ПРОИЗВОДНЫЕ ФЕНИЛ ФОРМАМИДИНА, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИМИКОБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2019 года по МПК A61K31/06 A61P31/06 

Производные фенил формамидина, обладающие антимикобактериальной активностью

Область техники

Данное изобретение относится к химии органических соединений, фармакологии, медицине, ветеринарии и касается профилактики и терапии заболеваний, вызванных микобактериальными инфекциями, в частности, туберкулеза, с помощью нового класса соединений.

Уровень техники

В настоящее время туберкулез (ТБ) является основной инфекционной причиной смерти в мире [1]. Большая часть смертельных исходов связана с высокой чувствительностью ВИЧ-инфицированных пациентов к ТБ, при наличии двойной инфекции ВИЧ/ТБ смертельный исход зафиксирован в четверти случаев.

Лечение микобактериальных инфекций затруднено. Это обусловлено такими особенностями патогена, как низкая скорость роста возбудителей, способность к переходу в покоящееся состояние, наличие высокогидрофобной клеточной поверхности Mycobacterium tuberculosis, которая служит своего рода физическим барьером, внутриклеточная локализация патогенов, высокая концентрация клеток M.  tuberculosis в пораженном органе. В настоящее время основным методом терапии больных ТБ является комплексная химиотерапия антимикробными препаратами, направленная на подавление размножения микобактерий ТБ или глубокое повреждение функции микробной клетки, приводящее к ее гибели. Существующие противотуберкулезные препараты обладают различной эффективностью, токсичностью и различаются механизмами действия, однако каждый обладает серьезными побочными действиями (гепатотоксичность, нефротоксичность, ототоксичность и т.д.).

Положение обостряется в связи с тем, что появление и распространение новых лекарственных препаратов через некоторое время регулярно сопровождается последовательным возникновением устойчивых к ним форм микобактерий; новая устойчивость часто “наслаивается” на предыдущую, в результате приобретая множественный характер. Достаточно часто осуществляется заражение de novo штаммами, которые уже приобрели множественную лекарственную устойчивость. В связи с этим, возникновение лекарственно устойчивых штаммов M. tuberculosis, включая множественную (MDR - multiple drug resistance), экстенсивную (XDR – extensive drug resistance) и абсолютную (TDR – total drug resistance) формы резистентности, обусловливает сохранение высоких показателей заболеваемости и смертности от ТБ в мире, несмотря на значительные усилия по борьбе с данным заболеванием.

Становится очевидным, что одной из важнейших задач в борьбе с ТБ и другими заболеваниями, ассоциированными с микобактерильными инфекциями, является разработка лекарственных препаратов нового поколения для лечения микобактериальных инфекций.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является разработка и создание новых противоинфекционных средств, обладающих антимикобактериальной активностью, перспективных для применения в клинической практике для лечения туберкулеза и других заболеваний, ассоциированных с микобактериальными инфекциями.

Техническим результатом изобретения является разработка и получение новых химических соединений, обладающих повышенной активностью и эффективностью в ингибировании микобактерий, в частности Mycobacterium tuberculosis, в том числе резистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis. Соединения по изобретению перспективны для применения в терапии заболеваний, ассоциированной с микобактериальной инфекцией, в частности в терапии туберкулеза, в том числе резистентных форм туберкулеза.

Указанный технический результат достигается посредством разработки и создания соединений общей формулы I и/или общей формулы II:

или их Z-стереоизомера, фармацевтически приемлемой соли, сольвата и/или гидрата, где:

R выбирается независимо и представляет собой C_4-14-метилразветвленный алкил, частично или полностью галогенированный C_4-14-метилразветвленный алкил, C_4-14-метилразветвленный алкенил, частично или полностью галогенированный C_4-14-метилразветвленный алкенил, причем заместитель R расположен в пара- или мета-положении относительно атома азота гидроксиформимидамидинового фрагмента;

R' выбирается независимо и представляет собой C_4-14-метилразветвленный алкил, частично или полностью галогенированный C_4-14-метилразветвленный алкил, C_4-14-метилразветвленный алкенил или частично или полностью галогенированный C_4-14-метилразветвленный алкенил, причем заместитель R' расположен в пара- или мета-положении относительно атома азота гидроксиформимидамидинового фрагмента.

