ПЕПТИД, ПОЛУЧЕННЫЙ ИЗ KOC1, И СОДЕРЖАЩАЯ ЕГО ВАКЦИНА Российский патент 2019 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 A61K35/12 A61K35/14 A61K39/00 A61K48/00 C12N15/09 C12N5/10 

[Область техники]

Настоящее изобретение относится к области биологической науки, более конкретно, к области терапии злокачественных опухолей. В частности, настоящее изобретение относится к новым пептидам, которые эффективны в качестве противоопухолевых вакцин, к способам для лечения и/или профилактики опухолей с использованием пептида/пептидов, и фармацевтическим композициям, содержащим пептид(-ы).

По настоящей заявке испрашивается приоритет патентных заявок Японии, зарегистрированных 4 августа 2014 года (патентная заявка Японии №№ 2014-158919, 2014-158920 и 2014-158921), полное содержание которых включено в качестве ссылки в настоящий документ.

[Предшествующий уровень техники]

Было показано, что цитотоксические T-лимфоциты (ЦТЛ) распознают эпитопные пептиды, полученные из опухолеассоциированных антигенов (TAA) и обнаруженные на молекуле главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I, а затем убивают опухолевые клетки. С момента открытия семейства антигенов меланомы (MAGE) с использованием иммунологических подходов было обнаружено много других TAA (NPL1: Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; NPL2: Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9). Некоторые из этих TAA в настоящее время проходят клиническую разработку в качестве мишеней для иммунотерапии.

В некоторых из этих TAA были выявлены эпитопные пептиды, которые могут распознаваться ЦТЛ, и планируется их применение в иммунотерапии для различных типов злокачественных опухолей (NPL3: Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; NPL4: Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; NPL5: Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; NPL6: van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9) 3308-14; NPL7: Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; NPL8: Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; NPL9: Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 439-66; NPL10: Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94). До настоящего времени, было зарегистрировано несколько клинических испытаний с использованием этих эпитопных пептидов для ЦТЛ, полученных из TAA. К сожалению, многие из этих клинических испытаний показали низкую частоту объективных ответов (NPL11: Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; NPL12: Coulie ПГ et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; NPL13: Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15). Таким образом, все еще существует потребность в выявлении новых эпитопов для ЦТЛ, которые можно использовать в иммунотерапии злокачественных опухолей.

KOC1 (инсулиноподобный фактор роста II и РНК-связывающий белок 3, также описанный как IGF2BP3 или IMP-3; референсная последовательность: GeneBank, номер доступа NM_006547.2 (SEQ ID NO: 109)) был идентифицирован как ген с повышенным уровнем экспрессии при раке легких при помощи анализа профиля экспрессии генов с использованием полногеномной микропанели кДНК, включающей 23,040 генов (NPL14: Kikuchi T et al., Oncogene. 2003 Apr 10; 22(14): 2192-205; PTL1: WO2004/031413). Наблюдали, что экспрессия KOC1 специфически повышена в опухолевых клетках более чем у 90% пациентов с раком легких, но он не экспрессируется в других здоровых важных органах, за исключением яичка и плаценты. Дополнительно показано, что клеточная пролиферация в линиях злокачественных клеток, экспрессирующих KOC1, подавляется в результате подавления экспрессии KOC1 путем РНК-интерференции.

Недавно были идентифицированы эпитопные пептиды для ЦТЛ, полученные из KOC1 и рестриктированные по HLA-A24 (PTL2: WO2006/090810; NPL15: Suda T et al., Cancer Sci. 2007 Nov; 98(11): 1803-8) и HLA-A2 (PTL3: WO2011/067920; NPL16: Tomita Y et al., Cancer Sci. 2011 Jan; 102(1): 71-8). Эти пептиды эффективны у пациентов со злокачественными опухолями, имеющих тип HLA-A24 или HLA-A2, но нельзя ожидать, чтобы они оказывали эффект у пациентов со злокачественными опухолями, у которых нет этих типов HLA.

[Список цитирования]

[Патентная литература]

[PTL 1] WO2004/031413

[PTL2] WO2006/090810

[PTL3] WO2011/067920

[Непатентная литература]

[NPL 1] Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80

[NPL 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9

[NPL 3] Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55

[NPL 4] Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42

[NPL 5] Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9

[NPL 6] van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14

[NPL 7] Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8

[NPL 8] Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72

[NPL 9] Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66

[NPL 10] Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94

[NPL 11] Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80

[NPL 12] Coulie ПГ et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42

[NPL 13] Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15

[NPL 14] Kikuchi T et al., Oncogene. 2003 Apr 10; 22(14): 2192-205

[NPL 15] Suda T et al., Cancer Sci. 2007 Nov; 98(11): 1803-8

[NPL 16] Tomita Y et al., Cancer Sci. 2011 Jan; 102(1): 71-8

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к пептидам, которые могут индуцировать ЦТЛ, специфичные к KOC1-экспрессирующим клеткам. Когда эти пептиды презентируются на антигенпрезентирующих клетках (АПК) при помощи лейкоцитарного антигена человека (HLA), индуцируются ЦТЛ, которые демонстрируют специфическую цитотоксическую активность против KOC1-экспрессирующих клеток. Пептиды, полученные из KOC1, которые были идентифицированы к настоящему времени, как имеющие способность индуцировать ЦТЛ (индуцибельность ЦТЛ), являются или HLA-A2-рестриктированными или HLA-A24-рестриктированными пептидами, и не могут индуцировать ЦТЛ против клеток, которые не экспрессируют эти HLA. Таким образом, известные пептиды не подходят для проведения иммунотерапии у индивидуумов, у которых нет этих HLA. HLA-A11 и HLA-A33 представляют собой аллели, которые часто встречаются у азиатов (Sette A, Sidney J., Immunogenetics 1999, 50: 201-12), а HLA-A03 и HLA-A01 представляют собой аллели, которые часто встречаются у европеоидов (Cao et al., Hum Immunol 2001; 62(9): 1009-30). Желательно вводить HLA-A11-рестриктированные пептиды HLA-A11-положительным индивидуумам, HLA-A33-рестриктированные пептиды HLA-A33-положительным индивидуумам, HLA-A03-рестриктированные пептиды HLA-A03-положительным индивидуумам, и HLA-A01-рестриктированные пептиды HLA-A01-положительным индивидуумам. Таким образом, настоящее изобретение относится к пептидам, полученным из KOC1 и способным индуцировать ЦТЛ, и которые являются рестриктированными по HLA-A11, HLA-A33, HLA-A03 или HLA-A01. На основании результатов, описываемых в настоящем документе, было доказано, что пептиды по настоящему изобретению являются эпитопными пептидами, которые могут индуцировать мощный и специфический иммунный ответ против клеток, экспрессирующих KOC1 и HLA-A11, HLA-A33, HLA-A03, или HLA-A01.

Таким образом, одной задач по настоящему изобретению является создание пептидов, полученных из KOC1, которые могут индуцировать ЦТЛ ограничительно по HLA-A11, HLA-A33, HLA-A03 или HLA-A01. Эти пептиды можно использовать для индуцирования ЦТЛ in vitro, ex vivo или in vivo, или можно использовать для введения индивидуумам с целью индуцирования иммунного ответа против KOC1-экспрессирующих злокачественных клеток. Предпочтительными пептидами являются пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5, 28, 30, 32, 61, 62, 63, 64, 67, 74,77, 52, 79, 80, 85, 27, 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41; более предпочтительными пептидами являются нонапептиды или декапептиды; и еще более предпочтительными пептидами являются пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30, 32, 61, 62, 63, 64, 67, 74,77, 52, 79, 80, 85, 27, 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41.

Пептиды по настоящему изобретению включают пептиды, в которых одна, две или более аминокислот замещены, удалены, вставлены и/или добавлены, при условии, что полученные модифицированные пептиды сохраняют способность исходного пептида индуцировать ЦТЛ.

Настоящее изобретение дополнительно относится к изолированным полинуклеотидам, кодирующим любой один из пептидов по настоящему изобретению. Аналогично пептидам по настоящему изобретению, эти полинуклеотиды можно использовать для индуцирования АПК со способностью индуцировать ЦТЛ, и можно вводить индивидуумам для индуцирования иммунного ответа против KOC1-экспрессирующих злокачественных клеток.

Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим один или несколько типов пептидов по настоящему изобретению, один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих один или несколько типов пептидов по настоящему изобретению, АПК по настоящему изобретению, экзосомы, презентирующие пептиды по настоящему изобретению, и/или ЦТЛ по настоящему изобретению. Композиции по настоящему изобретению предпочтительно являются фармацевтическими композициями. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, а также для профилактики послеоперационных рецидивов злокачественной опухоли. Их также можно использовать для индуцирования иммунного ответа против злокачественной опухоли. При введении индивидууму, пептид по настоящему изобретению презентируется на поверхности АПК, и в результате индуцируются ЦТЛ, нацеленные на пептид. Таким образом, другой задачей по настоящему изобретению является создание композиций для индуцирования ЦТЛ, где композиции содержат один или несколько типов пептидов по настоящему изобретению, один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих один или несколько типов пептидов по настоящему изобретению, АПК по настоящему изобретению и/или экзосомы, презентирующие пептиды по настоящему изобретению.

Следующей задачей по настоящему изобретению является создание способов индуцирования АПК, имеющих способность индуцировать ЦТЛ, где способы включают этап контакта одного или нескольких типов пептидов по настоящему изобретению с АПК, или этап введения полинуклеотида, кодирующего любой один пептид по настоящему изобретению, в АПК.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу индуцирования ЦТЛ, включающему этап совместного культивирования CD8-положительной T-клетки с АПК, которая презентирует на поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению, этап совместного культивирования CD8-положительной T-клетки с экзосомой, которая презентирует на поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению, или этап введения в CD8-положительную T-клетку вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий каждую субъединицу T-клеточного рецептора (TCR), способного связываться с пептидом по настоящему изобретению, который презентируется посредством антигена HLA на клеточной поверхности. Предпочтительным антигеном HLA в настоящем изобретении является HLA-A11, HLA-A33, HLA-A03 или HLA-A01.

Следующей задачей по настоящему изобретению является получение изолированных АПК, которые презентируют на поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению. Настоящее изобретение дополнительно относится к изолированным ЦТЛ, нацеленным на пептид по настоящему изобретению. Эти АПК и ЦТЛ можно использовать в иммунотерапии для KOC1-экспрессирующих злокачественных опухолей. В настоящем изобретении, злокачественная опухоль, которую лечат иммунотерапией, является, например, злокачественной опухолью у пациентом, гомозиготных или гетерозиготных по HLA-A11, HLA-A33, HLA-A03 или HLA-A01. Таким образом, настоящее изобретение относится к иммунотерапии для злокачественных опухолей, экспрессирующих KOC1 и, по меньшей мере, один антиген HLA, выбранный из HLA-A11, HLA-A33, HLA-A03 и HLA-A01.

Другой задачей по настоящему изобретению является создание способов индуцирования иммунного ответа против злокачественной опухоли у индивидуума, где способы включают этап введения индивидууму пептида/пептидов по настоящему изобретению, полинуклеотида/полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы), АПК по настоящему изобретению, экзосомы/экзосом, презентирующих пептид(-ы) по настоящему изобретению, и/или ЦТЛ по настоящему изобретению. Другой задачей по настоящему изобретению является создание способов для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, а также для профилактики послеоперационных рецидивов злокачественной опухоли у индивидуума, где способы включают этап введения индивидууму пептида/пептидов по настоящему изобретению, полинуклеотида/полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы), АПК по настоящему изобретению, экзосомы/экзосом, презентирующих пептид(-ы) по настоящему изобретению, и/или ЦТЛ по настоящему изобретению.

В дополнение к вышеизложенному, другие задачи и признаки настоящего изобретения станут более очевидными после прочтения последующего подробного описания в сочетании с сопутствующими фигурами и примерами. Однако следует понимать, что как указанная выше сущность по настоящему изобретению, так и последующее подробное описание являются примерами вариантов осуществления, и не ограничивают настоящее изобретение или другие альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения. В частности, хотя настоящее изобретение описано в настоящем документе со ссылкой на ряд конкретных вариантов осуществления, следует понимать, что описание является иллюстративным по отношению к настоящему изобретению и не ограничивает настоящее изобретение. Специалисту в данной области могут прийти на ум различные модификации и применения, в пределах сущности и объема по настоящему изобретению, описанных в прилагаемой формуле изобретения. Кроме того, другие цели, особенности, выгоды и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из сущности и определенных вариантов осуществления, описанных ниже, и будут легко понятны специалистам в данной области. Такие цели, особенности, выгоды и преимущества будут понятны из вышеизложенного в сочетании с сопутствующими примерами, данными, фигурами и всеми разумными выводами, вытекающими из них, по отдельности или с учетом ссылок, включенных в настоящий документ.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 состоит из фотографий от (a) до (e), показывающих результаты анализа способом иммуноферментных пятен (ELISPOT) с интерфероном (IFN)-гамма на ЦТЛ, индуцированных при помощи пептидов, полученных из KOC1. По сравнению с контролем, ЦТЛ в лунке #6 с KOC1-A11-9-415 (SEQ ID NO: 5) (a), лунке #4 с KOC1-A11-10-414 (SEQ ID NO: 28) (b), лунке #5 с KOC1-A11-10-204 (SEQ ID NO: 30) (c), и лунке #8 с KOC1-A11-10-14 (SEQ ID NO: 32) (d) показали активную выработку IFN-гамма. На этих фотографиях, квадрат на лунках показывает, что клетки из соответствующих лунок выращивали для создания линий ЦТЛ. Напротив, KOC1-A11-9-258 (SEQ ID NO: 1) (e) показан как пример типичных отрицательных данных, где не было специфической выработки IFN-гамма. На фигуре, «+» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом; и «-» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, которые не были активированы ни одним из пептидов.

Фиг. 2 состоит из серии линейных графиков от (a) до (c), показывающих результаты твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с IFN-гамма, подтверждающего выработку IFN-гамма в линиях ЦТЛ, стимулированных KOC1-A11-9-415 (SEQ ID NO: 5) (a), KOC1-A11-10-204 (SEQ ID NO: 30) (b) или KOC1-A11-10-14 (SEQ ID NO: 32) (c). Эти результаты подтверждают, что линии ЦТЛ, полученные путем стимуляции каждым из пептидов, демонстрируют активную выработку IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигуре, «+» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом; и «-» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, которые не были активированы ни одним из пептидов. Соотношение R/S указывает на соотношение числа клеток линий ЦТЛ (клетки-респондеры) и числа клеток-мишеней (клетки-стимуляторы).

Фиг. 3 состоит из линейных графиков (a) и (b), показывающих выработку IFN-гамма в клонах ЦТЛ, полученных при серийных разведениях из линий ЦТЛ, стимулированных KOC1-A11-9-415 (SEQ ID NO: 5) или KOC1-A11-10-14 (SEQ ID NO: 32). Эти результаты подтверждают, что линии ЦТЛ, полученные путем стимуляции каждым из пептидов, демонстрируют активную выработку IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигуре, «+» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом; и «-» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, которые я не были активированы ни одним из пептидов. Соотношение R/S указывает на соотношение числа клеток линий ЦТЛ (клетки-респондеры) и числа клеток-мишеней (клетки-стимуляторы).

Фиг. 4 представляет собой линейный график, показывающий специфическую активность ЦТЛ против клеток-мишеней, экспрессирующих и KOC1, и HLA-A*1101. Клетки COS7, трансфецированные или HLA-A*1101, или полноразмерным геном KOC1, получали в качестве контроля. Клон ЦТЛ, полученный при помощи KOC1-A11-10-14 (SEQ ID NO: 32), продемонстрировал специфическую активность ЦТЛ против клеток COS7, трансфецированных и KOC1, и HLA-A*1101 (черный ромб). С другой стороны, не было выявлено значительной специфической активности ЦТЛ против клеток-мишеней, трансфецированных либо HLA-A*1101 (белый треугольник), либо KOC1 (белый круг).

Фиг. 5 состоит из фотографий от (a) до (l), показывающих результаты анализа ELISPOT с IFN-гамма на ЦТЛ, индуцированных при помощи пептидов, полученных из KOC1. По сравнению с контролем, ЦТЛ в лунке #1 с KOC1-A33-9-543 (SEQ ID NO: 61) (a), лунке #2 с KOC1-A33-9-282 (SEQ ID NO: 62) (b), лунке #3 с KOC1-A33-9-317 (SEQ ID NO: 63) (c), лунке #8 с KOC1-A33-9-485 (SEQ ID NO: 64) (d), лунке #3 с KOC1-A33-9-286 (SEQ ID NO: 67) (e), лунке #8 с KOC1-A33-9-34 (SEQ ID NO: 74) (f), лунке #4 с KOC1-A33-10-542 (SEQ ID NO: 77) (г), лунке #3 с KOC1-A33-10-281 (SEQ ID NO: 52) (h), лунке #6 с KOC1-A33-10-543 (SEQ ID NO: 79) (i), лунке #1 с KOC1-A33-10-424 (SEQ ID NO: 80) (j), и лунке #5 с KOC1-A33-10-285 (SEQ ID NO: 85) (k) показали активную выработку IFN-гамма. На этих фотографиях, квадрат на лунках показывает, что клетки из соответствующих лунок выращивали для создания линий ЦТЛ. Напротив, KOC1-A33-9-517 (SEQ ID NO: 4) (l) показан как пример типичных отрицательных данных, где не было специфической выработки IFN-гамма. На фигуре, «+» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом; и «-» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, которые не были активированы ни одним из пептидов.

Фиг. 6 состоит из серий линейных графиков от (a) до (f) показывающих результаты ELISA с IFN-гамма, подтверждающих выработку IFN-гамма в линиях ЦТЛ, стимулированных KOC1-A33-9-543 (SEQ ID NO: 61) (a), KOC1-A33-9-282 (SEQ ID NO: 62) (b), KOC1-A33-9-485 (SEQ ID NO: 64) (c), KOC1-A33-9-286 (SEQ ID NO: 67) (d), KOC1-A33-10-542 (SEQ ID NO: 77) (e), или KOC1-A33-10-281 (SEQ ID NO: 52) (f). Эти результаты подтверждают, что линии ЦТЛ, полученные путем стимуляции каждым из пептидов, демонстрируют активную выработку IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигуре, «+» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом; и «-» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, которые не были активированы ни одним из пептидов. Соотношение R/S указывает на соотношение числа клеток линий ЦТЛ (клетки-респондеры) и числа клеток-мишеней (клетки-стимуляторы).

Фиг. 7 состоит из серий линейных графиков от (a) до (f), показывающих выработку IFN-гамма в клонах ЦТЛ, полученных при серийных разведениях из линий ЦТЛ, стимулированных KOC1-A33-9-543 (SEQ ID NO: 61) (a), KOC1-A33-9-282 (SEQ ID NO: 62) (b), KOC1-A33-9-485 (SEQ ID NO: 64) (c), KOC1-A33-9-286 (SEQ ID NO: 67) (d), KOC1-A33-10-542 (SEQ ID NO: 77) (e), или KOC1-A33-10-281 (SEQ ID NO: 52) (f). Эти результаты подтверждают, что линии ЦТЛ, полученные путем стимуляции каждым из пептидов, демонстрируют активную выработку IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигуре, «+» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом; и «-» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, которые не были активированы ни одним из пептидов. Соотношение R/S указывает на соотношение числа клеток линий ЦТЛ (клетки-респондеры) и числа клеток-мишеней (клетки-стимуляторы).

Фиг. 8 состоит из серий линейных графиков от (a) до (c), показывающих специфическую активность ЦТЛ против клеток-мишеней, экспрессирующих и KOC1, и HLA-A*3303. Клетки COS7, трансфецированные или HLA-A*3303, или полноразмерным геном KOC1, получали в качестве контроля. Клоны ЦТЛ, полученные при помощи KOC1-A33-9-485 (SEQ ID NO: 64) (a), KOC1-A33-9-286 (SEQ ID NO: 67) (b), и KOC1-A33-10-542 (SEQ ID NO: 77) (c) демонстрировали специфическую активность ЦТЛ против клеток COS7, трансфецированных и KOC1, и HLA-A*3303 (черный ромб). С другой стороны, не было выявлено значительной специфической активности ЦТЛ против клеток-мишеней, трансфецированных либо HLA-A*3303 (белый треугольник), либо KOC1 (белый круг).

Фиг. 9 состоит из фотографий от (a) до (d), показывающих результаты анализа ELISPOT с IFN-гамма на ЦТЛ, индуцированных при помощи пептидов, полученных из KOC1. По сравнению с контролем, ЦТЛ в лунке #5 с KOC1-A03-10-120 (SEQ ID NO: 27) (a), лунке #3 с KOC1-A03-10-204 (SEQ ID NO: 30) (b), и лунке #5 с KOC1-A03-10-281 (SEQ ID NO: 52) (c) показали активную выработку IFN-гамма. На этих фотографиях, квадрат на лунках показывает, что клетки из соответствующих лунок выращивали для создания линий ЦТЛ. Напротив, KOC1-A03-10-414 (SEQ ID NO: 28) (d) показан как пример типичных отрицательных данных, где не было специфической выработки IFN-гамма. На фигуре, «+» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом; и «-» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, которые не были активированы ни одним из пептидов.

Фиг. 10 представляет собой серии линейных графиков, показывающих результаты ELISA с IFN-гамма, подтверждающих выработку IFN-гамма в линиях ЦТЛ, стимулированных KOC1-A03-10-120 (SEQ ID NO: 27). Эти результаты подтверждают, что линии ЦТЛ, полученные путем стимуляции каждым из пептидов, демонстрируют активную выработку IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигуре, «+» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом; и «-» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, которые не были активированы ни одним из пептидов. Соотношение R/S указывает на соотношение числа клеток линий ЦТЛ (клетки-респондеры) и числа клеток-мишеней (клетки-стимуляторы).

Фиг. 11 представляет собой линейный график, показывающий выработку IFN-гамма в клоне ЦТЛ, полученном при серийных разведениях из линии ЦТЛ, стимулированной KOC1-A03-10-120 (SEQ ID NO: 27). Эти результаты подтверждают, что линии ЦТЛ, полученные путем стимуляции каждым из пептидов, демонстрируют активную выработку IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигуре, «+» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом; и «-» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, которые не были активированы ни одним из пептидов. Соотношение R/S указывает на соотношение числа клеток линий ЦТЛ (клетки-респондеры) и числа клеток-мишеней (клетки-стимуляторы).

Фиг. 12 представляет собой линейный график, показывающий специфическую активность ЦТЛ против клеток-мишеней, экспрессирующих и KOC1, и HLA-A*0301. Клетки COS7, трансфецированные или HLA-A*0301, или полноразмерным геном KOC1, получали в качестве контроля. Клон ЦТЛ, полученный при помощи KOC1-A03-10-120 (SEQ ID NO: 27) демонстрировал специфическую активность ЦТЛ против клеток COS7, трансфецированных и KOC1, и HLA-A*0301 (черный ромб). С другой стороны, не было выявлено значительной специфической активности ЦТЛ против клеток-мишеней, трансфецированных либо HLA-A*0301 (белый треугольник), либо KOC1 (белый круг).

Фиг. 13 представляет собой фотографии от (a) до (h), показывающих результаты анализа ELISPOT с IFN-гамма на ЦТЛ, индуцированных при помощи пептидов, полученных из KOC1. По сравнению с контролем, ЦТЛ в лунке #2 с KOC1-A01-9-96 (SEQ ID NO: 86) (a), лунке #4 с KOC1-A01-9-118 (SEQ ID NO: 87) (b), лунке #3 с KOC1-A01-9-404 (SEQ ID NO: 90) (c), лунке #4 с KOC1-A01-9-402 (SEQ ID NO: 92) (d), лунке 7# с KOC1-A01-10-312 (SEQ ID NO: 46) (e), лунке #1 с KOC1-A01-10-402 (SEQ ID NO: 95) (f), и лунке #1 с KOC1-A01-10-535 (SEQ ID NO: 41) (г) показали активную выработку IFN-гамма. На этих фотографиях, квадрат на лунках показывает, что клетки из соответствующих лунок выращивали для создания линий ЦТЛ. Напротив, KOC1-A01-9-536 (SEQ ID NO: 13) (h) показан как пример типичных отрицательных данных, где не было специфической выработки IFN-гамма. На фигуре, «+» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом; и «-» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, которые не были активированы ни одним из пептидов.

Фиг. 14 состоит из серий линейных графиков (a) и (b), показывающих результаты ELISA с IFN-гамма, подтверждающих выработку IFN-гамма в линиях ЦТЛ, стимулированных KOC1-A01-9-96 (SEQ ID NO: 86) (a) или KOC1-A01-9-118 (SEQ ID NO: 87) (b). Эти результаты подтверждают, что линии ЦТЛ, полученные путем стимуляции каждым из пептидов, демонстрируют активную выработку IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигуре, «+» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом; и «-» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, которые не были активированы ни одним из пептидов. Соотношение R/S указывает на соотношение числа клеток линий ЦТЛ (клетки-респондеры) и числа клеток-мишеней (клетки-стимуляторы).

Фиг. 15 представляет собой линейный график, показывающий выработку IFN-гамма в клоне ЦТЛ, полученном при серийных разведениях из линии ЦТЛ, стимулированной KOC1-A01-9-96 (SEQ ID NO: 86). Эти результаты подтверждают, что линии ЦТЛ, полученные путем стимуляции каждым из пептидов, демонстрируют активную выработку IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигуре, «+» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом; и «-» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, которые не были активированы ни одним из пептидов. Соотношение R/S указывает на соотношение числа клеток линий ЦТЛ (клетки-респондеры) и числа клеток-мишеней (клетки-стимуляторы).

Фиг. 16 представляет собой линейный график, показывающий специфическую активность ЦТЛ против клеток-мишеней, экспрессирующих и KOC1, и HLA-A*0101. Клетки COS7, трансфецированные или HLA-A*0101, или полноразмерным геном KOC1, получали в качестве контроля. Клон ЦТЛ, полученный при помощи KOC1-A01-9-96 (SEQ ID NO: 86), демонстрировал специфическую активность ЦТЛ против клеток COS7, трансфецированных и KOC1, и HLA-A*0101 (черный ромб). С другой стороны, не было выявлено значительной специфической активности ЦТЛ против клеток-мишеней, трансфецированных либо HLA-A*0101 (белый треугольник), либо KOC1 (белый круг).

[Способ осуществления изобретения]

Описание вариантов осуществления

Хотя в практическом осуществлении или тестировании вариантов осуществления настоящего изобретения можно использовать любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе, предпочтительные способы, устройства и материалы описаны в настоящем документе. Однако перед тем как будут описаны материалы и способы по настоящему изобретению, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными размерами, формами, измерениями, материалами, способами, протоколами, и т.д., описываемыми в настоящем документе, поскольку они могут варьировать в соответствии с рутинной экспериментальной деятельностью и оптимизацией. Также следует понимать, что терминология, применяемая в описании, предназначена только для описания конкретных версий или вариантов осуществления, и не предназначена для ограничения объема по настоящему изобретению, который ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

I. Определения

Определители единственного числа, используемые в настоящем документе, означают «по меньшей мере, один», если конкретно не указано иное.

Термины «изолированный» и «очищенный», применяемые по отношению к веществу (например, пептиду, антителу, полинуклеотиду или т.п.), указывают на то, что вещество по существу не содержит, по меньшей мере, ни одно вещество, которое также может входить в натуральный источник. Таким образом, изолированный или очищенный пептид относится к пептиду, который по существу не содержит другой клеточный материал, например, углевод, липид и другие загрязняющие белки из источника клеток или ткани, из которого получают пептид. Если пептид синтезируют химическим путем, изолированный или очищенный пептид относится к пептиду, который по существу не содержит вещество-предшественник или другое химическое вещество. Фраза «по существу не содержит клеточный материал» включает получение пептида, при котором пептид отделяют от клеточных компонентов из клеток, из которых пептид выделен или где он был рекомбинантно произведен. Таким образом, пептид, который по существу не содержит клеточный материал, включает пептидные препараты, которые содержат менее чем приблизительно 30%, 20%, 10%, 5%, 3%, 2% или 1% (на основании сухой массы) других клеточных материалов. Если пептид производят рекомбинантным способом, изолированный или очищенный пептид, который по существу не содержит среду для культивирования, включает пептидные препараты, которые содержат среду для культивирования, менее чем приблизительно 20%, 10% или 5%, 3%, 2% или 1% (на основании сухой массы) от объема пептидного препарата. Если пептид синтезируют химическим путем, изолированный или очищенный пептид по существу не содержит вещество-предшественник или другое химическое вещество, включает пептидные препараты, которые содержат вещество-предшественник или другие химические вещества, менее чем приблизительно 30%, 20%, 10%, 5%, 3%, 2% или 1% (на основании сухой массы) от объема пептидного препарата. То, что конкретный пептидный препарат является изолированным или очищенным можно подтверждать, например, при появлении одиночной полосы при электрофорезе с додецилсульфатом натрия (SDS) в полиакриламидном геле и окраске Кумасси бриллиантовым голубым или на подобном геле. В предпочтительном варианте осуществления пептиды и полинуклеотиды по настоящему изобретению являются изолированными или очищенными.

Термины «полипептид», «пептид» и «белок» в настоящем документе используются взаимозаменяемо, и относятся к полимерам из аминокислотных остатков. Эти термины также применяют к неприродным аминокислотным полимерам, содержащим один или несколько неприродных аминокислотных остатков, в дополнение к природным аминокислотным полимерам. Неприродные аминокислоты включают аналоги аминокислот, миметики аминокислот, и т.п.

Термин «аминокислота», применяемый в настоящем документе, относится к природным аминокислотам, а также аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют аналогично природным аминокислотам. Природными аминокислотами являются аминокислоты, которые кодируются генетическим кодом, а также аминокислоты, модифицированные после трансляции в клетках (например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутаминат, и O-фосфосерин, и т.д.). Фраза «аналог аминокислоты» относится к соединениям, которые имеют такую же основную химическую структуру (альфа углерод, связанный с водородом, карбоксигруппу, аминогруппу, и группу R), как и природная аминокислота, но имеют модифицированную R-группу или модифицированные остовы (например, гомосерин, норлейцин, метионин сульфоксид, метионин метил сульфоний, и т.п.). Фраза «миметик аминокислоты» относится к химическим соединениям, которые имеют различные структуры, но аналогичные функции с основными аминокислотами. Аминокислоты могут быть или L-аминокислотами или D-аминокислотами, и пептиды по настоящему изобретению предпочтительно являются L-аминокислотными полимерами.

Термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» используются взаимозаменяемо в настоящем документе, и относятся к полимеру из нуклеотидов.

Термин «композиция», применяемый в настоящем описании, предназначен для включения продуктов, которые содержат конкретно оговоренные ингредиенты в конкретно оговоренных количествах, и любых продуктов, полученных прямо или косвенно из комбинации конкретно оговоренных ингредиентов в конкретно оговоренных количествах. Если композиция представляет собой фармацевтическую композицию, термин «композиция» предназначен для включения продуктов, содержащих активный ингредиент/ингредиенты и инертный ингредиент/ингредиенты, а также любых продуктов, полученных прямо или косвенно из комбинации, комплексообразования или агрегации любых двух или более ингредиентов, из диссоциации одного или нескольких ингредиентов, или из реакций другого типа или взаимодействий одного или нескольких ингредиентов. Таким образом, фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают в себя любые композиции, полученные путем смешивания соединений или клеток по настоящему изобретению с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем. Не являясь ограничивающими, термины «фармацевтически приемлемый носитель» или «физиологически приемлемый носитель», применяемые в настоящем описании, включают жидкие или твердые наполнители, разбавители, эксципиенты, растворители, и инкапсулирующие материалы; и означают фармацевтически или физиологически приемлемые материалы, композиции, вещества или среды.

Если не указано иначе, термин «злокачественная опухоль» относится к злокачественной опухоли, которая гиперэкспрессирует ген KOC1; и примеры таких опухолей включают рак мочевого пузыря, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, хронический миелолейкоз (ХМЛ), рак толстого кишечника, рак прямой кишки, рак пищевода, диффузный рак желудка, немелкоклеточный рак легких, мелкоклеточный рак легких, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак почки, рак головы и шеи, опухоль мягких тканей, рак яичек и т.п., не ограничиваясь вышеизложенными. В иллюстративном варианте осуществления «злокачественная опухоль» представляет собой злокачественную опухоль, которая экспрессирует KOC1 и HLA-A11, HLA-A33, HLA-A03 и/или HLA-A01.

