ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 62/561843, поданной 22 сентября 2017 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
ПРЕДСТАВЛЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ТЕКСТОВОМ ФАЙЛЕ ASCII
Содержание нижеследующего представленного текстового файла ASCII включено в данный документ с помощью ссылки во всей своей полноте: машиночитаемая форма (CRF) перечня последовательностей (название файла: 159792014740SeqList.txt, дата составления: 20 сентября 2018 года, размер:19 KB).
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к вариантам молекул для RNAi. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к варианту средства для RNAi для лечения болезни Хантингтона.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Было показано, что РНК-интерференция (RNAi) является полезным инструментом для сайленсинга генов в рамках фундаментального исследования функции генов и обладает большим потенциалом в качестве терапевтического средства для подавления генов, связанных с развитием ряда заболеваний. В природе регуляция генов с помощью RNAi происходит посредством малых молекул РНК, известных как микроРНК (miRNA) (Ambros, (2004) Nature 431:350-355; Krol et al., (2010) Nat. Rev. Genet. 11:597-610). МикроРНК, как оказалось, являются эффективными регуляторами различных процессов в клетке, и при доставке с помощью вирусных векторов искусственные miRNA непрерывно экспрессируются, что приводит к устойчивому и длительному подавлению целевых генов. Разъяснение механизмов, вовлеченных в процессинг miRNA, позволило ученым использовать эндогенный клеточный аппарат RNAi и управлять расщеплением продукта целевого гена с применением искусственных miRNA (см., например, публикацию заявки на патент США № 2014/0163214 и Davidson et al., (2012) Cell 150:873-875).
Трудностью в клинической разработке средства для RNAi является вероятность нецелевого сайленсинга, при котором затравочная область средства для RNAi (обычно нуклеотиды 1-7 или 1-8) образовывает пары с последовательностями нецелевых мРНК в 3'-нетраслируемой области (UTR), что приводит к дестабилизации транскрипта. Подходы, направленные на снижение нецелевого сайленсинга, включают применение алгоритмов идентификации кандидатных затравочных последовательностей с высокой специфичностью к целевой мРНК с минимальным потенциалом нецелевого воздействия (Boudreau RL et al., (2012) Nucl. Acids Res. 41(1):e9) и размещение внутреннего выпетливания в направляющей области средства для RNAi (Terasawa et al., (2011) Journal of nucleic acids 2011:131579).
Средство для RNAi изучали в качестве терапевтического средства для лечения болезни Хантингтона (HD). HD представляет собой наследственное нейродегенеративное заболевание, возникающее вследствие экспансии CAG-повторов в экзоне 1 гена хантингтина (HTT). Образованное удлинение полиглутаминового тракта в N-концевой области придает токсическую мутацию приобретения функции мутантному белку хантингтину (mHtt). Потенциал подавления экспрессии mHtt в качестве стратегии терапии HD впервые был продемонстрирован в условной мышиной модели данного заболевания (Yamamoto et al., (2000) Cell 101:57-66). При индуцировании у этих мышей экспрессии mHtt проявлялись патологические и поведенческие нарушения. Последующая опосредуемая тетрациклином репрессия трансгена mHtt нивелировала эти аномалии, указывая на то, что снижение уровней mHtt позволяет механизмам белкового клиренса в нейронах нормализовать индуцированные mHtt изменения. Следовательно, терапевтические стратегии, которые уменьшают уровни mHtt могут потенциально останавливать прогрессирование заболевания и облегчать симптомы HD. miRNA, нацеливающиеся на Htt, представлены в WO 2016/130589, включенном в данный документ во всей своей полноте.
Все литературные источники, цитируемые в данном документе, в том числе патентные заявки и публикации, включены с помощью ссылки во всей своей полноте.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает средство для RNAi, содержащее первую нить и вторую нить, где a) первая нить и вторая нить образуют дуплекс; b) первая нить содержит направляющую область, при этом направляющая область содержит последовательность нуклеиновой кислоты 5'-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3' (SEQ ID NO:1) или 5'-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3' (SEQ ID NO:7);, и c) вторая нить содержит область, не являющуюся направляющей. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая направляющая область содержит последовательность нуклеиновой кислоты 5'-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3' (SEQ ID NO:1), и область, не являющаяся направляющей, содержит последовательность 5'- CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3' (SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления первая нить содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся приблизительно 90% идентичностью с SEQ ID NO:1 или приблизительно 90% идентичностью с SEQ ID NO:2. В других вариантах осуществления нуклеиновая направляющая область содержит последовательность нуклеиновой кислоты 5'-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3' (SEQ ID NO:7), и область, не являющаяся направляющей, содержит последовательность 5'-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3' (SEQ ID NO:8). В некоторых вариантах осуществления вторая нить содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся приблизительно 90% идентичностью с SEQ ID NO:7 или приблизительно 90% идентичностью с SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных вариантов осуществления первая нить и вторая нить соединены посредством РНК-линкера, способного образовывать петлевую структуру. В некоторых вариантах осуществления РНК-линкер содержит от 4 до 50 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления петлевая структура содержит от 4 до 20 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит в направлении от 5'- к 3'-концу: вторую нить, РНК-линкер и первую нить. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит в направлении от 5'- к 3'-концу: первую нить, РНК-линкер и вторую нить. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:4 или под SEQ ID NO:10. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит нуклеотидную последовательность, которая на приблизительно 90% идентична нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO:4 или под SEQ ID NO:10. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi представляет собой малую ингибирующую РНК (siRNA) микроРНК (miRNA) или малую шпилечную РНК (shRNA). В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi нацелено на РНК, кодирующую полипептид, связанный с болезнью Хантингтона. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой хантингтин. В некоторых вариантах осуществления хантингтин характеризуется мутацией, связанной с болезнью Хантингтона.
В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных аспектов и вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает экспрессионную конструкцию, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi по любому из пп. 1-16. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая средство для RNAi, предусматривает каркас miRNA. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая средство для RNAi, функционально связана с промотором. В некоторых вариантах осуществления промотор выбран из немедленно-раннего промотора цитомегаловируса (CMV), LTR RSV, LTR MoMLV, промотора гена фосфоглицераткиназы-1 (PGK), промотора вируса обезьян 40 (SV40), промотора CK6, промотора гена транстиретина (TTR), промотора TK, тетрациклин-чувствительного промотора (TRE), промотора HBV, промотора hAAT, LSP-промотора, химерного специфического для печени промотора (LSP), промотора E2F, промотора гена теломеразы (hTERT); составного промотора энхансер цитомегаловируса/промотор гена бета-актина курицы/интрон гена β-глобина кролика (CAG), промотора фактора элонгации 1-альфа (EF1-альфа), промотора гена β-глюкуронидазы человека, промотора гена β-актина курицы (CBA), ретровирусного LTR-промотора вируса саркомы Рауса (RSV), промотора гена дигидрофолатредуктазы и промотора гена 13-актина. В некоторых вариантах осуществления экспрессионная конструкция дополнительно содержит сигнал полиаденилирования. В некоторых вариантах осуществления сигнал полиаденилирования представляет собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста, сигнал полиаденилирования SV40 или pA TK HSV.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает вектор, содержащий экспрессионную конструкцию согласно любым из вариантов осуществления, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), вектор на основе рекомбинантного аденовируса, вектор на основе рекомбинантного лентивируса или вектор на основе рекомбинантного вируса простого герпеса (HSV). В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденовируса. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе рекомбинантного аденовируса получен из аденовируса серотипа 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad крупного рогатого скота типа 3, Ad собачьих типа 2, Ad овцы или Ad свиньи типа 3. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе рекомбинантного аденовируса получен из аденовируса серотипа 2 или варианта аденовируса серотипа 5. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного лентивируса. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе рекомбинантного лентивируса получен из лентивируса, псевдотипированного вирусом везикулярного стоматита (VSV), вирусом лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), вирусом реки Росс (RRV), вирусом Эбола, вирусом Марбург, вирусом Мокола, вирусом бешенства, RD114 или их вариантами. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор на основе rHSV. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе rHSV получен из rHSV-1 или rHSV-2.
В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных аспектов и вариантов осуществления вектор представляет собой вектор на основе rAAV. В некоторых вариантах осуществления экспрессионная конструкция фланкирована одной или несколькими последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR) AAV. В некоторых вариантах осуществления экспрессионная конструкция фланкирована двумя ITR AAV. В некоторых вариантах осуществления ITR AAV представляют собой ITR серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, AAV козы, AAV крупного рогатого скота или AAV мыши. В некоторых вариантах осуществления ITR AAV представляют собой ITR AAV2. В некоторых вариантах осуществления вектор дополнительно содержит спейсерную последовательность нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты расположена выше или ниже нуклеиновой кислоты, кодирующей средство для RNAi. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой самокомплементарный вектор на основе rAAV. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую средство для RNAi, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность, комплементарную последовательности средства для RNAi, где первая последовательность нуклеиновой кислоты может образовывать внутринитевые пары оснований со второй последовательностью нуклеиновой кислоты на протяжении большей части или всей ее длины. В некоторых вариантах осуществления первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая последовательность нуклеиновой кислоты соединены мутантным ITR AAV, где мутантный ITR AAV характеризуется делецией D-области и характеризуется мутацией последовательности концевого разрешения. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает клетку, содержащую любой из векторов (например, векторы на основе rAAV), описанных в данном документе.