Отдельный подкласс соединений, представляющих интерес, включает соединения по изобретению, выбранные из группы:

N'-гидрокси-N-(4-изопентил-2-метилфенил)формимидамид;

N'-гидрокси-N-(4-изогексил-2-метилфенил)формимидамид;

N'-гидрокси-N-(4-изогептил-2-метилфенил)формимидамид.

Данное изобретение также относится к применению соединений по изобретению для лечения и/или предотвращения инфекционного заболевания у субъекта, вызванного микобактериальной инфекцией.

В частных вариантах воплощения изобретения инфекционное заболевание вызвано Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium marinum, Mycobactérium kansasii, Mycobacterium avium или другими видами микроорганизмов, входящих в Микобактериальный туберкулёзный комплекс (Mycobacterium tuberculosis complex) или Mycobacterium avium комплекс (Mycobacterium avium сomplex).

В частных вариантах воплощения изобретения заболевание представляет собой туберкулез.

В некоторых частных вариантах воплощения изобретения туберкулез имеет резистентную форму.

В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой млекопитающее или птицу. В частных вариантах воплощения изобретения млекопитающее представляет собой человека.

Данное изобретение также относится к применению соединений по изобретению для получение фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения инфекционного заболевания, вызванного микобактериальной инфекцией.

Кроме того, изобретение предусматривает фармацевтические композиции для лечения и/или предотвращения инфекционного заболевания, вызванного микобактериальной инфекцией, включающие эффективное количество, по меньшей мере, одного соединение по изобретению и, по меньшей мере, одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В частных вариантах воплощения изобретения инфекционное заболевание вызвано Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium marinum, Mycobactérium kansasii, Mycobacterium avium или другими видами микроорганизмов, входящих в Микобактериальный туберкулёзный комплекс (Mycobacterium tuberculosis complex) или Mycobacterium avium комплекс (Mycobacterium avium сomplex). В некоторых частных вариантах воплощения изобретения заболевание представляет собой туберкулез. В некоторых других частных вариантах воплощения изобретения туберкулез имеет резистентную к лекарствам форму.

В частных вариантах воплощения изобретения фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество представляет собой носитель, наполнитель и/или растворитель.

В частных вариантах воплощения изобретения фармацевтическая композиция характеризуется тем, что обладает бактериостатическим действием.

В частных вариантах воплощения изобретения фармацевтическая композиция, характеризуется тем, что обладает бактерицидным действием.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения и/или профилактики инфекционных заболеваний, включающему введение (в качестве монотерапии или в комбинации с одним или несколькими агентами) терапевтически эффективного количества соединения, являющегося предметом изобретения, в организм человека или животного, нуждающегося в лечении и/или профилактике таких заболеваний. «Введение» в организм соединения настоящего изобретения включает доставку к реципиенту соединения, описанного в настоящем изобретении, пролекарства, или другого фармакологически приемлемого производного такого соединения, используя любые допустимые препараты или пути введения в организм, хорошо известные специалистам.

Изобретение также включает получение соединений общей формулы I и общей формулы II.

Определения (термины)

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения.

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Термин «алкил» в настоящем документе относится к разветвленным алкилам, а именно к метил-разветвленным алкильным группам, например, 3-метилбутил, 3-метилпентил, 3-метилгексил и т.д, предпочтительно 3-метилбутил и 3,6-диметилгептил. Кроме того, «алкил» может быть как замещенным, так и незамещенным. Термин «алкил» в настоящем документе также относится к группам, обычно имеющим от четырех до четырнадцати атомов углерода. Например, термин –C_4-14-алкил означает, изобутил изопентил, изогексил, изогептил и т.д. Аналогичные условности применяются и к другому общему термину, такому как «алкенил», где положение одной или нескольких двойных связей определяется у любого атома углерода C_4-14, предпочтительно 3-метилбут-1-енил, 3,6-диметилгепт-2-енил, 3,6-диметилгепт-2,5-диенил.

Термин «частично или полностью галогенированный алкил» включает разветвленные насыщенные углеводородные цепи, в которых один или несколько атомов водорода замещены на галоген. Примеры галогеналкильных групп включают, но не ограничиваются, следующие группы: 3-метил-4,4,4-трифторбутил, 5,5,5-трифтор-4-(трифторметил)пентил, 4,4,4-трифтор-3-(трифторметил)бутил и т.п.

Термин «галоген» сам по себе или в части другого термина относится к атому фтора, хлора, брома или йода.