Если не указано иначе, термины «цитотоксический T-лимфоцит» и «цитотоксическая T-клетка» и «ЦТЛ» используют взаимозаменяемо в настоящем документе. Если конкретно не указано иное, они относятся к подгруппе T-лимфоцитов, которая может распознавать «чужие» клетки (например, опухолевые/злокачественные клетки, вирус-инфицированные клетки) и индуцировать гибель таких клеток.

Если не указано иначе, термин «HLA-A11» относится к типу HLA-A11, который включает подтипы, такие как HLA-A^*1101, HLA-A^*1102, HLA-A^*1103, и HLA-A^*1104.

Если не указано иначе, термин «HLA-A33» относится к типу HLA-A33, который включает подтипы, такие как HLA-A^*3303, HLA-A^*3301, и HLA-A^*3304.

Если не указано иначе, термин «HLA-A03» относится к типу HLA-A03, который включает подтипы, такие как HLA-A^*0301, HLA-A^*0302, и HLA-A^*0305.

Если не указано иначе, термин «HLA-A01» относится к типу HLA-A01, который включает подтипы, такие как HLA-A^*0101, HLA-A^*0102, HLA-A^*0103, и HLA-A^*0104.

В отношении индивидуума или пациента, фраза «антиген HLA индивидуума (или пациента) представляет собой HLA-A11», применяемая в настоящем документе, означает, что индивидуум или пациент имеет ген антигена HLA-A11 в гомозиготном или гетерозиготном состоянии как молекулу MHC (Главного комплекса гистосовместимости) класса I, и что антиген HLA-A11 экспрессируется в клетках индивидуума или пациента в виде антигена HLA. Аналогично, фразы «антиген HLA индивидуума (или пациента) представляет собой HLA-A33», «антиген HLA индивидуума (или пациента) представляет собой HLA-A03» и «антиген HLA индивидуума (или пациента) представляет собой HLA-A01», применяемые в настоящем документе, означают, соответственно, что индивидуум или пациент имеет ген антигена HLA-A33 в гомозиготном или гетерозиготном состоянии как молекулу MHC (Главного комплекса гистосовместимости) класса I, и что антиген HLA-A33 экспрессируется в клетках индивидуума или пациента в виде антигена HLA; что индивидуум или пациент имеет антиген HLA-A03 в гомозиготном или гетерозиготном состоянии как молекулу MHC (Главного комплекса гистосовместимости) класса I, и что антиген HLA-A03 экспрессируется в клетках индивидуума или пациента в виде антигена HLA; и что индивидуум или пациент имеет ген HLA-A01 в гомозиготном или гетерозиготном состоянии как молекулу MHC (Главного комплекса гистосовместимости) класса I, и что антиген HLA-A01 экспрессируется в клетках индивидуума или пациента в виде антигена HLA.

При условии, что способы и композиции по настоящему изобретению пригодны в отношении «лечения» злокачественной опухоли, лечение считается «эффективным», если оно достигает клинических преимуществ, например, уменьшение размера, распространения или метастатических свойств злокачественной опухоли, замедление прогрессирования злокачественной опухоли, ослабление клинических симптомов злокачественной опухоли, продление периода выживания, подавление послеоперационных рецидивов у индивидуума. Если лечение применяется профилактически, «эффективность» означает, что лечение замедляет или предотвращает образование злокачественной опухоли, или предупреждает или ослабляет клинические симптомы злокачественной опухоли. Эффективность определяют по отношению к любым общеизвестным способам для диагностики или лечения конкретного типа опухоли.

При условии, что способы и композиции по настоящему изобретению пригодны в отношении «предупреждения (профилактики)» злокачественной опухоли, термин «предупреждение (профилактика)» в настоящем документе включает любую работу, которая облегчает бремя смертности или заболеваемости, ассоциированных со злокачественными опухолями. Предупреждение (профилактику) можно проводить на «первичном, вторичном и третичном профилактических уровнях». В то время как первичное предупреждение (профилактика) помогает избежать развития заболевания, вторичное и третичное предупреждение (профилактика) включает в себя предупреждение (профилактику) прогрессирования заболевания и появления симптомов, а также деятельность, предназначенную для снижения неблагоприятных воздействий существующего заболевания путем восстановления функций и уменьшения осложнений, ассоциированных с заболеванием. С другой стороны, предупреждение (профилактика) может включать в себя ослабление тяжести конкретного нарушения, например, обширную профилактическую терапию, предназначенную для уменьшения роста опухоли и метастазирования.

В контексте настоящего изобретения, лечение и/или предупреждение (профилактика) злокачественной опухоли и/или предупреждение (профилактика) ее послеоперационного рецидива включают в себя любое из событий, таких как ингибирование пролиферации злокачественных клеток, инволюцию или регрессию опухоли, инициацию ремиссии и подавление развития злокачественной опухоли, регрессию опухоли, а также уменьшение или ингибирование метастазирования, подавление послеоперационных рецидивов злокачественной опухоли, и продление периода выживания. Эффективное лечение и/или предупреждение (профилактика) злокачественной опухоли снижает смертность, улучшает прогноз индивидуума со злокачественной опухолью, снижает уровень опухолевых маркеров в крови, и облегчает выявляемые симптомы, ассоциированные со злокачественной опухолью. Например, облегчение или улучшение симптомов составляет эффективное лечение и/или предупреждение (профилактику), и включает состояние, при котором симптомы стабильны или улучшены на 10%, 20%, 30% или больше.

В контексте настоящего изобретения, термин «антитело» относится к иммуноглобулинам и их фрагментам, которые специфически реакционноспособны по отношению к обозначенному белку или его пептиду. Антитело может включать антитела человека, приматизированные антитела, химерные антитела, биспецифические антитела, гуманизированные антитела, антитела, слитые с другими белками или радиоактивными метками, и фрагменты антител. Кроме того, «антитело» в настоящем документе используется в самом широком смысле и конкретно включает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные из двух или более интактных антител, и фрагменты антител при условии, что они проявляют желательную биологическую активность. «Антитело» может быть антителами всех классов (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM).

Если не указано иначе, все технические термины и научные термины, применяемые в настоящем документе, имеют то же самое значение, в каком их обычно понимает специалист в области, к которой относится настоящее изобретение.

II. Пептиды

HLA-A11 и HLA-A33 представляют собой аллели, которые часто встречаются у азиатов (Sette A, Sidney J., Immunogenetics 1999, 50: 201-12), и HLA-A03 и HLA-A01 представляют собой аллели, которые часто встречаются у европеоидов (Cao et al., Hum Immunol 2001; 62(9): 1009-30). Таким образом, предлагается эффективный способ лечения KOC1-экспрессирующих злокачественных опухолей для большой популяции азиатов или европеоидов путем предоставления пептидов, полученных из KOC1, которые способны к индуцированию ЦТЛ и рестриктированы по HLA-A11, HLA-A33, HLA-A03, или HLA-A01. Таким образом, настоящее изобретение относится к пептидам, полученным из KOC1, которые способны индуцировать ЦТЛ ограничительно по HLA-A11, HLA-A33, HLA-A03, или HLA-A01.

Пептиды по настоящему изобретению представляют собой пептиды, полученные из KOC1, которые способны индуцировать ЦТЛ ограничительно по HLA-A11, HLA-A33, HLA-A03, или HLA-A01. Пептиды, способные индуцировать ЦТЛ ограничительно по HLA-A11, включают пептиды с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32. Аналогично, пептиды, способные индуцировать ЦТЛ ограничительно по HLA-A33, включают пептиды с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85. Аналогично, пептиды, способные индуцировать ЦТЛ ограничительно по HLA-A03, включают пептиды с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 27, 30 и 52. Аналогично, пептиды, способные индуцировать ЦТЛ ограничительно по HLA-A01, включают пептиды с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41.

ЦТЛ с цитотоксической активностью, специфичные по отношению к этим пептидам, можно создавать при стимуляции Т-клеток in vitro дендритными клетками (DC), активированными этими пептидами. Полученные ЦТЛ демонстрируют специфическую цитотоксическую активность против клеток-мишеней, активированных каждым из пептидов.

Ген KOC1 сверхэкспрессирован в злокачественных клетках, таких как злокачественные клетки, например, при раке мочевого пузыря, раке шейки матки, холангиоцеллюлярном раке, хроническом миелолейкозе (ХМЛ), раке толстого кишечника, раке прямой кишки, раке пищевода, диффузном раке желудка, немелкоклеточном раке легких, мелкоклеточном раке легких, лимфоме, остеосаркоме, раке яичника, раке почки, раке головы и шеи, опухоли мягких тканей, раке яичек и т.п., но не экспрессируется в большинстве здоровых органов. Таким образом, он представляет собой превосходную мишень для иммунотерапии. Таким образом, пептиды по настоящему изобретению могут быть подходящим образом использованы для иммунотерапии злокачественной опухоли. Предпочтительным пептидом является нонапептид (пептид, состоящий из 9 аминокислотных остатков) или декапептид (пептид, состоящий из 10 аминокислотных остатков), и более предпочтительным является пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30, 32, 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80, 85, 27, 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41. Например, пептид с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 32 подходит для индуцирования ЦТЛ, демонстрирующих цитотоксическую активность против клеток, экспрессирующих HLA-A11 и KOC1, и может быть подходящим образом использован для иммунотерапии злокачественной опухоли у HLA-A11-положительных пациентов. Кроме того, например, пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 64, 67 и 77 подходит для индуцирования ЦТЛ, демонстрирующих цитотоксическую активность против клеток, экспрессирующих HLA-A33 и KOC1, и может быть подходящим образом использован для иммунотерапии злокачественной опухоли у HLA-A33-положительных пациентов. Кроме того, например, пептид с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 27 подходит для индуцирования ЦТЛ, демонстрирующих цитотоксическую активность против клеток, экспрессирующих HLA-A03 и KOC1, и может быть подходящим образом использован для иммунотерапии злокачественной опухоли у HLA-A03-положительных пациентов. Дополнительно, например, пептид с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 86 подходит для индуцирования ЦТЛ, демонстрирующих цитотоксическую активность против клеток, экспрессирующих HLA-A01 и KOC1, и может быть подходящим образом использован для иммунотерапии злокачественной опухоли у HLA-A01-положительных пациентов. В более предпочтительном варианте осуществления пептид по настоящему изобретению представляет собой пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 32, 64, 67, 77, 27 и 86.

Для пептидов по настоящему изобретению, дополнительный аминокислотный остаток/остатки могут быть присоединены к аминокислотной последовательности пептида по настоящему изобретению, при условии, что полученные пептиды сохраняют способность исходного пептида индуцировать ЦТЛ. Дополнительный аминокислотный остаток/остатки могут состоять из любых типов аминокислот, при условии, что они не снижают способность исходного пептида индуцировать ЦТЛ. Таким образом, пептиды по настоящему изобретению включают пептиды, способные индуцировать ЦТЛ, состоящие из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30, 32, 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80, 85, 27, 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41. Такие пептиды состоят, например, менее чем из приблизительно 40 аминокислот, во многих случаях менее чем из приблизительно 20 аминокислот, и, как правило, менее чем из приблизительно 15 аминокислот. Таким образом, если исходный пептид представляет собой нонапептид, пептид по настоящему изобретению относится к пептидам, которые имеют 10 аминокислот в длину или 11-40 аминокислот в длину, которые получены добавлением дополнительной аминокислоты/аминокислот к пептиду. Кроме того, если исходный пептид представляет собой декапептид, пептид по настоящему изобретению относится к пептидам, которые имеют 11-40 аминокислот в длину, которые получены добавлением дополнительной аминокислоты/аминокислот к пептиду. Такой пептид может быть, например, пептидом, который имеет 11-20 аминокислот в длину, или пептидом, который имеет 11-15 аминокислот в длину. Предпочтительным примером дополнительного аминокислотного остатка/остатков является аминокислотный остаток/остатки, примыкающие к аминокислотной последовательности пептида по настоящему изобретению в полноразмерной аминокислотной последовательности KOC1 (например, SEQ ID NO: 110). Таким образом, пептиды по настоящему изобретению включают пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5, 28, 30, 32, 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80, 85, 27, 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41, и где пептиды представляют собой пептидные фрагменты KOC1 и имеют способность индуцировать ЦТЛ.

Как правило, модификации одной, двух или более аминокислот в определенном пептиде не влияют на функции пептида, или в некоторых случаях даже усиливают желаемые функции исходного пептида. Фактически, известно, что модифицированные пептиды (т.е., пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, в которой один, два или несколько аминокислотных остатков являются модифицированными (т.е., замещены, удалены, вставлены, и/или добавлены) по сравнению с исходной референсной последовательностью) сохраняют биологическую активность исходного пептида (Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). Таким образом, в одном из вариантов осуществления пептиды по настоящему изобретению могут быть пептидами, содержащими аминокислотную последовательность, в которой одна, две или несколько аминокислот замещены, удалены, вставлены, и/или добавлены к аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30, 32, 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80, 85, 27, 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41, и имеющими способность индуцировать ЦТЛ.

Специалисту в данной области ясно, что отдельные замены в аминокислотной последовательности, которые изменяют единичную аминокислоту или небольшое процентное содержание аминокислот, как правило, приводят к сохранению свойств исходной боковой цепи/цепей аминокислоты. Эти замены часто обозначают как «консервативные замены» или «консервативные модификации»; и модификация белка «консервативной заменой» или «консервативной модификацией» может приводить к модифицированному белку, который имеет функции, аналогичные функциям исходного белка. Таблицы консервативных замен, представляющие функционально сходные аминокислоты, хорошо известны в данной области. Примеры характеристик боковых цепей аминокислот, которые функционально похожи, включают, например, гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), и боковые цепи со следующими общими функциональными группами или характеристиками: алифатические боковые цепи (G, A, V, L, I, P); боковые цепи, содержащие гидроксильную группу (S, T, Y); боковые цепи, содержащие атом серы (C, M); боковые цепи, содержащие карбоновую кислоту и амид (D, N, E, Q); боковые цепи, содержащие основание (R, K, H); и ароматические боковые цепи (H, F, Y, W). Кроме того, следующие восемь групп содержат аминокислоты, которые принимаются в данной области в качестве консервативных замен друг для друга:

1) Аланин (A), Глицин (G);

2) Аспарагиновая кислота (D), Глутаминовая кислота (E);

3) Аспарагин (N), Глутамин (Q);

4) Аргинин (R), Лизин (K);

5) изолейцин (I), Лейцин (L), Метионин (M), Валин (V);

6) Фенилаланин (F), Тирозин (Y), Триптофан (W);

7) Серин (S), Треонин (T); и

8) Цистеин (C), Метионин (M) (см., например, Creighton, Proteins 1984).

Такие консервативно модифицированные пептиды также включены в пептиды по настоящему изобретению. Однако пептиды по настоящему изобретению не ограничены ими и могут включать неконсервативные модификации, при условии, что модифицированный пептид сохраняет способность исходного пептида индуцировать ЦТЛ. Кроме того, модифицированные пептиды не исключают пептиды, способные индуцировать ЦТЛ, которые получены из полиморфных вариантов, межвидовых гомологов, и аллелей KOC1.

При условии, что пептид сохраняет способность исходного пептида индуцировать ЦТЛ, можно модифицировать (т.е., замещать, удалять, вставлять и/или добавлять) небольшое число (например, 1, 2 или несколько) или небольшое процентное содержание аминокислот. В настоящем документе, термин «несколько» означает 5 или менее аминокислот, например, 4 или 3, или менее. Процентное содержание аминокислот, которые будут модифицированы, предпочтительно составляет 20% или менее, более предпочтительно, 15% или менее, даже более предпочтительно, 10% или менее, или от 1 до 5%.

При использовании для иммунотерапии, пептиды по настоящему изобретению презентируются на поверхности клетки или экзосомы, предпочтительно в виде комплекса с антигеном HLA. Таким образом, предпочтительно, что пептиды по настоящему изобретению обладают высокой аффинностью связывания с антигеном HLA. С этой целью, пептиды можно модифицировать при помощи замены, делеции, вставки, и/или добавления аминокислотных остатков для получения модифицированного пептида с улучшенной аффинностью связывания. Поскольку закономерность последовательностей пептидов, показанная путем связывания с антигенами HLA, уже известна (Falk, et al., Immunogenetics 1994 40 232-41; Chujoh, et al., Tissue Antigens 1998: 52: 501-9; Takiguchi, et al., Tissue Antigens 2000: 55: 296-302.), модификации на основании такой закономерности можно вводить в пептиды по настоящему изобретению.

Например, в пептидах с аффинностью связывания для HLA класса I, вторая аминокислота с N-конца и C-концевая аминокислота, как правило, представляют собой якорные остатки, участвующие в связывании с HLA класса I (Rammensee HG, et al., Immunogenetics. 1995; 41(4): 178-228.). Например, для HLA-A11, треонин, валин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, и тирозин в качестве второй аминокислоты с N-конца, и лизин и аргинин в качестве C-концевой аминокислоты известны как якорные остатки с высокой аффинностью связывания для HLA-A11 (Falk, et al., Immunogenetics 1994, 40: 232-41; Chujoh, et al., Tissue Antigens 1998: 52: 501-9). Дополнительно, для HLA-A11, существуют вспомогательные якорные остатки в положениях 3 и 7 от N-конца; и известно, что лейцин, фенилаланин, тирозин, изолейцин, и аланин являются предпочтительными в качестве третьей аминокислоты от N-конца, и что лейцин, изолейцин, тирозин, валин и фенилаланин являются предпочтительными в качестве седьмой аминокислоты с N-конца (Falk, et al., Immunogenetics 1994, 40: 232-41; Chujoh, et al., Tissue Antigens 1998: 52: 501-9). Таким образом, для сохранения или повышения аффинности связывания с HLA-A11, существует вероятность того, что желательно заменить вторую аминокислоту с N-конца треонином, валином, изолейцином, лейцином, фенилаланином, или тирозином, и/или заменить C-концевую аминокислоту лизином или аргинином. Дополнительно, существует вероятность того, что также желательно заменить третью аминокислоту с N-конца лейцином, фенилаланином, тирозином, изолейцином, или аланином, и/или заменить седьмую аминокислоту с N-конца лейцином, изолейцином, тирозином, валином или фенилаланином. Таким образом, пептиды со способностью индуцировать ЦТЛ, содержащие аминокислотную последовательность, в которой, в аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32, вторая аминокислота с N-конца замещена треонином, валином, изолейцином, лейцином, фенилаланином, или тирозином; третья аминокислота с N-конца замещена лейцином, фенилаланином, тирозином, изолейцином, или аланином; седьмая аминокислота с N-конца замещена лейцином, изолейцином, тирозином, валином или фенилаланином; и/или C-концевая аминокислота замещена лизином или аргинином, охватываются пептидами по настоящему изобретению. В предпочтительном варианте осуществления пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой, в аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32, вторая аминокислота с N-конца замещена треонином, валином, изолейцином, лейцином, фенилаланином, или тирозином; третья аминокислота с N-конца замещена лейцином, фенилаланином, тирозином, изолейцином, или аланином; седьмая аминокислота с N-конца замещена лейцином, изолейцином, тирозином, валином или фенилаланином; и/или C-концевая аминокислота замещена лизином или аргинином. То есть, пептиды по настоящему изобретению включают в себя пептиды со способностью индуцировать ЦТЛ, которые содержат аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько замен, выбранных из нижеизложенных от (a) до (d), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NOs: 5, 28, 30 и 32:

(a) вторая аминокислота с N-конца замещена треонином, валином, изолейцином, лейцином, фенилаланином, или тирозином;

(b) третья аминокислота с N-конца замещена лейцином, фенилаланином, тирозином, изолейцином, или аланином;

(c) седьмая аминокислота с N-конца замещена лейцином, изолейцином, тирозином, валином или фенилаланином; и

(d) C-концевая аминокислота замещена лизином или аргинином.

В предпочтительном варианте осуществления пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько замен, выбранных из вышеизложенных от (a) до (d), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32. В настоящем изобретении, предпочтительное число замен составляет 1, 2, 3 или 4 замены, выбранные из вышеизложенных от (a) до (d).

Пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой, в аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NOs: 5, 28, 30 и 32, вторая аминокислота с N-конца замещена треонином, валином, изолейцином, лейцином, фенилаланином, или тирозином, и/или C-концевая аминокислота замещена лизином или аргинином. Предпочтительно, пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой, в аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NOs: 5, 28, 30 и 32, вторая аминокислота с N-конца замещена треонином, валином, изолейцином, лейцином, фенилаланином, или тирозином, и/или C-концевая аминокислота замещена лизином или аргинином. То есть, пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько замен, выбранных из нижеизложенных от (a) до (b), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32:

(a) вторая аминокислота с N-конца замещена треонином, валином, изолейцином, лейцином, фенилаланином, или тирозином; и

(b) C-концевая аминокислота замещена лизином или аргинином.

В предпочтительном варианте осуществления пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько замен, выбранных из вышеизложенных от (a) до (b), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32. В более предпочтительном варианте осуществления вторая аминокислота с N-конца замещена треонином, валином, изолейцином, лейцином.

Для HLA-A33, фенилаланин, тирозин, аланин, изолейцин, лейцин, и валин в качестве второй аминокислоты с N-конца, и лизин и аргинин в качестве C-концевой аминокислоты известны как якорные остатки с высокой аффинностью связывания для HLA-A33 (Falk, et al., Immunogenetics 1994, 40: 232-41; Takiguchi, et al., Tissue Antigens 2000, 55: 296-302). Дополнительно известно, что для HLA-A33, первый аминокислотный остаток с N-конца также функционирует как якорный остаток, и известно, что аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота являются предпочтительными в качестве первой аминокислоты с N-конца (Falk, et al., Immunogenetics 1994, 40: 232-41; Takiguchi, et al., Tissue Antigens 2000: 55: 296-302). Таким образом, для сохранения или повышения аффинности связывания с HLA-A33, существует вероятность того, что желательно заменить первую аминокислоту с N-конца аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой, вторую аминокислоту с N-конца фенилаланином, тирозином, аланином, изолейцином, лейцином, или валином, и/или C-концевую аминокислоту лизином или аргинином. Пептиды со способностью индуцировать ЦТЛ, содержащие аминокислотную последовательность, в которой, в аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85, первая аминокислота с N-конца замещена аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой, вторая аминокислота с N-конца замещена фенилаланином, тирозином, аланином, изолейцином, лейцином, или валином, и/или C-концевая аминокислота замещена лизином или аргинином, охватываются пептидами по настоящему изобретению. В предпочтительном варианте осуществления пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой, в аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85, первая аминокислота с N-конца замещена аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой, вторая аминокислота с N-конца замещена фенилаланином, тирозином, аланином, изолейцином, лейцином, или валином, и/или C-концевая аминокислота замещена лизином или аргинином. То есть, пептиды по настоящему изобретению включают в себя пептиды со способностью индуцировать ЦТЛ, которые содержат аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько замен, выбранных из нижеизложенных от (a) до (c), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85:

(a) первая аминокислота с N-конца замещена аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой;

(b) вторая аминокислота с N-конца замещена фенилаланином, тирозином, аланином, изолейцином, лейцином, или валином; и

(c) C-концевая аминокислота замещена лизином или аргинином.

В предпочтительном варианте осуществления пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько замен, выбранных из вышеизложенных от (a) до (c), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85. В настоящем изобретении, предпочтительное число замен составляет 1, 2, 3 замены, выбранные из вышеизложенных от (a) до (c).

Кроме того, пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой, в аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85, вторая аминокислота с N-конца замещена фенилаланином, тирозином, аланином, изолейцином, лейцином, или валином, и/или C-концевая аминокислота замещена лизином или аргинином. Предпочтительно, пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой, в аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85, вторая аминокислота с N-конца замещена фенилаланином, тирозином, аланином, изолейцином, лейцином, или валином, и/или C-концевая аминокислота замещена аргинином или лизином. То есть, пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько замен, выбранных из нижеизложенных от (a) до (b), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NOs: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85:

(a) вторая аминокислота с N-конца замещена фенилаланином, тирозином, аланином, изолейцином, лейцином, или валином; и

(b) C-концевая аминокислота замещена аргинином или лизином.

В предпочтительном варианте осуществления пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько замен, выбранных из вышеизложенных от (a) до (b), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NOs: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85. В более предпочтительном варианте осуществления вторая аминокислота сe N-конца замещена фенилаланином или тирозином.

Для HLA-A03, лейцин, метионин, валин, аланин, изолейцин, серин, и треонин в качестве второй аминокислоты с N-конца, и аргинин, лизин, тирозин, и фенилаланин в качестве C-концевой аминокислоты известны как якорные остатки с высокой аффинностью связывания для HLA-A03 (Kubo RT. et al., J Immunol. 1994 Apr 15; 152(8): 3913-24; Sidney J et al., Hum Immunol. 1996 Feb; 45(2): 79-93; Gambacorti-Passerini C et al., Clin Cancer Res. 1997 May; 3(5): 675-83). Таким образом, для сохранения или повышения аффинности связывания с HLA-A03, существует вероятность того, что желательно заменить вторую аминокислоту с N-конца лейцином, метионином, валином, аланином, изолейцином, серином или треонином, и/или C-концевую аминокислоту аргинином, лизином, тирозином или фенилаланином. Таким образом, пептиды со способностью индуцировать ЦТЛ, содержащие аминокислотную последовательность, в которой, в аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 27, 30 и 52, вторая аминокислота с N-конца замещена конца лейцином, метионином, валином, аланином, изолейцином, серином или треонином, и/или C-концевая аминокислота замещена аргинином, лизином, тирозином или фенилаланином, охватываются пептидами по настоящему изобретению. В предпочтительном варианте осуществления пептиды по настоящему изобретению могут быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой, в аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 27, 30 и 52, вторая аминокислота с N-конца замещена конца лейцином, метионином, валином, аланином, изолейцином, серином или треонином, и/или C-концевая аминокислота замещена аргинином, лизином, тирозином или фенилаланином. То есть, пептиды по настоящему изобретению включают в себя пептид со способностью индуцировать ЦТЛ, который содержит аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько замен, выбранных из нижеизложенных от (a) до (b), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 27, 30 и 52:

(a) вторая аминокислота с N-конца замещена конца лейцином, метионином, валином, аланином, изолейцином, серином или треонином; и

(b) C-концевая аминокислота замещена аргинином, лизином, тирозином или фенилаланином.

В предпочтительном варианте осуществления пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько замен, выбранных из вышеизложенных от (a) до (b), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 27, 30 и 52. В более предпочтительном варианте осуществления вторая аминокислота с N-конца замещена лейцином, метионином или валином. В настоящем изобретении, предпочтительное число замен составляет 1 или 2 замены, выбранные из вышеизложенных от (a) и (b).

Для HLA-A01, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота в качестве третьей аминокислоты с N-конца, и тирозин в качестве C-концевой аминокислоты известны как якорные остатки с высокой аффинностью связывания для HLA-A01. Дополнительно, известно, что существуют вспомогательные якорные остатки в положении 2 с N-конца для HLA-A01, и что треонин и серин являются предпочтительными в качестве второй аминокислоты с N-конца (Kubo, R.T Journal of Immunology 1994, 152: 3913; Gambacorti-Passerini, C. Clinical Cancer Research 1997, 3: 675-83; Falk, K. Immunogenetics 1994, 40: 238-41). Таким образом, для сохранения или повышения аффинности связывания с HLA-A01, существует вероятность того, что желательно заменить третью аминокислоту с N-конца аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой, и/или C-концевую аминокислоту тирозином. Дополнительно, существует вероятность того, что также желательно заменить вторую аминокислоту с N-конца треонином или серином. Таким образом, пептиды со способностью индуцировать ЦТЛ, содержащие аминокислотную последовательность, в которой, в аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41, вторая аминокислота с N-конца замещена треонином или серином, третья аминокислота с N-конца замещена аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой, и/или C-концевая аминокислота замещена тирозином, охватываются пептидами по настоящему изобретению. В предпочтительном варианте осуществления пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой, в аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41, вторая аминокислота с N-конца замещена треонином или серином, третья аминокислота с N-конца замещена аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой, и/или C-концевая аминокислота замещена тирозином. То есть, пептиды по настоящему изобретению включают в себя пептид со способностью индуцировать ЦТЛ, который содержит аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько замен, выбранных из нижеизложенных от (a) до (c), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41:

(a) вторая аминокислота с N-конца замещена треонином или серином;

(b) третья аминокислота с N-конца замещена аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой; и

(c) C-концевая аминокислота замещена тирозином.

В предпочтительном варианте осуществления пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько замен, выбранных из вышеизложенных от (a) до (c), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41. В настоящем изобретении, предпочтительное число замен составляет 1, 2 или 3 замены, выбранные из вышеизложенных от (a) до (c).

Кроме того, пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который содержит аминокислотную последовательность, в которой, в аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41, третья аминокислота с N-конца замещена аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой, и/или C-концевая аминокислота замещена тирозином. Предпочтительно, пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который содержит аминокислотную последовательность, в которой, в аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41, третья аминокислота с N-конца замещена аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой, и/или C-концевая аминокислота замещена тирозином. То есть, пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который содержит аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько замен, выбранных из нижеизложенных от (a) до (b), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NOs: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41:

(a) третья аминокислота с N-конца замещена аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой; и

(b) C-концевая аминокислота замещена тирозином.

В предпочтительном варианте осуществления пептид по настоящему изобретению может быть пептидом, имеющим способность индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько замен, выбранные из вышеуказанных от (a) до (b), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41.

Замену/замены можно вводить в аминокислоту/аминокислоты пептидов не только в якорном участке/участках, но также в положении/положениях потенциальных участков распознавания T-клеточного рецептора (TCR). Несколько исследовательских работ продемонстрировали, что пептид, который имеет замены аминокислот, такие как CAP1, p53_(264-272), Her-2/neu_{（369-377）} или gp100_{（209-217）}, может иметь равную или лучшую активность по сравнению с исходным пептидом (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-7, 1997; T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1, 168(3): 1338-47.; S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206; и S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-14).

Настоящее изобретение также предполагает, что одну, две или несколько аминокислот можно добавлять с N-конца и/или C-конца пептидов по настоящему изобретению (например, пептидов, состоящих из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30, 32, 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80, 85, 27, 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41). Такие модифицированные пептиды, которые сохраняют способность индуцировать ЦТЛ, также включены в настоящее изобретение. Например, если пептид, в котором одна, две или несколько аминокислот добавляют с N-конца и/или C-конца пептида, состоящего из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 32, 64, 67, 77, 27 и 86, контактирует с АПК, он захватывается в АПК и процессируется до пептида, состоящего из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 32, 64, 67, 77, 27 и 86. Он может затем индуцировать ЦТЛ путем презентирования на клеточной поверхности АПК с помощью пути презентации антигена. Более конкретно, пептиды по настоящему изобретению могут быть пептидами, в которых одну, две или несколько аминокислот добавляют к любому из N-конца и C-конца, или к обоим.

Однако если аминокислотная последовательность пептида идентична части аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка с отличающейся функцией, могут быть индуцированы побочные эффекты, такие как аутоиммунные нарушения и/или аллергические симптомы против конкретных веществ. Таким образом, предпочтительно проводить поиски с использованием доступных баз данных, для того чтобы избежать ситуаций, в которых аминокислотная последовательность пептида соответствует аминокислотной последовательности другого белка. Если из поисков гомологии становится ясно, что не существует пептида всего лишь с одной или двумя различающимися аминокислотами по сравнению с указанным пептидом, указанный пептид можно модифицировать для того чтобы повысить его аффинность связывания с антигенами HLA, и/или увеличить его способность индуцировать ЦТЛ без опасности таких побочных эффектов.

Пептиды, в которых модифицированы одна, две или несколько аминокислот из пептида по настоящему изобретению, теоретически спрогнозированы для сохранения способности исходного пептида индуцировать ЦТЛ; однако предпочтительно проверить способность модифицированных пептидов индуцировать ЦТЛ. В настоящем документе, «пептид со способностью индуцировать ЦТЛ (индуцибельность ЦТЛ)» относится к пептиду, который индуцирует ЦТЛ при помощи АПК, стимулированных пептидом. «Индуцирование ЦТЛ» включает индуцирование дифференцировки в ЦТЛ, индуцирование активации ЦТЛ, индуцирование пролиферации ЦТЛ, индуцирование цитотоксической активности ЦТЛ, индуцирование опосредованного ЦТЛ разрушения клеток-мишеней, и индуцирование повышенной выработки IFN-гамма ЦТЛ.