В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных аспектов и вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает вирусную частицу, содержащую любой из векторов, описанных в данном документе, где вирусная частица представляет собой частицу AAV с заключенным в капсид вектором на основе rAAV, аденовирусную частицу с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного аденовируса, лентивирусную частицу с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного лентивируса или частицу HSV с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного HSV. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица представляет собой аденовирусную частицу с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного аденовируса. В некоторых вариантах осуществления аденовирусная частица содержит капсид от аденовируса серотипа 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad крупного рогатого скота типа 3, Ad собачьих типа 2, Ad овцы или Ad свиньи типа 3. В некоторых вариантах осуществления аденовирусная частица содержит капсид аденовируса серотипа 2 или капсид варианта аденовируса серотипа 5. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица представляет собой лентивирусную частицу с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного лентивируса. В некоторых вариантах осуществления лентивирусная частица содержит капсид, псевдотипированный вирусом везикулярного стоматита (VSV), вирусом лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), вирусом реки Росс (RRV), вирусом Эбола, вирусом Марбург, вирусом Мокола, вирусом бешенства, RD114 или их вариантами. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица представляет собой частицу HSV. В некоторых вариантах осуществления частица HSV представляет собой частицу rHSV-1 или частицу rHSV-2.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает частицу рекомбинантного AAV, содержащую любой из векторов на основе rAAV, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица AAV содержит капсид AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV козы, химерного AAV1/AAV2, AAV крупного рогатого скота или капсид AAV мыши, капсид rAAV2-HBKO (см. WO 2015/168666, который включен в данный документ посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления ITR и капсид вирусной частицы rAAV получены из одного и того же серотипа AAV. В некоторых вариантах осуществления ITR и капсид вирусной частицы rAAV получены из разных серотипов AAV. В некоторых вариантах осуществления ITR получен из AAV2 и капсид частицы rAAV получен из AAV1. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе rAAV содержит в направлении от 5'- к 3'-концу: ITR AAV2, промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi, сигнал полиаденилирования и ITR AAV2. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой промотор CBA. В некоторых вариантах осуществления сигнал полиаденилирования представляет собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе rAAV содержит в направлении от 5'- к 3'-концу: всю или часть (например, функциональную часть) последовательности ITR AAV2, промотора CBA, интрона (например, химерного интрона), нуклеиновой кислоты, кодирующей средство для RNAi, сигнала полиаденилирования бычьего гормона роста и ITR AAV2. В некоторых вариантах осуществления вектор дополнительно содержит спейсерную последовательность нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты дополнительно предусматривает нуклеиновую кислоту, кодирующую репортерный полипептид (например, зеленый флуоресцентный белок (GFP)). В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты расположена выше или ниже нуклеиновой кислоты, кодирующей средство для RNAi.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию (например, фармацевтическую композицию), содержащую любые из вирусных частиц (например, частицы rAAV), описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.
В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает набор, содержащий любое из средств для RNAi, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления набор содержит любые из вирусных частиц (например, частицы rAAV), описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления набор содержит любые из композиций, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления набор дополнительно содержит инструкции по применению.
В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает способы лечения болезни Хантингтона у млекопитающего, включающие введение млекопитающему средства для RNAi, содержащего первую нить, предусматривающую первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG -3' (SEQ ID NO:1), и вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'- CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA -3' (SEQ ID NO:2), или первую нить, предусматривающую первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA -3' (SEQ ID NO:7), и вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'- UGCUUGUCAACCACACCGACU -3' (SEQ ID NO:8). В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает способы подавления экспрессии htt у млекопитающего с болезнью Хантингтона, включающие введение млекопитающему средства для RNAi, содержащего первую нить, предусматривающую первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'- UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG -3' (SEQ ID NO:1), и вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA -3' (SEQ ID NO:2), или первую нить, предусматривающую первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'- AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA -3' (SEQ ID NO:7), и вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-UGCUUGUCAACCACACCGACU -3' (SEQ ID NO:10).. В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает способы подавления накопления htt в клетке млекопитающего с болезнью Хантингтона, включающие введение млекопитающему средства для RNAi, содержащего первую нить, предусматривающую первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG -3' (SEQ ID NO:1), и вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'- CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA -3' (SEQ ID NO:2), или первую нить, предусматривающую первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'- AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA -3' (SEQ ID NO:7), и вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'- UGCUUGUCAACCACACCGACU -3' (SEQ ID NO:8)..
В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов первая нить содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся приблизительно 90% идентичностью с SEQ ID NO:1 или приблизительно 90% идентичностью с SEQ ID NO:7. В некоторых вариантах осуществления вторая нить содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся приблизительно 90% идентичностью с SEQ ID NO:2 или приблизительно 90% идентичностью с SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления первая нить и вторая нить соединены посредством РНК-линкера, способного образовывать петлевую структуру. В некоторых вариантах осуществления РНК-линкер содержит от 4 до 50 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления петлевая структура содержит от 4 до 20 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит в направлении от 5'- к 3'-концу: вторую нить, РНК-линкер и первую нить. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит в направлении от 5'- к 3'-концу: первую нить, РНК-линкер и вторую нить. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:4 или под SEQ ID NO:10. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит нуклеотидную последовательность, которая на приблизительно 90% идентична нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO:4 или под SEQ ID NO:10.
В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов средство для RNAi кодируется экспрессионной конструкцией. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая средство для RNAi, предусматривает каркас miRNA. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая средство для RNAi, функционально связана с промотором. В некоторых вариантах осуществления промотор способен обеспечивать экспрессию средства для RNAi в головном мозге млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления промотор выбран из немедленно-раннего промотора цитомегаловируса (CMV), LTR RSV, LTR MoMLV, промотора гена фосфоглицераткиназы-1 (PGK), промотора вируса обезьян 40 (SV40), промотора CK6, промотора гена транстиретина (TTR), промотора TK, тетрациклин-чувствительного промотора (TRE), промотора HBV, промотора hAAT, LSP-промотора, химерного специфического для печени промотора (LSP), промотора E2F, промотора гена теломеразы (hTERT); составного промотора энхансер цитомегаловируса/промотор гена бета-актина курицы/интрон гена β-глобина кролика (CAG), промотора фактора элонгации 1-альфа (EF1-альфа) и промотора гена β-глюкуронидазы человека. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой гибридный промотор гена β-актина курицы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота дополнительно содержит всю или часть (например, функциональную часть) последовательности интрона и сигнала полиаденилирования. В некоторых вариантах осуществления сигнал полиаденилирования представляет собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста и интрон представляет собой химерный интрон.
В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов средство для RNAi закодировано в векторе, содержащем экспрессионную конструкцию согласно любому из вариантов осуществления, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), вектор на основе рекомбинантного аденовируса, вектор на основе рекомбинантного лентивируса или вектор на основе рекомбинантного вируса простого герпеса (HSV). В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденовируса. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе рекомбинантного аденовируса получен из аденовируса серотипа 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41 AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad крупного рогатого скота типа 3, Ad собачьих типа 2, Ad овцы или Ad свиньи типа 3. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе рекомбинантного аденовируса получен из аденовируса серотипа 2 или варианта аденовируса серотипа 5. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного лентивируса. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе рекомбинантного лентивируса получен из лентивируса, псевдотипированного вирусом везикулярного стоматита (VSV), вирусом лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), вирусом реки Росс (RRV), вирусом Эбола, вирусом Марбург, вирусом Мокола, вирусом бешенства, RD114 или их вариантами. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор на основе rHSV. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе rHSV получен из rHSV-1 или rHSV-2.
В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов вектор представляет собой вектор на основе rAAV. В некоторых вариантах осуществления экспрессионная конструкция фланкирована одной или несколькими последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR) AAV. В некоторых вариантах осуществления экспрессионная конструкция фланкирована двумя ITR AAV. В некоторых вариантах осуществления ITR AAV представляют собой ITR серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, AAV козы, AAV крупного рогатого скота или AAV мыши. В некоторых вариантах осуществления ITR AAV представляют собой ITR AAV2. В некоторых вариантах осуществления вектор дополнительно содержит спейсерную последовательность нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты расположена между промотором и нуклеиновой кислотой, кодирующей средство для RNAi. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой самокомплементарный вектор на основе rAAV. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую средство для RNAi, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность, комплементарную последовательности средства для RNAi, где первая последовательность нуклеиновой кислоты может образовывать внутринитевые пары оснований со второй последовательностью нуклеиновой кислоты на протяжении большей части или всей ее длины. В некоторых вариантах осуществления первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая последовательность нуклеиновой кислоты соединены мутантным ITR AAV, где мутантный ITR AAV характеризуется делецией D-области и характеризуется мутацией последовательности концевого разрешения. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает клетку, содержащую любой из векторов (например, векторы на основе rAAV), описанных в данном документе.
В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов вектор, кодирующий средство для RNAi, содержится в вирусной частице, где вирусная частица представляет собой частицу AAV с заключенным в капсид вектором на основе rAAV, аденовирусную частицу с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного аденовируса, лентивирусную частицу с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного лентивируса или частицу HSV с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного HSV. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица представляет собой аденовирусную частицу с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного аденовируса. В некоторых вариантах осуществления аденовирусная частица содержит капсид от аденовируса серотипа 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad крупного рогатого скота типа 3, Ad собачьих типа 2, Ad овцы или Ad свиньи типа 3. В некоторых вариантах осуществления аденовирусная частица содержит капсид аденовируса серотипа 2 или капсид варианта аденовируса серотипа 5. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица представляет собой лентивирусную частицу с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного лентивируса. В некоторых вариантах осуществления лентивирусная частица содержит капсид, псевдотипированный вирусом везикулярного стоматита (VSV), вирусом лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), вирусом реки Росс (RRV), вирусом Эбола, вирусом Марбург, вирусом Мокола, вирусом бешенства, RD114 или их вариантами. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица представляет собой частицу HSV. В некоторых вариантах осуществления частица HSV представляет собой частицу rHSV-1 или частицу rHSV-2.
В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов настоящее изобретение предусматривает частицу рекомбинантного AAV, содержащую любой из векторов на основе rAAV, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица AAV содержит капсид серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV козы, химерного AAV1/AAV2, AAV крупного рогатого скота или капсид AAV мыши, rAAV2/HBoV1. В некоторых вариантах осуществления ITR и капсид вирусной частицы rAAV получены из одного и того же серотипа AAV. В некоторых вариантах осуществления ITR и капсид вирусной частицы rAAV получены из разных серотипов AAV. В некоторых вариантах осуществления ITR получен из AAV2 и капсид частицы rAAV получен из AAV1. Настоящее изобретение предусматривает вектор, содержащий экспрессионную конструкцию согласно любому из вариантов осуществления, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), вектор на основе рекомбинантного аденовируса, вектор на основе рекомбинантного лентивируса или вектор на основе рекомбинантного вируса простого герпеса (HSV). В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденовируса. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе рекомбинантного аденовируса получен из аденовируса серотипа 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41 AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad крупного рогатого скота типа 3, Ad собачьих типа 2, Ad овцы или Ad свиньи типа 3. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе рекомбинантного аденовируса получен из аденовируса серотипа 2 или варианта аденовируса серотипа 5. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного лентивируса. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе рекомбинантного лентивируса получен из лентивируса, псевдотипированного вирусом везикулярного стоматита (VSV), вирусом лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), вирусом реки Росс (RRV), вирусом Эбола, вирусом Марбург, вирусом Мокола, вирусом бешенства, RD114 или их вариантами. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор на основе rHSV. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе rHSV получен из rHSV-1 или rHSV-2.