Термин «сольват» относится к ассоциации или комплексу из одной или нескольких молекул растворителя и соединения по изобретению. Примеры растворителей, образующих сольваты, включают, но ими не ограничиваются, воду, изопропанол, этанол, метанол, ДМСО, этилацетат, уксусную кислоту и этаноламин.

Термин «гидрат» относится к комплексу, где молекулой растворителя является вода.

Соединения настоящего изобретения могут существовать в свободной форме или, если требуется, в виде фармацевтически приемлемой соли или другого производного. Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к таким солям, которые, в рамках проведенного медицинского заключения, пригодны для использования в контакте с тканями человека и животных без излишней токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.д., и отвечают разумному соотношению пользы и риска. Фармацевтически приемлемые соли аминов, карбоновых кислот, фосфонатов и другие типы соединений хорошо известны в медицине. Соли могут быть получены in situ в процессе выделения или очистки соединений изобретения, а также могут быть получены отдельно, путем взаимодействия свободного основания соединения изобретения с подходящей кислотой. Примером фармацевтически приемлемых, нетоксичных солей кислот могут служить соли аминогруппы, образованные неорганическими кислотами, такими как соляная, бромоводородная, фосфорная и серная кислоты, или органическими кислотами, такими как уксусная, щавелевая, малеиновая, винная, янтарная или малоновая кислоты, или полученные другими методами, используемыми в данной области, например, с помощью ионного обмена. К другим фармацевтически приемлемым солям относятся адипинат, альгинат, аскорбат, аспартат, бензолсульфонат, бензоат, бисульфат, борат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, цитрат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, формиат, фумарат, глюкогептонат, глицерофосфат, глюконат, гемисульфат, гептанат, гексанат, гидройодид, 2-гидрокси-этансульфонат, лактобионат, лактат, лаурат, лаурил сульфат, малат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, стеарат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, п-толуолсульфонат, ундеканат, валериат и подобные.

Термин «пациент» охватывает все виды млекопитающих, предпочтительно человека, а также термин включает птиц.

Термины «лечение», «терапия» охватывают лечение патологических состояний у млекопитающих, предпочтительно у человека, и включают: а) блокирование (приостановку) течения заболевания, б) облегчение тяжести заболевания, т.е. индукцию регрессии заболевания.

Термин «профилактика», «предотвращение», «превентивная терапия» охватывает устранение факторов риска, а также профилактическое лечение субклинических стадий заболевания у человека, направленное на уменьшение вероятности возникновения клинических стадий заболевания. Пациенты для профилактической терапии отбираются на основе факторов, которые, на основании известных данных, влекут увеличение риска возникновения клинических стадий заболевания по сравнению с общим населением. К профилактической терапии относится а) первичная профилактика и б) вторичная профилактика. Первичная профилактика определяется как профилактическое лечение у пациентов, клиническая стадия заболевания у которых ещё не наступила. Вторичная профилактика - это предотвращение повторного наступления того же или близкого клинического состояния заболевания.

Термин «уменьшение риска» охватывает терапию, которая снижает частоту возникновения клинической стадии заболевания. Примерами уменьшения риска заболевания является первичная и вторичная профилактика заболевания.

Способ терапевтического применения соединений

Предмет данного изобретения также относится к способу лечения и/или предотвращения заболеваний, вызванных микобактериальной инфекцией, включающему введение пациенту соединения по изобретению. В частности, к способу лечения и/или предотвращения заболеваний, вызванных Mycobacterium tuberculosis.

В предпочтительных случаях, предмет данного изобретения относится к способу лечения и/или предотвращения туберкулеза, в том числе резистентных форм туберкулеза.

Предмет данного изобретения также включает введение субъекту, нуждающемуся в соответствующем лечении, терапевтически эффективного количества соединения общей формулы (I) и/или общей формулы (II). Под терапевтически эффективным количеством подразумевается количество одного или нескольких описанных соединений, вводимого или доставляемого пациенту, при котором у пациента с наибольшей вероятностью проявится желаемая реакция на лечение (профилактику). Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от возраста, массы тела и общего состояния пациента, тяжести заболевания, методики введения препарата, комбинированного лечения с другими препаратами и т.п.

Вещество, или фармацевтическая композиция, содержащая вещество, может быть введена в организм пациента в любом количестве и любым путем введения, эффективным для лечения или профилактики заболевания.