Способность индуцировать ЦТЛ можно подтверждать путем индуцирования и стимулирования АПК, несущих антиген HLA (например, B-лимфоциты, макрофаги и дендритные клетки) с пептидом, и смешивания с CD8-положительными Т-клетками; и затем с помощью измерения IFN-гамма, высвобожденного ЦТЛ против клеток-мишеней. В качестве АПК можно предпочтительно использовать дендритные клетки, полученные из мононуклеаров периферической крови человека. В качестве реакционной системы можно использовать трансгенных животных, созданных для экспрессии антигена HLA. Альтернативно, клетки-мишени могут быть радиоактивно-меченными с помощью ⁵¹Cr и так далее, и цитотоксическая активность пептид-индуцированных ЦТЛ может быть рассчитана на основании радиоактивности, испускаемой клетками-мишенями. Альтернативно, способность индуцировать ЦТЛ можно оценивать путем измерения IFN-гамма, выработанного и высвобожденного ЦТЛ в присутствии пептид-стимулированных АПК, и путем визуализации области ингибирования на среде с использованием моноклональных антител к IFN-гамма.

В дополнение к вышеизложенным модификациям, пептиды по настоящему изобретению могут быть связаны с другими пептидами при условии, что полученный связанный пептид сохраняет способность индуцировать ЦТЛ. Пример подходящего пептида для связывания с пептидами по настоящему изобретению относится к пептиду, индуцирующему ЦТЛ и полученному из TAA. Дополнительно, пептиды по настоящему изобретению могут также быть связаны друг с другом. Подходящие линкеры для применения для связывания пептидов известны в данной области, и, например, можно использовать линкеры, такие как AAY (P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK (SEQ ID NO: 111) (R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-15), или K (S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-6, K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-15). Пептиды можно связывать в различных расположениях (например, мелкими цепочками, повторами, и т.д.), и можно также связывать три или более пептидов.

Пептиды по настоящему изобретению могут также быть связааны с другими веществами при условии, что полученный связанный пептид сохраняет способность индуцировать ЦТЛ. Примеры подходящего вещества для связывания с пептидом по настоящему изобретению включают, например, пептид, липид, сахар или цепь сахаров, ацетильную группу, и природный или синтетический полимер. Пептиды по настоящему изобретению можно модифицировать путем гликозилирования, окисления боковых цепей, фосфорилирования или т.п., при условии, что их способность индуцировать ЦТЛ не будет нарушена. Можно также проводить такие типы модификаций для придания дополнительных функций (например, нацеливающей функции и функции доставки) или для стабилизации пептида.

Например, для повышения стабильности пептида in vivo в данной области известно введение D-аминокислот, миметиков аминокислот или неприродных аминокислот, и эта концепция также может быть применима к пептидам по настоящему изобретению. Стабильность пептидов можно оценивать несколькими способами. Например, стабильность можно тестировать с использованием пептидазы, а также различных биологических сред, таких как плазма и сыворотка человека (см., например, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302).

Дополнительно, как указано выше, среди модифицированных пептидов, в которых один, два, или несколько аминокислотных остатков были замещены, удалены, вставлены и/или добавлены, можно проводить скрининг или отбор по тем пептидам, которые имеют такую же или более высокую активность, как и исходные пептиды. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способам скрининга или отбора модифицированных пептидов, которые имеют такую же или более высокую активность, как и исходный пептид. Конкретно, настоящее изобретение относится к способу скрининга на пептид со способностью индуцировать ЦТЛ, где способ включает этапы:

(a) создания кандидатных последовательностей, состоящих из аминокислотной последовательности, в которой один, два, или несколько аминокислотных остатков замещены, удалены, вставлены и/или добавлены по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30, 32, 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80, 85, 27, 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41;

(b) отбора в кандидатных последовательностях, полученных в (a), кандидатной последовательности, которая не имеет значительной гомологии (идентичности последовательности) с любым известным продуктом гена человека, за исключением KOC1;

(c) контакта пептида, состоящего из кандидатной последовательности, выбранной в (b), с АПК;

(d) контакта АПК из (c) с CD8-положительными T-клетками; и

(e) отбора пептида, который имеет равную или более высокую способность индуцировать ЦТЛ, чем пептид, состоящий из исходной аминокислотной последовательности.

В настоящем документе, пептид по настоящему изобретению также описан как «пептид(-ы) KOC1» или a «полипептид(-ы) KOC1».

III. Получение пептидов по настоящему изобретению

Для получения пептидов по настоящему изобретению можно использовать хорошо известные способы. Например, для получения пептидов по настоящему изобретению можно использовать технологию рекомбинантных ДНК или химический синтез. Пептиды по настоящему изобретению можно синтезировать по отдельности, или в виде более длинных полипептидов, включающих два или более пептида. Пептиды по настоящему изобретению можно выделять из клеток-хозяев или продуктов реакции синтеза, после того как они были произведены в клетках-хозяевах при помощи технологии рекомбинантных ДНК или после того как они были синтезированы химическим путем. То есть, пептиды по настоящему изобретению можно очищать или изолировать таким образом, что они по существу не содержат других белков и их фрагментов из клетки-хозяина, или любых других химических веществ.

Пептиды по настоящему изобретению могут содержать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковых цепей, фосфорилирование при условии, что такие модификации не разрушают биологическую активность исходного пептида. Другие иллюстративные модификации включают введение D-аминокислот или других миметиков аминокислот, которые можно использовать, например, для увеличения времени полувыведения пептидов из сыворотки.

Пептид по настоящему изобретению можно получать путем химического синтеза на основании выбранной аминокислотной последовательности. Примеры общепринятых способов пептидного синтеза, которые можно адаптивровать для синтеза, включают способы, описанные в документах ниже:

(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;

(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;

(iii) ʺPeptide Synthesisʺ (in Japanese), Maruzen Co., 1975;

(iv) ʺBasics and Experiment of Peptide Synthesisʺ (in Japanese), Maruzen Co., 1985;

(v) ʺDevelopment of Pharmaceuticalsʺ (in Japanese), Continued Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991;

(vi) WO99/67288; и

(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, Solid Phase Peptide Synthesis, Academic Press, New York, 1980, 100-118.

Альтернативно, пептиды по настоящему изобретению можно получать, адаптируя любые известные способы генетической инженерии для выработки пептидов (например, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (Wu et al.) 1983, 101: 347-62). Например, сначала получают подходящий вектор, несущий полинуклеотид, который кодирует пептид по настоящему изобретению, в экспресирующейся форме (например, после регуляторной последовательности, соответствующей промоторной последовательности), и транформируют подходящую клетку-хозяина. Клетку-хозяина затем культивируют для получения пептида по настоящему изобретению. Пептид по настоящему изобретению также можно получать in vitro с использованием системы для трансляции in vitro.

IV. Полинуклеотиды

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, который кодирует любой из пептидов по настоящему изобретению. Он включает полинуклеотиды, полученные из природного гена KOC1 (например, номер доступа GeneBank NM_006547 (SEQ ID NO: 109)), а также полинуклеотиды с консервативно модифицированной нуклеотидной последовательностью. В настоящем документе, фраза «консервативно модифицированная нуклеотидная последовательность» относится к последовательностям, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности. Из-за вырожденности генетического кода, большое количество функционально идентичных нуклеиновых кислот кодирует любой указанный белок. Например, все кодоны GCA, GCC, GCG, и GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, где кодоном определен аланин, кодон можно изменять на любой из соответствующих вышеописанных кодонов без изменения кодируемого полипептида. Такие вариации нуклеиновых кислот представляют собой «молчащие вариации», которые являются одним из видов консервативно модифицированных вариаций. Каждая последовательность нуклеиновой кислоты в настоящем документе, которая кодирует пептид, также описывает любую возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области будет понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который, как правило, является единственным кодоном для метионина, и TGG, который, как правило, является единственным кодоном для триптофана) можно модифицировать для получения функционально идентичной молекулы. Таким образом, каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, неявно описана в каждой раскрытой последовательности.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может состоять из ДНК, РНК, и их производных. ДНК соответствующим образом состоит из оснований, таких как A, T, C, и G, и T заменена на U в РНК.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может кодировать несколько пептидов по настоящему изобретению с наличием или отсутствием между ними промежуточных аминокислотных последовательностей. Например, промежуточная аминокислотная последовательность может обеспечивать участок расщепления (например, последовательность распознавания фермента) полинуклеотида или транслированных пептидов. Кроме того, полинуклеотид может включать любые дополнительные последовательности в кодирующую последовательность, которая кодирует пептид по настоящему изобретению. Например, полинуклеотид может быть рекомбинантным полинуклеотидом, который включает регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии пептида или может быть экспрессирующим вектором (например, плазмидой) с маркерными генами и т.п. Как правило, такие рекомбинантные полинуклеотиды можно получать путем манипуляций с полинуклеотидами путем общепринятых рекомбинантных способов при помощи, например, полимераз и эндонуклеаз.

Для получения полинуклеотидов по настоящему изобретению можно использовать и рекомбинантные способы, и способы химического синтеза. Например, полинуклеотид можно получать путем вставки в соответствующий вектор, который можно экпрессировать после трансфекции в компетентных клетках. Альтернативно, полинуклеотид можно амплифицировать при помощи способов ПЦР или экспрессии в подходящих хозяевах (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Альтернативно, полинуклеотид можно синтезировать с ипользованием твердофазных способов, как описано в Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5.

V. Экзосомы

Настоящее изобретение дополнительно относится к внутриклеточным пузырькам, обозначаемым как экзосомы, которые презентируют на своей поверхности комплексы, образованные между пептидами по настоящему изобретению и антигенами HLA. Экзосомы можно получать, например, при помощи способов, подробно описанных в JPH11-510507 и WO99/03499, и можно получать с использованием АПК, полученных от пациентов, которые являются объектами для лечения и/или предупреждения заболевания (профилактики). Экзосомы по настоящему изобретению можно прививать как вакцины, аналогичным образом, как и пептиды по настоящему изобретению.

Тип антигенов HLA, включенных в описанные выше комплексы, должен совпадать с типом у индивидуума, которому необходимо лечение и/или предупреждение заболевания (профилактика). Например, в азиатских популяциях, HLA-A11 (например, HLA-A^*1101) и HLA-A33 (например, HLA-A^*3303) представляют собой аллели, широко и повсеместно наблюдаемые в азиатских популяциях, и эти типы антигенов HLA считаются подходящими для лечения азиатских пациентов. Дополнительно, HLA-A03 (например, HLA-A^*0301) и HLA-A01 (например, HLA-A^*0101) представляют собой аллели, широко и повсеместно наблюдаемые в европеоидных популяциях, и эти типы антигенов HLA считаются подходящими для лечения европеоидных пациентов. Как правило, в клинической практике, за счет предварительного исследования типа антигена HLA у пациента, нуждающегося в лечении, возможно выбрать подходящий пептид, который имеет высокий уровень аффинности связывания с конкретным антигеном HLA, или который имеет способность индуцировать ЦТЛ за счет презентации антигена, опосредованной конкретным антигеном HLA.

Экзосомы по настоящему изобретению презентируют на своей поверхности комплекс пептида по настоящему изобретению и HLA-A11, HLA-A33, HLA-A03 или HLA-A01. Если HLA, который образует комплекс с пептидом по настоящему изобретению, представляет собой HLA-A11, пептид по настоящему изобретению предпочтительно является пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32 или его модифицированным пептидом, и, более предпочтительно, пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32, или его модифицированным пептидом. Дополнительно, если HLA, который образует комплекс с пептидом по настоящему изобретению, представляет собой HLA-A33, пептид по настоящему изобретению предпочтительно является пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85, или его модифицированным пептидом, и, более предпочтительно, пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85, или его модифицированным пептидом. Дополнительно, если HLA, который образует комплекс с пептидом по настоящему изобретению, представляет собой HLA-A03, пептид по настоящему изобретению предпочтительно является пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 27, 30 и 52, или его модифицированным пептидом, и, более предпочтительно, пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 27, 30 и 52, или его модифицированным пептидом. Дополнительно, если HLA, который образует комплекс с пептидом по настоящему изобретению, представляет собой HLA-A01, пептид по настоящему изобретению предпочтительно является пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41, или его модифицированным пептидом, и, более предпочтительно, пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41, или его модифицированным пептидом.

VI. Антигенпрезентирующ клетки (АПК)

Настоящее изобретение дополнительно относится к АПК, которые презентируют на своей поверхности комплексы, образованные между антигенами HLA и пептидами по настоящему изобретению. Альтернативно, настоящее изобретение относится к АПК, имеющим на своей клеточной поверхности комплексы, образованные между антигенами HLA и пептидами по настоящему изобретению. АПК по настоящему изобретению могут быть изолированными АПК. При применении в отношении клетки (АПК, ЦТЛ, и т.д.), термин «изолированный» означает, что клетки отделены от другого типа клеток. АПК по настоящему изобретению могут быть АПК, индуцированными из АПК, полученных от пациента, которого собираются подвергать лечению и/или предупреждению (профилактике), и их можно вводить в виде вакцины сами по себе или в комбинации с другими лекарственными средствами, включая пептид(-ы), экзосому/экзосомы или ЦТЛ по настоящему изобретению.

АПК по настоящему изобретению не ограничиваются конкретным типом клеток, и включают клетки, о которых известно, что они презентируют белковые антигены на своей клеточной поверхности таким образом, что они распознаются лимфоцитами, например, дендритные клетки (DC), клетки Лангерганса, макрофаги, B-клетки, и активированные T-клетки. Поскольку DC является типичной АПК, которая имеет самую сильную способность индуцировать ЦТЛ среди АПК, DC могут быть предпочтительно использованы в качестве АПК по настоящему изобретению. В настоящем изобретении, предпочтительная DC является изолированной DC, полученной от человека. Дополнительно, для АПК по настоящему изобретению необязательно быть гомогенными, и они могут представлять собой смеси нескольких типов клеток с антиген-презентирующей функцией и могут быть смесями АПК, каждая из которых презентирует различные типы пептидов по настоящему изобретению.

Например, АПК по настоящему изобретению можно получать, изолируя DC из мононуклеарных клеток периферической крови, а затем стимулируя их in vitro пептидами по настоящему изобретению. Когда пептид по настоящему изобретению вводят индивидууму, АПК, презентирующие пептид по настоящему изобретению, индуцируются в организме индивидуума. Таким образом, после того как пептиды по настоящему изобретению вводят индивидууму, можно получать АПК по настоящему изобретению путем забора АПК от индивидуума. Альтернативно, АПК по настоящему изобретению можно получать путем контакта АПК, собранных у индивидуума, с пептидом по настоящему изобретению.

Для того чтобы индуцировать иммунный ответ против KOC1-экспрессирующих злокачественных клеток у индивидуума, АПК по настоящему изобретению можно вводить индивидууму сами по себе или в комбинации с другими лекарственными средствами, включая пептид(-ы), экзосому/экзосомы или ЦТЛ по настоящему изобретению. Например, введение ex vivo может включать следующие этапы:

(a) забор АПК у первого индивидуума;

(b) контакт АПК из этапа (a) с пептидом; и

(c) введение АПК из этапа (b) второму индивидууму.

Первый индивидуум и второй индивидуум могут быть одним и тем же индивидуумом, или могут быть разными индивидуумами. Когда первый индивидуум и второй индивидуум являются разными индивидуумами, предпочтительно, что HLA первого индивидуума и второго индивидуума представляют собой HLA одного типа. АПК, полученные на вышеописанном этапе (b), могут быть вакциной для лечения злокачественной опухоли и/или предупреждения заболевания (профилактики).

АПК по настоящему изобретению, полученные вышеописанным способом, имеют способность индуцировать ЦТЛ. Термин «способность индуцировать ЦТЛ (индуцибельность ЦТЛ)», применяемый в отношении АПК, относится к способности АПК индуцировать ЦТЛ при контакте с CD8-положительной T-клеткой/клетками. Дополнительно, «способность индуцировать ЦТЛ (индуцибельность ЦТЛ)» включает способность АПК индуцировать активацию ЦТЛ, способность АПК индуцировать пролиферацию ЦТЛ, способность АПК способствовать опосредованному ЦТЛ разрушению клеток-мишеней, и способность АПК повышать опосредованную ЦТЛ выработку IFN-гамма. ЦТЛ, индуцированная АПК по настоящему изобретению, представляет собой ЦТЛ, специфичную к KOC1, и демонстрирует специфическую цитотоксическую активность против KOC1-экспрессирующих клеток.

В дополнение к вышеописанным способам, АПК по настоящему изобретению можно получать путем введения полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в АПК in vitro. Вводимый полинуклеотид может быть в форме ДНК или РНК. Способ введения конкретно не ограничен, и его примеры включают различные способы, применяемые обычно в данной области, такие как липофекция, электропорация и способ с фосфатом кальция. Более конкретно, можно использовать способы, описанн в Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72, и JP2000-509281. За счет введения полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в АПК, полинуклеотид транскрибируется и транслируется в клетке, а затем произведенный пептид процессируется MHC класса I и проходит через путь презентации пептида по настоящему изобретению на клеточной поверхности АПК.

В предпочтительном варианте осуществления АПК по настоящему изобретению презентирует на своей клеточной поверхности комплекс, образованный между пептидом по настоящему изобретению и HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A^*1101), HLA-A33 (более предпочтительно HLA-A^*3303), HLA-A03 (более предпочтительно HLA-A^*0301) или HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A^*0101). Если HLA, который образует комплекс с пептидом по настоящему изобретению, представляет собой HLA-A11, пептид по настоящему изобретению предпочтительно является пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32 или его модифицированным пептидом, и, более предпочтительно, пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32. Если HLA, который образует комплекс с пептидом по настоящему изобретению, представляет собой HLA-A33, пептид по настоящему изобретению предпочтительно является пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85, или его модифицированным пептидом, и, более предпочтительно, пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85. Если HLA, который образует комплекс с пептидом по настоящему изобретению, представляет собой HLA-A03, пептид по настоящему изобретению предпочтительно является пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NOs: 27, 30 и 52, или его модифицированным пептидом, и, более предпочтительно, пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NOs: 27, 30 и 52. Если HLA, который образует комплекс с пептидом по настоящему изобретению, представляет собой HLA-A01, пептид по настоящему изобретению предпочтительно является пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NOs: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41, или его модифицированным пептидом, и, более предпочтительно, пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NOs: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41.

АПК по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой АПК, индуцированную способом, включающим этап, описанный (a) или (b) ниже:

(a) контакт АПК, экспрессирующей, по меньшей мере, один HLA, выбранный из HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A^*1101), HLA-A33 (более предпочтительно HLA-A^*3303), HLA-A03 (более предпочтительно HLA-A^*0301) и HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A^*0101), с пептидом по настоящему изобретению; или

(b) введение полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в АПК, экспрессирующую, по меньшей мере, один HLA, выбранный из HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A^*1101), HLA-A33 (более предпочтительно HLA-A^*3303), HLA-A03 (более предпочтительно HLA-A^*0301) и HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A^*0101).

Пептид по настоящему изобретению, который контактирует с HLA-A11-экспрессирующей АПК, предпочтительно представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32 или его модифицированный пептид, и более предпочтительно пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32.

Пептид по настоящему изобретению, который контактирует с HLA-A33-экспрессирующей АПК, предпочтительно представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85 или его модифицированный пептид, и более предпочтительно пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85.

Пептид по настоящему изобретению, который контактирует с HLA-A03-экспрессирующей АПК, предпочтительно представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 27, 30 и 52 или его модифицированный пептид, и более предпочтительно пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 27, 30 и 52.

Пептид по настоящему изобретению, который контактирует с HLA-A01-экспрессирующей АПК, предпочтительно представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41 или его модифицированный пептид, и более предпочтительно пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41.

Настоящее изобретение относится к применению пептида по настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции, которая индуцирует АПК со способностью индуцировать ЦТЛ. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу или процессу производства фармацевтической композиции, которая индуцирует АПК со способностью индуцировать ЦТЛ. Дополнительно, настоящее изобретение относится к пептиду по настоящему изобретению для индуцирования АПК со способностью индуцировать ЦТЛ.

VII. Цитотоксические T-лимфоциты (ЦТЛ)

ЦТЛ, индуцированные пептидом по настоящему изобретению можно использовать в качестве вакцины аналогичным образом, как и пептид по настоящему изобретению, для усиления иммунного ответа, нацеленного на KOC1-экспрессирующую клетку in vivo. Таким образом, настоящее изобретение относится к ЦТЛ, которые индуцируются или активируются пептидом по настоящему изобретению. ЦТЛ по настоящему изобретению представляют собой ЦТЛ, который нацелен на пептид по настоящему изобретению, и способен к связыванию с комплексом пептида по настоящему изобретению и антигена HLA. Связывание ЦТЛ с комплексом опосредуется через T-клеточный рецептор (TCR), присутствующий на клеточной поверхности ЦТЛ. ЦТЛ по настоящему изобретению может быть изолированным ЦТЛ. Предпочтительные ЦТЛ представляют собой изолированные ЦТЛ человеческого происхождения. ЦТЛ по настоящему изобретению не должны быть гомогенными, и могут представлять собой смеси ЦТЛ, каждая из которых нацелена на различные типы пептидов по настоящему изобретению.

ЦТЛ по настоящему изобретению можно получать путем (1) введения пептидов по настоящему изобретению индивидууму, (2) стимулирования АПК и CD8-положительных T-клеток, или мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC),полученных от индивидуума, пептидом по настоящему изобретению in vitro, (3) контакта CD8-положительных T-клеток или PBMC с АПК или экзосомами, которые презентируют на своей поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению, in vitro, или (4) введения в CD8-положительные T-клетки вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий каждую субъединицу T-клеточного рецептора (TCR), способного связываться с пептидом по настоящему изобретению, презентированным на клеточной поверхности посредством антигена HLA. Экзосомы и АПК, применяемые в способе (2) или (3) выше, можно получать путем способов, описанных в разделах «V. Экзосомы» и «VI. Антигенпрезентирующие клетки (АПК)», соответственно, а подробности способа (4) выше будут описаны в разделе «VIII. T-клеточный рецептор (TCR)».

ЦТЛ по настоящему изобретению можно вводить сами по себе пациентам, которые подвергаются лечению и/или предупреждению (профилактике), или в комбинации с другими лекарственными средствами, включая пептид(-ы), АПК или экзосому/экзосомы по настоящему изобретению с целью регулирования воздействий. Дополнительно, ЦТЛ по настоящему изобретению могут быть ЦТЛ, индуцированными из CD8-положительных T-клеток, полученных от пациентов, которым предполагается вводить ЦТЛ. ЦТЛ по настоящему изобретению действуют специфически на клетки-мишени, которые презентируют пептиды по настоящему изобретению, например, те же самые пептиды, которые использовали для индуцирования ЦТЛ по настоящему изобретению. Клетки-мишени могут быть клетками, которые эндогенно экспрессируют KOC1, такими как злокачественные клетки, или клетки, трансфецированные геном KOC1. Клетки, которые презентируют пептид по настоящему изобретению на своей клеточной поверхности из-за стимулирования пептидом, могут становиться мишенью для атаки ЦТЛ по настоящему изобретению. Клетки, являющиеся мишенями для ЦТЛ по настоящему изобретению, предпочтительно являются клетками, которые положительны, по меньшей мере, по одному из HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A^*1101), HLA-A33 (более предпочтительно HLA-A^*3303), HLA-A03 (более предпочтительно HLA-A^*0301), и HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A^*0101).

В предпочтительном варианте осуществления ЦТЛ по настоящему изобретению специфически нацелены на клетки, которые экспрессируют и KOC1, и, по меньшей мере, один HLA, выбранный из HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A^*1101), HLA-A33 (более предпочтительно HLA-A^*3303), HLA-A03 (более предпочтительно HLA-A^*0301), и HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A^*0101). В настоящем изобретении, клетки, являющиеся мишенями для ЦТЛ, могут быть клетками, которые имеют любые из аллелей HLA-A11, HLA-A33, HLA-A03, и HLA-A01 в гомозиготном или гетерозиготном состоянии.

В настоящем документе, то, что ЦТЛ «нацелен на» клетки, относится к распознаванию ЦТЛ клеток, которые презентируют на своей клеточной поверхности комплекс HLA и пептида по настоящему изобретению, и демонстрации цитотоксической активности против клеток. Дополнительно, «специфически нацелен на» относится к тому, что ЦТЛ демонстрирует цитотоксическую активность против таких клеток, но не демонстрирует повреждающей активности по отношению к другим клеткам. Выражение «распознавать клетки», применяемое в отношении ЦТЛ, относится к связыванию с комплексом HLA и пептида по настоящему изобретению, презентированным на клеточной поверхности, через TCR, и к демонстрации цитотоксической активности против клеток. Таким образом, ЦТЛ по настоящему изобретению предпочтительно является ЦТЛ, который может связываться через TCR с комплексом, образованным между пептидом по настоящему изобретению и HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A^*1101), HLA-A33 (более предпочтительно HLA-A^*3303), HLA-A03 (более предпочтительно HLA-A^*0301) или HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A^*0101), презентированным на клеточной поверхности.

Кроме того, ЦТЛ по настоящему изобретению предпочтительно являются ЦТЛ, индуцированными способом, включающим этап, описанный в (a) или (b) ниже:

(a) контакт in vitro CD8-положительных T-клеток с АПК или экзосомами, которые презентируют на своей поверхности комплекс пептида по настоящему изобретению и HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A^*1101), HLA-A33 (более предпочтительно HLA-A^*3303), HLA-A03 (более предпочтительно HLA-A^*0301) или HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A^*0101); или

(b) введение в CD8-положительные T-клетки полинуклеотида, кодирующего каждую субъединицу TCR, способного связываться с пептидом по настоящему изобретению, презентированным на клеточной поверхности посредством HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A^*1101), HLA-A33 (более предпочтительно HLA-A^*3303), HLA-A03 (более предпочтительно HLA-A^*0301) или HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A^*0101).

VIII. T-клеточные рецепторы (TCR)

Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим полинуклеотид, кодирующий каждую субъединицу TCR, способного связываться с пептидом по настоящему изобретению, который презентирован на клеточной поверхности при помощи антигена HLA, и к способам применения таких композиций. Полинуклеотид наделяет CD8-положительные T-клетки специфичностью против KOC1-экспрессирующих злокачественных клеток за счет экспрессии TCR, способного связываться с пептидом по настоящему изобретению, который презентирован на клеточной поверхности при помощи антигена HLA. Полинуклеотиды, кодирующие альфа цепь/цепи и бета цепь/цепи, можно идентифицировать как субъединицу TCR ЦТЛ, индуцированных пептидом по настоящему изобретению, с применением способов, известных в данной области (WO2007/032255 и Morgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)). Например, для анализа TCR предпочтительными являются способы ПЦР. Не ограничиваясь нижеописанными, праймеры для ПЦР для анализа могут быть, например, набором/наборами праймеров для амплификации путем комбинирования 5ʹ-концевого праймера и 3ʹ-концевого праймера/праймеров ниже:

5ʹ-концевой праймер:

5ʹ-R праймер (5ʹ-gtctaccaggcattcgcttcat-3ʹ) (SEQ ID NO: 105)

3ʹ-концевой праймер:

Специфичный к области С альфа-цепи TCR

3-TRa-C праймер (5ʹ-tcagctggaccacagccgcagcgt-3ʹ) (SEQ ID NO: 106)

Специфичный к области С1 бета-цепи TCR

3-TRb-C1 праймер (5ʹ-tcagaaatcctttctcttgac-3ʹ) (SEQ ID NO: 107) или

Специфичный к области С2 бета-цепи TCR

3-TR-бета-C2 праймер (5ʹ-ctagcctctggaatcctttctctt-3ʹ) (SEQ ID NO: 108)

TCR, образованные за счет введения идентифицированных полинуклеотидов в CD8-положительные T-клетки, могут связываться с высокой аффинностью связывания с клетками-мишенями, которые презентируют пептид по настоящему изобретению, и опосредовать эффективный лизис клеток-мишеней, презентирующих пептид по настоящему изобретению, in vivo и in vitro.

Полинуклеотид, кодирующий каждую субъединицу TCR, можно вставлять в подходящий вектор, например, ретровирусный вектор. Эти векторы хорошо известны в данной области. Полинуклеотид или вектор, содержащий его в экспрессируемой форме, можно вводить в CD8-положительную T-клетку, например, CD8-положительную T-клетку, полученную от пациента. Настоящее изобретение относится к готовым композициям, которые позволяют легко и быстро получить модифицированные T-клетки, имеющие превосходные свойства лизиса злокачественных клеток, за счет быстрой модификации собственных Т-клеток пациента (или T-клеток, полученных от другого индивидуума).

В настоящем документе, специфический TCR представляет собой TCR, который может придавать специфическую цитотоксическую активность против клеток-мишеней за счет специфического распознавания комплекса пептида по настоящему изобретению и антигена HLA, презентированного на поверхности клеток-мишеней, при этом TCR присутствует на поверхности CD8-положительной T-клетки. Специфическое распознавание вышеописанного комплекса можно подтверждать любым известным способом, и предпочтительные примеры способов включают анализ окрашивания мультимеров HLA с использованием молекул HLA и пептидов по настоящему изобретению, и способы анализа иммуноферментных пятен (ELISPOT). Специфическое, опосредованное TCR, распознавание клетки-мишени Т-клеткой, в которую был введен вышеописанный полинуклеотид, и передачу сигнала в клетке можно подтверждать, проводя анализ ELISPOT. Когда вышеописанный TCR присутствует на поверхности CD8-положительной T-клетки, может ли он наделять CD8-положительную T-клетку специфической цитотоксической активностью против клетки-мишени можно также подтверждать известными способами. Предпочтительные способы включают, например, измерение цитотоксической активности против клеток-мишеней при помощи анализа высвобождения хрома или т.п.

Настоящее изобретение в отношении HLA-A11 относится к ЦТЛ, полученным путем трансформации CD8-положительных T-клеток полинуклеотидом, кодирующим каждую субъединицу TCR, которая связывается, например, с пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32.

Настоящее изобретение в отношении HLA-A33 относится к ЦТЛ, полученным путем трансформации CD8-положительных T-клеток полинуклеотидом, кодирующим каждую субъединицу TCR, которая связывается, например, с пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85.

Настоящее изобретение в отношении HLA-A03 относится к ЦТЛ, полученным путем трансформации CD8-положительных T-клеток полинуклеотидом, кодирующим каждую субъединицу TCR, которая связывается, например, с пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 27, 30 и 52.

Настоящее изобретение в отношении HLA-A01 относится к ЦТЛ, полученным путем трансформации CD8-положительных T-клеток полинуклеотидом, кодирующим каждую субъединицу TCR, которая связывается, например, с пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41.

Трансформированные ЦТЛ способны к хоумингу in vivo и могут быть выращены при помощи хорошо известного способа культивирования in vitro (например, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-61 (1989)). ЦТЛ по настоящему изобретению можно использовать для получения иммуногенной композиции, подходящей для лечения заболевания или предупреждения заболевания (профилактики) у пациента, нуждающегося в лечении или предупреждении заболевания (профилактике) (содержание включено в настоящий документ в виде ссылки WO2006/031221).

IX. Фармацевтические композиции

Настоящее изобретение дополнительно относится к композициям или фармацевтическим композициям, содержащим, по меньшей мере, один активный ингредиент, выбранный из нижеизложенных:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК по настоящему изобретению;

(d) экзосома по настоящему изобретению; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать по мере необходимости носитель/носители, эксципиент (-ы) или т.п., широко используемые в фармацевтических препаратах без конкретных ограничений, в дополнение к вышеописанному активному ингредиенту/ингредиентам. Примеры носителя, который можно использовать в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, относятся к стерилизованной воде, физиологическому раствору, фосфатному буферу, культуральной жидкости и т.п. Таким образом, настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим, по меньшей мере, один активный ингредиент, выбранный из нижеизложенных от (a) до (e), и фармацевтически приемлемый носитель:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК по настоящему изобретению;

(d) экзосома по настоящему изобретению; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

Дополнительно, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать, по мере необходимости, стабилизаторы, суспензии, консерванты, поверхностно-активные вещества, солюбилизаторы, регуляторы pH, ингибиторы агрегации и т.п.