В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных аспектов и вариантов осуществления вектор представляет собой вектор на основе rAAV. В некоторых вариантах осуществления экспрессионная конструкция фланкирована одной или несколькими последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR) AAV. В некоторых вариантах осуществления экспрессионная конструкция фланкирована двумя ITR AAV. В некоторых вариантах осуществления ITR AAV представляют собой ITR серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, AAV козы, AAV крупного рогатого скота или AAV мыши. В некоторых вариантах осуществления ITR AAV представляют собой ITR AAV2. В некоторых вариантах осуществления вектор дополнительно содержит спейсерную последовательность нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты расположена между промотором и нуклеиновой кислотой, кодирующей средство для RNAi. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой самокомплементарный вектор на основе rAAV. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую средство для RNAi, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность, комплементарную последовательности средства для RNAi, где первая последовательность нуклеиновой кислоты может образовывать внутринитевые пары оснований со второй последовательностью нуклеиновой кислоты на протяжении большей части или всей ее длины. В некоторых вариантах осуществления первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая последовательность нуклеиновой кислоты соединены мутантным ITR AAV, где мутантный ITR AAV характеризуется делецией D-области и характеризуется мутацией последовательности концевого разрешения. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает клетку, содержащую любой из векторов (например, векторы на основе rAAV), описанных в данном документе.
В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных аспектов и вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает вирусную частицу, содержащую любой из векторов, описанных в данном документе, где вирусная частица представляет собой частицу AAV с заключенным в капсид вектором на основе rAAV, аденовирусную частицу с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного аденовируса, лентивирусную частицу с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного лентивируса или частицу HSV с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного HSV. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица представляет собой аденовирусную частицу с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного аденовируса. В некоторых вариантах осуществления аденовирусная частица содержит капсид от аденовируса серотипа 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad крупного рогатого скота типа 3, Ad собачьих типа 2, Ad овцы или Ad свиньи типа 3. В некоторых вариантах осуществления аденовирусная частица содержит капсид аденовируса серотипа 2 или капсид варианта аденовируса серотипа 5. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица представляет собой лентивирусную частицу с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного лентивируса. В некоторых вариантах осуществления лентивирусная частица содержит капсид, псевдотипированный вирусом везикулярного стоматита (VSV), вирусом лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), вирусом реки Росс (RRV), вирусом Эбола, вирусом Марбург, вирусом Мокола, вирусом бешенства, RD114 или их вариантами. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица представляет собой частицу HSV. В некоторых вариантах осуществления частица HSV представляет собой частицу rHSV-1 или частицу rHSV-2.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает частицу рекомбинантного AAV, содержащую любой из векторов на основе rAAV, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица AAV содержит капсид серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV козы, химерного AAV1/AAV2, AAV крупного рогатого скота или капсид AAV мыши, rAAV2/HBoV1. В некоторых вариантах осуществления ITR и капсид вирусной частицы rAAV получены из одного и того же серотипа AAV. В некоторых вариантах осуществления ITR и капсид вирусной частицы rAAV получены из разных серотипов AAV. В некоторых вариантах осуществления ITR получен из AAV2 и капсид частицы rAAV получен из AAV1. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе rAAV содержит в направлении от 5'- к 3'-концу: ITR AAV2, промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi, сигнал полиаденилирования и ITR AAV2. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой промотор CBA. В некоторых вариантах осуществления сигнал полиаденилирования представляет собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе rAAV содержит в направлении от 5'- к 3'-концу: ITR AAV2, промотор CBA, интрон, нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi, сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста и ITR AAV2. В некоторых вариантах осуществления вектор дополнительно содержит спейсерную последовательность нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает нуклеиновую кислоту, кодирующую зеленый флуоресцентный белок (GFP). В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты расположена между промотором и нуклеиновой кислотой, кодирующей средство для RNAi.
В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов, вирусная частица (например, частица rAAV) содержится в композиции (например, фармацевтической композиции). В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фиг. 1A показана последовательность ДНК для miRNA Htt 206 (SEQ ID NO:22) и miRNA Htt 207 (SEQ ID NO:10). На фиг. 1B показана карта ssAAV2/1miRHtt.de. На фиг. 1C показана последовательность кодирующей нити ssAAV2/1miRHtt.de (SEQ ID NO: 16) и некодирующей нити ssAAV2/1miRHtt.de (SEQ ID NO:19).
На фиг. 2 показана способность miRNA Htt 170XA, miRNA Htt 206 и miRNA Htt 207 опосредовать снижение Htt in vitro. Значения приведены в виде средних ± SEM.
На фиг. 3A и 3B показана способность AAV2/1-miRNA Htt 206 и AAV2/1-miRNA Htt 207 опосредовать снижение Htt, что измерено по количеству белка (фиг. 3A) или мРНК (фиг. 3B). CTL-3 представляет собой контроль в виде некодирующей miRNA. Значения приведены в виде средних ± SEM. * указывает на значимое различие относительно мышей CTL3, p<0,05; ANOVA с последующим применением апостериорного критерия Тьюки.
На фиг. 4A и 4B показаны вес тела (фиг. 4A) и вес головного мозга (фиг. 4B) через один месяц после введения AAV2/1-miRNA Htt 206 и AAV2/1-miRNA Htt 207. CTL-3 представляет собой контроль в виде некодирующей miRNA. * значимое различие относительно контрольных мышей CTL3, p<0,05; ANOVA с последующим применением апостериорного критерия Тьюки.
На фиг. 5A-5D показано, что уровень человеческого Htt в значительной степени уменьшался в полосатом теле у мышей YAC128 и FVB дикого типа из одного помета, которым вводили AAV2/1-miRNA-Htt-207. Уровни человеческого белка HTT показаны на фиг. 5A. Уровни мышиного белка HTT показаны на фиг. 5B. Уровни человеческой мРНК HTT показаны на фиг. 5C. Уровни мышиной мРНК HTT показаны на фиг. 5D.
На фиг. 6A и 6B показано, что обработка с помощью AAV2/1-miRNA-Htt-207 может корректировать нарушения моторной координации у мышей YAC128, как определено с помощью теста "вращающийся стержень" (фиг. 6A), и депрессивный фенотип у мышей YAC128, как определено с использованием теста "вынужденного плавания" по Порсолту (фиг. 6B). Мыши были либо дикого типа (WT также называемые FVB), либо YAC128 (YAC), обработанные с помощью контроля в виде некодирующей РНК (CTL3) или AAV2/1-miRNA-Htt-207 (207). На фиг.6 * указывает на значительный дефицит у мышей CTL3, которых обрабатывали контролем в виде некодирующей miRNA, p<0,05; ANOVA с последующим применением апостериорного критерия Тьюки по сравнению с мышами дикого типа, мышами дикого типа, обработанными AAV2/1-miRNA-Htt-207, и мышами YAC128, обработанными AAV2/1-miRNA-Htt-207.
На фиг. 7A и 7B показаны значения веса тела (FIG. 7A) и веса головного мозга (FIG. 7B) через три месяца после инфицирования. Мыши были либо дикого типа (WT), либо YAC128 (YAC), обработанные с помощью контроля в виде некодирующей РНК (CTL3), либо AAV2/1-miRNA-Htt-207 (207).
На фиг. 8 показана карта генома самокомплементарного вектора на основе miRHtt 207. CMV enh/промотор CBA представляет собой энхансер CMV/промотор гена бета-актина курицы. Химерный интрон ∆ представляет собой укороченный химерный интрон. BGH представляет собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста. ∆ITR представляет собой ITR AAV, не содержащий последовательности концевого разрешения.
На фиг. 9 показана карта альтернативного генома самокомплементарного вектора на основе miRHtt 207. Промотор CBA представляет собой промотор гена бета-актина курицы. Химерный интрон ∆ представляет собой укороченный химерный интрон. BGH представляет собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает средство для RNAi для лечения болезни Хантингтона, где средство для RNAi содержит первую нить, предусматривающую первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3' (SEQ ID NO:1), и вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3' (SEQ ID NO:2), где первая нить и вторая нить образуют дуплекс. В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает средство для RNAi для лечения болезни Хантингтона, где средство для RNAi содержит первую нить, предусматривающую первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3' (SEQ ID NO:7), и вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3' (SEQ ID NO:8),, где первая нить и вторая нить образуют дуплекс. В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает кассеты экспрессии, векторы (например, векторы на основе рекомбинантных AAV, аденовируса, лентивируса или HSV), клетки, вирусные частицы (например, вирусные частицы AAV, аденовирусные, лентивирусные частицы или вирусные частицы HSV) и фармацевтические композиции, содержащие средство для RNAi согласно настоящему изобретению. В дополнительных аспектах настоящее изобретение предусматривает способы лечения болезни Хантингтона, подавления экспрессии htt и подавления накопления htt в клетке у млекопитающего, предусматривающие введение млекопитающему фармацевтической композиции, содержащей средство для RNAi согласно настоящему изобретению. В других дополнительных аспектах настоящее изобретение предусматривает применение фармацевтической композиции, содержащей средство для RNAi согласно настоящему изобретению, для лечения болезни Хантингтона (например, для уменьшения интенсивности симптомов болезни Хантингтона), подавления экспрессии htt или подавления накопления htt в клетке у млекопитающего с болезнью Хантингтона. В других дополнительных аспектах настоящее изобретение предусматривает наборы для лечения болезни Хантингтона у млекопитающего, содержащие средство для RNAi согласно настоящему изобретению.
I. Общие методики
Методики и процедуры, описанные или упоминаемые в данном документе, как правило, хорошо известны и часто используются специалистами в данной области техники с использованием традиционной методологии, как например широко используемые методики, описанные в Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); серии Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995) и Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011).
II. Определения
Термин "вектор", используемый в данном документе, относится к рекомбинантной плазмиде или вирусу, которые содержат нуклеиновую кислоту, подлежащую доставке в клетку-хозяина либо in vitro, либо in vivo.
Термины "полинуклеотид" или "нуклеиновая кислота", используемые в данном документе, относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, предусматривающей либо рибонуклеотиды, либо дезоксирибонуклеотиды. Таким образом, данный термин включает без ограничения одно-, двух- или многонитевые ДНК или РНК, геномную ДНК, cDNA, гибриды ДНК-РНК или полимер, содержащий пуриновые и пиримидиновые основания или другие природные, химически или биохимически модифицированные, неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания. Остов полинуклеотида может содержать сахара и фосфатные группы (которые обычно могут обнаруживаться в РНК или ДНК) или модифицированные либо замещенные сахарные или фосфатные группы. Как альтернатива, остов полинуклеотида может предусматривать полимер из синтетических субъединиц, таких как фосфорамидаты, и таким образом может представлять собой олигодезоксинуклеозидный фосфорамидат (P-NH2) или смешанный олигомер фосфорамидата-сложного фосфодиэфира. Кроме того, двухнитевой полинуклеотид можно получить из однонитевого полинуклеотидного продукта химического синтеза либо путем синтеза комплементарной нити и гибридизации нитей в соответствующих условиях, либо путем синтеза комплементарной нити de novo с использованием ДНК-полимеразы с соответствующим праймером.