После смешения лекарственного препарата с конкретным подходящим фармацевтически допустимым носителем в желаемой дозировке, композиции, составляющие суть изобретения, могут быть введены в организм человека или других животных перорально, парентерально, местно и т.п. Введение может осуществляться как разово, так и несколько раз в день, неделю (или любой другой временной интервал), или время от времени. Кроме того, соединение может вводиться в организм пациента ежедневно в течение определенного периода дней, а затем следует период без приема вещества.

В том случае, когда соединение данного изобретения используется как часть режима комбинированной терапии, доза каждого из компонентов комбинированной терапии вводится в течение требуемого периода лечения. Соединения, составляющие комбинированную терапию, могут вводиться в организм пациента как единовременно, в виде дозировки, содержащей все компоненты, так и в виде индивидуальных дозировок компонентов.

Фармацевтические композиции

Изобретение также относится с фармацевтическим композициям, которые содержат, по меньшей мере, одно из описанных здесь соединений (или пролекарственную форму, фармацевтически приемлемую соль или другое фармацевтически приемлемое производное) и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, адъювантов, растворителей и/или наполнителей, таких, которые могут быть введены в организм пациента совместно с соединением, составляющем суть данного изобретения, и которые не разрушают фармакологической активности этого соединения, и являются нетоксичным при введении в дозах, достаточных для доставки терапевтического количества соединения.

Фармацевтические композиции, заявляемые в данном изобретении, содержат соединения данного изобретения совместно с фармацевтически приемлемыми носителями, которые могут включать в себя любые растворители, разбавители, дисперсии или суспензии, поверхностно-активные вещества, изотонические агенты, загустители и эмульгаторы, консерванты, вяжущие вещества, смазочные материалы и т.д., подходящие для конкретной формы дозирования. Материалы, которые могут служить фармацевтически приемлемыми носителями, включают, но не ограничиваются, моно- и олигосахариды, а также их производные; желатин; тальк; эксципиенты, такие как какао-масло и воск для суппозиториев; масла, такие как арахисовое, хлопковое, сафроловое, кунжутное, оливковое, кукурузное и соевое масло; гликоли, такие как пропиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; буферные вещества, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновая кислота; апирогенная вода; изотонический раствор, раствор Рингера; этиловый спирт и фосфатные буферные растворы. Также в составе композиции могут быть другие нетоксичные совместимые смазочные вещества, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красители, разделительные жидкости, пленкообразователи, подсластители, вкусовые добавки и ароматизаторы, консерванты и антиоксиданты.

Предметом данного изобретения являются также лекарственные формы - класс фармацевтических композиций, состав которых оптимизирован для определённого пути введения в организм в терапевтически эффективной дозе, например, для введения в организм орально, местно, пульмональным, например, в виде ингаляционного спрея, или внутрисосудистым способом, интраназально, подкожно, внутримышечно, а также инфузионным способом, в рекомендованных дозировках.

Лекарственная форма данного изобретения может содержать соединение описанной здесь формулы или его фармацевтически приемлемую соль, и дополнительный препарат, например, выбранный из числа следующих: противоопухолевый препарат, противовирусный препарат, противовоспалительный препарат, и любой фармацевтически приемлемый носитель, адъювант или растворитель. Лекарственные формы данного изобретения могут содержать составы, полученные методами использования липосом или микрокапсуляционные методы, методами приготовления наноформ препарата, и прочие примеры, известные в фармацевтике.

При получении композиции, например, в форме таблетки активное начало смешивают с одним или несколькими фармацевтическими эксципиентами, такими как желатин, крахмал, лактоза, стеарат магния, тальк, кремнезем, аравийская камедь, маннит, микрокристаллическая целлюлоза, гипромеллоза или аналогичные соединения.

Таблетки можно покрыть сахарозой, целлюлозным производным или другими веществами, подходящими для нанесения оболочки. Таблетки могут быть получены различными способами, такими как непосредственное сжатие, сухое или влажное гранулирование или горячее сплавление в горячем состоянии.

Фармацевтическую композицию в форме желатиновой капсулы можно получить, смешивая активное начало с растворителем и заполняя полученной смесью мягкие или твердые капсулы.