Экспрессия KOC1 значительно повышена в злокачественных клетках по сравнению с нормальными тканями. Таким образом, пептид по настоящему изобретению или полинуклеотид, кодирующий пептид, можно использовать для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, и/или профилактики ее послеоперационного рецидива. Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, и/или профилактики ее послеоперационного рецидива, содержащим один или несколько типов пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. Альтернативно, пептиды по настоящему изобретению можно производить для презентирования на поверхности экзосом или АПК для применения в качестве фармацевтических композиций. Кроме того, ЦТЛ по настоящему изобретению, нацеленный на любой один из пептидов по настоящему изобретению, также можно использовать в качестве активного ингредиента фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать терапевтически эффективное количество или фармацевтически эффективное количество вышеописанного активного ингредиента.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению также можно использовать в качестве вакцины. В контексте настоящего изобретения, термин «вакцина» (также называемая «иммуногенная композиция») относится к композициям, которые имеют функцию индуцирования иммунного ответа, приводящего к противоопухолевому действию при введении животному. Таким образом, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать для индуцирования иммунного ответа, приводящего к противоопухолевому действию. Иммунный ответ, индуцируемый пептидом, полинуклеотидом, АПК, ЦТЛ и фармацевтической композицией по настоящему изобретению, конкретно не ограничен при условии, что он является иммунным ответом, который приводит к противоопухолевому действию, и примеры включают индуцирование ЦТЛ, специфичных к злокачественным клеткам, и индуцирование специфической цитотоксической активности против злокачественных клеток.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, и/или профилактики ее послеоперационного рецидива у человеческих индивидуумов или пациентов. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать предпочтительно индивидууму, положительному, по меньшей мере, по одному HLA, выбранному из HLA-A11, HLA-A33, HLA-A03 и HLA-A01. Дополнительно, фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать предпочтительно для лечения и/или профилактики злокачественных опухолей, экспрессирующих KOC1 и, по меньшей мере, один HLA, выбранный из HLA-A11, HLA-A33, HLA-A03 и HLA-A01, и/или для профилактики их послеоперационного рецидива.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению активного ингредиента, выбранного из нижеуказанных, в производстве фармацевтической композиции для лечения или профилактики злокачественной опухоли:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к активному ингредиенту, выбранному из нижеуказанных, для применения в лечении или профилактике злокачественной опухоли:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к способу или процессу для производства фармацевтической композиции для лечения или профилактики злокачественной опухоли, где способ или процесс включает этап формулирования, по меньшей мере, одного активного ингредиента, выбранного из нижеуказанных, с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение дополнительно относится к способу или процессу для производства фармацевтической композиции для лечения или профилактики злокачественной опухоли, где способ или процесс включает этап смешивания активного ингредиента, выбранного из нижеуказанных, с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение дополнительно относится к способу лечения или профилактики злокачественной опухоли, который включает этап введения индивидууму, по меньшей мере, одного активного ингредиента, выбранного из нижеуказанных:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

В настоящем изобретении, пептиды с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32, идентифицированы как эпитопные пептиды, рестриктированные по HLA-A11, которые могут индуцировать мощный и специфический иммунный ответ. Таким образом, фармацевтические композиции по настоящему изобретению, содержащие, по меньшей мере, один пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32, являются подходящими, в частности для введения индивидууму с HLA-A11 (например, HLA-A^*1101) в качестве антигена HLA. То же самое относится и к фармацевтическим композициям, содержащим полинуклеотид, кодирующий любые из этих пептидов (т.е., полинуклеотиды по настоящему изобретению), АПК или экзосому, которые презентируют эти пептиды (т.е., АПК или экзосомы по настоящему изобретению), или ЦТЛ, нацеленный на эти пептиды (т.е., ЦТЛ по настоящему изобретению). То есть, фармацевтические композиции, содержащие активный ингредиент в контексте с пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32, являются подходящими для введения индивидуумам с HLA-A11 (т.е., HLA-A11-положительным индивидуумам). В более предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, которая содержит пептид с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 32.

Аналогично, в настоящем изобретении, пептиды с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85, идентифицированы как эпитопные пептиды, рестриктированные по HLA-A33, которые могут индуцировать мощный и специфический иммунный ответ. Таким образом, фармацевтические композиции по настоящему изобретению, содержащие, по меньшей мере, один пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85 являются подходящими, в частности для введения индивидууму с HLA-A33 (например, HLA-A^*3303) в качестве антигена HLA. То же самое относится и к фармацевтическим композициям, содержащим полинуклеотид, кодирующий любые из этих пептидов (т.е., полинуклеотиды по настоящему изобретению), АПК или экзосому, которые презентируют эти пептиды (т.е., АПК или экзосомы по настоящему изобретению), или ЦТЛ, нацеленный на эти пептиды (т.е., ЦТЛ по настоящему изобретению). То есть, фармацевтические композиции, содержащие активный ингредиент в контексте с пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NOs: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85, являются подходящими для введения индивидуумам с HLA-A33 (т.е., HLA-A33-положительным индивидуумам). В более предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, которая содержит, по меньшей мере, один пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 64, 67 и 77.

Аналогично, в настоящем изобретении, пептиды с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 27, 30 и 52, идентифицированы как эпитопные пептиды, рестриктированные по HLA-A03, которые могут индуцировать мощный и специфический иммунный ответ. Таким образом, фармацевтические композиции по настоящему изобретению, содержащие, по меньшей мере, один пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NOs: 27, 30 и 52 являются подходящими, в частности для введения индивидууму с HLA-A03 (например, HLA-A^*0301) в качестве антигена HLA. То же самое относится и к фармацевтическим композициям, содержащим полинуклеотид, кодирующий любые из этих пептидов (т.е., полинуклеотиды по настоящему изобретению), АПК или экзосому, которые презентируют эти пептиды (т.е., АПК или экзосомы по настоящему изобретению), или ЦТЛ, нацеленный на эти пептиды (т.е., ЦТЛ по настоящему изобретению). То есть, фармацевтические композиции, содержащие активный ингредиент в контексте с пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NOs: 27, 30 и 52, являются подходящими для введения индивидуумам с HLA-A03 (т.е., HLA-A03-положительным индивидуумам). В более предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, которая содержит пептид с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 27.

Аналогично, в настоящем изобретении, пептиды с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41, идентифицированы как эпитопные пептиды, рестриктированные по HLA-A01, которые могут индуцировать мощный и специфический иммунный ответ. Таким образом, фармацевтические композиции по настоящему изобретению, содержащие, по меньшей мере, один пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41 являются подходящими, в частности для введения индивидууму с HLA-A01 (например, HLA-A^*0101) в качестве антигена HLA. То же самое относится и к фармацевтическим композициям, содержащим полинуклеотид, кодирующий любые из этих пептидов (т.е., полинуклеотиды по настоящему изобретению), АПК или экзосому, которые презентируют эти пептиды (т.е., АПК или экзосомы по настоящему изобретению), или a ЦТЛ, нацеленный на эти пептиды (т.е., ЦТЛ по настоящему изобретению). То есть, фармацевтические композиции, содержащие активный ингредиент в контексте с пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41, являются подходящими для введения индивидуумам с HLA-A01 (т.е., HLA-A01-положительным индивидуумам). В более предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, которая содержит пептид с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 86.

Злокачественные опухоли для лечения и/или профилактики при помощи фармацевтических композиций по настоящему изобретению конкретно не ограничены при условии, что они являются злокачественными опухолями, экспрессирующими KOC1, и включают рак мочевого пузыря, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, хронический миелолейкоз (ХМЛ), рак толстого кишечника, рак прямой кишки, рак пищевода, диффузный рак желудка, немелкоклеточный рак легких, мелкоклеточный рак легких, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак почки, рак головы и шеи, опухоль мягких тканей, рак яичек и т.п. Предпочтительно применять фармацевтическую композицию по настоящему изобретению у индивидуумов, которые имеют аллель HLA, выбранный из HLA-A11, HLA-A33, HLA-A03 и HLA-A01, в гомозиготном или гетерозиготном состоянии.

В дополнение к активным ингредиентам, описанным выше, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать другие пептиды, которые имеют способность индуцировать ЦТЛ против злокачественных клеток (например, другие пептиды, полученные из TAA и индуцирующие ЦТЛ), другие полинуклеотиды, кодирующие другие пептиды, другие клетки, которые презентируют другие пептиды, или т.п.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут также необязательно содержать другие терапевтические вещества в качестве активного ингредиента, при условии, что они не ингибируют противоопухолевые воздействия вышеписанных активных ингредиентов, таких как пептиды по настоящему изобретению. Например, фармацевтические композиции по настоящему изобретению необязательно могут содержать противовоспалительные композиции, анальгетики, химиотерапевтические препараты и т.п. В дополнение к включению других терапевтических веществ в фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, можно также вводить фармацевтическую композицию по настоящему изобретению последовательно или одновременно с одной или несколькими другими фармацевтическими композициями. Доза фармацевтической композиции по настоящему изобретению и других фармацевтических композиций зависит, например, от типа применяемой фармацевтической композиции и заболевания, которое лечат, а также от режима и путей введения.

Следует понимать, что с учетом типа состава, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может включать другие компоненты, общепринятые в данной области, в дополнение к ингредиентам, конкретно упомянутым в настоящем документе.

Настоящее изобретение также относится к промышленным изделиям или наборам, которые содержат фармацевтическую композицию по настоящему изобретению. Промышленные изделия или наборы по настоящему изобретению могут включать контейнер, который содержит фармацевтическую композицию по настоящему изобретению. Пример подходящего контейнера включает бутылку, флакон или пробирку, но не ограничивается ими. Контейнер может быть сделан из различных материалов, таких как стекло или пластик. К контейнеру может быть присоединена этикетка, и на этикетке может быть описано заболевание или состояние болезни, для которого должна быть использована фармацевтическая композиция по настоящему изобретению. Этикетка может также содержать указания для введения и т.п.

Промышленные изделия или наборы по настоящему изобретению могут дополнительно включать второй контейнер, который содержит фармацевтически приемлемые разбавители, необязательно, в дополнение к контейнеру, который содержит фармацевтическую композицию по настоящему изобретению. Промышленные изделия или наборы по настоящему изобретению могут дополнительно содержать другие материалы, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения пользователя, такие как другие буферы, разбавители, фильтры, иглы для инъекций, шприцы, вкладыши в упаковку с инструкциями по применению.

По мере необходимости, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно предоставлять в упаковке или в дозаторном устройстве, которые могут содержать одну или несколько единиц лекарственных форм, содержащих активные ингредиенты. Упаковка может включать, например, металлическую пленку или полимерную пленку, такую как блистерная упаковка. Инструкции для введения могут быть прикреплены к упаковке или к дозаторному устройству.

(1) Фармацевтические композиции, содержащие пептид(-ы) в качестве активного ингредиента

Фармацевтическую композицию, содержащую пептид по настоящему изобретению можно формулировать путем общепринятых способов рецептуры по мере необходимости. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут включать по мере необходимости в дополнение к пептиду по настоящему изобретению, носители, эксципиенты и т.п., широко используемые в фармацевтических препаратах без конкретных ограничений. Примеры носителей, которые можно использовать в фармацевтических композициях по настоящему изобретению включают стерилизованную воду (например, воду для инъекций), физиологический раствор, фосфатный буфер, фосфатно-солевой буфер, физиологический раствор, забуференный Трисом, 0,3% глицин, культуральную жижкость, и т.п. Дополнительно, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать по мере необходимости стабилизаторы, суспензии, консерванты, поверхностно-активные вещества, солюбилизаторы, регуляторы pH, ингибиторы агрегации, и т.п. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут индуцировать специфический иммунитет против KOC1-экспрессирующих злокачественных клеток, и, таким образом, их можно применять с целью лечения злокачественных опухолей или предупреждения (профилактики) злокачественных опухолей.

Например, фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно получать путем растворения в фармацевтически или физиологически приемлемых водорастворимых носителях, таких как стерилизованная вода (например, вода для инъекций), физиологический раствор, фосфатный буфер, фосфатно-солевой буфер, физиологический раствор, забуференный Трисом, и добавления, по мере необходимости, стабилизаторов, суспензий, консервантов, поверхностно-активных веществ, солюбилизаторов, регуляторов pH, ингибиторов агрегации, и т.п., а затем стерилизации раствора пептида. Способ стерилизации раствора пептида конкретно не ограничен, и предпочтительно проводится путем стерилизации фильтрацией. Стерилизацию фильтрацией можно проводить при помощи, например, фильтра для стерилизации фильтрацией 0,22 мкм или менее по диаметру пор. Раствор пептида, стерилизованный фильтрацией, можно вводить индивидууму, например, в виде инъекции, не ограничиваясь ею. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно получать в виде лиофилизированного состава путем лиофильного высушивания вышеописанного раствора пептида. Лиофилизированный состав можно получать путем заполнения раствором пептида, приготовленным, как описано выше, подходящего контейнера, такого как ампула, флакон или пластиковый контейнер, с последующей лиофильной сушкой и инкапсуляцией в контейнер с промытой стерилизованной резиновой пробкой или т.п. после восстановления давления. Лиофилизированный состав можно вводить индивидууму после повторного растворения в фармацевтически или физиологически приемлемых водорастворимых носителях, таких как стерилизованная вода (например, вода для инъекций), физиологический раствор, фосфатный буфер, фосфатно-солевой буфер, физиологический раствор, забуференный Трисом, и т.п., перед введением. Предпочтительные примеры фармацевтических композиций по настоящему изобретению включают инъекции такого стерилизованного фильтрацией раствора пептида, и лиофилизированные составы, которые получают из лиофилизированного раствора пептида. Настоящее изобретение дополнительно включает наборы, содержащие такой лиофилизированный состав и раствор для повторного растворения. Настоящее изобретение также включает наборы, содержащие контейнер, который содержит лиофилизированный состав, который представляет собой фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, и контейнер, который содержит раствор для его повторного растворения.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут включать комбинацию двух или более типов пептидов по настоящему изобретению. Комбинация пептидов может быть в форме коктейля из смешанных пептидов, или они могут быть конъюгированы друг с другом стандартными способами. Например, пептиды могут быть химически связаны или могут экспрессироваться в виде последовательностей одиночного слитого полипептида. За счет введения пептида по настоящему изобретению, пептид с высокой плотностью презентируется на АПК при помощи антигена HLA, а затем ЦТЛ, которые специфически реагируют с комплексом, образованным между презентируемым пептидом и антигеном HLA, индуцируются. Альтернативно, АПК (например, DC) забирают у индивидуума, и затем стимулируют пептидами по настоящему изобретению для получения АПК, которые презентируют любой из пептидов по настоящему изобретению на своей клеточной поверхности. Эти АПК повторно вводят индивидууму для индуцирования ЦТЛ у индивидуума, и в результате, повышается их агрессивность по отношению к KOC1-экспрессирующим злокачественным клеткам.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут также содержать адъювант, известный эффективным формированием клеточного иммунитета. Адъювант относится к соединению, которое усиливает иммунный ответ против антигена и которое имеет иммунологическую активность при введении вместе (или последовательно) с антигеном. Можно использовать известные адъюванты, описанные в литературе, например, Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89. Примеры подходящего адъюванта включают соли алюминия (фосфат алюминия, гидроксид алюминия, алюминий оксигидроксид и т.п.), квасцы, холерный токсин, токсин сальмонеллы, неполный адъювант Фрейнда (IFA), полный адъювант Фрейнда (CFA), ISCOMatrix, GM-CSF и другие иммуностимулирующие цитокины, олигодезоксинуклеотид, содержащий мотив CpG (CpG7909 и т.п.), эмульсии «масло-в-воде», сапонин или его производные (QS21 и т.п.), липополисахарид, такой как липид A или его производные (MPL, RC529, GLA, E6020 и т.п.), липопептиды, лактоферрин, флагеллин, двухцепочечную РНК или ее производные (poly I:C и т.п.), бактериальную ДНК, имидазохинолины (имиквимод, R848 и т.п.), лиганд лектина С-типа (трегалоза-6,6ʹ-дибегенат (TDB) и т.п.), лиганд CD1d (альфа-галактозилцерамид и т.п.), скваленовые эмульсии (MF59, AS03, AF03 и т.п.), PLGA, и т.п., не ограничиваясь указанными. Адъювант может находиться в другом контейнере отдельно от фармацевтической композиции, содержащей пептид по настоящему изобретению, в наборах, содержащих фармацевтическую композицию по настоящему изобретению. В этом случае, адъювант и фармацевтическую композицию можно вводить индивидууму последовательно, или смешивать друг с другом непосредственно перед введением индивидууму. Такие наборы, содержащие фармацевтическую композицию, включающую пептид по настоящему изобретению и адъювант, также предусмотрены настоящим изобретением. Когда фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой лиофилизированный состав, набор может дополнительно содержать раствор для повторного растворения. Дополнительно, настоящее изобретение относится к наборам, содержащим контейнер, который содержит фармацевтическую композицию по настоящему изобретению и контейнер, который содержит адъювант. Набор может дополнительно содержать по мере необходимости контейнер, который содержит раствор для повторного растворения.

Когда в качестве адъюванта используют масляный адъювант, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно получать в виде эмульсии. Эмульсии можно получать, например, путем смешивания и перемешивания раствора пептида, приготовленного, как описано выше, и масляного адъюванта. Раствор пептида может быть раствором, который был восстановлен после лиофилизации. Эмульсия может быть или типа «вода в масле», или типа «масло в воде», и эмульсия типа «вода в масле» является предпочтительной для получения высокоэффективного усиленного иммунного ответа. В качестве масляного адъюванта может быть предпочтительно использован IFA, без ограничений упомянутым. Получение эмульсии можно проводить непосредственно перед введением индивидууму, и в этом случае, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть предоставлена в виде набора, содержащего раствор пептида по настоящему изобретению и масляный адъювант. Когда фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой лиофилизированный состав, набор может дополнительно содержать раствор для повторного растворения.

Дополнительно, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть составом с липосомами, в которые инкапсулирован пептид по настоящему изобретению, гранулярным составом, в котором пептид связан с гранулами несколько микрометров в диаметре, или составом, в котором липид связан с пептидом.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения пептид по настоящему изобретению также можно вводить в форме фармацевтически приемлемой соли. Предпочтительные примеры солей включают соли со щелочными металлами (литием, калием, натрием и т.п.), соли со щелочноземельными металлами (кальцием, магнием и т.п.), соли с другими металлами (медью, железом, цинком, марганцем и т.п.), соли с органическими основаниями, соли с аминами, соли с органическими кислотами (уксусной кислотой, муравьиной кислотой, пропионовой кислотой, фумаровой кислотой, малеиновой кислотой, янтарной кислотой, винной кислотой, лимонной кислотой, яблочной кислотой, щавелевой кислотой, бензойной кислотой, метансульфоновой кислотой и т.п.), и соли с неорганическими кислотами (соляной кислотой, фосфорной кислотой, бромистоводородной кислотой, серной кислотой, азотной кислотой и т.п.). Фраза «фармацевтически приемлемая соль», применяемая в настоящем документе, относится к соли, которая сохраняет биологическую, физиологическую, фармакологическую и фармацевтическую эффективность и свойства соединений. Таким образом, фармацевтические композиции, содержащие фармацевтически приемлемую соль пептида по настоящему изобретению, также охватываются настоящим изобретением. Дополнительно, «пептид по настоящему изобретению» также включает, в дополнение к свободному пептиду, его фармацевтически приемлемые соли.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут дополнительно включать компонент, который примирует ЦТЛ. Липиды были идентифицированы как вещества, способные примировать ЦТЛ in vivo против вирусных антигенов. Например, остатки пальмитиновой кислоты можно присоединять к эпсилон- и альфа-аминогруппам остатка лизина, а затем связывать с пептидом по настоящему изобретению. Липидированный пептид затем можно вводить или напрямую в мицеллу или частицу, включенную в липосому, или эмульгировать в адъюванте. В качестве другого примера липида, примирующего ответы ЦТЛ, можно использовать липопротеины E. coli, такие как трипальмитоил-S-глицерилцистенил-серил-серин (P3CSS), для примирования ЦТЛ при ковалентном присоединении к соответствующему пептиду (см., например, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4).

Примеры подходящих способов для введения пептидов или фармацевтических композиций по настоящему изобретению включают пероральные, эпидермальные, подкожные, внутримышечные, внутрикостные, внтурибрюшинные, и внутривенные инъекции, а также системное введение или местное введение в непосредственной близости от участков-мишеней, но не ограничиваются перечисленными. Предпочтительный способ введения включает подкожную инъекцию в непосредственной близости от лимфоузлов, таких как подмышечный или паховый. Введение можно проводить путем одиночного введения или разделенным на несколько введений. Пептиды по настоящему изобретению можно вводить индивидууму в терапевтически или фармацевтически эффективном количестве для лечения злокачественной опухоли или в терапевтически или фармацевтически эффективном количестве для индуцирования иммунитета (более конкретно, ЦТЛ) против KOC1-экспрессирующих злокачественных клеток. Доза пептидов по настоящему изобретению может быть соответствующим образом скорректирована в соответствии с заболеванием, подлежащим лечению, возрастом и массой пациента, способом введения и т.п. Для каждого из пептидов по настоящему изобретению, доза составляет, как правило, 0,001 мг - 1000 мг, например, 0,01 мг - 100 мг, например, 0,1 мг - 30 мг, например, 0,1 мг - 10 мг, например, 0,5 мг - 5 мг. Интервал между дозами может составлять от одного раза каждые несколько суток до нескольких месяцев, и например, дозировку можно производить с интервалом раз в неделю. Специалист в данной области может соответствующим образом выбрать подходящую дозу (дозирование).

В предпочтительном варианте осуществления фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат терапевтически эффективное количество пептида по настоящему изобретению и фармацевтически или физиологически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат терапевтически эффективное количество пептида по настоящему изобретению, фармацевтически или физиологически приемлемый носитель и адъювант. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать 0,001 мг - 1000 мг, предпочтительно 0,01 мг - 100 мг, более предпочтительно 0,1 мг - 30 мг, даже более предпочтительно 0,1 мг - 10 мг, например, 0,5 мг - 5 мг пептида по настоящему изобретению. Когда фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой инъекцию, она может содержать пептид по настоящему изобретению в концентрации 0,001 мг/мл - 1000 мг/мл, предпочтительно 0,01 мг/мл - 100 мг/мл, более предпочтительно 0,1 мг/мл - 30 мг/мл, даже более предпочтительно 0,1 мг/мл - 10 мг/мл, например, 0,5 мг/мл - 5 мг/мл. В этом случае, например, можно вводить индивидууму путем инъекции от 0,1 до 5 мл, предпочтительно, от 0,5 мл до 2 мл фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

Дополнительно, настоящее изобретение относится к способам лечения и/или профилактики злокачественной опухоли и/или профилактики ее послеоперационного рецидива, которые включают введение индивидууму терапевтически эффективного количества пептида по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Как описано выше, пептиды по настоящему изобретению можно вводить индивидууму в однократной дозе, как правило, 0,001 мг - 1000 мг, например, 0,01 мг - 100 мг, например, 0,1 мг - 30 мг, например, 0,1 мг - 10 мг, или например, 0,5 мг - 5 мг. В предпочтительном варианте осуществления пептиды по настоящему изобретению вводят индивидууму вместе с адъювантом. Дополнительно, интервал между дозами может составлять от одного раза каждые несколько суток до нескольких месяцев, предпочтительно от одного раза каждые несколько суток до раза в месяц, например, от одного раза в неделю или однога раза в две недели.

(2) Фармацевтические композиции, содержащие полинуклеотиды в качестве активного ингредиента

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут также содержать полинуклеотиды, кодирующие пептиды по настоящему изобретению, в экспрессируемой форме. В настоящем документе, фраза «в экспрессируемой форме» означает, что полинуклеотид, при введении в клетку, будет экспрессироваться как пептид по настоящему изобретению. В примере варианта осуществления, последовательность полинуклеотида по настоящему изобретению относится к регуляторным элементам, необходимым для экспрессии пептида по настоящему изобретению. Полинуклеотид(-ы) по настоящему изобретению могут быть дополнены последовательностью, необходимой для достижения стабильной вставки в геном клеток-мишеней (см., например, Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 для описания кассетных векторов для гомологичной рекомбинации). См., например, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; патенты США №№ 5580859, 5589466, 5804566, 5739118, 5736524, 5679647; и WO98/04720. Примеры технологий доставки на основе ДНК включают «голую ДНК», облегченную доставку (бупивакаин, полимеры, опосредованную пептидами), комплексы катионных липидов, и доставку, опосредованную частицами («генная пушка») или давлением (см., например, патент США № 5922687).

Пептиды по настоящему изобретению можно также экспрессировать при помощи вирусных или бактериальных векторов. Примеры экспрессирующих векторов включают аттенуированные вирусы-хозяева, такие как вирус осповакцины или вирус оспы кур. Например, можно использовать вирус осповакцины в качестве вектора для экспрессии пептида по настоящему изобретению. После введения в хозяина, рекомбинантный вирус осповакцины экспрессирует иммуногенный пептид, и, таким образом, вызывает иммунный ответ. Векторы на основе вируса осповакцины и способы, подходящие для протоколов иммунизации, описаны, например, в патенте США № 4722848. Другим вектором является БЦЖ (бацилла Кальмета-Герена). Векторы на основе БЦЖ описаны у Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60. Будет очевиден широкий спектр других векторов, подходящих для терапевтического введения или иммунизации, например, аденовирусные и аденоассоциированные вирусные векторы, ретровирусные векторы, векторы на основе Salmonella typhi, векторы на основе обезвреженного токсина сибирской язвы и т.п. См., например, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71；Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806；Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85.

Доставка полинуклеотида по настоящему изобретению пациенту может быть или прямой, при этом пациент может напрямую получать вектор, несущий полинуклеотид по настоящему изобретению, или опосредованной, при этом, сначала клетки трансформируются вектором, несущим полинуклеотид по настоящему изобретению in vitro, затем клетки пересаживают пациенту. Эти два подхода известны, соответственно, как генная терапия in vivo и ex vivo.

Для общих обзоров способов генотерапии, см. Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu и Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215. Способы, общеизвестные в области технологии рекомбинантных ДНК, которые также можно использовать для настоящего изобретения, описаны в Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; и Krieger, Gene Transfer и Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990.

Аналогично введению пептидов, введение полинуклеотидов можно проводить путем пероральной, интрадермальной, подкожной, внутривенной, внутримышечной, внутрикостной и/или внутрибрюшинной инъекции, и т.п. Введение полинуклеотидов может быть системным введением или местным введением в непосредственной близости от участков-мишеней. Введение можно проводить путем одиночного введения или разделенным на несколько введений. Полинуклеотиды по настоящему изобретению можно вводить индивидууму в терапевтически или фармацевтически эффективном количестве для лечения злокачественной опухоли или в терапевтически или фармацевтически эффективном количестве для индуцирования иммунитета (более конкретно, ЦТЛ) против KOC1-экспрессирующих злокачественных клеток. Доза полинуклеотида в подходящем носителе или доза полинуклеотида в клетках, трансформированных полинуклеотидом, кодирующим пептид по настоящему изобретению, может быть соответствующим образом скорректирована в соответствии с заболеванием, подлежащим лечению, возрастом и массой пациента, способом введения и т.п., и она может составлять, как правило, 0,001 мг - 1000 мг, например, 0,01 мг - 100 мг, например, 0,1 мг - 30 мг, например, 0,1 мг - 10 мг, или например, 0,5 мг - 5 мг. Интервал между дозами может составлять от одного раза каждые несколько суток до нескольких месяцев, и например, дозировку можно производить с интервалом раз в неделю. Специалист в данной области может соответствующим образом выбрать подходящую дозу (дозирование).

X. Способы применения пептидов, экзосом, АПК и ЦТЛ

Пептиды и полинуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать для индуцирования АПК и ЦТЛ. ЦТЛ можно также индуцировать при помощи экзосом и АПК по настоящему изобретению. Пептиды, полинуклеотиды, экзосомы и АПК можно использовать в комбинации с любым другим соединением/соединениями при условии, что не будет ингибирована их способность индуцировать ЦТЛ. Таким образом, ЦТЛ по настоящему изобретению можно индуцировать при помощи фармацевтической композиции, содержащей любой из пептидов, полинуклеотиды, АПК и экзосомы по настоящему изобретению. Дополнительно, АПК по настоящему изобретению можно индуцировать при помощи фармацевтической композиции, содержащей пептид или полинуклеотид по настоящему изобретению.

(1) Способы индуцирования АПК

Настоящее изобретение относится к способам индуцирования АПК со способностью индуцировать ЦТЛ, при помощи пептида/пептидов или полинуклеотида/полинуклеотидов по настоящему изобретению.

Способы по настоящему изобретению включают этап контакта АПК с пептидом по настоящему изобретению in vitro, ex vivo, или in vivo. Например, способ контакта АПК с пептидом ex vivo может включать нижеизложенные этапы:

(a) забор АПК у индивидуума; и

(b) контакт АПК из этапа (a) с пептидом по настоящему изобретению.

Вышеописанные АПК не ограничиваются конкретным типом клеток, и включают клетки, о которых известно, что они презентируют белковые антигены на своей клеточной поверхности, таким образом, что они распознаются лимфоцитами, например, можно использовать DC, клетки Лангерганса, макрофаги, B-клетки, и активированные T-клетки. Среди АПК, DC имеют наиболее мощную способность индуцировать ЦТЛ, и, таким образом, предпочтительно использовать DC. Любые пептиды по настоящему изобретению можно использовать сами по себе или в комбинации с другими пептидами по настоящему изобретению. Дополнительно, пептиды по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с другими пептидами, индуцирующими ЦТЛ (например, другими пептидами, полученными из TAA и индуцирующими ЦТЛ).

Помимо этого, когда пептид по настоящему изобретению вводят индивидууму, АПК контактируют с пептидом in vivo, и в результате АПК, имеющие высокую способность индуцировать ЦТЛ, индуцируются в организме индивидуума. Таким образом, способы по настоящему изобретению могут включать этап введения пептида по настоящему изобретению индивидууму. Аналогично, когда полинуклеотид по настоящему изобретению вводят индивидууму в экспрессируемой форме, пептид по настоящему изобретению экспрессируется in vivo, экспрессировавшийся пептид контактирует с АПК in vivo, и в результате АПК, имеющие высокую способность индуцировать ЦТЛ, индуцируются в организме индивидуума. Таким образом, настоящее изобретение может также включать этап введения полинуклеотида по настоящему изобретению индивидууму.

Для того чтобы индуцировать АПК со способностью индуцировать ЦТЛ, настоящее изобретение может включать этап введения полинуклеотида по настоящему изобретению в АПК. Например, способ может включать нижеизложенные этапы:

(a) забор АПК у индивидуума; и

(b) введение полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в АПК из этапа (a).

Этап (b) можно проводить, как описано выше в разделе «VI. Антигенпрезентирующие клетки (АПК)».

Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу индуцирования АПК со способностью индуцировать ЦТЛ, включающему нижеизложенные этапы (a) или (b):

(a) контакт АПК с пептидом по настоящему изобретению; или

(b) введение полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в АПК.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения АПК со способностью индуцировать ЦТЛ, включающему нижеизложенные этапы (a) или (b):

(a) контакт АПК с пептидом по настоящему изобретению; или

(b) введение полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в АПК.

Вышеописанные способы можно проводить in vitro, ex vivo, или in vivo, и предпочтительно проводить их in vitro или ex vivo. АПК, применяемые в вышеописанных способах, можно получать от индивидуума, которому планируется вводить индуцированные АПК, или их можно получать от другого индивидуума. Когда используют АПК, полученные от индивидуума (донора), отличного от индивидуума, для которого запланировано введение, индивидуум для введения и донор должны иметь идентичный тип HLA. В способах по настоящему изобретению, когда пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32, или его модифицированный пептид используют в качестве пептида по настоящему изобретению, тип HLA предпочтительно представляет собой HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A^*1101), как у индивидуума для введения, так и у донора. Альтернативно, АПК, применяемые в вышеописанных способах, предпочтительно представляют собой АПК, которые экспрессируют HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A^*1101). Аналогично, когда пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85, или его модифицированный пептид используют в качестве пептида по настоящему изобретению, тип HLA предпочтительно представляет собой HLA-A33 (более предпочтительно HLA-A^*3303), как у индивидуума для введения, так и у донора. Альтернативно, АПК, применяемые в вышеописанных способах, предпочтительно представляют собой АПК, которые экспрессируют HLA-A33 (более предпочтительно HLA-A^*3303). Аналогично, когда пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 27, 30 и 52, или его модифицированный пептид используют в качестве пептида по настоящему изобретению, тип HLA предпочтительно представляет собой HLA-A03 (более предпочтительно HLA-A^*0301), как у индивидуума для введения, так и у донора. Альтернативно, АПК, применяемые в вышеописанных способах, предпочтительно представляют собой АПК, которые экспрессируют HLA-A03 (более предпочтительно HLA-A^*0301). Аналогично, когда пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41 или его модифицированный пептид используют в качестве пептида по настоящему изобретению, тип HLA предпочтительно представляет собой HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A^*0101), как у индивидуума для введения, так и у донора. Альтернативно, АПК, применяемые в вышеописанных способах, предпочтительно представляют собой АПК, которые экспрессируют HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A^*0101). АПК можно получать с применением известных способов из PBMC, после того как PBMC выделены из крови, полученной от донора, путем способа центрифугирования с удельной плотностью или т.п.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат пептид по настоящему изобретению или полинуклеотид, кодирующий пептид, для индуцирования АПК со способностью индуцировать ЦТЛ.