Термины "полипептид" и "белок" используются взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков и не ограничены минимальной длиной. Такие полимеры из аминокислотных остатков могут содержать природные или неприродные аминокислотные остатки и включают без ограничения пептиды, олигопептиды, димеры, тримеры и мультимеры из аминокислотных остатков. Данным определением охватываются как полноразмерные белки, так и их фрагменты. Термины включают также постэкспрессионные модификации полипептида, например, гликозилирование, сиалирование, ацетилирование, фосфорилирование и т. п. Кроме того, применительно к целям настоящего изобретения термин "полипептид" относится к белку, нативная последовательность которого предусматривает модификации, такие как делеции, добавления и замены (обычно консервативные по своей природе), при условии, что белок сохраняет требуемую активность. Эти модификации могут быть преднамеренными, как например полученными с помощью сайт-направленного мутагенеза, или могут быть случайными, как например возникшими вследствие мутаций у хозяев, которые продуцируют белки, или ошибок, обусловленных ПЦР-амплификацией.
Термин "рекомбинантный вирусный вектор" относится к рекомбинантному полинуклеотидному вектору, содержащему одну или несколько гетерологичных последовательностей (т. е. последовательность нуклеиновой кислоты, не происходящую от вируса). В случае векторов на основе рекомбинантного AAV рекомбинантную нуклеиновую кислоту фланкируют с помощью по меньшей мере одной, а в некоторых вариантах осуществления двух, последовательностей инвертированных концевых повторов (ITR).
"Вектор на основе рекомбинантного AAV (вектор на основе rAAV)" относится к полинуклеотидному вектору, содержащему одну или несколько гетерологичных последовательностей (т. е. последовательность нуклеиновой кислоты, не происходящую из AAV), которые фланкированы по меньшей мере одной, а в некоторых вариантах осуществления двумя последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR) AAV. Такие векторы на основе rAAV могут реплицироваться и упаковываться в инфекционные вирусные частицы, когда они находятся в клетке-хозяине, которая была инфицирована подходящим вирусом-помощником (или которая экспрессирует подходящие хелперные функциональные элементы) и которая экспрессирует продукты генов rep и cap AAV (т. е. белки Rep и Cap AAV). Если вектор на основе rAAV встроен в более крупный полинуклеотид (например, в хромосому или в другой вектор, такой как плазмида, применяемая для клонирования или трансфекции), то вектор на основе rAAV можно обозначить как "провектор", который может быть "восстановлен" посредством репликации и заключения в капсид в присутствии упаковывающих функциональных элементов и подходящих функциональных элементов помощника AAV. Вектор на основе rAAV может находиться в любой из множества форм, в том числе без ограничения в форме плазмид, линейных искусственных хромосом, в комплексе с липидами, инкапсулированным в липосомах и заключенным в капсид вирусной частицы, в частности частицы AAV. Вектор на основе rAAV может быть упакован в капсид вируса AAV с получением "частицы рекомбинантного аденоассоциированного вируса (частица rAAV)".
Термин "вектор на основе рекомбинантного аденовируса" относится к полинуклеотидному вектору, содержащему одну или несколько гетерологичных последовательностей (т. е. последовательность нуклеиновой кислоты, не происходящую из аденовируса), которые фланкированы по меньшей мере одной последовательностью инвертированного концевого повтора (ITR) аденовируса. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная нуклеиновая кислота фланкирована двумя последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR). Такие векторы на основе рекомбинантных вирусов могут реплицироваться и упаковываться в инфекционные вирусные частицы, когда они находятся в клетке-хозяине, которая экспрессирует жизненно важные гены аденовируса, которые были подвергнуты удалению в геноме рекомбинантного вируса (например, гены E1, гены E2, гены E4 и т. д.). Если рекомбинантный вирусный вектор включен в более крупный полинуклеотид (например, в хромосому или в другой вектор, такой как плазмида, используемая для клонирования или трансфекции), то рекомбинантный вирусный вектор можно обозначить как "провектор", который может быть "восстановлен" посредством репликации и заключения в капсид в присутствии упаковывающих функциональных элементов аденовируса. Рекомбинантный вирусный вектор может находиться в любой из множества форм, в том числе без ограничения в форме плазмид, линейных искусственных хромосом, в комплексе с липидами, инкапсулированным в липосомах и заключенным в капсид вирусной частицы, например аденовирусной частице. Вектор на основе рекомбинантного вируса может быть упакован в вирусный капсид аденовируса с получением "рекомбинантной аденовирусной частицы".
"Вектор на основе рекомбинантного лентивируса" относится к полинуклеотидному вектору, содержащему одну или несколько гетерологичных последовательностей (т. е. последовательность нуклеиновой кислоты, не происходящую из лентивируса), которые фланкированы по меньшей мере одной последовательностью концевого повтора лентивируса (LTR). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная нуклеиновая кислота фланкирована двумя последовательностями концевых повторов лентивируса (LTR). Такие векторы на основе рекомбинантных вирусов могут реплицироваться и упаковываться в инфекционные вирусные частицы, когда они находятся в клетке-хозяине, которая была инфицирована подходящим хелперным функциональным элементом. Вектор на основе рекомбинантного лентивируса может быть упакован в капсид лентивируса с получением "рекомбинантной лентивирусной частицы".
Термин "вектор на основе рекомбинантного вируса простого герпеса (вектор на основе рекомбинантного HSV)" относится к полинуклеотидному вектору, содержащему одну или несколько гетерологичных последовательностей (т. е. последовательность нуклеиновой кислоты, не происходящую из HSV), которые фланкированы последовательностями концевых повторов HSV. Такие векторы на основе рекомбинантных вирусов могут реплицироваться и упаковываться в инфекционные вирусные частицы, когда они находятся в клетке-хозяине, которая была инфицирована подходящим хелперным функциональным элементом. Если рекомбинантный вирусный вектор включен в более крупный полинуклеотид (например, в хромосому или в другой вектор, такой как плазмида, используемая для клонирования или трансфекции), то рекомбинантный вирусный вектор можно обозначить как "провектор", который может быть "восстановлен" посредством репликации и заключения в капсид в присутствии упаковывающих функциональных элементов HSV. Рекомбинантный вирусный вектор может находиться в любой из множества форм, в том числе без ограничения в форме плазмид, линейных искусственных хромосом, в комплексе с липидами, инкапсулированным в липосомах и заключенным в капсид вирусной частицы, например частицы HSV. Рекомбинантный вирусный вектор может быть упакован в капсид HSV с получением "частицы рекомбинантного вируса простого герпеса".
"Гетерологичный" означает полученный из объекта, генотипически отличающегося от остальной части объекта, с которым его сравнивают или в который его вводят или встраивают. Например, полинуклеотид, введенный посредством методик генетической инженерии в клетку другого типа, является гетерологичным полинуклеотидом (и при экспрессии может кодировать гетерологичный полипептид). Подобным образом, последовательность, характерная для клетки (например, ген или его часть), встроенная в вирусный вектор, является гетерологичной нуклеотидной последовательностью по отношению к вектору.
Термин "трансген" относится к полинуклеотиду, вводимому в клетку и способному к транскрипции в РНК и необязательно к трансляции и/или экспрессии в соответствующих условиях. В некоторых аспектах он придает требуемое свойство клетке, в которую он был введен, или иным образом приводит к требуемому терапевтическому или диагностическому эффекту. В другом аспекте он может транскрибироваться в молекулу, которая опосредует РНК-интерференцию, такую как опосредуемую miRNA, siRNA или shRNA.
"Промотор гена β-актина курицы (CBA)" относится к полинуклеотидной последовательности, полученной из гена β-актина курицы (например, бета-актина Gallus gallus, представленного геном с ID 396526 в GenBank Entrez). Применяемый в данном документе термин "промотор гена β-актина курицы" может относиться к промотору, содержащему ранний энхансерный элемент цитомегаловируса (CMV), промотор и первый экзон и интрон гена β-актина курицы и акцепторный сайт сплайсинга гена бета-глобина кролика, как например последовательности, описанные в Miyazaki, J. et al. (1989) Gene 79(2):269-77. Применяемый в данном документе термин "промотор CAG" может применяться взаимозаменяемо. Применяемый в данном документе термин "ранний энхансер CMV/промотор гена бета-актина курицы (CAG)" может использоваться взаимозаменяемо.
Термины "геномные частицы (gp)", "геномные эквиваленты" или "копии генома", используемые в отношении вирусного титра, относятся к числу вирионов, содержащих ДНК-геном рекомбинантного AAV, вне зависимости от инфекционности или функциональности. Число геномных частиц в конкретном препарате на основе векторов можно измерять с помощью процедур, таких как описанные в примерах в данном документе или, например, в Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278.
Применяемый в данном документе термин "геном вектора (vg)" может относиться к одному или нескольким полинуклеотидам, содержащим набор полинуклеотидных последовательностей вектора, например вирусного вектора. Геном вектора может быть заключен в капсид вирусной частицы. В зависимости от конкретного вирусного вектора, геном вектора может содержать однонитевую ДНК, двухнитевую ДНК, или однонитевую РНК, или двухнитевую РНК. Геном вектора может содержать эндогенные последовательности, ассоциированные с конкретным вирусным вектором, и/или любые гетерологичные последовательности, встроенные в конкретный вирусный вектор посредством рекомбинантных методик. Например, геном вектора на основе рекомбинантного AAV может содержать по меньшей мере одну последовательность ITR, фланкирующую промотор, спейсерный фрагмент, последовательность, представляющую интерес (например, средства для RNAi), и последовательность полиаденилирования. Полный геном вектора может содержать полную совокупность полинуклеотидных последовательностей вектора. В некоторых вариантах осуществления титр нуклеиновых кислот вирусного вектора можно измерять в единицах vg/мл. Способы, подходящие для измерения данного титра, известны из уровня техники (например, количественная ПЦР).
