев заболевания анаэробной энтеротоксемией животных. Вакцина в рекомендуемых, а также двукратно превышающих дозах, безвредная. Лечебными свойствами не обладает.

Пример 4. Биологические свойства и порядок применения вакцины против анаэробной энтеротоксемии молодняка крупного рогатого скота.

Активными компонентами вакцины являются антитоксины Cl. perfringens типов A, C, D. Все компоненты безвредны, обладают высокой эффективностью и полностью совместимы.

Вакцина при двукратном введении с интервалом 3-4 недель в соответствующих дозах вызывает у молодняка и взрослого поголовья крупного рогатого скотаобразование напряженного иммунитета продолжительностью 12 месяцев. У новорожденных телят, полученных от вакцинированных коров, формируется колостральный иммунитет.

Порядок применения вакцины. Вакцину применяют с профилактической целью в угрожаемых и стационарно неблагополучных хозяйствах по анаэробной энтеротоксемии молодняка крупного рогатого скота. Иммунизируют клинически здоровые животные. В хозяйствах, неблагополучных по анаэробной энтеротоксемии специфическую профилактику начинают с иммунизации стельных коров и нетелей, которым прививают двукратно с интервалом 3-4 недели, в объеме 5 см³. В последующем ранее вакцинированным животным вакцину вводят однократно в объеме 5 см³ за 3-6 недель до отела. Коров ревакцинируют перед каждым отелом. Для иммунизации телят препарат вводят подкожно в объеме 4 см³.

Перед применением флаконы с вакциной необходимо тщательно встряхивать, а в холодное время подогревать в водяной бане до 37-38°C.

Молоко и продукты убоя, полученные от иммунизированных животных, в любое время после вакцинации реализуются без ограничений.

При проведении прививок необходимо соблюдать правила асептики и антисептики. Место введения вакцины дезинфицируют 70% раствором этилового спирта. Шприцы и иглы используют одноразовые, для каждого животного.

Противопоказания к применению:

- не вакцинировать больных и ослабленных животных;

- не применять гипериммунные сыворотки или иммунодепрессанты в течение 1 месяца после вакцинации.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к иммунологии и ветеринарной медицине, и может быть использована для получения поливалентной вакцины против анаэробной энтеротоксемии молодняка крупного рогатого скота. Для этого вакцина изготовлена из культур Cl. perfringens типов А - №28, С - №3 и D - №91, которые выращивали на мясо-казеиновой среде в реакторе при +37°С в течение 4-16 часов в зависимости от времени токсинообразования конкретного штамма. Использовали полученные культуры, содержащие высокоактивные токсины с накоплением: Cl. perfringens тип D не менее 2000 ДЛМ/см³, тип А не менее 100 ДЛМ/см³ и тип С не менее 6000 ДЛМ/см³ для белых мышей, в которые после проведенного культивирования в реактор с культурой добавили формалин с содержанием 37% формальдегида к объему культуральной жидкости, предварительно установив рН 7,2. Инактивацию проводили при +37°С в течение 7 суток, полученные культуры центрифугировали, надосадок использовали для получения антигена. Для осаждения антигенов в культуральную жидкость добавили 18% трехпроцентного стерильный раствора гидроокиси алюминия, тщательно перемешали и оставили при температуре +20°С на 2-5 суток до полного просветления надосадочной жидкости, затем декантировали около 70% надосадочной жидкости с получением инактивированной вакцины. Группа изобретений относится также к применению полученной поливалентной вакцины против анаэробной энтеротоксемии молодняка крупного рогатого скота. Использование данной группы изобретений позволяет повысить сохранность молодняка, защищая от заболевания инфекционной анаэробной энтеротоксемии крупного рогатого скота. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Поливалентная вакцина против анаэробной энтеротоксемии молодняка крупного рогатого скота, изготовлена из культур Cl. perfringens типов А - №28, С - №3 и D - №91, которые выращивали на мясо-казеиновой среде в реакторе при +37°С в течение 4-16 часов в зависимости от времени токсинообразования конкретного штамма, использовали полученные культуры, содержащие высокоактивные токсины с накоплением: Cl. perfringens тип D не менее 2000 ДЛМ/см³, тип А не менее 100 ДЛМ/см³ и тип С не менее 6000 ДЛМ/см³ для белых мышей, в которые после проведенного культивирования в реактор с культурой добавили формалин с содержанием 37% формальдегида к объему культуральной жидкости, предварительно установив рН 7,2, инактивацию проводили при +37°С в течение 7 суток, полученные культуры центрифугировали, надосадок использовали для получения антигена, для осаждения антигенов в культуральную жидкость добавили 18% трехпроцентного стерильного раствора гидроокиси алюминия, тщательно перемешали и оставили при температуре +20°С на 2-5 суток до полного просветления надосадочной жидкости, затем декантировали около 70% надосадочной жидкости с получением инактивированной вакцины.

2. Способ применения поливалентной вакцины против анаэробной энтеротоксемии молодняка крупного рогатого скота по п. 1, характеризуется тем, что при первичной вакцинации стельных коров и нетелей иммунизируют двукратно с интервалом 21-28 дней, вторую дозу вакцины вводят не позднее 3-6 недель до отела, в последующем ранее вакцинированным стельным коровам и нетелям вакцину вводят однократно в дозе 5 см³ за 3-6 недель до каждого следующего отела, при этом для иммунизации телят 14-20 дневного возраста препарат вводят двукратно с интервалом 3-4 недели подкожно в объеме 3 см³.

3. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что коров ревакцинируют перед каждым отелом.