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к применению пептида по настоящему изобретению или полинуклеотида, кодирующего пептид, в производстве фармацевтической композиции для индуцирования АПК со способностью индуцировать ЦТЛ.

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к пептидам по настоящему изобретению или полинуклеотидам, кодирующим пептиды, для применения для индуцирования АПК со способностью индуцировать ЦТЛ.

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к способам или процессам производства фармацевтической композиции для индуцирования АПК, где способ или процесс включают этап формулирования пептида по настоящему изобретению или полинуклеотида, кодирующего пептид, с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение дополнительно относится к способам или процессам производства фармацевтической композиции для индуцирования АПК со способностью индуцировать ЦТЛ, где способ или процесс включают этап смешивания пептида по настоящему изобретению или полинуклеотида, кодирующего пептид, с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем.

АПК, индуцированные способами по настоящему изобретению, могут индуцировать ЦТЛ, специфичные к KOC1 (т.е., ЦТЛ по настоящему изобретению).

(2) Способы индуцирования ЦТЛ

Настоящее изобретение также относится к способам индуцирования ЦТЛ с использованием пептидов, полинуклеотидов, экзосом или АПК по настоящему изобретению. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам индуцирования ЦТЛ с использованием одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих полипептид(-ы), которые могут формировать T-клеточный рецептор (TCR) (т.е., субъединицу TCR), способный распознавать комплекс пептида по настоящему изобретению и антигена HLA. Предпочтительно, способы индуцирования ЦТЛ включают, по меньшей мере, один этап, выбранный из нижеизложенных:

(a) контакт CD8-положительных T-клеток с антигенпрезентирующими клетками, которые презентируют на своей поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению;

(b) контакт CD8-положительных T-клеток с экзосомами, которые презентируют на своей поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению; и

(c) введение в CD8-положительные T-клетки одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих полипептид(-ы), которые могут формировать TCR, способный распознавать комплекс пептида по настоящему изобретению и антигена HLA.

Когда пептид(-ы), полинуклеотид(-ы), экзосому/экзосомы или АПК по настоящему изобретению вводят индивидууму, ЦТЛ индуцируются в организме индивидуума, и сила иммунного ответа, нацеленного на KOC1-экспрессирующие злокачественные клетки, возрастает. Таким образом, способы по настоящему изобретению могут включать этап введения индивидууму пептида/пептидов, полинуклеотида/полинуклеотидов, АПК или экзосомы/экзосом по настоящему изобретению.

Альтернативно, ЦТЛ можно индуцировать при использовании их in vitro или ex vivo. Например, способы по настоящему изобретению могут включать следующие этапы:

(a) забор АПК у индивидуума;

(b) контакт АПК из этапа (а) с пептидом по настоящему изобретению; и

(c) совместное культивирование АПК из этапа (b) с CD8-положительными T-клетками.

Индуцированные ЦТЛ впоследствии можно возвращать индивидууму.

АПК для совместного культивирования с CD8-положительными T-клетками из этапа (c) выше также можно получать путем введения в АПК полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, как описано выше в разделе «VI. Антигенпрезентирующие клетки (АПК)». Однако АПК для применения в способах по настоящему изобретению не ограничиваются вышеуказанными, и можно использовать любые АПК, которые презентируют на своей поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению.

В способах по настоящему изобретению, вместо таких АПК, также можно использовать экзосомы, которые презентируют на своей поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению. То есть, способы по настоящему изобретению могут включать этап совместного культивирования с экзосомами, которые презентируют на своей поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению. Такие экзосомы можно получать способами, описанными выше в разделе «V. Экзосомы».

Дополнительно, ЦТЛ также можно индуцировать путем введения в CD8-положительную T-клетку вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий каждую субъединицу TCR, способного связываться с пептидом по настоящему изобретению, презентированным при помощи антигена HLA на клеточной поверхности. Такую трансформацию можно проводить, как описано выше в разделе «VIII. T-клеточные рецепторы (TCR)».

Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам индуцирования ЦТЛ, включающим этап, выбранный из нижеизложенных:

(a) совместное культивирование CD8-положительных T-клеток с АПК, которые презентируют на своей поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению;

(b) совместное культивирование CD8-положительных T-клеток с экзосомами, которые презентируют на своей поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению; и

(c) введение в CD8-положительные T-клетки вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий каждую субъединицу TCR, способного связываться с пептидом по настоящему изобретению, презентированным при помощи антигена HLA на клеточной поверхности.

Вышеописанные способы можно проводить in vitro, ex vivo, или in vivo, и предпочтительно проводить их in vitro или ex vivo. АПК, или экзосомы, и CD8-положительные T-клетки, применяемые в вышеописанных способах, можно получать от индивидуума, которому планируется вводить индуцированные АПК, или их можно получать от другого индивидуума. Когда используют АПК, или экзосомы, и CD8-положительные T-клетки, полученные от индивидуума (донора), отличного от индивидуума, для которого запланировано введение, индивидуум для введения и донор должны иметь идентичный тип HLA. Например, когда пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32, или его модифицированный пептид используют в качестве пептидов по настоящему изобретению, тип HLA предпочтительно представляет собой HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A^*1101), как у индивидуума для введения, так и у донора. Альтернативно, АПК или экзосомы, применяемые в вышеописанных способах, предпочтительно представляют собой АПК или экзосомы, которые презентируют на своей поверхности комплекс из HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A^*1101) и пептида по настоящему изобретению (пептида с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32, или его модифицированного пептида). В этом случае, индуцированные ЦТЛ демонстрируют специфическую цитотоксическую активность против клеток, которые презентируют комплекс из HLA-A11 и пептида по настоящему изобретению (например, KOC1-экспрессирующие HLA-A11-положительные клетки). Альтернативно, например, когда пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85, или его модифицированный пептид используют в качестве пептидов по настоящему изобретению, тип HLA предпочтительно представляет собой HLA-A33 (более предпочтительно HLA-A^*3303), как у индивидуума для введения, так и у донора. Альтернативно, АПК или экзосомы, применяемые в вышеописанных способах, предпочтительно представляют собой АПК или экзосомы, которые презентируют на своей поверхности комплекс из HLA-A33 (более предпочтительно HLA-A^*3303) и пептида по настоящему изобретению (пептида с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85, или его модифицированного пептида). В этом случае, индуцированные ЦТЛ демонстрируют специфическую цитотоксическую активность против клеток, которые презентируют комплекс из HLA-A33 и пептида по настоящему изобретению (например, KOC1-экспрессирующие HLA-A33-положительные клетки). Альтернативно, например, когда пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 27, 30 и 52, или его модифицированный пептид используют в качестве пептидов по настоящему изобретению, тип HLA предпочтительно представляет собой HLA-A03 (более предпочтительно HLA-A^*0301), как у индивидуума для введения, так и у донора. Альтернативно, АПК или экзосомы, применяемые в вышеописанных способах, предпочтительно представляют собой АПК или экзосомы, которые презентируют на своей поверхности комплекс из HLA-A03 (более предпочтительно HLA-A^*0301) и пептида по настоящему изобретению (пептида с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 27, 30 и 52, или его модифицированного пептида). В этом случае, индуцированные ЦТЛ демонстрируют специфическую цитотоксическую активность против клеток, которые презентируют комплекс из HLA-A03 и пептида по настоящему изобретению (например, KOC1-экспрессирующие HLA-A03-положительные клетки). Альтернативно, например, когда пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41, или его модифицированный пептид используют в качестве пептидов по настоящему изобретению, тип HLA предпочтительно представляет собой HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A^*0101), как у индивидуума для введения, так и у донора. Альтернативно, АПК или экзосомы, применяемые в вышеописанных способах, предпочтительно представляют собой АПК или экзосомы, которые презентируют на своей поверхности комплекс из HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A^*0101) и пептида по настоящему изобретению (пептида с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41, или его модифицированного пептида). В этом случае, индуцированные ЦТЛ демонстрируют специфическую цитотоксическую активность против клеток, которые презентируют комплекс из HLA-A01 и пептида по настоящему изобретению (например, KOC1-экспрессирующие HLA-A01-положительные клетки).

В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к композициям или фармацевтическим композициям для индуцирования ЦТЛ, содержащим по меньшей мере один активный ингредиент, выбранный из нижеизложенных:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к применению активного ингредиента, выбранного из нижеизложенных, в производстве композиций или фармацевтических композиций для индуцирования ЦТЛ:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности.

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к активному ингредиенту, выбранному из нижеизложенных, для применения в индуцировании ЦТЛ:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности.

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к способу или процессу для производства композиции или фармацевтической композиции для индуцирования ЦТЛ, где способ или процесс включает этап формулирования активного ингредиента, выбранного из нижеизложенных, с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение дополнительно относится к способу или процессу для производства композиции или фармацевтической композиции для индуцирования ЦТЛ, где способ или процесс включает этап смешивания активного ингредиента, выбранного из нижеизложенных, с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности.

XI. Способы индуцирования иммунного ответа

Настоящее изобретение дополнительно относится к способам индуцирования иммунного ответа против KOC1-экспрессирующих злокачественных опухолей. Подходящие злокачественные опухоли включают рак мочевого пузыря, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, хронический миелолейкоз (ХМЛ), рак толстого кишечника, рак прямой кишки, рак пищевода, диффузный рак желудка, немелкоклеточный рак легких, мелкоклеточный рак легких, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак почки, рак головы и шеи, опухоль мягких тканей, рак яичек и т.п., не ограничиваясь вышеизложенными. Предпочтительно, чтобы злокачественная опухоль экспрессировала, по меньшей мере, один HLA, выбранный из HLA-A11, HLA-A33, HLA-A03 и HLA-A01.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способам индуцирования иммунного ответа против KOC1-экспрессирующих злокачественных клеток. Признано, что KOC1 сверхэкспрессирован в различных типах злокачественных опухолей, описанных выше. Таким образом, когда индуцируется иммунный ответ против KOC1-экспрессирующих злокачественных клеток, в результате ингибируется пролиферация злокачественных клеток. Таким образом, настоящее изобретение дополнительно относится к способам ингибирования пролиферации KOC1-экспрессирующих злокачественных клеток. Способы по настоящему изобретению подходят, в частности, для ингибирования пролиферации злокачественных клеток, экспрессирующих KOC1 и, по меньшей мере, один HLA, выбранный из HLA-A11, HLA-A33, HLA-A03 и HLA-A01.

Способы по настоящему изобретению могут включать этап введения композиции, содержащей любой из пептидов по настоящему изобретению или полинуклеотида/полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы). Способы по настоящему изобретению также включают введение АПК или экзосом, презентирующих любой из пептидов по настоящему изобретению. За деталями можно обращаться в раздел «IX. Фармацевтические композиции», в частности, к частям, описывающим применение фармацевтических композиций по настоящему изобретению в качестве вакцин. Кроме того, экзосомы и АПК, которые можно использовать в способах по настоящему изобретению для индуцирования иммунного ответа, описаны подробно в «V. Экзосомы», «VI. Антигенпрезентирующие клетки (АПК)» и в пунктах (1) и (2) из «X. Способы применения пептидов, экзосом, АПК и ЦТЛ», описанных выше.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям или вакцинам для индуцирования иммунного ответа против KOC1-экспрессирующих злокачественных опухолей, где фармацевтическая композиция или вакцина содержит активный ингредиент, выбранный из нижеизложенных:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

Альтернативно, настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям или вакцинам для индуцирования иммунного ответа против KOC1-экспрессирующих злокачественных клеток, где фармацевтическая композиция или вакцина содержит активный ингредиент, выбранный из нижеизложенных:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к фармацевтическим композициям или вакцинам для ингибирования пролиферации KOC1-экспрессирующих злокачественных клеток, где фармацевтическая композиция или вакцина содержит активный ингредиент, выбранный из нижеизложенных:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению активного ингредиента, выбранного из нижеизложенных, в производстве фармацевтических композиций или вакцин для индуцирования иммунного ответа против KOC1-экспрессирующих злокачественных опухолей:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

Альтернативно, настоящее изобретение относится к применению активного ингредиента, выбранного из нижеизложенных, в производстве фармацевтических композиций или вакцин для индуцирования иммунного ответа против KOC1-экспрессирующих злокачественных клеток:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

Альтернативно, настоящее изобретение относится к применению активного ингредиента, выбранного из нижеизложенных, в производстве фармацевтических композиций или вакцин для ингибирования пролиферации KOC1-экспрессирующих злокачественных клеток:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способам или процессам для производства фармацевтических композиций, которые индуцируют иммунный ответ против KOC1-экспрессирующих злокачественных опухолей, при этом способ может включать этап смешивания или формулирования пептида или полинуклеотида по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем.

Альтернативно, настоящее изобретение относится к способам для ингибирования пролиферации KOC1-экспрессирующих злокачественных клеток или к способам индуцирования иммунного ответа против KOC1-экспрессирующих злокачественных опухолей, которые включают этап введения индивидууму вакцин или фармацевтических композиций, содержащих активный ингредиент, выбранный из нижеизложенных:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

В контексте настоящего изобретения, KOC1-экспрессирующие злокачественные опухоли можно лечить путем введения пептида, полинуклеотида, АПК, экзосомы и/или ЦТЛ по настоящему изобретению. Альтернативно, иммунный ответ против KOC1-экспрессирующих злокачественных опухолей можно индуцировать путем введения пептида, полинуклеотида, АПК, экзосомы и/или ЦТЛ по настоящему изобретению. Примеры таких злокачественных опухолей включают рак мочевого пузыря, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, хронический миелолейкоз (ХМЛ), рак толстого кишечника, рак прямой кишки, рак пищевода, диффузный рак желудка, немелкоклеточный рак легких, мелкоклеточный рак легких, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак почки, рак головы и шеи, опухоль мягких тканей, рак яичек и т.п., не ограничиваясь перечисленными. Дополнительно, иммунный ответ против KOC1-экспрессирующих злокачественных клеток можно индуцировать путем введения пептида, полинуклеотида, АПК, экзосомы и/или ЦТЛ по настоящему изобретению. Таким образом, перед введением вакцины или фармацевтической композиции, содержащей вышеописанный активный ингредиент, предпочтительно подтвердить, увеличен ли уровень экспрессии KOC1 в больном участке у индивидуума, подлежащего лечению, или нет.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к лечению KOC1-экспрессирующей злокачественной опухоли у пациента, нуждающегося в лечении злокачественных опухолей, где способ включает нижеизложенные этапы:

(i) измерение уровня экспрессии KOC1 в биологическом образце, полученном из больного участка индивидуума со злокачественной опухолью;

(ii) выявление индивидуума с KOC1-экспрессирующей злокачественной опухолью на основании уровня экспрессии KOC1, измеренного в (i); и

(iii) введение индивидууму с KOC1-экспрессирующей злокачественной опухолью, по меньшей мере, одного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из вышеописанных от (a) до (e).

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к вакцинам и фармацевтическим композициям, содержащим, по меньшей мере, один активный ингредиент, выбранный из группы, состоящей из вышеописанных от (a) до (e), для введения индивидууму с KOC1-экспрессирующей злокачественной опухолью. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу выявления или отбора индивидуума, подлежащего лечению, по меньшей мере, одним активным ингредиентом, выбранным из группы, состоящей из вышеописанных от (a) до (e), где способ включает нижеизложенные этапы:

(i) измерение уровня экспрессии KOC1 в биологическом образце, полученном из больного участка индивидуума со злокачественной опухолью;

(ii) выявление индивидуума с KOC1-экспрессирующей злокачественной опухолью на основании уровня экспрессии KOC1, измеренного в (i); и

(iii) идентификация или отбор индивидуума, выявленного в (ii) как индивидуума, которого можно лечить, по меньшей мере, одним активным ингредиентом, выбранным из группы, состоящей из вышеописанных от (a) до (e).

Биологическ образцы, собранные у индивидуума для измерения уровня экспрессии KOC1 в вышеописанных способах конкретно не ограничены, и например, можно предпочтительно использовать образцы ткани, полученные путем биопсии и т.п и содержащие злокачественные клетки. Уровень экспрессии KOC1 в биологическом образце можно измерять известными способами, и например, можно использовать способы, которые детектируют продукты транскрипции гена KOC1 при помощи зондов, или способы ПЦР (например, способ микропанелей с кДНК, способ Нозерн-блоттинга, способ ОТ-ПЦР или т.п.), способы, которые детектируют продукты трансляции гена KOC1 при помощи антител или т.п. (например, способ Вестерн-блоттинга, способ иммуноокрашивания или т.п.), и т.п. Дополнительно, биологические образцы могут быть образцами крови, и в этом случае, измеряют уровень антител против KOC1 в крови, и можно оценивать уровень экспрессии KOC1 в месте заболевания на основании уровня в крови. Уровень антитела против KOC1 или его фрагмента в крови можно измерять с применением известных способов, и, например, можно использовать иммуноферментный анализ (EIA), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунологический анализ (РИА) и т.п., с использованием белка KOC1 или пептида по настоящему изобретению в качестве антигена.

Как правило, в тканях и клетках, которые не экспрессируют KOC1, практически не выявляются продукты транскрипции и трансляции KOC1. Таким образом, когда продукт транскрипции или трансляции KOC1 детектируется в полученных от индивидуума злокачественных клетках или образце ткани, содержащем злокачественные клетки, можно определить, что злокачественная опухоль индивидуума экспрессирует KOC1. В образцах крови индивидуума, у которого нет KOC1-экспрессирующей злокачественной опухоли, практически не выявляются антитела против KOC1 или их фрагменты. Таким образом, когда антитела против KOC1 или их фрагменты детектируются в образце крови, полученном от индивидуума, можно определить, что злокачественная опухоль индивидуума экспрессирует KOC1. Экспрессирует ли злокачественная опухоль индивидуума KOC1 или нет, также можно определить при сравнении результатов измерений в биологическом материале того же типа, полученном из неопухолевого участка индивидуума или в биологическом материале того же типа, полученном от индивидуума без злокачественной опухоли (образец здорового контроля). То есть, при сравнении с уровнем мишени измерения в образце здорового контроля (уровень у здорового контроля), если уровень в биологическом образце исследуемого индивидуума повышен, злокачественную опухоль индивидуума оценивают как экспрессирующую KOC1. Например, когда количество выявленной мишени измерения повышено, по меньшей мере, на 10% или более по сравнению уровнем у здорового контроля, злокачественную опухоль индивидуума можно оценивать как экспрессирующую KOC1. Желательно, чтобы количество выявленной мишени измерения было повышено предпочтительно на 25% или более, и более предпочтительно, на 50% или более, чем уровень у здорового контроля. Дополнительно, количество выявленного продукта транскрипции или трансляции KOC1 можно оценивать при нормализации его против выявленного количества известного гена «домашнего хозяйства», такого как бета-актин, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, или рибосомальный белок P1.

В предпочтительном варианте осуществления, предпочтительно подтверждать тип HLA у индивидуума перед введением, по меньшей мере, одного активного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из вышеизложенных от (a) to (e). Например, для индивидуумов, которым вводят активный ингредиент, связанный с пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32, предпочтительно выбирать HLA-A11-положительных индивидуумов. Для индивидуумов, которым вводят активный ингредиент, связанный с пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85, предпочтительно выбирать HLA-A33-положительных индивидуумов. Для индивидуумов, которым вводят активный ингредиент, связанный с пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 27, 30 и 52, предпочтительно выбирать HLA-A03-положительных индивидуумов. Для индивидуумов, которым вводят активный ингредиент, связанный с пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41, предпочтительно выбирать HLA-A01-положительных индивидуумов.

Настоящее изобретение дополнительно относится к комплексам пептида по настоящему изобретению и HLA. Вышеописанные комплексы по настоящему изобретению могут быть мономерами или мультимерами. Когда комплекс по настоящему изобретению является мультимером, число полимеров конкретно не ограничено, и он может быть мультимером с любым числом полимеров. Примеры включают тетрамер, пентамер, гексамер и т.п., но не ограничиваются перечисленными. Мультимеры по настоящему изобретению также включают декстрамеры (WO2002/072631) и стрептамеры (Knabel M et al., Nat Med. 2002 Jun; 8(6): 631-7.). Комплексы пептида по настоящему изобретению и HLA можно получать в соответствии с известными способами (например, Altman JD et al., Science.1996, 274(5284): 94-6; WO2002/072631; WO2009/003492; Knabel M et al., Nat Med. 2002 Jun; 8(6): 631-7, и т.д.). Комплексы по настоящему изобретению, например, можно использовать в количественной оценке ЦТЛ, специфичных к пептиду по настоящему изобретению. Например, образец крови получают у индивидуума, которому вводили фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, и после отделения PBMC получают CD4-негативные клетки и приводят их в контакт с комплексом по настоящему изобретению, который конъюгирован с флуоресцентным красителем. Затем, можно измерять процентное содержание ЦТЛ, специфичных к пептиду по настоящему изобретению, путем анализа проточной цитометрией. Например, воздействия фармацевтической композиции по настоящему изобретению на индуцирование иммунного ответа можно контролировать, измеряя специфические ЦТЛ против пептида по настоящему изобретению до, во время и/или после введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

XII. Антитела

Настоящее изобретение дополнительно относится к антителам, которые связываются с пептидом по настоящему изобретению. Предпочтительные антитела специфически связываются с пептидом по настоящему изобретению, но не связываются (или слабо связываются) с пептидом, который не является пептидом по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления такое антитело может включать антитело, которое распознает пептид относительно молекул HLA, т.е., антитело, которое связывается с комплексом пептид-MHC. Специфичность связывания антитела можно подтверждать анализом ингибирования. То есть, если связывание между анализируемым антителом и полноразмерным полипептидом KOC1 ингибируется в присутствии пептида по настоящему изобретению, такое антитело демонстрирует специфическое связывание с пептидом по настоящему изобретению. Антитела против пептидов по настоящему изобретению можно использовать в анализах для диагностики и прогнозирования заболевания, а также отбора индивидуума для введения фармацевтических композиций по настоящему изобретению и мониторинга фармацевтических композиций по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к различным иммунологическим анализам для детекции и/или количественного определения пептидов по настоящему изобретению или их фрагментов. Такие иммунологические анализы включают радиоиммунологический анализ, имунохроматографию, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), иммуноферментный флуоресцентный анализ (ELIFA) и т.п., не ограничиваясь перечисленными, и их проводят в рамках различных форматов иммунологических анализов, хорошо известных в данной области.

Антитела по настоящему изобретению можно использовать в способах иммунологической визуализации, которые могут выявлять KOC1-экспрессирующие злокачественные опухоли, и их примеры включают радиоактивную сцинтиграфию с использованием меченого антитела по настоящему изобретению, не ограничиваясь указанным. Такие способы анализа используют в клинике для детекции, мониторинга, и прогнозирования KOC1-экспрессирующих злокачественных опухолей; и примеры таких злокачественных опухолей включают рак мочевого пузыря, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, хронический миелолейкоз (ХМЛ), рак толстого кишечника, рак прямой кишки, рак пищевода, диффузный рак желудка, немелкоклеточный рак легких, мелкоклеточный рак легких, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак почки, рак головы и шеи, опухоль мягких тканей, рак яичек и т.п., не ограничиваясь перечисленными.

Антитела по настоящему изобретению можно использовать в любой произвольной форме, такой как моноклональные антитела или поликлональные антитела, и они могут дополнительно включать антитела, полученные при иммунизации животного, такого как кролик, пептидом по настоящему изобретению, все классы поликлональных антител и моноклональных антител, антитела человека, а также химерные антитела и гуманизированные антитела, полученные путем генетической рекомбинации.

Пептид по настоящему изобретению или его фрагмент, применяемый в качестве антигена для получения антител, можно получать путем химического синтеза или способов генетической инженерии, на основании аминокислотных последовательностей, описываемых в настоящем документе.

Пептид, применяемый в качестве иммунизирующего антигена, может быть пептидом по настоящему изобретению или фрагментом пептида по настоящему изобретению. Дополнительно, пептид может быть связан или конъюгирован с носителем для повышения иммуногенности. Гемоцианин морского блюдца (KLH) является хорошо известным носителем. Способы для связывания KLH с пептидом также хорошо известны в данной области.

Любое млекопитающее можно иммунизировать вышеописанным антигеном, и предпочтительно рассматривать совместимость сродительской клеткой, применяемой в слиянии клеток, при получении моноклонального антитела. Как правило, можно использовать животных отряда Грызуны (Rodentia), Зайцеобразные (Lagomorpha) или Приматы (Primate). Животные отряда Грызунов включают, например, мышей, крыс и хомяков. Животные отряда Зайцеобразных включают, например, кроликов. Животные отряда Приматов включают, например, обезьян катарринов (обезьян старого света), таких как яванский макак (Macaca fascicularis), макаки-резусы, гамадрилы, и шимпанзе.

Способы иммунизации животных антигеном известны в данной области. Интраперитонеальная и подкожная инъекции антигена являются стандартными способами для иммунизации млекопитающих. Более конкретно, антиген разбавляют и суспендируют в соответствующем количестве фосфатно-солевого буфера (PBS), физиологического раствора, или т.п. По мере необходимости, раствор суспензии антигена можно вводить млекопитающим после смешивания с соответствующим количеством стандартного адъюванта, такого как полный адъювант Фрейнда, и эмульсификации. Затем предпочтительно вводить антиген, смешанный с соответствующим количеством неполного адъюванта Фрейнда несколько раз в интервале от 4 до 21 суток. Для иимунизации можно использовать подходящий носитель. После вышеуказанной иммунизации, сыворотку можно тестировать стандартным способом на увеличение количества желаемого антитела.

Поликлональные антитела против пептида по настоящему изобретению можно получать, забирая кровь у млекопитающих, у которых было подтверждено увеличение уровня желаемого антитела в сыворотке после иммунизации, и отделяя сыворотку от крови любым общепринятым способом. Поликлональное антитело может быть сывороткой, содержащей поликлональное антитело, или из сывороткии можно выделять фракцию, содержащую поликлональное антитело. Иммуноглобулин G или M можно получать из фракций, которые распознают только пептид по настоящему изобретению, например, с использованием аффинной колонки, конъюгированной с пептидом по настоящему изобретению, а затем дополнительной очистки фракций с использованием колонки с белком A или белком G.

Для того чтобы приготовить моноклональные антитела, после подтверждения увеличения уровня желаемого антитела в сыворотке после иммунизации, у млекопитающих забирают иммунные клетки и проводят клеточное слияние. Иммунные клетки, используемые для слияния клеток, предпочтительно можно получать из селезенки. Для других родительских клеток, которые сливают с вышеуказанными иммунными клетками, можно использовать, например, миеломную клетку млекопитающих, предпочтительно, миеломную клетку, которая приобрела свойство селекции по лекарственному средству клеток для слияния.

Вышеуказанные иммунные клетки можно сливать с миеломными клетками следующими известными способами, например, способом из Milstein et al. (Galfre и Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)).

Гибридомы, полученные путем слияния клеток, можно отбирать, культивируя их в стандартной селективной среде, такой как среда HAT (среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культивирование клеток продолжают в среде HAT в течение достаточного периода времени (например, от нескольких суток до нескольких недель), чтобы погибли все остальные клетки (не слитые клетки), кроме желаемых гибридом. Затем, гибридомные клетки, вырабатывающие желаемое антитело можно отбирать и клонировать, проводя стандартные лимитирующие разведения.

В дополнение к вышеописанным способам иммунизации не являющегося человеком животного при помощи антигена для получения гибридомы, можно иммунизировать лимфоциты человека, такие как лимфоциты, инфицированные вирусом Эпштейна-Барр, in vitro пептидом, клетками, экспрессирующими пептид, или их лизатами. Затем иммунизированные лимфоциты можно сливать с иммортализованными миеломными клетками, полученными от человека, такими как U266, для получения гибридом, производящих желаемое антитело человека, способное связываться с пептидом (JPS63-17688).

Затем, полученную гибридому пересаживают в брюшную полость мыши, и забирают асцитную жидкость. Полученное моноклональное антитело можно очищать, например, путем осаждения сульфатом аммония, на колонках с белком A или белком G, ионообменной хроматографией с DEAE, или на аффинной колонке, конъюгированной с пептидом по настоящему изобретению.

Альтернативно, антителопродуцирующие иммунные клетки, такие как иммунизированные лимфоциты, можно иммортализовать при помощи гена злокачественной опухоли ген и использовать для получения моноклональных антител.

Моноклональные антитела, полученные таким образом, также можно получать путем рекомбинации с использованием способов генетической инженерии (см., например, Borrebaeck и Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, опубликованную в Великобритании у MacMillan Publishers LTD (1990)). Например, ДНК, кодирующую антитело, можно клонировать в иммунные клетки, такие как клетки антителопродуцирующей гибридомы или иммунизированные лимфоциты, и вставить в подходящий вектор, а затем ввести в клетки-хозяева для получения рекомбинантного антитела. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным антителам, полученным, как описано выше.

Дополнительно, антитела по настоящему изобретению могут быть фрагментами антител или модифицированными антителами, при условии, что они связываются с пептидами по настоящему изобретению. Например, желательно, чтобы фрагмент антитела содержал антигенсвязывающий участок/участки антител. Конкретно, фрагменты антител могут быть Fab, F(abʹ)₂, Fv, или одноцепочечным Fv(scFv), в котором фрагменты Fv, полученные из тяжелой и легкой цепей связаны подходящим линкером (Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)). Более конкретно, фрагменты антител можно получать при обработке антитела ферментом, таким как папаин или пепсин. Альтернативно, можно сконструировать ген, кодирующий фрагмент антитела, вставить в экспрессирующий вектор, и экспрессировать в подходящей клетке-хозяине (см., например, Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994); Better и Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989); Pluckthun и Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986); Bird и Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)).

Антитела можно модифицировать путем конъюгации с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Настоящее изобретение относится к таким модифицированным антителам. Модифицированные антитела можно получать путем химической модификации антител. Эти способы модификации являются общепринятыми в данной области.

Альтернативно, антитела по настоящему изобретению можно получать в виде химерных антител из вариабельной области антитела, не принадлежащего человеку, и константной области антитела человека, или в виде гуманизированных антител, которые содержат определяющую комплементарность область (CDR) из антитела, не принадлежащего человеку, и каркасную область, и константную область (FR) из антитела человека. Такие антитела можно получать в соответствии с известными способами. Гуманизацию можно проводить, замещая последовательность/последовательности антитела человека соответствующей последовательностью/последовательностями CDR из антитела, не принадлежащего человеку (см., например, Verhoeyen et al., Science 239: 1534-6 (1988)). Таким образом, такие гуманизированные антитела представляют собой химерные антитела, в которых по существу менее чем интактный вариабельный домен человека замещен соответствующей последовательностью от видов, не являющихся человеком.

Также можно использовать интактные антитела человека, содержащие вариабельную область человека в дополнение к каркасу и константным областям человека. Такие антитела можно получать при помощи различных способов, известных в данной области. Например, способы in vitro включают использование рекомбинантных библиотек из фрагментов антител человека, презентированных на бактериофагах (например, Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991)). Аналогично, антитела человека можно также получать, вводя локусы гена иммуноглобулина человека трансгенным животным, например, мышам, у которых гены эндогенных иммуноглобулинов были частично или полностью инактивированы. Этот подход описан, например, в патентах США №№ 6150584, 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425 и 5661016.