Применяемый в данном документе термин "подавление" может относится к действию, направленному на блокирование, снижение уровня, устранение или иное противодействие в отношении присутствия или активности конкретной мишени. Подавление может относится к частичному подавлению или полному подавлению. Например, подавление экспрессии гена может относится к любому действию, приводящему к блокировке, снижению уровня, устранению или любому другому противодействию экспрессии гена, в том числе снижению содержания мРНК (например, за счет подавления транскрипции мРНК), разрушению мРНК, подавлению трансляции mRNA и т. п. В некоторых вариантах осуществления подавление экспрессии HTT может относится к блокировке, снижению уровня, устранению или любому другому противодействию экспрессии HTT, в том числе снижению содержания мРНК HTT (например, за счет подавления транскрипции мРНК HTT), разрушению мРНК HTT, подавлению трансляции мРНК HTT и т. п. В качестве другого примера, подавление накопления белка в клетке может относится к любому действию, приводящему к блокировке, снижению уровня, устранению или другому противодействию экспрессии белка, в том числе снижению содержания мРНК (например, за счет подавления транскрипции мРНК), разрушению мРНК, подавлению трансляции мРНК, разрушению белка и т. п. В некоторых вариантах осуществления подавление накопления белка HTT в клетке относится к блокировке, снижению уровня, устранению или другому противодействию экспрессии белка HTT в клетке, в том числе снижению содержания мРНК HTT (например, за счет подавления транскрипции мРНК HTT), разрушению мРНК HTT, подавлению трансляции мРНК HTT, разрушению белка HTT и т. п.
Термины "инфекционная единица (iu)", "инфекционная частица" или "единица репликации", используемые в отношении вирусного титра, относятся к числу инфекционных и репликационно компетентных частиц, представляющих собой вектор на основе рекомбинантного AAV, как измерено с помощью анализа инфекционных центров, также известного как анализ центров репликации, описанного например в McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973.
Термин "трансдуцирующая единица (tu)", используемый в отношении вирусного титра, относится к числу инфекционных частиц, представляющих собой вектор на основе рекомбинантного AAV, которые приводят к получению функционального трансгенного продукта, измеряемому в функциональных анализах, таких как описанные в примерах в данном документе или, например, в Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124 или в Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532 (анализ LFU).
Последовательность "инвертированных концевых повторов" или "ITR" является термином, хорошо известным в уровне техники, и относится к относительно коротким последовательностям, встречающимся на концах вирусных геномов, которые имеют противоположную ориентацию.
Хорошо известный из уровня техники термин последовательность "инвертированного концевого повтора (ITR) AAV" обозначает последовательность из примерно 145 нуклеотидов, которая присутствует на обоих концах нативного однонитевого генома AAV. Крайние 125 нуклеотидов ITR могут присутствовать в любой из двух альтернативных ориентаций, что обуславливает гетерогенность между различными геномами AAV и между двумя концами одного генома AAV. Крайние 125 нуклеотидов также содержат несколько более коротких областей самокомплементарности (обозначаемых как A-, A'-, B-, B'-, C-, C'- и D-области), которые обеспечивают возможность образования внутринитевого спаривания оснований в пределах данной части ITR.
"Последовательность концевого разрешения" или "trs" представляет собой последовательность в D-области ITR AAV, которая отщепляется белками rep AAV в ходе репликации вирусной ДНК. Мутантная последовательность концевого разрешения устойчива к отщеплению белками rep AAV.
"Хелперные функциональные элементы AAV" относятся к функциональным элементам, которые обеспечивают возможность репликации и упаковки AAV в клетке-хозяине. Хелперные функциональные элементы AAV могут быть представлены любой из множества форм, в том числе без ограничения вирусом-помощником или генами вируса-помощника, которые способствуют репликации и упаковке AAV. Из уровня техники известны другие функциональные элементы помощника AAV, такие как генотоксичные средства.
Термин "вирус-помощник" для AAV относится к вирусу, который обеспечивает возможность репликации и упаковки AAV (который является дефектным парвовирусом) в клетке-хозяине. Вирус-помощник обеспечивает "хелперные функциональные элементы", которые обеспечивают возможность репликации AAV. Было идентифицировано множество таких вирусов-помощников, в том числе аденовирусы, герпесвирусы и поксвирусы, такие как вирус осповакцины и бакуловирус. Аденовирусы охватывают множество различных подгрупп, однако наиболее широко применяется аденовирус 5 типа подгруппы C (Ad5). Многочисленные аденовирусы человека, млекопитающих, отличных от человека, и птиц, известны и доступны из депозитариев, таких как ATCC. Вирусы семейства герпесвирусов, которые также доступны из депозитариев, таких как ATCC, включают, например, вирусы простого герпеса (HSV), вирусы Эпштейна-Барр (EBV), цитомегаловирусы (CMV) и вирусы псевдобешенства (PRV). Примеры аденовирусных хелперных функциональных элементов для репликации AAV включают функциональные элементы E1A, функциональные элементы E1B, функциональные элементы E2A, функциональные элементы VA и функциональные элементы E4orf6. Бакуловирусы, доступные из депозитариев, включают вирус ядерного полиэдроза Autographa californica.
Считается, что препарат на основе rAAV "по существу не содержит" вируса-помощника, если соотношение инфекционных частиц AAV и инфекционных частиц вируса-помощника составляет по меньшей мере приблизительно 102:1; по меньшей мере приблизительно 104:1, по меньшей мере приблизительно 106:1 или по меньшей мере приблизительно 108:1 или больше. В некоторых вариантах осуществления препараты также не содержат эквивалентных количеств белков вируса-помощника (т. е. белков, которые присутствовали бы в результате такого уровня вируса-помощника, если бы вышеуказанные частицы вируса-помощника, представляющие собой инородные включения, присутствовали в разрушенной форме). Контаминацию вирусными и/или клеточными белками можно в целом наблюдать по наличию окрашенных Кумасси полос на гелях SDS (например, появлению полос, отличных от соответствующих капсидным белкам AAV VP1, VP2 и VP3).
Термин "процентная (%) идентичность последовательностей" относительно эталонной полипептидной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты определяется как процентная доля аминокислотных остатков или нуклеотидов в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам или нуклеотидам в эталонной полипептидной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты после выравнивания последовательностей и, при необходимости, введения гэпов для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей, и не учитывая любые консервативные замены как часть идентичности последовательностей. Выравнивание для целей определения процентной идентичности аминокислотных последовательностей или последовательностей нуклеиновых кислот может быть достигнуто различными способами, которые находятся в пределах компетенции специалиста в данной области техники, например с помощью общедоступных компьютерных программ, например описанных в Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1987), Supp. 30, раздел 7.7.18, таблица 7.7.1, и в том числе программного обеспечения BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Предпочтительной программой выравнивания является ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Пенсильвания). Специалисты в данной области техники способны определить соответствующие параметры для оценки выравнивания, в том числе любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по полной длине сравниваемых последовательностей. Для целей данного документа % идентичность аминокислотной последовательности, которой характеризуется конкретная аминокислотная последовательность А по отношению к, с или в сравнении с конкретной аминокислотной последовательностью В (что в качестве альтернативы можно перефразировать как конкретная аминокислотная последовательность A, которая характеризуется или обладает определенной % идентичностью аминокислотной последовательности по отношению к, с или в сравнении с конкретной аминокислотной последовательностью B), рассчитывается следующим образом: 100 умножить на частное от X/Y, где X представляет собой число аминокислотных остатков, учитываемых в качестве идентичных совпадений программой для выравнивания последовательностей при осуществлении данной программой выравнивания A и B, и где Y представляет собой общее число аминокислотных остатков в B. Следует принимать во внимание, что если длина аминокислотной последовательности A не равна длине аминокислотной последовательности B, то % идентичность аминокислотной последовательности A по отношению к B не будет равна % идентичности аминокислотной последовательности B по отношению к A. Для целей данного документа % идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, которой характеризуется конкретная последовательность нуклеиновой кислоты C по отношению к, с или в сравнении с конкретной последовательностью нуклеиновой кислоты D (что в качестве альтернативы можно перефразировать как данная последовательность нуклеиновой кислоты C, которая характеризуется или обладает определенной % идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты по отношению к, с или в сравнении с конкретной последовательностью нуклеиновой кислоты D), рассчитывается следующим образом: 100 умножить на частное от W/Z, где W представляет собой число нуклеотидов, учитываемых в качестве идентичных совпадений программой для выравнивания последовательностей при осуществлении данной программой выравнивания C и D, и где Z представляет собой общее число нуклеотидов в D. Следует принимать во внимание, что если длина последовательности нуклеиновой кислоты C не равна длине последовательности нуклеиновой кислоты D, то % идентичность последовательности нуклеиновой кислоты C по отношению к D не будет равна % идентичности последовательности нуклеиновой кислоты D по отношению к C.
Термин "выделенная" молекула (например, нуклеиновая кислота или белок) или клетка означает, что она была идентифицирована и отделена и/или извлечена из компонента своего природного окружения.
Термин "эффективное количество" представляет собой количество, достаточное для достижения благоприятных или требуемых результатов, в том числе клинических результатов (например, уменьшения интенсивности симптомов, достижения клинических конечных точек и т. п.). Эффективное количество можно вводить за одно или несколько введений. Применительно к болезненному состоянию, эффективным количеством является количество, достаточное для уменьшения интенсивности, стабилизации или задержки развития заболевания.
"Индивидуум" или "субъект" представляет собой млекопитающее. Млекопитающие включают без ограничения одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и отличных от человека приматов, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В некоторых вариантах осуществления индивидуум или субъект является человеком.
Применяемый в данном документе термин "лечение" представляет собой подход для получения благоприятных или требуемых клинических результатов. Применительно к целям настоящего изобретения благоприятные или требуемые клинические результаты включают без ограничения облегчение симптомов, уменьшение степени тяжести заболевания, стабилизацию (например, отсутствие ухудшения) болезненного состояния, предупреждение распространения (например, метастазирования) заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности или временное ослабление проявлений болезненного состояния и ремиссию (как частичную, так и полную), как выявляемые, так и невыявляемые. Термин "лечение" может означать также продление выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью в случае неполучения лечения.
Применяемый в данном документе термин "профилактическое лечение" относится к лечению, при котором у индивидуума известно или подозревается наличие или имеется риск наличия нарушения, однако не проявляются симптомы или проявляются минимальные симптомы нарушения. Индивидуума, подвергаемого профилактическому лечению, можно подвергать лечению до начала проявления симптомов.
"Болезнь Хантингтона (HD)" относится к прогрессирующему нарушению мозговой деятельности, обычно вызванному мутациями в гене HTT (также известном как хантингтин, HD или IT15). Она может характеризоваться симптомами, включающими аномальные движения (называемые хорея), постепенной утратой двигательной функции, эмоциональными или психическими заболеваниями и прогрессирующим ухудшением когнитивной функции. Несмотря на то, что большинство симптомов возникают в возрасте от 30 лет до 40 лет, также наблюдаются ювенильные формы заболевания. Для дополнительного описания HD см. регистрационный № 143100 в OMIM.