Подробное раскрытие изобретения

Обзор методов получения соединений изобретения

Соединения, являющиеся предметом настоящего изобретения, могут быть получены с использованием описанных ниже синтетических методов. Перечисленные методы не являются исчерпывающими и допускают введение разумных модификаций. Указанные реакции должны проводиться с использованием подходящих растворителей и материалов. При реализации данных общих методик для синтеза конкретных веществ необходимо учитывать присутствующие в веществах функциональные группы и их влияние на протекание реакции. Для получения некоторых веществ необходимо изменить порядок стадий либо отдать предпочтение одной из нескольких альтернативных схем синтеза. Следует понимать, что эти и все приведенные в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.

Получение соединений по изобретению

На схеме 1 представлено получение соединений по изобретению.

Схема 1. Общая схема получения производных N-гидрокси-N'-(фенил)-формамидина.

Получение соединения (E)-N'-гидрокси-N-(4-изопентил-2-метилфенил)формимидамида

Схема 2. Общая схема получения соединения (E)-N'-гидрокси-N-(4-изопентил-2-метилфенил)формимидамида

Стадия получения 2-метил-4-(3-метилбут-1-енил)-нитробензола (2)

В трехгорлую круглодонную колбу, снабженную магнитной мешалкой, термометром и капельной воронкой помещают 250 мл толуола и 39 г изобутилтрифенилфосфоний бромида. В капельную воронку помещают раствор 11 г трет-бутоксида калия в 60 мл тетрагидрофурана и добавляют в колбу при перемешивании в течение 15 мин, после добавления раствор перемешивают 2 ч и охлаждают до -40°С. Затем добавляют раствор 13 г нитробензальдегида (соединение 1) в 50 мл толуола при перемешивании, поддерживая температуру минус 40°С. После добавления альдегида охлаждение убирают и смесь перемешивают при комнатной температуре 3 ч. Затем добавляют 100 мл насыщенного раствора хлористого аммония, органический слой отделяют, промывают 100 мл воды, высушивают и упаривают. Остаток очищают на колонке с силикагелем и получают 15 г нитроолефина (соединение 2; 93%).

Стадия получения 4-изопентил-2-метиланилина (3)

В круглодонную колбу, снабженную магнитной мешалкой помещают 150 мл метанола, 15 г олефина (соединение 2) и 1,5 г 10% палладия на активированном угле. Смесь перемешивают при 1 атм водорода 36 ч, после чего катализатор отфильтровывают. Фильтраты упаривают, остаток очищают на колонке с силикагелем и получают 11,4 г амина (соединение 3; 88%).

Стадия получения N'-(4-изопентил-2-метилфенил)-N,N-диметилформимидамида (4)

В круглодонную колбу, снабженную обратным холодильником и магнитной мешалкой, помещают 60 мл сухого толуола, 11,4 г амина (соединение 3) и 10,3 мл диметилацеталя диметилформамида. Смесь кипятят 4 ч, охлаждают, растворитель упаривают и получают 11,4 г N,N-диметилформимидамида (соединение 4), который используют в следующей стадии без дальнейшей очистки.

Стадия получения (E)-N'-гидрокси-N-(4-изопентил-2-метилфенил)формимидамида

В круглодонную колбу, снабженную магнитной мешалкой, помещают 500 мл метанола; 11,4 г N,N-диметилформимидамида (соединение 4) и 5,33 г гидрохлорида гидроксиламина. Смесь перемешивают при комнатной температуре 2 ч, затем растворитель упаривают. Остаток разбавляют 100 мл диэтилового эфира и осадок отфильтровывают. Фильтрат промывают водой, высушивают и растворитель упаривают. Остаток разбавляют петролейным эфиром, образовавшиеся кристаллы отфильтровывают и получают 10,3 г гидроксиформимидамида (соединение 5; 73% в расчете на соединение 5).

Спектры ЯМР ¹Н и ¹³С для соединения 5 зарегистрированы на спектрометре AVANCE 500 с рабочей частотой 500 и 125 MГц для ядер ¹Н и ¹³С, соответственно, при температуре образца 293 K для растворов в CDCl₃. В качестве внутреннего стандарта использовался остаточный сигнал растворителя δ CDCl₃ - 7.26 м.д. (¹Н), 77.16 м.д. (¹³С):

¹H ЯМР (500 MГц, CDCl₃) δ: 7.36 (1H CHN), 7.08 – 6.96 (3H, H-3, H-5, NH), 6.93 (J = 8.5 Гц, 1H, H-6), 6.43 (1H, OH), 2.54 (2H, H-1'), 2.26 (3H, H-3), 1.58 (1H, H-3'), 1.47 (2H, H-2'), 0.93 (J = 6.5 Гц, 6H, H-4').