Антитела, полученные, как описано выше, можно очищать для гомогенности. Например, выделение и очистку антител можно проводить в соответствии со способами выделения и способами очистки, применяемыми для распространенных белков. Например, антитело можно отделять и изолировать при помощи соответствующим образом выбранного и скомбинированного применения хроматографии на колонках, такой как аффинная хроматография, фильтрации, ультрафильтрации, высаливания, диализа, SDS-электрофореза в полиакриламидном геле и электрофореза с изоэлектрофокусированием (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow и David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), но не ограничиваясь перечисленными. Колонку с белком A и колонку с белком G можно использовать в качестве аффинной колонки. Примеры колонок с белком A, которые можно использовать, включают, например, Hyper D, POROS и Sepharose F.F. (Pharmacia).

Кроме аффинной хроматографии, примеры хроматографии включают, например, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию, хроматографию с обратной фазой, адсорбционную хроматографию и т.п. (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Хроматографию можно проводить путем хроматографии в жидкой фазе, такой как ВЭЖХ и FPLC.

Активность связывания антигена для антитела по настоящему изобретению можно измерять, например, при помощи измерения оптической плотности, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), иммуноферментного анализа (EIA), радиоиммунологического анализа (РИА), и/или иммунофлуоресценции (IF). В случае ELISA, антитело по настоящему изобретению иммобилизуют на планшете, пептид по настоящему изобретению наносят на планшет, а затем наносят образец, содержащий желаемое антитело, такой как культуральный супернатант антителопродуцирующих клеток или очищенные антитела. Затем наносят вторичное антитело, которое распознает первичное антитело и помечено ферментом, таким как щелочная фосфатаза, и инкубируют планшет. Затем после отмывания на планшет наносят субстрат для фермента, такой как п-нитрофенилфосфат, и оценивают активность связывания антигена для образца по измерению оптической плотности. Для оценки активности связывания антитела, в качестве антигена можно использовать пептидные фрагменты, такие как C-концевые или N-концевые фрагменты. Для оценки активности антитела по настоящему изобретению можно использовать BIAcore (Pharmacia).

Возможно выявлять или измерять пептид по настоящему изобретению при помощи вышеописанных способов, добавляя антитело по настоящему изобретению к образцу, предположительно содержащему пептид по настоящему изобретению, и выявляя или измеряя иммунный комплекс, образовавшийся между антителом и пептидом.

Например, антитело по настоящему изобретению можно использовать для выявления пептида по настоящему изобретению, присутствующего в образце крови (например, образце сыворотки) индивидуума. Альтернативно, антитело по настоящему изобретению, присутствующее в образце крови (например, образце сыворотки) индивидуума, также можно выявлять при помощи пептида по настоящему изобретению. Результат измерения пептида по настоящему изобретению или антитела по настоящему изобретению в образце крови индивидуума можно использовать для отбора индивидуума для введения фармацевтических композиций по настоящему изобретению или мониторинга эффективности фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Кроме того, опубликовано, что пациенты, у которых есть антитело против пептида, вводимого в качестве вакцины, могут иметь высокую восприимчивость к вакцине. Таким образом, пептид по настоящему изобретению можно использовать в качестве антигена для иммунологического анализа с использованием антитела как индикатора для отбора пациента с высокой восприимчивостью, когда пептид вводят в качестве вакцины.

XIII. Векторы и клетки-хозяева

Настоящее изобретение относится к векторам, содержащим полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению, и клетки-хозяева, в которые введены векторы. Вектор по настоящему изобретению можно использовать для хранения полинуклеотида по настоящему изобретению в клетке-хозяине, для экспрессии пептида по настоящему изобретению в клетке-хозяине, или для введения полинуклеотида по настоящему изобретению для генотерапии.

Когда E. coli является клеткой-хозяином и вектор амплифицируют в большом количестве в E. coli (например, JM109, DH5-альфа, HB101 или XL1-Blue), вектор должен иметь «точку начала репликации» для амплификации в E. coli и маркерный ген для селекции трансформированных E. coli (например, ген резистентности к лекарственному средству, отбирающий по лекарственному средству, такому как ампициллин, тетрациклин, канамицин, хлорамфеникол). Например, можно использовать векторы серии M13, векторы серии pUC, pBR322, pBluescript, pCR-Script и т.п. Кроме того, для клонирования можно использовать pGEM-T, pDIRECT и pT7, а также вышеуказанные векторы. Когда вектор используют для продукции пептида по настоящему изобретению, можно использовать экспрессирующий вектор. Например, экспрессирующий вектор для экспрессии в E. coli должен иметь вышеуказанные характеристики для амплификации в E. coli. Когда E. coli, такие как JM109, DH5-альфа, HB101 или XL1-Blue используют в качестве клетки-хозяина, вектор должен иметь промотор, например, промотор lacZ (Ward et al., Nature 341: 544-6 (1989); FASEB J 6: 2422-7 (1989)), промотор araB (Better et al., Science 240: 1041-3 (1988)), промотор T7 или т.п., который может эффективно экспрессировать желаемый ген в E. coli. В этом отношении вместо вышеуказанных векторов можно использовать, например, pGEX-5X-1 (Pharmacia), "QIAexpress system" (Qiagen), pEGFP и pET (в этом случае, хозяином предпочтительно являются BL21, которые экспрессируют РНК-полимеразу T7). Дополнительно, вектор может содержать сигнальную последовательность для секреции пептида. Иллюстративной сигнальной последовательностью, которая направляет пептид для секреции в периплазматическое пространство E. Coli, является сигнальная последовательность pelB (Lei et al., J Bacteriol 169: 4379 (1987)). Способы для введения векторов в целевые клетки-хозяева включают, например, способ с хлоридом кальция и способ электропорации.

В дополнение к E. coli, для получения полипептида по настоящему изобретению можно использовать, например, экспрессирующие векторы, полученные от млекопитающих (например, pcDNA3 (Invitrogen) и pEGF-BOS (Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)), pEF, pCDM8), экспрессирующие векторы, полученные из клеток насекомых (например, "экспрессирующая бакуловирусная система Bac-to-BAC" (GIBCO BRL), pBacPAK8), экспрессирующие векторы, полученные из растений (например, pMH1, pMH2), экспрессирующие векторы, полученные из вирусов животных (например, pHSV, pMV, pAdexLcw), экспрессирующие векторы, полученные из ретровирусов (например, pZIpneo), экспрессирующие векторы, полученные из дрожжей (например, "Pichia Expression Kit" (Invitrogen), pNV11, SP-Q01) и экспрессирующие векторы, полученные из Bacillus subtilis (например, pPL608, pKTH50).

Для того чтобы экспрессировать вектор в клетках животных, таких как клетки CHO, COS или NIH3T3, вектор должен нести промотор, необходимый для экспрессии в таких клетках, например, промотор SV40 (Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979)), промотор MMLV-LTR, промотор EF1-альфа (Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)), промотор CMV и т.п., и предпочтительно маркерный ген для селекции трансформантов (например, ген резистентности к лекарственному средству, отбирающий по лекарственному средству (например, неомицину, G418)). Примеры известных векторов с этими характеристиками включают, например, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV и pOP13.

Варианты осуществления настоящего изобретения проиллюстрированы ниже на основании вышеизложенного объяснения, однако настоящее изобретение не ограничено этими вариантами осуществления.

[1] Пептид менее чем из 15 аминокислот со способностью индуцировать цитотоксическую T-клетку (ЦТЛ), который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(a) аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 28, 30, 32, 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80, 85, 27, 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41; и

(b) аминокислотной последовательности, в которой одна, две или несколько аминокислот замещены, удалены, вставлены и/или добавлены к аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 28, 30, 32, 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80, 85, 27, 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41.

[2] Пептид из [1], который выбран из группы, состоящей из нижеизложенных от (i) до (iv):

(i) пептид, содержащий аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из нижеизложенных от (a) до (d), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32:

(a) вторая аминокислота с N-конца замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из треонина, валина, изолейцина, лейцина, фенилаланина и тирозина;

(b) третья аминокислота с N-конца замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лейцина, фенилаланина, тирозина, изолейцина и аланина;

(c) седьмая аминокислота с N-конца замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лейцина, изолейцина, тирозина, валина и фенилаланина; и

(d) C-концевая аминокислота замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лизина и аргинина;

(ii) пептид, содержащий аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из нижеизложенных от (a) до (c), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80 и 85:

(a) первая аминокислота с N-конца замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты;

(b) вторая аминокислота с N-конца замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из фенилаланина, тирозина, аланина, изолейцина, лейцина и валина; и

(c) C-концевая аминокислота замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из аргинина и лизина;

(iii) пептид, содержащий аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из нижеизложенных от (a) до (b), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 27, 30 и 52:

(a) вторая аминокислота с N-конца замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лейцина, метионина, валина, аланина, изолейцина, серина и треонина; и

(b) C-концевая аминокислота замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из аргинина, лизина, тирозина и фенилаланина; и

(iv) пептид, содержащий аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из нижеизложенных от (a) до (c), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41:

(a) вторая аминокислота с N-конца замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из треонина и серина;

(b) третья аминокислота с N-конца замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты; и

(c) C-концевая аминокислота замещена тирозином.

[3] Пептид из [1], который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 28, 30, 32, 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80, 85, 27, 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41.

[4] Полинуклеотид, который кодирует пептид по любому из пп. с [1] до [3].

[5] Композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и, по меньшей мере, один ингредиент, выбранный из группы, состоящей из нижеизложенных от (a) до (e):

(a) один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3];

(b) один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. с [1] до [3] в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA;

(d) экзосома, которая презентирует на своей поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA; и

(e) ЦТЛ, который нацелен на пептид по любому из пп. с [1] до [3].

[6] Композиция по п. [5], которая является композицией для индуцирования ЦТЛ, где ингредиент представляет собой, по меньшей мере, один ингредиент, выбранный из группы, состоящей из из нижеизложенных от (a) до (d):

(a) один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3];

(b) один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. с [1] до [3] в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA;

(d) экзосома, которая презентирует на своей поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA.

[7] Композиция по п. [5], которая является фармацевтической композицией.

[8] Композиция по п. [7], которая предназначена для одного или нескольких применений, выбранных из группы, состоящей из (i) лечения злокачественных опухолей, (ii) предупреждения (профилактики) злокачественной опухоли и (iii) предупреждения (профилактики) послеоперационного рецидива злокачественной опухоли.

[9] Композиция по п. [7], которая предназначена для индуцирования иммунного ответа против злокачественной опухоли.

[10] Композиция по п. [8] или [9], где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака шейки матки, холангиоцеллюлярного рака, хронического миелолейкоза (ХМЛ), рака толстого кишечника, рака прямой кишки, рака пищевода, диффузного рака желудка, немелкоклеточного рака легких, мелкоклеточного рака легких, лимфомы, остеосаркомы, рака яичника, рака почки, рака головы и шеи, опухоли мягких тканей и рака яичек.

[11] Композиция по любому из пп. с [5] до [10], которую формулируют для введения индивидууму, положительному, по меньшей мере, по одному HLA, выбранному из группы, состоящей из HLA-A11, HLA-A33, HLA-A03 и HLA-A01.

[12] Способ индуцирования АПК со способностью индуцировать ЦТЛ, который включает этап, выбранный из группы, состоящей из нижеизложенных (a) и (b):

(a) контакт АПК с пептидом по любому из пп. с [1] до [3] in vitro, ex vivo или in vivo; и

(b) введение полинуклеотида, кодирующего пептид по любому из пп. с [1] до [3], в АПК.

[13] Способ индуцирования ЦТЛ, который включает этап, выбранный из группы, состоящей из нижеизложенных от (a) до (c):

(a) совместное культивирование CD8-положительной T-клетки/клеток с АПК, которые презентируют на своей поверхности комплекс из антигена HLA и пептида по любому из пп. с [1] до [3];

(b) совместное культивирование CD8-положительной T-клетки/клеток с экзосомой/экзосомами, которые презентируют на своей поверхности комплекс из антигена HLA и пептида по любому из пп. с [1] до [3]; и

(c) введение в CD8-положительную T-клетку/клетки полинуклеотида, кодирующего каждую субъединицу T-клеточного рецептора (TCR), способного связываться с пептидом по любому из пп. с [1] до [3], презентированным при помощи антигена HLA на клеточной поверхности.

[14] АПК, которая презентирует на своей поверхности комплекс из антигена HLA и пептида по любому из пп. с [1] до [3].

[15] АПК по п. [14], которая индуцирована при помощи способа из п. [12].

[16] ЦТЛ, которая нацелена на пептид по любому из пп. с [1] до [3].

[17] ЦТЛ из п. [16], которая индуцирована при помощи способа из п. [13].

[18] Способ индуцирования иммунного ответа против злокачественной опухоли, который включает введение индивидууму, по меньшей мере, одного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из нижеизложенных с (a) по (e):

(a) один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3];

(b) один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. с [1] до [3] в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA;

(d) экзосома, которая презентирует на своей поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA; и

(e) ЦТЛ, который нацелен на пептид по любому из пп. с [1] до [3].

[19] Способ лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, и/или профилактики ее послеоперационного рецидива, который включает введение индивидууму, по меньшей мере, одного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из нижеизложенных пп. с (a) по (e):

(a) один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3];

(b) один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. с [1] до [3] в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA;

(d) экзосома, которая презентирует на своей поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA; и

(e) ЦТЛ, который нацелен на пептид по любому из пп. с [1] до [3].

[20] Антитело, которое связывается с пептидом по любому из пп. с [1] до [3].

[21] Способ скрининга на пептид со способностью индуцировать ЦТЛ, который включает этапы:

(a) создания кандидатных последовательностей, состоящих из аминокислотной последовательности, в которой один, два, или несколько аминокислотных остатков замещены, удалены, вставлены и/или добавлены по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5, 28, 30, 32, 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80, 85, 27, 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41;

(b) отбора в кандидатных последовательностях, полученных в (a), кандидатной последовательности, которая не имеет значительной гомологии (идентичности последовательности) с любым известным продуктом гена человека, за исключением KOC1;

(c) контакта пептида, состоящего из кандидатной последовательности, выбранной в (b), с АПК;

(d) контакта АПК из (c) с CD8-положительной T-клеткой/клетками; и

(e) отбора пептида, который имеет равную или более высокую способность индуцировать ЦТЛ, по сравнению с пептидом, состоящим из исходной аминокислотной последовательности.

[22] Применение, по меньшей мере, одного ингредиента выбранного из группы, состоящей из нижеизложенных пп. с (a) по (e), в производстве композиции для индуцирования иммунного ответа против злокачественной опухоли:

(a) один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3];

(b) один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. с [1] до [3] в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA;

(d) экзосома, которая презентирует на своей поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA; и

(e) ЦТЛ, который нацелен на пептид по любому из пп. с [1] до [3].

[23] Применение, по меньшей мере, одного ингредиента выбранного из группы, состоящей из нижеизложенных пп. с (a) по (e), в производстве фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, и/или профилактики ее послеоперационного рецидива:

(a) один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3];

(b) один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. с [1] до [3] в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA;

(d) экзосома, которая презентирует на своей поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA; и

(e) ЦТЛ, который нацелен на пептид по любому из пп. с [1] до [3].

[24] Применение, по меньшей мере, одного ингредиента выбранного из группы, состоящей из нижеизложенных пп. с (a) по (e), для индуцирования иммунного ответа против злокачественной опухоли:

(a) один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3];

(b) один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. с [1] до [3] в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA;

(d) экзосома, которая презентирует на своей поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA; и

(e) ЦТЛ, который нацелен на пептид по любому из пп. с [1] до [3].

[25] Применение, по меньшей мере, одного ингредиента выбранного из группы, состоящей из нижеизложенных пп. с (a) по (e), для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, и/или профилактики ее послеоперационного рецидива:

(a) один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3];

(b) один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. с [1] до [3] в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA;

(d) экзосома, которая презентирует на своей поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA; и

(e) ЦТЛ, который нацелен на пептид по любому из пп. с [1] до [3].

[26] Способ индуцирования цитотоксической активности против KOC1-экспрессирующей клетки/клеток, который включает этап введения индивидууму, по меньшей мере, одного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из нижеизложенных пп. с (a) по (e):

(a) один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3];

(b) один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. с [1] до [3] в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA;

(d) экзосома, которая презентирует на своей поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA; и

(e) ЦТЛ, который нацелен на пептид по любому из пп. с [1] до [3].

[27] Лиофилизированный состав, содержащий один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3].

[28] Фармацевтическая композиция, которую получают способом, включающим растворение одного или нескольких типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3] в водорастворимом носителе, и проведение стерилизации фильтрованием.

[29] Водный раствор, стерилизованный фильтрованием, который представляет собой водный раствор, содержащий один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3] и водорастворимый носитель.

[30] Эмульсия, содержащая один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3], водорастворимый носитель и масляный адъювант.

[31] Набор, включающий контейнер, который содержит фармацевтическую композицию по любому из пп. с [7] по [11], и контейнер, который содержит адъювант.

[32] Набор, включающий контейнер, в котором находится лиофилизированный состав, содержащий пептид по любому из пп. с [1] до [3], контейнер, в котором находится адъювант, и контейнер, в котором находится раствор для повторного растворения лиофилизированного состава.

Настоящее изобретение поясняется в настоящем документе подробно со ссылкой на его конкретные варианты осуществления. Однако следует понимать, что вышеизложенное объяснение по факту является иллюстративным и пояснительным, и предназначено для объяснения настоящего изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления. Путем общепринятого экспериментирования, специалист в данной области легко поймет, что можно производить различные изменения и модификации в пределах сущности и объема настоящего изобретения. Таким образом, настоящее изобретение не ограничивается вышеизложенным разъяснением, а определяется прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

Здесь и далее, настоящее изобретение более подробно описано со ссылкой на примеры. Однако, хотя последующие материалы, способ и примеры могу помочь специалисту в производстве и использовании определенных вариантов настоящего изобретения, они существуют только для иллюстрации аспектов настоящего изобретения, и, таким образом, нкоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения. Специалист в данной области может использовать способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе, в практическом осуществлении или испытаниях по настоящему изобретению.

Все документы по известному уровню техники, процитированные в настоящем документе, включены посредством ссылки в настоящее описание.

Примеры

[Пример 1]

Материалы и способы

Линии клеток

C1R, HLA-A- и HLA-B-негативную В-лимфобластную линию клеток человека, и COS7, линию клеток почки африканской зеленой мартышки, приобретали у ATCC.

Создание клеток-стимуляторов со стабильной экспрессией HLA-A*1101

C1R (C1R-A11), которые стабильно экспрессируют HLA-A*1101, использовали в качестве клеток-стимуляторов. Амплифицировали путем ПЦР кДНК, кодирующую открытую рамку считывания HLA-A*1101, и клонировали в экспрессирующий вектор. Клетки C1R трансфецировали экспрессирующим вектором, а затем проводили селекцию при помощи G418 (Invitrogen) через две недели. Селектированные по G418 клетки высевали в лунки, содержащие среду для культивирования с G418, в 96-луночный планшет, и дополнительно культивировали в течение 30 суток. Экзогенную экспрессию HLA-A*1101 в клетках C1R подтверждали анализом проточной цитометрии.

Селекция кандидатных пептидов, полученных из KOC1

Девяти- и десятимерные пептиды, полученные из KOC1, которые связываются с молекулой HLA-A*1101 были теоретически рассчитаны при помощи сервера для предсказания связывания «NetMHC 3.2» (www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) (Buus et al., Tissue Antigens. 2003 Nov, 62(5): 378-84; Nielsen et al., Protein Sci. 2003 May, 12(5): 1007-17; Bioinformatics. 2004 Jun 12: 20(9): 1388-97).

Пептидный синтез

Пептиды синтезировали в Biosynthesis (Lewisville, Texas) в соответствии со стандартным способом синтеза на твердой фазе, и очищали при помощи обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Пептиды анализировали по чистоте (>90%) и идентичности путем аналитической ВЭЖХ и масс-спектрометрии, соответственно. Пептиды растворяли в диметилсульфоксиде из расчета 20 мг/мл и хранили при -80°C.

Индукция ЦТЛ in vitro

Дендритные клетки (DC) моноцитарного происхождения использовали в качестве антигенпрезентирующей клетки для того чтобы индуцировать ответ цитотоксического T-лимфоцита (ЦТЛ) против пептидов, презентированных на лейкоцитарных антигенах человека (HLA). Как описано в других разделах, DC получали in vitro (Nakahara S et al., Cancer Res 2003, 63(14): 4112-8). Конкретно, мононуклеарные клетки периферической крови, выделенные у здоровых добровольцев (HLA-A*1101-положительных) при помощи раствора Фиколл-Пак плюс (Pharmacia) разделяли путем прикрепления к пластиковым чашкам для тканевой культуры (Becton Dickinson) и концентрировали в виде фракции моноцитов. Популяцию концентрированных моноцитов культивировали в присутствии 1000 МЕ/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (R&D System) и 1000 МЕ/мл интерлейкина(IL)-4 (R&D System) в среде AIM-V (Invitrogen), содержащей 2% инактивированной нагреванием аутологичной сыворотки (AS). Через семь суток культивирования, цитокин-индуцированные DC были активированы 20 мкг/мл каждого из синтезированных пептидов в среде AIM-V при 37°C в течение трех часов в присутствии 3 мкг/мл бета 2-микроглобулина. Полученные клетки по наблюдениям экспрессировали на своей клеточной поверхности DC-ассоциированные молекулы, такие как CD80, CD83, CD86 и HLA класса II (данные не показаны). Затем, эти активированные пептидами DC были инактивированы рентгеновским облучением (20 Гр), и смешаны в соотношении 1:20 с аутологичными CD8⁺ T-клетками, полученными путем положительной селекции при помощи CD8 Positive Isolation Kit (Dynal). Эти культуральные продукты высевали в 48-луночный планшет (Corning). Каждая лунка содержала 1,5×10⁴ активированных пептидами DC, 3×10⁵ CD8⁺ T-клеток и 10 нг/мл IL-7 (R&D System) в 0,5 мл среды AIM-V с 2% AS. Через три дня, к этим культуральным продуктам добавляли IL-2 (CHIRON) с конечной концентрацией 20 МЕ/мл. На сутки 7 и сутки 14, T-клетки дополнительно стимулировали аутологичными DC, активированными пептидами. DC получали каждый ра тем же способом, что и вышеописанный. На сутки 21, после третьей стимуляции пептидом, ЦТЛ тестировали против активированных пептидами C1R-A11 при помощи анализа иммуноферментных пятен (ELISPOT) с человеческим интерфероном (IFN)-гамма (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

Способ наращивания ЦТЛ

ЦТЛ выращивали в культуре при помощи способов, аналогичных, описанным у Riddell et al. (Walter EA et al., N Engl J Med 1995, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996, 2(2): 216-23). ЦТЛ совместно культивировали в 25 мл среды AIM-V, содержащей 5% AS (AIM-V/5%AS) и 40 нг/мл антитела к CD3, с двумя типами В-лимфобластных клеточных линий человека, обработанных митомицином C, в количестве 5×10⁶ клеток/колбу. Через сутки после начала культивирования к культуре добавляли 120 МЕ/мл IL-2. На сутки 5, 8 и 11 к культуре добавляли свежую среду AIM-V с 5% AS, содержащую 30 МЕ/мл IL-2 (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

Создание клонов ЦТЛ

Проводили разведение ЦТЛ для получения 0,3, 1 и 3 клеток/лунку в 96-луночных круглодонных планшетах для микротитрования (Nalge Nunc International). ЦТЛ совместно культивировали с двумя типами В-лимфобластных клеточных линий человека, обработанных митомицином C, в концентрации 1×10⁴ клеток/лунку в общем объеме 150 мкл/лунку среды AIM-V/5%AS с 30 нг/мл антитела к CD3 и 125 МЕ/мл IL-2. Через десять суток, к среде добавляли IL-2 в количестве 50 мкл/лунку для получения конечной концентрации 125 МЕ/мл. На сутки 14, тестировали активность ЦТЛ, и наращивали клоны ЦТЛ с использованием способа, аналогичного описанному выше (Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

Специфическая активность ЦТЛ

Для исследования специфической активности ЦТЛ проводили анализ ELISPOT с IFN-гамма и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) с IFN-гамма. Конкретно, активированные пептидами C1R-A11 (1×10⁴ клетки/лунку) получали в качестве клеток-стимуляторов. Индуцированные ЦТЛ, т.е., линии и клоны ЦТЛ, использовали в качестве клеток-респондеров. Анализ ELISPOT с IFN-гамма и ELISA с IFN-гамма проводили согласно протоколам производителя.

Создание клеток-мишеней, принудительно экспрессирующих ген-мишень и HLA-A*1101

кДНК, кодирующую открытую рамку считывания гена-мишени или HLA-A*1101 амплифицировали при помощи ПЦР. Амплифицированный продукт клонировали в экспрессирующий вектор. Вектор, экспрессирующий ген-мишень и вектор, экспрессирующий HLA-A*1101, вместе или по отдельности были трансфецированы в клетки COS7, которые представляют собой линию клеток, негативную по гену-мишени и HLA, с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) согласно протоколу, рекомендованному производителем. Через 2 дня после трансфекции, трансфецированные клетки собирали с использованием версена (Invitrogen) и использовали в качестве клеток-мишеней для анализа активности ЦТЛ (5×10⁴ клетки/лунку).

Результаты

Предсказание пептидов, полученных из KOC1 и связывающихся с HLA-A*1101

Таблицы 1a и 1b показывают девятимерные и десятимерные пептиды, полученные из KOC1, которые были теоретически рассчитаны как связывающиеся с HLA-A*1101, в порядке уменьшения аффинности связывания. Всего выбрали 60 пептидов, которые потенциально обладают свойством связываться с HLA-A*1101 и исследовали для выявления эпитопных пептидов.

Таблица 1а
9-мерные пептиды, полученные из К0С1 и связывающиеся с HLA-A11 Начальноe положение Аминокислотная последовательность Kd(HM) SEQ ID NO 258 KSILEIMHK 16 1 121 VVNVTYSSK 18 2 465 KAQGRIYGK 32 3 517 SSAEVVVPR 45 4 415 LSVGAIIGK 76 5 28 PVSGPFLVK 85 6 52 KAIEALSGK 92 7 142 FQLENFTLK 150 8 215 GATIRNITK 293 9 338 КАЕЕЕIМКК 297 10 497 FAAGRVIGK 405 11 15 PSDLESIFK 451 12 536 VVKITGHFY 757 13 479 FVSPKEEVK 791 14 493 RVPSFAAGR 1100 15 272 KFTEEIPLK 1108 16 226 QSKIDVHRK 1125 17 330 KGNVETCAK 1835 18 544 YACQVAQRK 1841 19 220 NITKQTQSK 2617 20 301 KIEQDTDTK 2631 21 553 IQEILTQVK 3008 22 182 QGSPGSVSK 3293 23 559 QVKQHQQQK 3313 24 58 SGKIELHGK 4377 25 205 QFVGAIIGK 4472 26

Таблица 1b
10-мерные пептиды, полученные из КОС1 и связывающиеся с HLA-A11 Начальное положение Аминокислотная последовательность Kd (нМ) SEQ ID NO 120 AVVNVTYSSK 13 27 414 ALSVGAIIGK 33 28 456 ITGPPEAQFK 73 29 204 TQFVGAIIGK 86 30 73 SVPKRQRIRK 103 31 14 APSDLESIFK 152 32 183 GSPGSVSKQK 165 33 496 SFAAGRVIGK 168 34 516 LSSAEVVVPR 169 35 552 KIQEILTQVK 214 36 431 LSRFAGASIK 342 37 181 RQGSPGSVSK 368 38 124 VTYSSKDQAR 437 39 225 TQSKIDVHRK 478 40 535 VVVKITGHFY 678 41 224 QTQSKIDVHR 711 42 57 LSGKIELHGK 904 43 141 GFQEENFTLK 911 44 568 AEQSGPPQSR 1065 45 312 ISPLQELTLY 1262 46 441 IAPAEAPDAK 1570 47 27 BPVSGPFLVK 1622 48 570 QSGPPQSRRK 1777 49 95 EVLDSLLVQY 2124 50 336 CAKAEEEIMK 2194 51 281 ILAHNNFVGR 2264 52 466 AQGRIYGKIK 2595 53 160 AQQNPLQQPR 2689 54 420 IIGKQGQHIK 2763 55 558 TQVKQHQQQK 2862 56 257 CKSILEIMHK 3467 57 291 LIGKEGRNLK 3795 58 263 IMHKEAQDIK 4083 59 569 LQSGPPQSRR 4107 60 Начальное положение указывает на номер аминокислотного остатка с N-конца КОС1.
Константа диссоциации [Kd(нМ)] получена из "NetMHC3.2".

Индуцирование ЦТЛ теоретически рассчитанными пептидами, полученными из KOC1 и рестриктированными по HLA-A*1101

ЦТЛ против пептидов, полученных из KOC1, получали в соответствии с протоколом, описанным в «Материалах и способах». Пептид-специфическую активность ЦТЛ измеряли путем анализа ELISPOT с IFN-гамма (фиг. 1). В сравнении с контролем, ЦТЛ в лунке #6 с KOC1-A11-9-415 (SEQ ID NO: 5) (a), лунке #4 с KOC1-A11-10-414 (SEQ ID NO: 28) (b), лунке #5 с KOC1-A11-10-204 (SEQ ID NO: 30) (c), и лунке #8 с KOC1-A11-10-14 (SEQ ID NO: 32) (d) демонстрировали мощную выработку IFN-гамма. В то же время, несмотря на то, что остальные пептиды, показанные в таблицах 1a и 1b, потенциально имели активность связывания с HLA-A*1101, не было выявлено специфической активности ЦТЛ в результате стимуляции этими пептидами. Примером типичных отрицательных данных является отсутствие специфической выработки IFN-гамма у ЦТЛ, стимулированных KOC1-A11-9-258 (SEQ ID NO: 1) (e). В результате, выбрали четыре типа пептидов, полученных из KOC1, в качестве пептидов, способных индуцировать высокоактивные ЦТЛ.

Получение линий и клонов ЦТЛ против пептидов, полученных из KOC1 и рестриктированных по HLA-A*1101

Линии ЦТЛ получали путем наращивания ЦТЛ в лунке #6 с KOC1-A11-9-415 (SEQ ID NO: 5) (a), лунке #5 с KOC1-A11-10-204 (SEQ ID NO: 30) (b), и лунке #8 с KOC1-A11-10-14 (SEQ ID NO: 32) (c), которые продемонстрировали пептид-специфическую активность ЦТЛ в нализе ELISPOT с IFN-гамма. Активность ЦТЛ из этих линий ЦТЛ измеряли при помощи ELISA с IFN-гамма (фиг. 2). Эти линии ЦТЛ показали мощную выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующими пептидами, по сравнению с клетками-мишенями, которые не были активированы пептидами. Дополнительно, клоны ЦТЛ были получены из линий ЦТЛ путем лимитирующих разведений, как описано в разделе «Материалы и способы» выше, и выработку IFN-гамма из клонов ЦТЛ против пептид-активированных C1R-A11 измеряли при помощи ELISA с IFN-гамма. Мощную выработку IFN-гамма наблюдали в клонах ЦТЛ, стимулированных KOC1-A11-9-415 (SEQ ID NO: 5) (a) и KOC1-A11-10-14 (SEQ ID NO: 32) (b) (фиг. 3).

Специфическая активность ЦТЛ против клеток-мишеней, экспрессирующих KOC1 и HLA-A*1101

Клоны ЦТЛ, созданные против KOC1-A11-10-14 (SEQ ID NO: 32) исследовали на их способность распознавать клетки-мишени, экспрессирующие KOC1 и молекулу HLA-A*1101. Клетки COS7, трансфецированные и полноразмерным KOC1, и геном HLA-A*1101 (специфическая модель клеток-мишеней, экспрессирующих KOC1 и ген HLA-A*1101), получали в качестве клеток-мишеней. Клетки COS7, транфецированные или полноразмерным KOC1, или HLA-A*1101, получали в качестве контроля. Клон ЦТЛ, стимулированный KOC1-A11-10-14 (SEQ ID NO: 32), продемонстрировал мощную активность ЦТЛ против клеток COS7, экспрессирующих и KOC1, и HLA-A*1101 (фиг. 4). С другой стороны, не было выявлено значительной активности ЦТЛ против контрольных клеток. Эти данные ясно доказывают, что KOC1-A11-10-14 (SEQ ID NO: 32) представляет собой пептид, полученный в результате эндогенного процессинга KOC1, презентированный на клетках-мишенях при помощи молекулы HLA-A*1101 и распознающийся ЦТЛ. Эти результаты демонстрируют возможность того, что KOC1-A11-10-14 (SEQ ID NO: 32) может подходить в качестве противораковой вакцины для пациентов с KOC1-экспрессирующей злокачественной опухолью.