"Хантингтин (HTT)" может относиться либо к гену, либо к его полипептидному продукту, связанному с большинством случаев болезни Хантингтона. Нормальная функция хантингтина до конца не понятна. Однако известно, что мутации в гене хантингтина вызывают HD. Данные мутации, как правило, наследуются по аутосомно-доминантному типу и включают экспансию тринуклеотидных повторов CAG в гене HTT, что приводит к образованию полиглутаминового (polyQ) тракта в белке Htt.
Применяемый в данном документе термин "средство для RNAi" может относится к любой молекуле РНК, которая индуцирует РНК-интерференцию в клетке. Примеры средства для RNAi включают без ограничения малые ингибирующие РНК (siRNA), микроРНК (miRNA) и малые шпилечные РНК (shRNA).
"Каркас miRNA" может относится к полинуклеотиду, содержащему (i) двухнитевую последовательность, нацеливающуюся на ген, представляющий интерес, для осуществления нокдауна, осуществляемого средством для RNAi, и (ii) дополнительные последовательности, которые образуют структуру "стебель-петля", напоминающую таковую у эндогенных miRNA. Последовательность, нацеливающаяся на ген, представляющий интерес для осуществления RNAi (например, короткая последовательность из ~20 нуклеотидов), может быть лигирована с последовательностями, которые создают подобную miRNA структуру стебель-петля, и последовательностью, которая образует пары оснований с последовательностью, представляющей интерес, с образованием дуплекса при сворачивании полинуклеотида в подобную miRNA вторичную структуру. Как описано в данном документе, этот дуплекс может гибридизироваться несовершенным образом, например, он может содержать одно или несколько неспаренных или ошибочно спаренных оснований. При расщеплении такого полинуклеотида с помощью Dicer этот дуплекс, содержащий последовательность, нацеливающуюся на ген, представляющий интерес, может раскручиваться и встраиваться в комплекс RISC. Каркас miRNA может относится к miRNA как таковой или к ДНК-полинуклеотиду, кодирующему miRNA. Примером каркаса miRNA является последовательность miR-155 (Lagos-Quintana, M. et al. (2002) Curr. Biol. 12:735-9). Коммерчески доступные наборы для встраивания последовательности в каркас miRNA известны из уровня техники (например, набор BLOCK-iT™ от Invitrogen™ с вектором для индуцируемой Pol II экспрессии miR RNAi от Life Technologies, Thermo Fisher Scientific; Уолтем, Массачусетс).
Применяемый в данном документе термин "выпетливание" относится к области нуклеиновой кислоты, которая не является комплементарной нуклеиновой кислоте, расположенной с противоположной стороны в дуплексе из нуклеиновой кислоты. Например, выпетливание может относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая не является комплементарной нуклеиновой кислоте, расположенной с противоположной стороны в дуплексе из нуклеиновой кислоты, где выпетливание фланкировано областями нуклеиновой кислоты, которые являются комплементарными нуклеиновой кислоте, расположенной с противоположной стороны в дуплексе из нуклеиновой кислоты. В некоторых примерах длина выпетливания может быть любой из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более 10 оснований. В некоторых примерах выпетливание может быть результатом ошибочного спаривания (например, противоположная нить содержит основание, не являющееся комплементарным), или выпетливание может быть результатом отсутствия спаривания (например, противоположная нить включает нуклеиновую кислоту, комплементарную нуклеиновой кислоте, фланкирующей выпетливание, однако противоположная нить не включает нуклеиновую кислоту, противоположную выпячиванию).
Применяемый в данном документе термин "смысловая" нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, которая кодирует весь трансген или его часть. В некоторых примерах мРНК трансгена представляет собой смысловую нуклеиновую кислоту.
Применяемый в данном документе термин "антисмысловая" нуклеиновая кислота представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной "смысловой" нуклеиновой кислоте. Например, антисмысловая нуклеиновая кислота может быть комплементарной мРНК, кодирующей трансген.
Используемый в данном документе термин "направляющая область" средства для RNAi представляет собой нить средства для RNAi, которая связывается с целевой мРНК, обычно основываясь на комплементарности. Область комплементарности может охватывать всю направляющую область или ее часть. Обычно область комплементарности включает по меньшей мере затравочную область. Зачастую антисмысловой областью средства для RNAi является направляющая область.
Применяемые в данном документе "сопровождающая область" или "область, не являющаяся направляющей" средства для RNAi, используемые в данном документе взаимозаменяемо, представляют собой область средства для RNAi, которая является комплементарной направляющей области. Зачастую смысловой областью средства для RNAi является сопровождающая область.
Используемый в данном документе термин "затравочная область" средства для RNAi (например, miRNA) представляет собой область микроРНК длиной приблизительно 1-8 нуклеотидов. В некоторых примерах затравочная область и 3′-UTR ее целевой мРНК могут являться ключевыми детерминантами в распознавании средства для RNAi.
Применяемый в данном документе термин "нецелевой сайленсинг генов" относится к спариванию затравочной области средства для RNAi с последовательностями в 3′-UTR мРНК, не являющихся мишенями, что приводит при этом к трансляционной репрессии и дестабилизации данных транскриптов (например, снижению уровня экспрессии мРНК, не являющихся мишенями).
Ссылка на термин "приблизительно" в отношении значения или параметра в данном документе включает (и описывает) варианты осуществления, которые направлены на данное значение или параметр per se. Например, описание, относящееся к "приблизительно X", включает описание "X".
Формы единственного числа, используемые в данном документе, включают ссылки на множественное число, если не указано иное.
Понятно, что аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения, описанные в данном документе, включают "содержащие", "состоящие из" и/или "состоящие по сути из" аспекты и варианты осуществления.
III. Средство для RNAi
В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает улучшенное средство для RNAi, нацеленное на РНК htt, для лечения болезни Хантингтона. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi представляет собой малую ингибирующую РНК (siRNA) микроРНК (miRNA) или малую шпилечную РНК (shRNA). Малая ингибирующая или интерферирующая РНК (siRNA) известна в данной области техники как молекула двухнитевой РНК длиной примерно 19-25 (например, 19-23) пар оснований, которая индуцирует RNAi в клетке. Малая шпилечная РНК (shRNA) известна в данной области техники как молекула РНК, содержащая примерно 19-25 (например, 19-23) пар оснований в двухнитевой РНК, соединенной короткой петлей (например, ~4-11 нуклеотидов), которая индуцирует RNAi в клетке. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит первую нить и вторую нить, где a) первая нить и вторая нить образуют дуплекс; b) первая нить содержит направляющую область, при этом направляющая область содержит последовательность нуклеиновой кислоты 5'-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3' (SEQ ID NO:1) или 5'-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3' (SEQ ID NO:7);, и c) вторая нить содержит область, не являющуюся направляющей. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая направляющая область содержит последовательность нуклеиновой кислоты 5'-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3' (SEQ ID NO:1), и область, не являющаяся направляющей, содержит последовательность 5'- CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3' (SEQ ID NO:2). В других вариантах осуществления, нуклеиновая направляющая область содержит последовательность нуклеиновой кислоты 5'-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3' (SEQ ID NO:7) и область, не являющаяся направляющей содержит последовательность 5'- UGCUUGUCAACCACACCGACU-3' (SEQ ID NO:8).
В некоторых вариантах осуществления первая нить содержит направляющую область, где направляющая область содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся более чем приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичностью с 5'-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3' (SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления первая нить содержит направляющую область, где направляющая область содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся более чем приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичностью с 5'-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3' (SEQ ID NO:1), но сохраняет по меньшей мере один CpG-мотив. В некоторых вариантах осуществления первая нить содержит направляющую область, где направляющая область содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся более чем приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичностью с 5'-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3' (SEQ ID NO:7). В некоторых вариантах осуществления первая нить содержит направляющая область, где направляющая область содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся более чем приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичностью с 5'-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3' (SEQ ID NO:7), но сохраняет по меньшей мере один CpG-мотив. В некоторых вариантах осуществления вторая нить содержит область, не являющуюся направляющей, где область, не являющаяся направляющей, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся более чем приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичностью с 5'- CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3' (SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления вторая нить содержит область, не являющуюся направляющей, где область, не являющаяся направляющей, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся более чем приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичностью с 5'-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3' (SEQ ID NO:2), но сохраняет по меньшей мере один CpG-мотив. В некоторых вариантах осуществления вторая нить содержит область, не являющуюся направляющей, где область, не являющаяся направляющей, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся более чем приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичностью с 5'- UGCUUGUCAACCACACCGACU-3' (SEQ ID NO:8). В некоторых вариантах осуществления вторая нить содержит область, не являющуюся направляющей, где область, не являющаяся направляющей, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся более чем приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичностью с 5'- UGCUUGUCAACCACACCGACU-3' (SEQ ID NO:8), но сохраняет по меньшей мере один CpG-мотив.
В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:4. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся более чем приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичностью с SEQ ID NO:4. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся более чем приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичностью с SEQ ID NO:4, но сохраняющей по меньшей мере одну последовательность (например, в затравочной последовательности). В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi представляет собой miRNA-207. В других вариантах осуществления средство для RNAi представляет собой miRNA-206.
В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:10. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся более чем приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичностью с SEQ ID NO:10. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся более чем приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичностью с SEQ ID NO:10, но сохраняющей по меньшей мере одну CpG последовательность (например, в затравочной последовательности). В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi представляет собой miRNA-207. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi представляет собой miRNA-206.
МикроРНК (miRNA) известна в данной области техники как молекула РНК, которая индуцирует RNAi в клетке, содержащая короткую (например, 19-25 пар оснований) последовательность двухнитевой РНК, соединенной петлей, и содержащая одну или несколько дополнительных последовательностей в двухнитевой РНК, содержащих одно или несколько выпетливаний (например, ошибочно спаренных или неспаренных пар оснований). Применяемый в данном документе термин "miRNA" охватывает как эндогенные miRNA, так и экзогенные или гетерологичные miRNA. В некоторых вариантах осуществления "miRNA" может относится к pri-miRNA или pre-miRNA. В ходе процессинга miRNA образуется первичный транскрипт pri-miRNA. Для образования pre-miRNA pri-miRNA подвергается процессингу при помощи Drosha-DGCR8 путем вырезания одной или нескольких последовательностей, оставляя pre-miRNA с 5'-фланкирующей областью, направляющей нитью, петлевой областью, нитью, не являющейся направляющей, и 3'-фланкирующей областью; или 5'-фланкирующей областью, нитью, не являющейся направляющей, петлевой областью, направляющей нитью и 3'-фланкирующей областью. Затем pre-miRNA экспортируется в цитоплазму и подвергается процессингу при помощи Dicer с образованием siRNA с направляющей нитью и нитью, не являющейся направляющей (или сопровождающей). Затем направляющая нить задействуется в комплексе RISC для активации сайленсинга генов, например, путем распознавания целевой последовательности РНК, комплементарной направляющей нити. Дополнительное описание miRNA можно найти, например, в WO 2008/150897. Распознавание miRNA целевой последовательности определяется, главным образом, спариванием между целевой и затравочной последовательностью miRNA, например, нуклеотидами 1-8 (в направлении от 5'-конца к 3'-концу) направляющей нити (см., например, Boudreau, R.L. et al. (2013) Nucleic Acids Res. 41:e9).