¹³C ЯМР (125 MHz, CDCl₃) δ 140.90 (CN), 137.83 (C-1), 135.43 (C-4), 131.24 (C-3), 127.13 (C-5), 125.81 (C-2), 115.23 (C-6), 41.13 (C-2'), 33.11 (C-1'), 27.80 (C-3'), 22.67 (C-4'), 17.47 (С-2).

Характеристика биологической активности соединений

Для соединений, являющихся предметом настоящего изобретения, была изучена их эффективность в качестве соединений, обладающих антимикобактериальной активностью. Исследования были проведены, в частности, в отношении соединения N'-гидрокси-N-(4-изопентил-2-метилфенил)формимидамида с химической формулой:

Оценка влияния соединений по изобретению на типичные и cell wall deficient (CWD) микобактерии туберкулеза.

Оценка влияния соединений по изобретению на типичный штамм M.tuberculosis и cell wall deficient (CWD) штамм M.tuberculosis проводилась в соответствии с рекомендациями по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза. Штамм M.tuberculosis H37Rv, выращенный на среде Левенштейна-Иенсена (2-х недельный рост). Сell wall deficient (CWD) штамм M.tuberculosis, выращенный на среде Myccell DW.

Бактериальную массу снимали в стерильную ступку и гомогенизировали в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия. Суспензию шприцем переносили в стерильную пробирку и отстаивали 15 мин для осаждения конгломератов клеток. Надосадочную жидкость (2-3 мл) шприцем переносили в специальную стерильную пробирку и, используя стандарт мутности (5 единиц), выравнивали концентрацию клеток до стандарта (Стандартный образец мутности ГИИСК им Тарасевича ОСО 42-28-10). 1,5 мл суспензии разводили в 13,5 мл изотонического раствора (разведение 1:10).

0,22 мл полученной суспензии микобактерий добавляли в стерильные эппендорфы К1 (контроль - 0,9%-й водный раствор хлорида натрия) и K2 (контроль 0,9%-й водный раствор хлорида натрия с 1% ДМСО). К отобранному объему суспензии в эппендорф К 1 добавляли 0,22 мл 0,9%-й водного раствора хлорида натрия, а в эппендорф К2 добавляли 0,2 мл 0,9%-й водного раствора хлорида натрия с ДМСО (так, чтобы конечная концентрация ДМСО была 1%). Для опытных образцов из суспензии в стерильные эппендорфы отбирали по 0,12 мл. К отобранному объему добавляли по 0,12 мл раствора N'-гидрокси-N-(4-изопентил-2-метилфенил)формимидамида, чтобы конечная концентрация соединения была 25 мкг/мл. Смеси инкубировали 12 ч при 37°С, затем смесь суспендировали на вортексе и высевали по 0,2 мл на среду Левенштейна-Иенсена (для штамма M.tuberculosis H37Rv) или на среду Myccell DW (для cell wall deficient (CWD) штамма M.tuberculosis) в 10 мл стеклянные пробирки. Пробирки выдерживали 4 суток в горизонтальном положении при 37°С, далее перемещали в штатив и инкубировали в вертикальном состоянии до 21 дня при 37°С. Оценка роста микобактерий проводилась визуально по покрытию поверхности среды колониями микобактерий.

Использование N'-гидрокси-N-(4-изопентил-2-метилфенил)формимидамида в концентрации 25 мкг/мл приводит к полной задержке роста как H37Rv штамма M.tuberculosis, так и cell wall deficient (CWD) штамма M.tuberculosis. В контрольных пробирках (K1 и K2) наблюдался сплошной рост микобактерий.

Определение MIC_100% (100% минимальная ингибирующая концентрация) соединений по изобретению.

Определение MIC_100% (100% минимальная ингибирующая концентрация) соединений по изобретению проводилось в соответствии с ранее разработанной и применяемой методикой [2].

В лунки 96-луночного плашки вносили суспензию M.tuberculosis штамм H37Rv в бульоне Дюбо [500 (пятьсот) H37Rv/180 мкл/лунку], суспензию M.avium в бульоне Дюбо [500 (пятьсот) M.avium/180 мкл/лунку] или суспензию M.tuberculosis штамм CN-40 [250 (двести пятьдесят) CN-40/180 мкл/лунку].