Анализ гомологии антигенных пептидов

ЦТЛ, стимулированные KOC1-A11-9-415 (SEQ ID NO: 5), KOC1-A11-10-414 (SEQ ID NO: 28), KOC1-A11-10-204 (SEQ ID NO: 30), или KOC1-A11-10-14 (SEQ ID NO: 32) демонстрировали значительную специфическую активность ЦТЛ. Эти результаты могут быть связаны с тем, что последовательности KOC1-A11-9-415 (SEQ ID NO: 5), KOC1-A11-10-414 (SEQ ID NO: 28), KOC1-A11-10-204 (SEQ ID NO: 30), и KOC1-A11-10-14 (SEQ ID NO: 32) гомологичны пептидам, полученным из других молекул, известных тем, что они сенсибилизируют иммунную систему человека. Для того чтобы исключить эту возможность, проводили анализ гомологии, запрашивая эти пептидные последовательности при помощи алгоритма BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Этот результат показывает, что не существует последовательности, имеющей значительную гомологию с последовательностями KOC1-A11-9-415 (SEQ ID NO: 5), KOC1-A11-10-414 (SEQ ID NO: 28), KOC1-A11-10-204 (SEQ ID NO: 30), и KOC1-A11-10-14 (SEQ ID NO: 32). С другой стороны, KOC1-A11-10-204 (SEQ ID NO: 30) идентичен пептидной последовательности, выявленной в IMP-2, который представляет собой другое семейство IMP. Ранее было описано, что IMP-2 не экспрессируется в здоровых органах, за исключением яичек и зародышевой печени (Hammer NA et al., Reproduction. 2005; 130(2): 203-12). Он участвует в пролиферации злокачественных стволовых клеток глиобластомы (Janiszewska M et al., Genes Dev. 2012; 26(17): 1926-44). IMP-2 является перспективным в качестве антигена-мишени для иммунотерапии злокачественных опухоле. Таким образом, как известно авторам настоящего изобретения, практически не существует возможности того, что эти пептиды могли бы вызвать непреднамеренный иммунный ответ против других неродственных молекул. Подводя итоги, были выявлены новые эпитопные пептиды, полученные из KOC1 и рестриктированные по HLA-A11. Продемонстрировано, что эпитопные пептиды, полученные из KOC1, применимы для иммунотерапии злокачественных опухолей.

[Пример 2]

Материалы и способы

Линии клеток

C1R, HLA-A- и HLA-B-негативную В-лимфобластную линию клеток человека, и COS7, линию клеток почки африканской зеленой мартышки, приобретали у ATCC.

Создание клеток-стимуляторов со стабильной экспрессией HLA-A*3303

C1R (C1R-A33), которые стабильно экспрессируют HLA-A*3303, использовали в качестве клеток-стимуляторов. Амплифицировали путем ПЦР кДНК, кодирующую открытую рамку считывания HLA-A*3303, и клонировали в экспрессирующий вектор. Клетки C1R трансфецировали экспрессирующим вектором, а затем проводили селекцию при помощи G418 (Invitrogen) через две недели. Селектированные по G418 клетки высевали в лунки, содержащие среду для культивирования с G418, в 96-луночный планшет, и дополнительно культивировали в течение 30 суток. Экзогенную экспрессию HLA-A*3303 в клетках C1R подтверждали анализом проточной цитометрии.

Селекция кандидатных пептидов, полученных из KOC1

Девяти- и десятимерные пептиды, полученные из KOC1, которые связываются с молекулой HLA-A*3303 были теоретически рассчитаны при помощи сервера для предсказания связывания «NetMHC 3.2» (www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) (Nielsen et al., PLoS One. 2007; 29; 2(8): e796; Hoof et al., Immunogenetics. 2009; 61(1): 1-13).

Пептидный синтез

Эти пептиды синтезировали в Biosynthesis (Lewisville, Texas) в соответствии со стандартным способом синтеза на твердой фазе, и очищали при помощи обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Пептиды анализировали по чистоте (>90%) и идентичности путем аналитической ВЭЖХ и масс-спектрометрии, соответственно. Пептиды растворяли в диметилсульфоксиде из расчета 20 мг/мл и хранили при -80°C.

Индукция ЦТЛ in vitro

Дендритные клетки (DC) моноцитарного происхождения использовали в качестве антигенпрезентирующей клетки для того чтобы индуцировать ответ цитотоксического T-лимфоцита (ЦТЛ) против пептидов, презентированных на лейкоцитарных антигенах человека (HLA). Как описано в других разделах, DC получали in vitro (Nakahara S et al., Cancer Res 2003, 63(14): 4112-8). Конкретно, мононуклеарные клетки периферической крови, выделенные у здоровых добровольцев (HLA-A*3303-положительных) при помощи раствора Фиколл-Пак плюс (Pharmacia) разделяли путем прикрепления к пластиковым чашкам для тканевой культуры (Becton Dickinson) и концентрировали в виде фракции моноцитов. Популяцию концентрированных моноцитов культивировали в присутствии 1000 МЕ/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (R&D System) и 1000 МЕ/мл интерлейкина(IL)-4 (R&D System) в среде AIM-V (Invitrogen), содержащей 2% инактивированной нагреванием аутологичной сыворотки (AS). Через семь суток культивирования, цитокин-индуцированные DC были активирован 20 мкг/мл каждого из синтезированных пептидов в среде AIM-V при 37°C в течение трех часов в присутствии 3 мкг/мл бета 2-микроглобулина. Полученные клетки по наблюдениям экспрессировали на своей клеточной поверхности DC-ассоциированные молекулы, такие как CD80, CD83, CD86 и HLA класса II (данные не показаны). Затем, эти активированные пептидами DC были инактивированы рентгеновским облучением (20 Гр), и смешаны в соотношении 1:20 с аутологичными CD8⁺ T-клетками, полученными путем положительной селекции при помощи CD8 Positive Isolation Kit (Dynal). Эти культуральные продукты высевали в 48-луночный планшет (Corning). Каждая лунка содержала 1,5×10⁴ активированных пептидами DC, 3×10⁵ CD8⁺ T-клеток и 10 нг/мл IL-7 (R&D System) в 0,5 мл среды AIM-V с 2% AS. Через три дня, к этим культуральным продуктам добавляли IL-2 (CHIRON) с конечной концентрацией 20 МЕ/мл. На сутки 7 и сутки 14, T-клетки дополнительно стимулировали аутологичными DC, активированными пептидами. DC получали каждый раз тем же способом, что и вышеописанный. На сутки 21, после третьей стимуляции пептидом, ЦТЛ тестировали против активированных пептидами C1R-A11 при помощи анализа иммуноферментных пятен (ELISPOT) с человеческим интерфероном (IFN)-гамма (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

Способ наращивания ЦТЛ

ЦТЛ выращивали в культуре при помощи способов, аналогичных, описанным у Riddell et al. (Walter EA et al., N Engl J Med 1995, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996, 2(2): 216-23). ЦТЛ совместно культивировали в 25 мл среды AIM-V, содержащей 5% AS (AIM-V/5%AS) и 40 нг/мл антитела к CD3, с двумя типами В-лимфобластных клеточных линий человека, обработанных митомицином C, в количестве 5×10⁶ клеток/колбу. Через сутки после начала культивирования к культуре добавляли 120 МЕ/мл IL-2. На сутки 5, 8 и 11 к культуре добавляли свежую среду AIM-V с 5% AS, содержащую 30 МЕ/мл IL-2 (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

Создание клонов ЦТЛ

Проводили разведение ЦТЛ для получения 0,3, 1 и 3 клеток/лунку в 96-луночных круглодонных планшетах для микротитрования (Nalge Nunc International). ЦТЛ совместно культивировали с двумя типами В-лимфобластных клеточных линий человека, обработанных митомицином C, в концентрации 1×10⁴ клеток/лунку в общем объеме 150 мкл/лунку среды AIM-V/5%AS с 30 нг/мл антитела к CD3 и 125 МЕ/мл IL-2. Через десять суток, к среде добавляли IL-2 в количестве 50 мкл/лунку для получения конечной концентрации 125 МЕ/мл. На сутки 14, тестировали активность ЦТЛ, и наращивали клоны ЦТЛ с использованием способа, аналогичного описанному выше (Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

Специфическая активность ЦТЛ

Для исследования специфической активности ЦТЛ проводили анализ ELISPOT с IFN-гамма и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) с IFN-гамма. Конкретно, активированные пептидами C1R-A33 (1×10⁴ клетки/лунку) получали в качестве клеток-стимуляторов. Индуцированные ЦТЛ, т.е., линии и клоны ЦТЛ, использовали в качестве клеток-респондеров. Анализ ELISPOT с IFN-гамма и ELISA с IFN-гамма проводили согласно протоколам производителя.

Создание клеток-мишеней, принудительно экспрессирующих ген-мишень и HLA-A*3303

кДНК, кодирующую открытую рамку считывания гена-мишени или HLA-A*3303 амплифицировали при помощи ПЦР. Амплифицированный продукт клонировали в экспрессирующий вектор. Вектор, экспрессирующий ген-мишень и вектор, экспрессирующий HLA-A*3303, вместе или по отдельности были трансфецированы в клетки COS7, которые представляют собой линию клеток, негативную по гену-мишени и HLA, с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) согласно протоколу, рекомендованному производителем. Через 2 дня после трансфекции, трансфецированные клетки собирали с использованием версена (Invitrogen) и использовали в качестве клеток-мишеней для анализа активности ЦТЛ (5×10⁴ клетки/лунку).

Результаты

Предсказание пептидов, полученных из KOC1 и связывающихся с HLA-A*3303

Таблицы 2a и 2b показывают девятимерные и десятимерные пептиды, полученные из KOC1, которые были теоретически рассчитаны как связывающиеся с HLA-A*3303 в порядке уменьшения аффинности связывания. Всего выбрали 37 пептидов, которые потенциально обладают свойством связываться с HLA-A*3303, и исследовали для выявления эпитопных пептидов.

Таблица 2а
9-мерные пептиды, полученные из КОС1 и связывающиеся с HLA-A33 Начальное положение Аминокислотная последовательность Kd (нМ) SEQ ID NO 543 FYACQVAQR 98 61 517 SSAEVVVPR 105 4 282 LAHNNFVGR 140 62 493 RVPSFAAGR 182 15 317 ELTLYNPER 260 63 485 EVKLEAHIR 278 64 125 TYSSKDQAR 467 65 461 EAQFKAQGR 555 66 286 NFVGRLIGK 933 67 225 TQSKIDVHR 1039 68 69 EVEHSVPKR 1453 69 161 QQNPLQQPR 1485 70 406 ETVHLFIPA 2340 71 73 SVPKRQRIR 2969 72 570 QSGPPQSRR 3001 73 121 WWNVTYSSK 3272 2 465 KAQGRIYGK 3308 3 142 FQLENFTLK 4063 8 34 LVKTGYAFV 4107 74 211 IGKEGATIR 4197 75 307 DTKITISPL 4676 76

Таблица 2b
10-мерные пептиды, полученные из КОС1 и связывающиеся с HLA-A33 Начальное положение Аминокислотная последовательность Kd(HM) SEQ ID NO 542 HFYACQVAQR 16 77 124 VTYSSKDQAR 201 39 224 QTQSKIDVHR 296 42 281 ILAHNNFVGR 320 52 72 HSVPKRQRIR 428 78 516 LSSAEVVVPR 467 35 496 SFAAGRVIGK 1710 34 543 FYACQVAQRK 2635 79 424 QGQHIKQLSR 2752 80 190 KQKPCDLPLR 3492 81 431 LSRFAGASIK 3726 37 568 ALQSGPPQSR 4478 45 210 IIGICEGATIR 4831 82 478 NFVSPKEEVK 4831 83 77 RQRIRKIQIR 4883 84 285 NNFVGRLIGK 4883 85 Начальное положение указывает на номер аминокислотного остатка с КОС1.
Константа диссоциации [Kd(HM)] получена из "NetMHCpan2.8.

Индуцирование ЦТЛ теоретически рассчитанными пептидами, полученными из KOC1 и рестриктированными по HLA-A*3303

ЦТЛ против пептидов, полученных из KOC1, получали в соответствии с протоколом, описанным в «Материалах и способах». Пептид-специфическую активность ЦТЛ измеряли путем анализа ELISPOT с IFN-гамма (фиг. 5). В сравнении с контролем, ЦТЛ в лунке #1 с KOC1-A33-9-543 (SEQ ID NO: 61) (a), лунке #2 с KOC1-A33-9-282 (SEQ ID NO: 62) (b), лунке #3 с KOC1-A33-9-317 (SEQ ID NO: 63) (c), лунке #8 с KOC1-A33-9-485 (SEQ ID NO: 64) (d), лунке #3 с KOC1-A33-9-286 (SEQ ID NO: 67) (e), лунке #8 с KOC1-A33-9-34 (SEQ ID NO: 74) (f), лунке #4 с KOC1-A33-10-542 (SEQ ID NO: 77) (г), лунке #3 с KOC1-A33-10-281 (SEQ ID NO: 52) (h), лунке #6 с KOC1-A33-10-543 (SEQ ID NO: 79) (i), лунке #1 с KOC1-A33-10-424 (SEQ ID NO: 80) (j), и лунке #5 с KOC1-A33-10-285 (SEQ ID NO: 85) (k) демонстрировали мощную выработку IFN-гамма. В то же время, несмотря на то, что остальные пептиды, показанные в таблицах 2a и 2b, потенциально имели активность связывания с HLA-A*3303, не было выявлено специфической активности ЦТЛ в результате стимуляции этими пептидами. Примером типичных отрицательных данных является отсутствие специфической выработки IFN-гамма у ЦТЛ, стимулированных KOC1-A33-9-517 (SEQ ID NO: 4) (l). В результате, выбрали одиннадцать типов пептидов, полученных из KOC1, в качестве пептидов, способных индуцировать высокоактивные ЦТЛ.

Получение линий и клонов ЦТЛ против пептидов, полученных из KOC1 и рестриктированных по HLA-A*3303

Линии ЦТЛ получали путем наращивания ЦТЛ в лунке #1 с KOC1-A33-9-543 (SEQ ID NO: 61) (a), лунке #2 с KOC1-A33-9-282 (SEQ ID NO: 62) (b), лунке #8 с KOC1-A33-9-485 (SEQ ID NO: 64) (c), лунке #3 с KOC1-A33-9-286 (SEQ ID NO: 67) (d), лунке #4 с KOC1-A33-10-542 (SEQ ID NO: 77) (e), и лунке #3 с KOC1-A33-10-281 (SEQ ID NO: 52) (f), которые продемонстрировали пептид-специфическую активность ЦТЛ в анализе ELISPOT с IFN-гамма. Активность ЦТЛ из этих линий ЦТЛ измеряли при помощи ELISA с IFN-гамма (фиг. 6). Эти линии ЦТЛ показали мощную выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующими пептидами, по сравнению с клетками-мишенями, которые не были активированы пептидами. Дополнительно, клоны ЦТЛ были получены из линий ЦТЛ путем лимитирующих разведений, как описано разделе «Материалы и способы» выше, и выработку IFN-гамма из клонов ЦТЛ против пептид-активированных C1R-A33 измеряли при помощи ELISA с IFN-гамма. Мощную выработку IFN-гамма наблюдали в клонах ЦТЛ, стимулированных KOC1-A33-9-543 (SEQ ID NO: 61) (a), KOC1-A33-9-282 (SEQ ID NO: 62) (b), KOC1-A33-9-485 (SEQ ID NO: 64) (c), KOC1-A33-9-286 (SEQ ID NO: 67) (d), KOC1-A33-10-542 (SEQ ID NO: 77) (e), и KOC1-A33-10-281 (SEQ ID NO: 52) (f) (фиг. 7).

Специфическая активность ЦТЛ против клеток-мишеней, экспрессирующих KOC1 и HLA-A*3303

Линни и клоны ЦТЛ, созданные против KOC1-A33-9-485 (SEQ ID NO: 64) (a), KOC1-A33-9-286 (SEQ ID NO: 67) (b), и KOC1-A33-10-542 (SEQ ID NO: 77) (c) исследовали на их способность распознавать клетки-мишени, экспрессирующие KOC1 и молекулу HLA-A*3303. Клетки COS7, трансфецированные и полноразмерным KOC1, и геном HLA-A*3303 (специфическая модель клеток-мишеней, экспрессирующих KOC1 и ген HLA-A*3303) получали в качестве клеток-мишеней. Клетки COS7, трансфецированные или полноразмерным KOC1, или HLA-A*3303 получали в качестве контроля. Клоны ЦТЛ, стимулированные KOC1-A33-9-485 (SEQ ID NO: 64) (a), KOC1-A33-9-286 (SEQ ID NO: 67) (b), или KOC1-A33-10-542 (SEQ ID NO: 77) (c) продемонстрировали мощную активность ЦТЛ против клеток COS7, экспрессирующих и KOC1, и HLA-A*3303 (фиг. 8 С другой стороны, не было выявлено значительной активности ЦТЛ против контрольных клеток. Эти данные ясно доказывают, что KOC1-A33-9-485 (SEQ ID NO: 64), KOC1-A33-9-286 (SEQ ID NO: 67), и KOC1-A33-10-542 (SEQ ID NO: 77) представляют собой пептиды, полученные в результате эндогенного процессинга KOC1, презентированные на клетках-мишенях при помощи молекулы HLA-A*3303 и распознающиеся ЦТЛ. Эти результаты демонстрируют возможность того, что KOC1-A33-9-485 (SEQ ID NO: 64), KOC1-A33-9-286 (SEQ ID NO: 67), и KOC1-A33-10-542 (SEQ ID NO: 77 могут подходить в качестве противораковой вакцины для пациентов с KOC1-экспрессирующей злокачественной опухолью.

Анализ гомологии антигенных пептидов

ЦТЛ, стимулированные KOC1-A33-9-543 (SEQ ID NO: 61), KOC1-A33-9-282 (SEQ ID NO: 62), KOC1-A33-9-317 (SEQ ID NO: 63), KOC1-A33-9-485 (SEQ ID NO: 64), KOC1-A33-9-286 (SEQ ID NO: 67), KOC1-A33-9-34 (SEQ ID NO: 74), KOC1-A33-10-542 (SEQ ID NO: 77), KOC1-A33-10-281 (SEQ ID NO: 52), KOC1-A33-10-543 (SEQ ID NO: 79), KOC1-A33-10-424 (SEQ ID NO: 80), или KOC1-A33-10-285 (SEQ ID NO: 85) демонстрировали значительную специфическую активность ЦТЛ. Эти результаты могут быть связаны с тем, что последовательности KOC1-A33-9-543 (SEQ ID NO: 61), KOC1-A33-9-282 (SEQ ID NO: 62), KOC1-A33-9-317 (SEQ ID NO: 63), KOC1-A33-9-485 (SEQ ID NO: 64), KOC1-A33-9-286 (SEQ ID NO: 67), KOC1-A33-9-34 (SEQ ID NO: 74), KOC1-A33-10-542 (SEQ ID NO: 77), KOC1-A33-10-281 (SEQ ID NO: 52), KOC1-A33-10-543 (SEQ ID NO: 79), KOC1-A33-10-424 (SEQ ID NO: 80), и KOC1-A33-10-285 (SEQ ID NO: 85) гомологичны пептидам, полученным из других молекул, известных тем, что они сенсибилизируют иммунную систему человека. Для того чтобы исключить эту возможность, проводили анализ гомологии, запрашивая эти пептидные последовательности при помощи алгоритма BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Этот результат подтверждает, что последовательности KOC1-A33-9-543 (SEQ ID NO: 61), KOC1-A33-9-317 (SEQ ID NO: 63), KOC1-A33-9-485 (SEQ ID NO: 64), KOC1-A33-9-34 (SEQ ID NO: 74), KOC1-A33-10-542 (SEQ ID NO: 77), KOC1-A33-10-543 (SEQ ID NO: 79), и KOC1-A33-10-424 (SEQ ID NO: 80) являются уникальными. С другой стороны, KOC1-A33-9-282 (SEQ ID NO: 62), KOC1-A33-9-286 (SEQ ID NO: 67), KOC1-A33-10-281 (SEQ ID NO: 52), и KOC1-A33-10-285 (SEQ ID NO: 85) идентичны пептидным последовательностям, выявленным в IMP-1, который представляет собой другое семейство IMP. KOC1-A33-9-485 (SEQ ID NO: 64) идентичен пептидной последовательности, выявленной в IMP-2. Ранее было описано, что IMP-1 не экспрессируется в здоровых органах, за исключением яичек, зародышевой печени и плаценты (Hammer NA et al., Reproduction. 2005; 130(2): 203-12). Описано, что он ассоциирован с прогрессированием опухоли у пациентов с раком легких (Kato T et al., Clin Cancer Res. 2007; 13: 434-42). Ранее было описано, что IMP-2 не экспрессируется в здоровых органах, за исключением яичек и зародышевой печени (Hammer NA et al., Reproduction. 2005; 130(2): 203-12). Он участвует в пролиферации злокачественных стволовых клеток глиобластомы (Janiszewska M et al., Genes Dev. 2012; 26(17): 1926-44). IMP-1 и IMP-2 являются перспективными в качестве антигена-мишени для иммунотерапии злокачественных опухолей. Таким образом, как известно авторам настоящего изобретения, практически не существует возможности того, что эти пептиды могли бы вызвать непреднамеренный иммунный ответ против других неродственных молекул. Подводя итоги, были выявлены новые эпитопные пептиды, полученные из KOC1 и рестриктированные по HLA-A33. Продемонстрировано, что эпитопные пептиды, полученные из KOC1, применимы для иммунотерапии злокачественных опухолей.

[Пример 3]

Материалы и способы

Линии клеток

C1R, HLA-A- и HLA-B-негативную В-лимфобластную линию клеток человека, и COS7, линию клеток почки африканской зеленой мартышки, приобретали у ATCC.

Создание клеток-стимуляторов со стабильной экспрессией HLA-A*0301

C1R (C1R-A03), которые стабильно экспрессируют HLA-A*0301, использовали в качестве клеток-стимуляторов. Амплифицировали путем ПЦР кДНК, кодирующую открытую рамку считывания HLA-A*0301, и клонировали в экспрессирующий вектор. Клетки C1R трансфецировали экспрессирующим вектором, а затем проводили селекцию при помощи G418 (Invitrogen) через две недели. Селектированные по G418 клетки высевали в лунки, содержащие среду для культивирования с G418, в 96-луночный планшет, и дополнительно культивировали в течение 30 суток. Экзогенную экспрессию HLA-A*0301 в клетках C1R подтверждали анализом проточной цитометрии.

Селекция кандидатных пептидов, полученных из KOC1

Девяти- и десятимерные пептиды, полученные из KOC1, которые связываются с молекулой HLA-A*0301 были теоретически рассчитаны при помощи сервера для предсказания связывания «NetMHC 3.2» (www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) (Buus et al., Tissue Antigens. 2003 Nov, 62(5): 378-84; Nielsen et al., Protein Sci. 2003 May, 12(5): 1007-17; Bioinformatics. 2004 Jun 12: 20(9): 1388-97).

Пептидный синтез

Пептиды синтезировали в Biosynthesis (Lewisville, Texas) в соответствии со стандартным способом синтеза на твердой фазе, и очищали при помощи обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Пептиды анализировали по чистоте (>90%) и идентичности путем аналитической ВЭЖХ и масс-спектрометрии, соответственно. Пептиды растворяли в диметилсульфоксиде из расчета 20 мг/мл и хранили при -80°C.

Индукция ЦТЛ in vitro

Дендритные клетки (DC) моноцитарного происхождения использовали в качестве антигенпрезентирующей клетки для того чтобы индуцировать ответ цитотоксического T-лимфоцита (ЦТЛ) против пептидов, презентированных на лейкоцитарных антигенах человека (HLA). Как описано в других разделах, DC получали in vitro (Nakahara S et al., Cancer Res 2003, 63(14): 4112-8). Конкретно, мононуклеарные клетки периферической крови, выделенные у здоровых добровольцев (HLA-A*0301-положительных) при помощи раствора Фиколл-Пак плюс (Pharmacia) разделяли путем прикрепления к пластиковым чашкам для тканевой культуры (Becton Dickinson) и концентрировали в виде фракции моноцитов. Популяцию концентрированных моноцитов культивировали в присутствии 1000 МЕ/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (R&D System) и 1000 МЕ/мл интерлейкина(IL)-4 (R&D System) в среде AIM-V (Invitrogen), содержащей 2% инактивированной нагреванием аутологичной сыворотки (AS). Через семь суток культивирования, цитокин-индуцированные DC были активирован 20 мкг/мл каждого из синтезированных пептидов в среде AIM-V при 37°C в течение трех часов в присутствии 3 мкг/мл бета 2-микроглобулина. Полученные клетки по наблюдениям экспрессировали на своей клеточной поверхности DC-ассоциированные молекулы, такие как CD80, CD83, CD86 и HLA класса II (данные не показаны). Затем, эти активированные пептидами DC были инактивированы рентгеновским облучением (20 Гр), и смешаны в соотношении 1:20 с аутологичными CD8⁺ T-клетками, полученными путем положительной селекции при помощи CD8 Positive Isolation Kit (Dynal). Эти культуральные продукты высевали в 48-луночный планшет (Corning). Каждая лунка содержала 1,5×10⁴ активированных пептидами DC, 3×10⁵ CD8⁺ T-клеток и 10 нг/мл IL-7 (R&D System) в 0,5 мл среды AIM-V с 2% AS. Через три дня, к этим культуральным продуктам добавляли IL-2 (CHIRON) с конечной концентрацией 20 МЕ/мл. На сутки 7 и сутки 14, T-клетки дополнительно стимулировали аутологичными DC, активированными пептидами. DC получали каждый раз тем же способом, что и вышеописанный. На сутки 21, после третьей стимуляции пептидом, ЦТЛ тестировали против активированных пептидами C1R-A03 при помощи анализа иммуноферментных пятен (ELISPOT) с человеческим интерфероном (IFN)-гамма (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

Способ наращивания ЦТЛ

ЦТЛ выращивали в культуре при помощи способов, аналогичных, описанным у Riddell et al. (Walter EA et al., N Engl J Med 1995, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996, 2(2): 216-23). ЦТЛ совместно культивировали в 25 мл среды AIM-V, содержащей 5% AS (AIM-V/5%AS) и 40 нг/мл антитела к CD3, с двумя типами В-лимфобластных клеточных линий человека, обработанных митомицином C, в количестве 5×10⁶ клеток/колбу. Через сутки после начала культивирования к культуре добавляли 120 МЕ/мл IL-2. На сутки 5, 8 и 11 к культуре добавляли свежую среду AIM-V с 5% AS, содержащую 30 МЕ/мл IL-2 (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

Создание клонов ЦТЛ

Проводили разведение ЦТЛ для получения 0,3, 1 и 3 клеток/лунку в 96-луночных круглодонных планшетах для микротитрования (Nalge Nunc International). ЦТЛ совместно культивировали с двумя типами В-лимфобластных клеточных линий человека, обработанных митомицином C, в концентрации 1×10⁴ клеток/лунку в общем объеме 150 мкл/лунку среды AIM-V/5%AS с 30 нг/мл антитела к CD3 и 125 МЕ/мл IL-2. Через десять суток, к среде добавляли IL-2 в количестве 50 мкл/лунку для получения конечной концентрации 125 МЕ/мл. На сутки 14, тестировали активность ЦТЛ, и наращивали клоны ЦТЛ с использованием способа, аналогичного описанному выше (Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

Специфическая активность ЦТЛ

Для исследования специфической активности ЦТЛ проводили анализ ELISPOT с IFN-гамма и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) с IFN-гамма. Конкретно, активированные пептидами C1R-A03 (1×10⁴ клетки/лунку) получали в качестве клеток-стимуляторов. Индуцированные ЦТЛ, т.е., линии и клоны ЦТЛ, использовали в качестве клеток-респондеров. Анализ ELISPOT с IFN-гамма и ELISA с IFN-гамма проводили согласно протоколам производителя.

Создание клеток-мишеней, принудительно экспрессирующих ген-мишень и HLA-A*0301

кДНК, кодирующую открытую рамку считывания гена-мишени или HLA-A*0301 амплифицировали при помощи ПЦР. Амплифицированный продукт клонировали в экспрессирующий вектор. Вектор, экспрессирующий ген-мишень и вектор, экспрессирующий HLA-A*0301, вместе или по отдельности были трансфецированы в клетки COS7, которые представляют собой линию клеток, негативную по гену-мишени и HLA, с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) согласно протоколу, рекомендованному производителем. Через 2 дня после трансфекции, трансфецированные клетки собирали с использованием версена (Invitrogen) и использовали в качестве клеток-мишеней для анализа активности ЦТЛ (5×10⁴ клетки/лунку).

Результаты

Предсказание пептидов, полученных из KOC1 и связывающихся с HLA-A*0301

Таблицы 3a и 3b показывают девятимерные и десятимерные пептиды, полученные из KOC1, которые были теоретически рассчитаны как связывающиеся с HLA-A*0301, в порядке уменьшения аффинности связывания. Всего выбрали 23 пептида, которые потенциально обладают свойством связываться с HLA-A*0301, и исследовали для выявления эпитопных пептидов.

Таблица 3а
9-мерные пептиды, полученные из КОС1 и связывающиеся с HLA-A3 Начальное положение Аминокислотная последовательность Kd(нМ) SEQ ID NO 121 VVNVTYSSK 84 2 258 KSILEIMHK 124 1 52 KAIEALSGK 496 7 28 PVSGPFLVK 613 6 465 KAQGRIYGK 650 3 142 FQLENFTLK 752 8 415 LSVGAIIGK 764 5 497 FAAGRVIGK 927 11 559 QVKQHQQQK 1152 24

Таблица 3b
10-мерные пептиды, полученные из КОС1 и связывающиеся с HLA-A3 Начальное положение Аминокислотная последовательность Kd(HM) SEQ ID NO 120 AVVNVTYSSK [7 27 414 ALSVGAIIGK 37 28 431 LSRFAGASIK 69 37 181 RQGSPGSVSK 104 38 456 ITGPPEAQFK 211 29 204 TQFVGAIIGK 211 30 496 SFAAGRVIGK 215 34 552 KIQEILTQVK 365 36 281 ILAHNNFVGR 459 52 73 SVPKRQRIRK 521 31 535 VVVKITGHFY 682 41 420 IIGKQGQHIK 858 55 14] GFQLENFTLK 1112 44 14 APSDLESIFK 1275 32 Начальное положение указывает на номер аминокислотного остатка с N-конца КОС1.
Константа диссоциации [Kd(нМ)] получена из "NetMHC3.2".

Индуцирование ЦТЛ теоретически рассчитанными пептидами, полученными из KOC1 и рестриктированными по HLA-A*0301

ЦТЛ против пептидов, полученных из KOC1, получали в соответствии с протоколом, описанным в «Материалах и способах». Пептид-специфическую активность ЦТЛ измеряли путем анализа ELISPOT с IFN-гамма (фиг. 9). В сравнении с контролем, ЦТЛ в лунке #5 с KOC1-A03-10-120 (SEQ ID NO: 27) (a), лунке #3 с KOC1-A03-10-204 (SEQ ID NO: 30) (b), и лунке #5 с KOC1-A03-10-281 (SEQ ID NO: 52) (c) демонстрировали мощную выработку IFN-гамма. В то же время, несмотря на то, что остальные пептиды, показанные в таблицах 3a и 3b, потенциально имели активность связывания с HLA-A*0301, не было выявлено специфической активности ЦТЛ в результате стимуляции этими пептидами. Примером типичных отрицательных данных является отсутствие специфической выработки IFN-гамма у ЦТЛ, стимулированных KOC1-A03-10-414 (SEQ ID NO: 28) (d). В результате, выбрали три типа пептидов, полученных из KOC1, в качестве пептидов, способных индуцировать высокоактивные ЦТЛ.