В структуре pri/pre-miRNA область контакта направляющая нить:нить, не являющаяся направляющей, в дуплексе образуется отчасти посредством комплементарного спаривания оснований (например, Уотсон-Криковского спаривания оснований). Однако в некоторых вариантах осуществления данное комплементарное спаривание оснований не распространяется на весь дуплекс. В некоторых вариантах осуществления выпетливание в области контакта может находиться в одном или нескольких нуклеотидных положениях. Применяемый в данном документе термин "выпетливание" может относиться к области нуклеиновой кислоты, которая не является комплементарной нуклеиновой кислоте, расположенной с противоположной стороны в дуплексе. В некоторых вариантах осуществления выпетливание образуется, когда области комплементарных нуклеиновых кислот связываются друг с другом, тогда как области центральной некомплементарной области не связываются. В некоторых вариантах осуществления выпетливание образуется, когда две нити нуклеиновой кислоты, размещенные между двумя комплементарными областями, имеют разную длину. Как описано ниже, выпетливание может состоять из 1 или нескольких нуклеотидов.
miRNA в ходе процессинга miRNA расщепляется в участке расщепления, смежном с областью контакта направляющая нить:нить, не являющаяся направляющей, отделяя таким образом дуплекс siRNA из направляющей нити и нити, не являющейся направляющей. В некоторых вариантах осуществления miRNA содержит выпетливание в смысловой или антисмысловой нитях, смежных с участком расщепления. Другими словами, в некоторых вариантах осуществления miRNA содержит выпетливание в направляющей нити или нити, не являющейся направляющей, являющееся смежным с затравочной последовательностью. См. фиг. 1A.
В некоторых вариантах осуществления miRNA содержит выпетливание в направляющей нити, расположенное с противоположной стороны от 5'-конца участка расщепления в зрелой нити, не являющейся направляющей. В некоторых вариантах осуществления miRNA содержит выпетливание, расположенное с противоположной стороны от 5'-концевого нуклеотида нити, не являющейся направляющей. В некоторых вариантах осуществления miRNA содержит выпетливание в смысловой нити, расположенное с противоположной стороны от 3'-конца участка расщепления в зрелой направляющей нити. В некоторых вариантах осуществления miRNA содержит выпетливание, расположенное с противоположной стороны от 3'-концевого нуклеотида направляющей нити.
В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит первую нить и вторую нить, где a) первая нить и вторая нить образуют дуплекс; b) первая нить содержит направляющую область составляющую по меньшей мере 11 оснований, при этом направляющая область содержит затравочную область, содержащую основания 1-N направляющей нити, где N=7 или N=8; и c) вторая нить содержит область, не являющуюся направляющей, составляющую по меньшей мере 11 оснований, при этом область, не являющаяся направляющей, содержит последовательность, образующую выпетливание, расположенную напротив любого одного или нескольких оснований 1-(N+2) направляющей области в дуплексе. В некоторых вариантах осуществления N=7 и выпетливание находится напротив основания 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 направляющей области. В других вариантах осуществления N=8 и выпетливание находится напротив основания 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 направляющей области.
В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит первую нить и вторую нить, где a) первая нить и вторая нить образуют дуплекс; b) первая нить содержит направляющую область составляющую по меньшей мере 10 оснований, при этом направляющая область содержит затравочную область, содержащую основания 1-N направляющей нити, при этом N=7 или N=8; и c) вторая нить содержит область, не являющуюся направляющей, составляющую по меньшей мере 10 оснований, где область, не являющаяся направляющей, содержит последовательность, образующую выпетливание, располагающуюся напротив любого одного или нескольких оснований 1-(N+1) направляющей области в дуплексе. В некоторых вариантах осуществления N=7 и выпетливание находится напротив основания 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 направляющей области. В других вариантах осуществления N=8 и выпетливание находится напротив основания 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 направляющей области.
В некоторых вариантах осуществления область, не являющаяся направляющей, содержит последовательность, образующую выпетливание, расположенную напротив любого одного или нескольких оснований 1-N направляющей области в дуплексе. В некоторых вариантах осуществления N=7 и выпетливание находится напротив основания 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 направляющей области. В других вариантах осуществления N=8 и выпетливание находится напротив оснований 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 направляющей области.
В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит первую нить и вторую нить, где a) первая нить и вторая нить образуют дуплекс; b) первая нить содержит направляющую область составляющую по меньшей мере 9 оснований, при этом направляющая область содержит затравочную область, содержащую основания 2-7 или 2-8 направляющей нити, и c) вторая нить содержит область, не являющуюся направляющей, составляющую по меньшей мере 9 оснований, при этом область, не являющаяся направляющей, содержит последовательность, образующую выпетливание, расположенную напротив основания 1 или основания 9 направляющей области в дуплексе.
В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит первую нить и вторую нить, где a) первая нить и вторая нить образуют дуплекс; b) первая нить содержит направляющую область составляющую по меньшей мере 9 оснований, при этом направляющая область содержит затравочную область, содержащую основания 2-7 или 2-8 направляющей нити, и c) вторая нить содержит область, не являющуюся направляющей, составляющую по меньшей мере 9 оснований, при этом область, не являющаяся направляющей, содержит последовательность, образующую выпетливание, расположенную напротив основания 1 направляющей области в дуплексе.
В некоторых вариантах осуществления выпетливание образовано одним или несколькими основаниями нити, не являющейся направляющей, в дуплексе, которые не имеют комплементарных оснований в направляющей области, где выпетливание фланкировано основаниями, которые спариваются с основаниями направляющей нити. В некоторых вариантах осуществления последовательность, образующая выпетливание, содержит приблизительно 1-10 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления последовательность, образующая выпетливание, содержит приблизительно 2-15 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления последовательность, образующая выпетливание, содержит приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14 или приблизительно 15 нуклеотидов.
Безопасность терапевтических средств для RNAi может ограничиваться способностью малых ингибирующих РНК (siRNA) связываться с мРНК, не являющимися мишенями, и снижать уровень их экспрессии, при этом данный эффект известен как нецелевой сайленсинг генов. Нецелевое воздействие главным образом происходит при спаривании затравочной области (нуклеотиды 2-8 малой РНК) с последовательностями в 3′-UTR мРНК, не являющихся мишенями, что приводит при этом к трансляционной репрессии и дестабилизации данных транскриптов. Средство для RNAi со сниженным уровнем нецелевого воздействия можно конструировать путем замены оснований в направляющей последовательности и последовательности, не являющейся направляющей; например, путем создания CpG-мотивов. Потенциальные замены, которые могут привести к значительно меньшему показателю нецелевого воздействия, можно оценить с применением алгоритма SiSPOTR, являющегося алгоритмом конструирования, ориентированным на специфичность siRNA, посредством которого идентифицируют кандидатные последовательности, характеризующиеся минимальной способностью нецелевого воздействия и высокой способностью к сайленсингу (Boudreau et al, Nucleic Acids Res. 2013 Jan; 41(1) e9. Низкий показатель SiSPOTR прогнозирует последовательности, которые характеризуются меньшим числом потенциальных нецелевых мишеней у человека по сравнению с исходными молекулами средства для RNAi. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения средство для RNAi улучшено для обеспечения снижения уровня нецелевого сайленсинга генов. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит один или несколько CpG-мотивов. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит один или несколько CpG-мотивов в пределах затравочной области.
В некоторых вариантах осуществления первая нить и вторая нить соединены посредством РНК (например, РНК-линкера), способной образовывать петлевую структуру. Как общеизвестно в данной области техники, петлевая структура на основе РНК (например, стебель-петля или шпилька) образуется в случае, когда молекула РНК содержит две последовательности РНК, основания которых образуют пары друг с другом, разделенные последовательностью РНК, основания которой не образуют пары друг с другом. Например, петлевая структура может образовываться в молекуле РНК с последовательностями A-B-C, если последовательности A и C являются комплементарными или частично комплементарными, ввиду чего их основания образуют пары друг с другом, а основания в последовательности B не образуют пары друг с другом.
В некоторых вариантах осуществления РНК, способная образовывать петлевую структуру, содержит от 4 до 50 нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления РНК, способная образовывать петлевую структуру, содержит 13 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления число нуклеотидов в РНК, способной образовывать петлю, составляет от 4 до 50 нуклеотидов или любое целое число в этом диапазоне. В некоторых вариантах осуществления 0-50% петли могут быть комплементарными другой части петли. Применяемый в данном документе термин "петлевая структура" представляет собой последовательность, которая соединяет две комплементарные нити нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления 1-3 нуклеотида петлевой структуры прилегают к комплементарным нитям нуклеиновой кислоты и могут быть комплементарными 1-3 нуклеотидам дистальной части петлевой структуры. Например, три нуклеотида на 5'-конце петлевой структуры могут быть комплементарными трем нуклеотидам на 3'-конце петлевой структуры.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая средство для RNAi согласно настоящему изобретению, содержит каркас гетерологичной miRNA. В некоторых вариантах осуществления применение каркаса гетерологичной miRNA используют для модулирования экспрессии miRNA; например, для повышения уровня экспрессии miRNA или для снижения уровня экспрессии miRNA. Можно применять любой каркас miRNA, известный из уровня техники. В некоторых вариантах осуществления каркас miRNA получен из каркаса miR-155 (см., например, Lagos-Quintana, M. et al. (2002) Curr. Biol. 12:735-9 и набор BLOCK-iT™ от Invitrogen™ с вектором экспрессии Pol II miR RNAi от Life Technologies, Thermo Fisher Scientific; Уолтем, Массачусетс).