Плашки инкубировали в CO₂-инкубаторе 24 часа после чего в лунки добавляли по 20 мкл различных концентраций N'-гидрокси-N-(4-изопентил-2-метилфенил)формимидамида или 20 мкл бульона Дюбо (контроль) и инкубировали в течение 12-14 дней.

За MIC_100% принимали минимальную концентрацию тестируемого вещества, которая к 12-14 дню инкубации полностью подавляет рост микобактерий, что проявляется в отсутствии видимого осадка микобактерий на дне лунки.

Таким образом, исследовано ингибирование или оптимальное блокирование роста эталонного штамма и резистентных штаммов M.tuberculosis (in vitro тестирование с использованием определенных штаммов) посредством использования соединений по изобретению. В результате проведенного исследования установлено, что MIC_100% как против штамма H37Rv M.tuberculosis, так и против штамма CN-40 M.tuberculosis (изониазид-резистентного штамма) лежит в диапазоне 7,1÷9,5 мкг/мл. MIC_100% против Mycobacterium avium в диапазоне 9,5÷12,7 мкг/мл.

Оценка клеточной токсичности соединений

Оценка клеточной токсичности соединений проводилось в соответствии с существующими стандартными протоколами [3,4].

MTT-тест проводился, в частности, с N'-гидрокси-N-(4-изопентил-2-метилфенил)формимидамида при концентрациях от 1 до 50 мкМ на культуре клеток HEK293T. Через день после рассева, клетки инкубировали с соединениями по изобретению 1 сутки. Далее спектрофотометрически определяли способность клеток восстанавливать МТТ. На основании полученных данных выявляли характер зависимости между концентрацией ингибитора и метаболической активностью клеток.

Методика:

1) Клетки HEK 293T рассеваются в 96-луночный планшет в концентрации 100 000 клеток/мл, по 100 мкл в лунку.

2) Спустя 24 часа, после прикрепления клеток, в среду добавляется исследуемое вещество. Концентрации вещества: 50, 35, 20 и 5 мкM в 2-х повторностях. При этом оставляются лунки для контрольных образцов:

a. Лунки без клеток, проходящие все стадии эксперимента (Blank);

b. Лунки с клетками, проходящие все стадии эксперимента. Вместо исследуемого вещества добавляется растворитель (DMSO).

3) После инкубации с исследуемым веществом, удаляют среду из лунок. Добавляют 90 мкл PBS + 10 мкл МТТ (5 мг/мл). Культуральный планшет возвращают в СО₂-инкубатор на 2 часа.

4) Удаляют 80 мкл PBS с МТТ. Добавляют 100 мкл DMSO для растворения кристаллов формазана.

5) Производят считывание оптического поглощения при 570 нм.

В результате оценки цитотоксичности на клеточных культурах (МТТ – тест на HEK293 клетках) было установлено, что соединения по изобретению не проявляют токсичности, в частности, N'-гидрокси-N-(4-изопентил-2-метилфенил)формимидамид не проявляет токсичности при концентрации 50 мкМ.

Оценка действия соединений на фагоцитированные легочными макрофаги штамм M.tuberculosis H37Rv

Оценка действия соединений по изобретению, в частности N'-гидрокси-N-(4-изопентил-2-метилфенил)формимидамида, на фагоцитированные легочными макрофагами (Mph) M.tuberculosis штамм H37Rv (по включению микобактериями 3Н-урацила) проводилась в соответствии с методикой [5]. Эксперименты проводились в трех повторах.

Содержание включенного микобактериями 3Н-урацила выраженная в CPM (counts per minute) (mean±SD):

Mph+ H37Rv (контроль, без соединения по изобретению): 76263±5011;

H37Rv (контроль на включение урацила внеклеточными H37Rv): 1561±211;

Mph+ H37Rv + соединение (40 мкг/мл.): 15188±1603;

Mph+ H37Rv +соединение (10 мкг/мл.): 19574±2894;

Mph+ H37Rv +соединение (2,5 мкг/мл.): 57348±6451.

Полученные результаты исследований свидетельствуют об эффективном ингибировании роста микобактерий в легочных макрофагах с использованием соединений по изобретению и, в частности с использованием N'-гидрокси-N-(4-изопентил-2-метилфенил)формимидамида.