Получение линий и клонов ЦТЛ против пептидов, полученных из KOC1 и рестриктированных по HLA-A*0301

Линию ЦТЛ получали путем наращивания ЦТЛ в лунке #5 с KOC1-A03-10-120 (SEQ ID NO: 27), которая продемонстрировала пептид-специфическую активность ЦТЛ в анализе ELISPOT с IFN-гамма. Активность ЦТЛ из этих линий ЦТЛ измеряли при помощи ELISA с IFN-гамма (фиг. 10). Эти линии ЦТЛ показали мощную выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующими пептидами, по сравнению с клетками-мишенями, которые не были активированы пептидами. Дополнительно, клоны ЦТЛ были получены из линий ЦТЛ путем лимитирующих разведений, как описано разделе «Материалы и способы» выше, и выработку IFN-гамма из клонов ЦТЛ против пептид-активированных C1R-A03 измеряли при помощи ELISA с IFN-гамма. Мощную выработку IFN-гамма наблюдали в клоне ЦТЛ, стимулированном KOC1-A03-10-120 (SEQ ID NO: 27) (фиг. 11).

Специфическая активность ЦТЛ против клеток-мишеней, экспрессирующих KOC1 и HLA-A*0301

Клон ЦТЛ, созданный против KOC1-A03-10-120 (SEQ ID NO: 27) исследовали на его способность распознавать клетки-мишени, экспрессирующие KOC1 и молекулу HLA-A*0301. Клетки COS7, трансфецированные и полноразмерным KOC1, и геном HLA-A*0301 (специфическая модель клеток-мишеней, экспрессирующих KOC1 и ген HLA-A*0301) получали в качестве клеток-мишеней. Клетки COS7, трансфецированные или полноразмерным KOC1, или HLA-A*0301, получали в качестве контроля. Клон ЦТЛ, стимулированный KOC1-A03-10-120 (SEQ ID NO: 27) продемонстрировал мощную активность ЦТЛ против клеток COS7, экспрессирующих и KOC1, и HLA-A*0301 (фиг. 12). С другой стороны, не было выявлено значительной активности ЦТЛ против контрольных клеток. Эти данные ясно доказывают, что KOC1-A03-10-120 (SEQ ID NO: 27) представляет собой пептид, полученный в результате эндогенного процессинга KOC1, презентированный на клетках-мишенях при помощи молекулы HLA-A*0301 и распознающийся ЦТЛ. Эти результаты демонстрируют возможность того, что KOC1-A03-10-120 (SEQ ID NO: 27) может подходить в качестве противораковой вакцины для пациентов с KOC1-экспрессирующей злокачественной опухолью.

Анализ гомологии антигенных пептидов

ЦТЛ, стимулированные KOC1-A03-10-120 (SEQ ID NO: 27), KOC1-A03-10-204 (SEQ ID NO: 30), или KOC1-A03-10-281 (SEQ ID NO: 52) демонстрировали значительную специфическую активность ЦТЛ. Эти результаты могут быть связаны с тем, что последовательности KOC1-A03-10-120 (SEQ ID NO: 27), KOC1-A03-10-204 (SEQ ID NO: 30) и KOC1-A03-10-281 (SEQ ID NO: 52) гомологичны пептидам, полученным из других молекул, известных тем, что они сенсибилизируют иммунную систему человека. Для того чтобы исключить эту возможность, проводили анализ гомологии, запрашивая эти пептидные последовательности при помощи алгоритма BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Этот результат показывает, что не существует последовательности, имеющей значительную гомологию с последовательностью KOC1-A03-10-120 (SEQ ID NO: 27). С другой стороны, KOC1-A03-10-204 (SEQ ID NO: 30) идентичен пептидной последовательности, выявленной в IMP-2, который представляет собой другое семейство IMP. KOC1-A03-10-281 (SEQ ID NO: 52) идентичен пептидной последовательности, выявленной в IMP-1, который представляет другое семейство IMP. Ранее было описано, что IMP-1 не экспрессируется в здоровых органах, за исключением яичек, зародышевой печени и плаценты (Hammer NA et al., Reproduction. 2005; 130(2): 203-12). Описано, что он ассоциирован с прогрессированием опухоли у пациентов с раком легких (Kato T et al., Clin Cancer Res. 2007; 13: 434-42). Ранее было описано, что IMP-2 не экспрессируется в здоровых органах, за исключением яичек и зародышевой печени (Hammer NA et al., Reproduction. 2005; 130(2): 203-12). Он участвует в пролиферации злокачественных стволовых клеток глиобластомы (Janiszewska M et al., Genes Dev. 2012; 26(17): 1926-44). IMP-1 и IMP-2 являются перспективными в качестве антигена-мишени для иммунотерапии злокачественных опухолей. Таким образом, как известно авторам настоящего изобретения, практически не существует возможности того, что эти пептиды могли бы вызвать непреднамеренный иммунный ответ против других неродственных молекул. Подводя итоги, были выявлены новые эпитопные пептиды, полученные из KOC1 и рестриктированные по HLA-A03. Продемонстрировано, что эпитопные пептиды, полученные из KOC1, применимы для иммунотерапии злокачественных опухолей.

[Пример 4]

Материалы и способы

Линии клеток

C1R, HLA-A- и HLA-B-негативную В-лимфобластную линию клеток человека, и COS7, линию клеток почки африканской зеленой мартышки, приобретали у ATCC.

Создание клеток-стимуляторов со стабильной экспрессией HLA-A*0101

C1R (C1R-A01), которые стабильно экспрессируют HLA-A*0101, использовали в качестве клеток-стимуляторов. Амплифицировали путем ПЦР кДНК, кодирующую открытую рамку считывания HLA-A*0101, и клонировали в экспрессирующий вектор. Клетки C1R трансфецировали экспрессирующим вектором, а затем проводили селекцию при помощи G418 (Invitrogen) через две недели. Селектированные по G418 клетки высевали в лунки, содержащие среду для культивирования с G418, в 96-луночный планшет, и дополнительно культивировали в течение 30 суток. Экзогенную экспрессию HLA-A*0101 в клетках C1R подтверждали анализом проточной цитометрии.

Селекция кандидатных пептидов, полученных из KOC1

Девяти- и десятимерные пептиды, полученные из KOC1, которые связываются с молекулой HLA-A*0101, были теоретически рассчитаны при помощи сервера для предсказания связывания «NetMHC 3.2» (www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) (Buus et al., Tissue Antigens. 2003 Nov, 62(5): 378-84; Nielsen et al., Protein Sci. 2003 May, 12(5): 1007-17; Bioinformatics. 2004 Jun 12: 20(9): 1388-97).

Пептидный синтез

Пептиды синтезировали в Biosynthesis (Lewisville, Texas) в соответствии со стандартным способом синтеза на твердой фазе, и очищали при помощи обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Пептиды анализировали по чистоте (>90%) и идентичности путем аналитической ВЭЖХ и масс-спектрометрии, соответственно. Пептиды растворяли в диметилсульфоксиде из расчета 20 мг/мл и хранили при -80°C.

Индукция ЦТЛ in vitro

Дендритные клетки (DC) моноцитарного происхождения использовали в качестве антигенпрезентирующей клетки для того чтобы индуцировать ответ цитотоксического T-лимфоцита (ЦТЛ) против пептидов, презентированных на лейкоцитарных антигенах человека (HLA). Как описано в других разделах, DC получали in vitro (Nakahara S et al., Cancer Res 2003, 63(14): 4112-8). Конкретно, мононуклеарные клетки периферической крови, выделенные у здоровых добровольцев (HLA-A*0101-положительных) при помощи раствора Фиколл-Пак плюс (Pharmacia) разделяли путем прикрепления к пластиковым чашкам для тканевой культуры (Becton Dickinson) и концентрировали в виде фракции моноцитов. Популяцию концентрированных моноцитов культивировали в присутствии 1000 МЕ/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (R&D System) и 1000 МЕ/мл интерлейкина(IL)-4 (R&D System) в среде AIM-V (Invitrogen), содержащей 2% инактивированной нагреванием аутологичной сыворотки (AS). Через семь суток культивирования, цитокин-индуцированные DC были активирован 20 мкг/мл каждого из синтезированных пептидов в среде AIM-V при 37°C в течение трех часов в присутствии 3 мкг/мл бета 2-микроглобулина. Полученные клетки по наблюдениям экспрессировали на своей клеточной поверхности DC-ассоциированные молекулы, такие как CD80, CD83, CD86 и HLA класса II (данные не показаны). Затем, эти активированные пептидами DC были инактивированы рентгеновским облучением (20 Гр), и смешаны в соотношении 1:20 с аутологичными CD8⁺ T-клетками, полученными путем положительной селекции при помощи CD8 Positive Isolation Kit (Dynal). Эти культуральные продукты высевали в 48-луночный планшет (Corning). Каждая лунка содержала 1,5×10⁴ активированных пептидами DC, 3×10⁵ CD8⁺ T-клеток и 10 нг/мл IL-7 (R&D System) в 0,5 мл среды AIM-V с 2% AS. Через три дня, к этим культуральным продуктам добавляли IL-2 (CHIRON) с конечной концентрацией 20 МЕ/мл. На сутки 7 и сутки 14, T-клетки дополнительно стимулировали аутологичными DC, активированными пептидами. DC получали каждый раз тем же способом, что и вышеописанный. На сутки 21, после третьей стимуляции пептидом, ЦТЛ тестировали против активированных пептидами клеток C1R-A01 (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

Способ наращивания ЦТЛ

ЦТЛ выращивали в культуре при помощи способов, аналогичных, описанным у Riddell et al. (Walter EA et al., N Engl J Med 1995, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996, 2(2): 216-23). ЦТЛ совместно культивировали в 25 мл среды AIM-V, содержащей 5% AS (AIM-V/5%AS) и 40 нг/мл антитела к CD3, с двумя типами В-лимфобластных клеточных линий человека, обработанных митомицином C, в количестве 5×10⁶ клеток/колбу. Через сутки после начала культивирования к культуре добавляли 120 МЕ/мл IL-2. На сутки 5, 8 и 11 к культуре добавляли свежую среду AIM-V с 5% AS, содержащую 30 МЕ/мл IL-2 (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

Создание клонов ЦТЛ

Проводили разведение ЦТЛ для получения 0,3, 1 и 3 клеток/лунку в 96-луночных круглодонных планшетах для микротитрования (Nalge Nunc International). ЦТЛ совместно культивировали с двумя типами В-лимфобластных клеточных линий человека, обработанных митомицином C, в концентрации 1×10⁴ клеток/лунку в общем объеме 150 мкл/лунку среды AIM-V/5%AS с 30 нг/мл антитела к CD3 и 125 МЕ/мл IL-2. Через десять суток, к среде добавляли IL-2 в количестве 50 мкл/лунку для получения конечной концентрации 125 МЕ/мл. На сутки 14, тестировали активность ЦТЛ, и наращивали клоны ЦТЛ с использованием способа, аналогичного описанному выше (Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

Специфическая активность ЦТЛ

Для исследования специфической активности ЦТЛ проводили анализ ELISPOT с IFN-гамма и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) с IFN-гамма. Конкретно, активированные пептидами C1R-A01 (1×10⁴ клетки/лунку) получали в качестве клеток-стимуляторов. Индуцированные ЦТЛ, т.е., линии и клоны ЦТЛ, использовали в качестве клеток-респондеров. Анализ ELISPOT с IFN-гамма и ELISA с IFN-гамма проводили согласно протоколам производителя.

Создание клеток-мишеней, принудительно экспрессирующих ген-мишень и HLA-A*0101

кДНК, кодирующую открытую рамку считывания гена-мишени или HLA-A*0101, амплифицировали при помощи ПЦР. Амплифицированный продукт клонировали в экспрессирующий вектор. Экспрессирующие векторы трансфецировали при помощи Липофектамина 2000 (Invitrogen) согласно протоколу, рекомендованному производителем. Через 2 дня после трансфекции, трансфецированные клетки собирали с использованием версена (Invitrogen) и использовали в качестве клеток-мишеней для анализа активности ЦТЛ (5×10⁴ клетки/лунку).

Результаты

Предсказание пептидов, полученных из KOC1 и связывающихся с HLA-A*0101

Таблицы 4a и 4b показывают девятимерные и десятимерные пептиды, полученные из KOC1, которые были теоретически рассчитаны как связывающиеся с HLA-A*0101 в порядке уменьшения аффинности связывания. Всего выбрали 27 пептидов, которые потенциально обладают свойством связываться с HLA-A*1101 и исследовали для выявления эпитопных пептидов.

Таблица 4а
9-мерные пептиды, полученные из КОС1 и связывающиеся с HLA-A1 Начальное положение Аминокислотная последовательность Kd(нМ) SEQ ID NO 96 VLDSLLVQY 56 86 118 ETAWNVTY 57 87 114 NTDSETAVV 453 88 273 FTEEIPLKI 528 89 404 ETETVHLFI 1528 90 536 VVKITGHFY 5589 13 15 PSDLESIFK 5882 12 143 QLENFTLKV 11578 91 402 QSETETVHL 13101 92 305 DTDTKITIS 13406 93 313 SPLQELTLY 21305 94 338 KAEEEIMKK 23866 10 301 KIEQDTDTK 24016 21 69 EVEHSVPKR 24734 69

Таблица 4b
10-мерные пептиды, полученные из КОС1 и связывающиеся с HLA-A1 Начальное положение Аминокислотная последовательность Kd(HM) SEQ ID NO 312 ISPLQELTLY 146 46 95 EVLDSLLVQY 498 50 402 QSETETVHLF 1737 95 9 LSENAAPSDL 2164 96 535 VVVKITGHFY 3359 41 273 FTEEIPLKIL 4478 97 462 AQFKAQGRIY 6263 98 342 EIMKKIRESY 7665 99 252 GTSAACKSIL 9689 100 30 SGPFLVKTGY 17794 101 114 NTDSETAVVN 22411 102 305 DTDTKITISP 29728 103 17 DLESIFKDAK 35078 104 Начальное положение указывает на номер аминокислотного остатка с N-конца КОC1.
Константа диссоциации [Кd(нМ)] получена из "NetMHC3.2".

Индуцирование ЦТЛ теоретически рассчитанными пептидами, полученными из KOC1 и рестриктированными по HLA-A*0101

ЦТЛ против пептидов, полученных из KOC1, получали в соответствии с протоколом, описанным в «Материалах и способах». Пептид-специфическую активность ЦТЛ измеряли путем анализа ELISPOT с IFN-гамма (фиг. 13). В сравнении с контролем, ЦТЛ в лунке #2 с KOC1-A01-9-96 (SEQ ID NO: 86) (a), лунке #4 с KOC1-A01-9-118 (SEQ ID NO: 87) (b), лунке #3 с KOC1-A01-9-404 (SEQ ID NO: 90) (c), лунке #4 с KOC1-A01-9-402 (SEQ ID NO: 92) (d), лунке #7 с KOC1-A01-10-312 (SEQ ID NO: 46) （e）, лунке #1 с KOC1-A01-10-402 (SEQ ID NO: 95) (f) и лунке #1 с KOC1-A01-10-535 (SEQ ID NO: 41) (g) демонстрировали мощную выработку IFN-гамма. В то же время, несмотря на то, что остальные пептиды, показанные в таблицах 4a и 4b, потенциально имели активность связывания с HLA-A*0101-активность связывания, не было выявлено специфической активности ЦТЛ в результате стимуляции этими пептидами. Примером типичных отрицательных данных является отсутствие специфической выработки IFN-гамма у ЦТЛ, стимулированных KOC1-A01-9-536 (SEQ ID NO: 13) (h). В результате, выбрали семь типов пептидов, полученных из KOC1, в качестве пептидов, способных индуцировать высокоактивные ЦТЛ.

Получение линий и клонов ЦТЛ против пептидов, полученных из KOC1

Линии ЦТЛ получали путем наращивания ЦТЛ в лунке #2 с KOC1-A01-9-96 (SEQ ID NO: 86) (a) и лунке #4 с KOC1-A01-9-118 (SEQ ID NO: 87) (b), которые продемонстрировали пептид-специфическую активность ЦТЛ в анализе ELISPOT с IFN-гамма. Активность ЦТЛ из этих линий ЦТЛ измеряли при помощи ELISA с IFN-гамма (фиг. 14). Эти линии ЦТЛ показали мощную выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующими пептидами, по сравнению с клетками-мишенями, которые не были активированы пептидами. Дополнительно, клоны ЦТЛ были получены из линий ЦТЛ путем лимитирующих разведений, как описано разделе «Материалы и способы» выше, и выработку IFN-гамма из клонов ЦТЛ против пептид-активированных клеток C1R-A01 измеряли при помощи ELISA с IFN-гамма. Мощную выработку IFN-гамма наблюдали в клоне ЦТЛ, стимулированном KOC1-A01-9-96 (SEQ ID NO: 86) (фиг. 15).

Специфическая активность ЦТЛ против клеток-мишеней, экспрессирующих KOC1 и HLA-A*0101

Клон ЦТЛ, созданный против KOC1-A01-9-96 (SEQ ID NO: 86) исследовали на его способность распознавать клетки-мишени, экспрессирующие KOC1 и молекулу HLA-A*0101 Клетки COS7, трансфецированные и полноразмерным KOC1, и геном HLA-A*0101 (специфическая модель клеток-мишеней, экспрессирующих KOC1 и ген HLA-A*0101) получали в качестве клеток-мишеней. Клетки COS7, трансфецированные или полноразмерным KOC1, или HLA-A*0101, получали в качестве контроля. Клон ЦТЛ, стимулированный KOC1-A01-9-96 (SEQ ID NO: 86) продемонстрировал мощную активность ЦТЛ против клеток COS7, экспрессирующих и KOC1, и HLA-A*0101 (фиг. 16). С другой стороны, не было выявлено значительной активности ЦТЛ против контрольных клеток. Эти данные ясно доказывают, что KOC1-A01-9-96 (SEQ ID NO: 86) представляет собой пептид, полученный в результате эндогенного процессинга KOC1, презентированный на клетках-мишенях при помощи молекулы HLA-A*0101 и распознающийся ЦТЛ. Эти результаты демонстрируют возможность того, что KOC1-A01-9-96 (SEQ ID NO: 86) может подходить в качестве противораковой вакцины для пациентов с KOC1-экспрессирующей злокачественной опухолью.

Анализ гомологии антигенных пептидов

ЦТЛ, стимулированные KOC1-A01-9-96 (SEQ ID NO: 86), KOC1-A01-9-118 (SEQ ID NO: 87), KOC1-A01-9-404 (SEQ ID NO: 90), KOC1-A01-9-402 (SEQ ID NO: 92), KOC1-A01-10-312 (SEQ ID NO: 46), KOC1-A01-10-402 (SEQ ID NO: 95), или KOC1-A01-10-535 (SEQ ID NO: 41), демонстрировали значительную специфическую активность ЦТЛ. Эти результаты могут быть связаны с тем, что последовательности KOC1-A01-9-96 (SEQ ID NO: 86), KOC1-A01-9-118 (SEQ ID NO: 87), KOC1-A01-9-404 (SEQ ID NO: 90), KOC1-A01-9-402 (SEQ ID NO: 92), KOC1-A01-10-312 (SEQ ID NO: 46), KOC1-A01-10-402 (SEQ ID NO: 95), и KOC1-A01-10-535 (SEQ ID NO: 41) гомологичны пептидам, полученным из других молекул, известных тем, что они сенсибилизируют иммунную систему человека. Для того чтобы исключить эту возможность, проводили анализ гомологии, запрашивая эти пептидные последовательности при помощи алгоритма BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Этот результат показывает, что не существует последовательности, имеющей значительную гомологию с последовательностями KOC1-A01-9-96 (SEQ ID NO: 86), KOC1-A01-9-118 (SEQ ID NO: 87), KOC1-A01-9-404 (SEQ ID NO: 90), KOC1-A01-9-402 (SEQ ID NO: 92), KOC1-A01-10-312 (SEQ ID NO: 46), KOC1-A01-10-402 (SEQ ID NO: 95), и KOC1-A01-10-535 (SEQ ID NO: 41). С другой стороны, KOC1-A01-9-118 (SEQ ID NO: 87) идентичен пептидным последовательностям, выявленным в IMP-1 и IMP-2 которые представляют собой другое семейство IMP. Ранее было описано, что IMP-1 не экспрессируется в здоровых органах, за исключением яичек, зародышевой печени и плаценты (Hammer NA et al., Reproduction. 2005; 130(2): 203-12). Описано, что он ассоциирован с прогрессированием опухоли у пациентов с раком легких (Kato T et al., Clin Cancer Res. 2007; 13: 434-42). Ранее было описано, что IMP-2 не экспрессируется в здоровых органах, за исключением яичек и зародышевой печени (Hammer NA et al., Reproduction. 2005; 130(2): 203-12). Он участвует в пролиферации злокачественных стволовых клеток глиобластомы (Janiszewska M et al., Genes Dev. 2012; 26(17): 1926-44). IMP-1 и IMP-2 являются перспективными в качестве антигена-мишени для иммунотерапии злокачественных опухолей. Таким образом, как известно авторам настоящего изобретения, практически не существует возможности того, что эти пептиды могли бы вызвать непреднамеренный иммунный ответ против других неродственных молекул. Подводя итоги, были выявлены новые эпитопные пептиды, полученные из KOC1 и рестриктированные по HLA-A01. Продемонстрировано, что эпитопные пептиды, полученные из KOC1, применимы для иммунотерапии злокачественных опухолей.

[Пример 5]

Получение составов эмульсий

Пептид растворяли в растворителе для инъекций или стерильном физиологическом растворе до получения концентрации от 1,0 мг/мл до 10,0 мг/мл, и набирали в шприц. Его соединяли через коннектор со шприцем, наполненным неполным адъювантом Фрейнда (IFA), в количестве, эквивалентном количеству растворителя для инъекций или стерильного физиологического раствора, и перемешивали, поочередно нажимая на поршни двух соединенных шприцев. После нескольких минут перемешивания, готовность эмульсии оценивали путем капельной пробы. Капельную пробу можно проводить, капая одну каплю смешанного образца на воду. Эмульсию оценивают как готовую, когда образец, капнутый на воду, не сразу диффундирует в воде; и эмульсию оценивают, как не готовую, когда образец, капнутый на воду, сразу растворяется в воде. Когда эмульсию оценивают как не готовую, дополнительно проводят перемешивание до готовности эмульсии. Готовую эмульсию можно вводить пациенту со злокачественной опухолью путем подкожной инъекции. Пациента со злокачественной опухолью, подходящего для введения, можно выбирать из пациентов, страдающих от рака мочевого пузыря, рака шейки матки, холангиоцеллюлярного рака, хронического миелолейкоза (ХМЛ), рака толстого кишечника, рака прямой кишки, рака пищевода, диффузного рака желудка, немелкоклеточного рака легких, мелкоклеточного рака легких, лимфомы, остеосаркомы, рака яичника, рака почки, рака головы и шеи, опухоли мягких тканей, рака яичек или т.п.

Получение лиофилизированных составов

Пептид растворяли в растворителе для инъекций растворе до получения концентрации от 1,0 мг/мл до 10,0 мг/мл, и стерилизовали фильтрованием. Раствором заполняли стерилизованный флакон, и наполовину закрывали стерилизованной резиновой пробкой. После лиофилизации флакона, его полностью закрывали и запаивали алюминиевой крышкой для получения лиофилизированного состава. При использовании, растворитель для инъекций или стерильный физиологический раствор инъецировали во флакон для повторного растворения лиофилизированного порошка. Повторно растворенный раствор во флаконе собирали в шприц, и шприц соединяли через коннектор со шприцем, наполненным IFA, в количестве, эквивалентном собранному повторно растворенному раствору. Повторно растворенный раствор и IFA смешивали, поочередно нажимая на поршни двух соединенных шприцев. После нескольких минут перемешивания, готовность эмульсии оценивали путем капельной пробы. Готовую эмульсию можно вводить пациенту со злокачественной опухолью путем подкожной инъекции. Пациента со злокачественной опухолью, подходящего для введения, можно выбирать из пациентов, страдающих от рака мочевого пузыря, рака шейки матки, холангиоцеллюлярного рака, хронического миелолейкоза (ХМЛ), рака толстого кишечника, рака прямой кишки, рака пищевода, диффузного рака желудка, немелкоклеточного рака легких, мелкоклеточного рака легких, лимфомы, остеосаркомы, рака яичника, рака почки, рака головы и шеи, опухоли мягких тканей и рака яичек или т.п.

Применимость в промышленности

Настоящее изобретение относится к новым эпитопным пептидам, полученным из KOC1 и рестриктированным по HLA-A11, HLA-A33, HLA-A03 и HLA-A01, которые могут индуцировать мощный и специфический противоопухолевый иммунный ответ, и, таким образом, иметь применимость для широкого спектра типов злокачественных опухолей. Пептиды, композиции, АПК, и ЦТЛ по настоящему изобретению можно использовать в качестве пептидной вакцины для злокачественной опухоли, экспрессирующей KOC1, например, рака мочевого пузыря, рака шейки матки, холангиоцеллюлярного рака, хронического миелолейкоза (ХМЛ), рака толстого кишечника, рака прямой кишки, рака пищевода, диффузного рака желудка, немелкоклеточного рака легких, мелкоклеточного рака легких, лимфомы, остеосаркомы, рака яичника, рака почки, рака головы и шеи, опухоли мягких тканей и рака яичек.

Хотя настоящее изобретение в настоящем документе описано подробно и относительно его конкретных вариантов осуществления, следует понимать, что вышеуказанное описание является по своему характеру иллюстративным и пояснительным и предназначено для иллюстрации настоящего изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления. Путем рутинных экспериментов, специалист в данной области легко поймет, что в изобретении можно производить различные изменения и модификации в пределах существа и объема настоящего изобретения, пределы которых определены прилагаемой формулой изобретения.

Изобретение относится к эпитопным пептидам, полученным из KOC1, со способностью индуцировать цитотоксические T-клетки. Настоящее изобретение дополнительно относится к полинуклеотидам, кодирующим пептиды, антигенпрезентирующим клеткам, презентирующим пептиды, и цитотоксическим T-клеткам, нацеленным на пептиды, а также к способам индуцирования антигенпрезентирующих клеток или ЦТЛ. Настоящее изобретение также относится к композициям и фармацевтическим композициям, содержащим их в качестве активного ингредиента. Дополнительно настоящее изобретение относится к способам лечения и/или профилактики злокачественной опухоли и/или профилактики ее послеоперационного рецидива с использованием пептидов, полинуклеотидов, антигенпрезентирующих клеток, цитотоксических T-клеток или фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Также предлагаются способы индуцирования иммунного ответа против злокачественной опухоли. 12 н. и 7 з.п. ф-лы, 16 ил., 4 табл., 5 пр.

1. Пептид, имеющий способность индуцировать цитотоксическую T-клетку (ЦТЛ), где пептид состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из нижеуказанной группы:

(a) аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32; и

(b) аминокислотной последовательности, в которой одна или более замен, выбранные из нижеуказанной группы, состоящей из (i)-(iv), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32, где

(i) вторая аминокислота с N конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, 28, 30 или 32 замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из треонина, валина, изолейцина, лейцина, фенилаланина и тирозина;

(ii) третья аминокислота с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, 28, 30 или 32 замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лейцина, фенилаланина, тирозина, изолейцина и аланина;

(iii) седьмая аминокислота с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, 28, 30 или 32 замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лейцина, изолейцина, тирозина, валина и фенилаланина; и

(iv) C-концевая аминокислота аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, 28, 30 или 32 замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лизина и аргинина.

2. Пептид по п. 1, где пептид состоит из аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из нижеизложенных от (i) до (iv), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32, где

(i) вторая аминокислота с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, 28, 30 или 32 замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из треонина, валина, изолейцина, лейцина, фенилаланина и тирозина;

(ii) третья аминокислота с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, 28, 30 или 32 замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лейцина, фенилаланина, тирозина, изолейцина и аланина;

(iii) седьмая аминокислота с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, 28, 30 или 32 замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лейцина, изолейцина, тирозина, валина и фенилаланина; и

(iv) C-концевая аминокислота аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, 28, 30 или 32 замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лизина и аргинина.

3. Пептид по п. 1, который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 28, 30 и 32.

4. Полинуклеотид, который кодирует пептид по любому из пп. 1-3.

5. Композиция для индуцирования иммунного ответа против злокачественной опухоли, экспрессирующей KOC1, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и 0,001 мг-1000 мг одного или несколько типов пептидов по любому из пп. 1-3.

6. Композиция для индуцирования цитотоксической(их) T-клетки(ок), содержащая фармацевтически приемлемый носитель и 0,001 мг-1000 мг одного или несколько типов пептидов по любому из пп. 1-3.

7. Композиция по п. 5, которая является фармацевтической композицией.

8. Композиция по п. 7, которая предназначена для одного или нескольких применений, выбранных из группы, состоящей из (i) лечения злокачественных опухолей, (ii) предупреждения (профилактики) злокачественной опухоли и (iii) предупреждения (профилактики) послеоперационного рецидива злокачественной опухоли.

9. Композиция по п. 7, которая предназначена для индуцирования иммунного ответа против злокачественной опухоли.

10. Композиция по п. 8 или 9, где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака шейки матки, холангиоцеллюлярного рака, хронического миелолейкоза (ХМЛ), рака толстого кишечника, рака прямой кишки, рака пищевода, диффузного рака желудка, немелкоклеточного рака легких, мелкоклеточного рака легких, лимфомы, остеосаркомы, рака яичника, рака почки, рака головы и шеи, опухоли мягких тканей и рака яичек.

11. Композиция по любому из пп. 5-10, которую формулируют для введения индивидууму, положительному HLA-A11.

12. Способ индуцирования антигенпрезентирующей(их) клетки(ок) (АПК) со способностью индуцировать цитотоксическую клетку, который включает этап, выбранный из группы, состоящей из:

(a) контакта антигенпрезентирующей(их) клетки(ок) с пептидом по любому из пп. 1-3 in vitro, ex vivo или in vivo; и

(b) введения полинуклеотида, кодирующего пептид по любому из пп. 1-3, в антигенпрезентирующую(ие) клетку(ки).

13. Способ индуцирования цитотоксической(их) клетки(ок), который включает этап, выбранный из группы, состоящей из:

(a) совместного культивирования CD8-положительной T-клетки/клеток с антигенпрезентирующей(ими) клеткой(ами), которая презентирует на своей поверхности комплекс из антигена HLA и пептида по любому из пп. 1-3;

(b) совместного культивирования CD8-положительной T-клетки/клеток с экзосомой/экзосомами, которая презентирует на своей поверхности комплекс из антигена HLA и пептида по любому из пп. 1-3; и

(c) введение в CD8-положительную T-клетку/клетки полинуклеотида, кодирующего каждую субъединицу T-клеточного рецептора (TCR), способного связываться с пептидом по любому из пп. 1-3, презентированным при помощи антигена HLA на клеточной поверхности.

14. Выделенная АПК, которая презентирует на своей поверхности комплекс из антигена HLA и пептида по любому из пп. 1-3, где указанная АПК индуцирована способом по п. 12.

15. Выделенная ЦТЛ, которая нацелена на пептид по любому из пп. 1-3, где указанная ЦТЛ индуцирована способом по п. 13.

16. Способ индуцирования иммунного ответа против злокачественной опухоли, экспрессирующей KOC1, который включает введение индивидууму, по меньшей мере, одного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из нижеизложенных с (a) по (e):

(a) один или несколько типов пептидов по любому из пп. 1-3;

(b) один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. 1-3 в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. 1-3 и антигена HLA;

(d) экзосома, которая презентирует на своей поверхности комплекс из пептида по любому из пп. 1-3 и антигена HLA; и

(e) ЦТЛ, который нацелен на пептид по любому из пп. 1-3.

17. Способ лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, экспрессирующей KOC1, и/или профилактики ее послеоперационного рецидива, который включает введение индивидууму, по меньшей мере, одного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из нижеизложенных с (a) по (e):

(a) один или несколько типов пептидов по любому из пп. 1-3;

(b) один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. 1-3 в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. 1-3 и антигена HLA;

(d) экзосома, которая презентирует на своей поверхности комплекс из пептида по любому из пп. 1-3 и антигена HLA; и

(e) ЦТЛ, который нацелен на пептид по любому из пп. 1-3.

18. Эмульсия для индуцирования иммунного ответа против злокачественной опухоли, экспрессирующей KOC1, содержащая 0,001 мг-1000мг одного или несколько типов пептидов по любому из пп. 1-3, водорастворимый носитель и масляный адъювант.

19. Набор для индуцирования иммунного ответа против злокачественной опухоли, экспрессирующей KOC1, включающий контейнер, который содержит композицию по любому из пп. 5-11, и контейнер, который содержит адъювант.