Таким образом, в результате проведенных исследований было неожиданно обнаружено, что соединения по изобретению общей формулы (I) и общей формулы (II) характеризуются высокой антимикобактериальной активностью, в частности, в отношении M.tuberculosis, и являются перспективными для применения в терапии различных инфекционных заболеваний, вызванных (ассоциированных) микобактериальными инфекциями, в том числе туберкулеза и его резистентных форм.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Список литературы, которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылок:

1. Global tuberculosis report 2016. (2016) World Health Organization, 21st edition, P1-214.

2. In Vitro Activity of 3-Triazeneindoles against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Nikonenko BV, Kornienko A, Majorov K, Ivanov P, Kondratieva T, Korotetskaya M, Apt AS, Salina E, Velezheva V. Antimicrob Agents Chemother. 2016 Sep 23;60(10):6422-6424. PMID: 27503657.

3. MTT Cell Proliferation Assay Instruction Manual (ATCC Kit #30-1010K).

4. Cell sensitivity assays: the MTT assay. van Meerloo J, Kaspers GJ, Cloos J. Methods Mol Biol. 2011;731:P.237-245.

5. Lyadova I, Yeremeev V, Majorov K, Nikonenko B, Khaidukov S, Kondratieva T, Kobets N, Apt A. An ex vivo study of T lymphocytes recovered from the lungs of I/St mice infected with and susceptible to Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun. 1998; 66(10):4981-8.

Группа изобретений относится к области медицины и предназначена для профилактики и лечения инфекционных заболеваний, вызванных микобактериальными инфекциями. Одним воплощением является соединение N'-гидрокси-N-(4-изопентил-2-метилфенил)формимидамид, характеризующееся следующей структурной формулой:

Другими воплощениями являются применение указанного соединения для лечения и/или предотвращения инфекционного заболевания у субъекта, вызванного микобактериальной инфекцией, и применение указанного соединения для получения фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения инфекционного заболевания, вызванного микобактериальной инфекцией. Также, обеспечивается фармацевтическая композиция для лечения и/или предотвращения инфекционного заболевания, вызванного микобактериальной инфекцией, включающая эффективное количество указанного соединения и, по меньшей мере, одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Использование группы изобретений позволяет повысить эффективность профилактики и лечения заболеваний, ассоциированных с микобактериальной инфекцией, в частности туберкулеза. 4 н. и 11 з.п. ф-лы.

1. Соединение N'-гидрокси-N-(4-изопентил-2-метилфенил)формимидамид, характеризующееся следующей структурной формулой:

.

2. Применение соединения по п. 1 для лечения и/или предотвращения инфекционного заболевания у субъекта, вызванного микобактериальной инфекцией.

3. Применение по п.2, характеризующееся тем, что инфекционное заболевание вызвано Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium marinum, Mycobactérium kansasii или Mycobacterium avium.

4. Применение по п.2, характеризующееся тем, что заболевание представляет собой туберкулез.

5. Применение по п.4, характеризующееся тем, что туберкулез имеет резистентную форму.

6. Применение по п.2, характеризующееся тем, что субъект представляет собой млекопитающее или птицу.

7. Применение по п.6, характеризующееся тем, что млекопитающее представляет собой человека.

8. Применение соединения по п.1 для получения фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения инфекционного заболевания, вызванного микобактериальной инфекцией.

9. Фармацевтическая композиция для лечения и/или предотвращения инфекционного заболевания, вызванного микобактериальной инфекцией, включающая эффективное количество соединения по п.1 и, по меньшей мере, одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

10. Фармацевтическая композиция по п.9, характеризующаяся тем, что инфекционное заболевание вызвано Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium marinum, Mycobactérium kansasii или Mycobacterium avium.

11. Фармацевтическая композиция по п.9, характеризующаяся тем, что заболевание представляет собой туберкулез.

12. Фармацевтическая композиция по п.11, характеризующаяся тем, что туберкулез имеет резистентную форму.

13. Фармацевтическая композиция по п.9, характеризующаяся тем, что фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество представляет собой носитель, наполнитель и/или растворитель.

14. Фармацевтическая композиция по п.9, характеризующаяся тем, что обладает бактерицидным действием.

15. Фармацевтическая композиция по п.9, характеризующаяся тем, что обладает бактериостатическим действием.