IV. Болезнь Хантингтона и ее экспериментальные модели
Болезнь Хантингтона (HD) представляет собой наследственное нейродегенеративное заболевание, возникающее вследствие экспансии повтора CAG в экзоне 1 гена хантингтина (HTT). Образованное в результате удлинение полиглутаминового тракта в N-концевой области придает токсическую мутацию типа приобретения функции мутантному белку хантингтину (mHtt). Токсичность mHtt может возникать в результате образования нерастворимых агрегатов, содержащих mHtt, нарушения транскрипционной регуляции и нарушений белкового гомеостаза, все из которых могут привести к гибели нейронов (Saudou et al. (1998) Cell, 95:55-66; Zuccato et al. (2003) Nat. Genet. 35:76-83; Schaffar et al. (2004) Mol.Cell. 15:95-105; Benn et al., (2008) J. Neurosci. 28:10720-10733). Патологии, обнаруженные у пациентов с HD, включают истончение коры больших полушарий и четко выраженную прогрессирующую утрату нейронов полосатого тела (Rosas et al., (2002) Neurology 58:695-701). Начало развития заболевания обычно приходится на период от третьего до четвертого десятилетия жизни; при этом симптомы включают хореиформные движения, нарушенную координацию, прогрессирующую деменцию и другие психические расстройства (Vonsattel et al., (1985) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 44:559-577). В большинстве случаев симптомы начинают проявляться в возрасте от 30 лет до 40 лет со слабовыраженными нарушениями двигательных навыков, когнитивной функции и личности. С течением времени они перерастают в прерывистые, неконтролируемые движения и утрату мышечного контроля, деменцию и психические заболевания, такие как депрессия, агрессивность, тревожность и обсессивно-компульсивное поведение. Смерть, как правило, наступает через 10-15 лет после начала проявления симптомов. Менее 10% случаев HD составляет ювенильная форма заболевания, характеризующаяся более быстрым прогрессированием заболевания. Считается, что примерно 1 из 10000 американцев имеет HD.
Не смотря на то, что генетические основы HD известны уже на протяжении почти 20 лет, существующие виды терапии в основном являются паллиативными и не направлены на устранение первопричины заболевания. Это, по-видимому, отчасти обусловлено тем фактом, что этиология этого заболевания является сложной, так как пагубные эффекты наблюдаются во множестве различных клеточных процессах. Следовательно, основное внимание при разработке лекарственного средства было направлено на рассмотрение первичного инициирующего фактора, приводящего к нарушению, а именно мутантного гена HTT как такового.
Большинство случаев HD связаны с экспансией тринуклеотидного повтора CAG в гене HTT. Число повторов CAG в гене HTT сильно коррелирует с проявлением HD. Например, у индивидуумов с 35 или меньшим количеством повторов, как правило, не развивается HD, но индивидуумы с 27-35 повторами имеют больший риск иметь потомство с HD. Индивидуумы с количеством повторов от 36 до 40-42 характеризуются неполной пенетрантностью HD, тогда как для индивидуумов с более чем 40-42 повторами продемонстрирована полная пенетрантность. Случаи ювенильной HD могут быть ассоциированы с размерами повтора CAG, составляющими 60 или больше.
Белок Htt, удлиненный за счет рolyQ вследствие экспансии данного повтора CAG, ассоциирован с клеточными агрегатами или тельцами-включениями, нарушениями белкового гомеостаза и нарушением регуляции транскрипции. Несмотря на то, что эти токсические фенотипы могут наблюдаться в различных частях тела, они, как правило, ассоциированы с клеточной гибелью нейронов в ЦНС. У пациентов с HD часто наблюдают истончение коры больших полушарий и четко выраженную прогрессирующую утрату нейронов полосатого тела. Полосатое тело, по всей видимости, является наиболее уязвимой областью головного мозга при HD (в частности, срединные шипиковые нейроны полосатого тела), при этом ранние эффекты наблюдаются в скорлупе чечевицеобразного ядра и хвостатом ядре. В головном мозге пациентов с HD наблюдают клеточную гибель шипиковых нейронов полосатого тела, увеличение количества астроцитов и активацию микроглии. HD также может поражать определенные области гиппокампа, коры больших полушарий головного мозга, таламуса, гипоталамуса и мозжечка.
Предлагаемые подходы, направленные на блокирование экспрессии Htt, включают применение антисмысловых олигонуклеотидов (ASO), а также РНК-интерференции (RNAi), при которой используют либо дуплексные РНК (dsRNA), либо химически модифицированные однонитевые РНК (ssRNA) (Harper et al., (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:5820-5825; DiFiglia et al., (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:17204-17209; Boudreau et al., (2009b) Mol. Ther. 17:1053-1063; Drouet et al., (2009) Ann. Neurol.65:276-285; Sah et al., (2011) J. Clin. Invest. 121:500-507; Matsui et al., (2012) Drug Discov. Today 17:443-450; Yu et al., (2012) Cell 150:895-908). Однако сложности воплощения подхода с применением ASO в клинической практике могут включать необходимость обеспечения устройства для облегчения осуществления повторных и длительных инфузий ASO в ЦНС и необходимость правильного распределения лекарственного средства в областях-мишенях в обширном головном мозге.
Во избежание этих потенциальных проблем с ASO преимущественным может быть использование подхода с опосредованной AAV экспрессией средства для RNAi (например, siRNA), который предоставляет возможности для обеспечения повышенной безопасности, повышенной эффективности и более продолжительной эффективности. Поскольку у пациентов с HD экспрессируется как мутантный аллель Htt, так и аллель Htt дикого типа, большинство нацеливающихся последовательностей siRNA, по-видимому, будут разрушать оба аллеля. Однако неспецифический в отношении аллелей сайленсинг Htt у мышей с HD, как было показано, хорошо переносится и может обеспечивать такую же пользу, как снижение уровня экспрессии только мутантного Htt (Boudreau et al., (2009b) Mol. Ther. 17:1053-1063; Drouet et al., (2009) Ann. Neurol. 65:276-285; Kordasiewicz et al., (2012) Neuron 74(6):1031-1044). Кроме того, согласно имеющимся данным частичная и длительная супрессия Htt дикого типа в скорлупе чечевицеобразного ядра у отличных от человека приматов с последующей опосредованной AAV RNAi не характеризовалась неблагоприятными эффектами, что дает основание предположить, что головной мозг взрослого может переносить низкие уровни Htt дикого типа (McBride et al., (2011) Mol. Ther. 19:2152-2162; Grondin et al., (2012) Brain 135:1197-1209).
Животные модели HD можно применять для тестирования потенциальных терапевтических стратегий, таких как композиции и способы согласно настоящему изобретению. Из уровня техники известны мышиные модели HD. Они включают мышиные модели с фрагментами мутантного HTT, как например мышей R6/1 и N171-82Q HD (Harper et al., (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:5820-5825, Rodriguez-Lebron et al., (2005) Mol. Ther. 12:618-633, Machida et al., (2006) Biochem. Biophys. Res. Commun. 343:190-197). Другим примером мышиной модели HD, описанной в данном документе, является модель на основе мышей YAC128. Данная модель несет искусственную хромосому дрожжей (YAC), экспрессирующую мутантный ген HTT человека с 128 повторами CAG, и мыши YAC128 характеризуются значительным и обширным накоплением агрегатов Htt в полосатом теле по достижению возраста 12 месяцев (Slow et al., (2003) Hum. Mol. Genet. 12:1555-1567, Pouladi et al., (2012) Hum. Mol. Genet. 21:2219-2232).
Можно также использовать другие животные модели HD. Например, были описаны модели на основе трансгенной крысы (von Horsten, S. et al. (2003) Hum. Mol. Genet. 12:617-24) и обезьяны-резуса (Yang, S.H. et al. (2008) Nature 453:921-4). Также известны негенетические модели. Они наиболее часто включают применение эксайтотоксичных соединений (таких как хинолиновая кислота или каиновая кислота) или митохондриальных токсинов (таких как 3-нитропропионовая кислота и малоновая кислота) для индукции клеточной гибели нейронов полосатого тела у грызунов или отличных от человека приматов (для более подробного описания и ссылок см. Ramaswamy, S. et al. (2007) ILAR J. 48:356-73).
V. Способы лечения болезни Хантингтона
В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает способы и композиции для лечения болезни Хантингтона у млекопитающего, предусматривающие введение млекопитающему фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению (например, фармацевтической композиции, содержащей вирусную частицу согласно настоящему изобретению). В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает способы и композиции для подавления экспрессии htt у млекопитающего с болезнью Хантингтона, предусматривающие введение млекопитающему фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению (например, фармацевтической композиции, содержащей вирусную частицу согласно настоящему изобретению). В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает способы и композиции для подавления накопления htt в клетке млекопитающего с болезнью Хантингтона, предусматривающие введение млекопитающему фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению (например, фармацевтической композиции, содержащей вирусную частицу согласно настоящему изобретению).
Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предусматриваются способы и композиции для уменьшения интенсивности симптома HD, предусматривающие введение эффективного количества рекомбинантных вирусных частиц, содержащих вектор, кодирующий средство для RNAi согласно настоящему изобретению, в головной мозг млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления симптомы HD включают без ограничения хорею, ригидность, неконтролируемые телодвижения, потерю контроля над мышцами, отсутствие координации движений, беспокойство, замедление движений глаз, принятие аномальных поз, неустойчивость, атаксическую походку, аномальное выражение лица, проблемы с речью, затрудненное жевание и/или глотание, нарушение сна, эпилептические припадки, деменцию, когнитивные расстройства (например, ослабление способностей, связанных с планированием, абстрактным мышлением, гибкостью, усвоением правил, межличностной восприимчивостью, самоконтролем, вниманием, обучением и памятью), депрессию, тревожность, изменения личности, агрессивность, компульсивное поведение, обсессивно-компульсивное поведение, гиперсексуальность, психоз, апатию, раздражительность, суицидальные мысли, потерю в весе, атрофию мышц, сердечную недостаточность, снижение толерантности к глюкозе, атрофию яичек и остеопороз.
В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает способы предупреждения или замедления прогрессирования HD. Аутосомно-доминантная HD представляет собой генетическое заболевание, которое можно генотипировать. Например, число повторов CAG в HTT можно определять посредством определения размера повторов с использованием ПЦР. Диагностику этого типа можно проводить на любой стадии жизни путем непосредственного тестирования детей или взрослых (например, на фоне проявления клинических симптомов), пренатального скрининга или пренатального тестирования с исключением (например, путем взятия пробы ворсин хориона или амниоцентеза) или предимплантационного скрининга эмбрионов. Таким образом, способы, описанные в данном документе, можно применять в качестве профилактического лечения HD, поскольку диагноз может быть поставлен до проявления симптомов. Например, HD можно диагностировать путем генетического тестирования (пренатального тестирования, тестирования при рождении и т. п.) и лечить с целью профилактики (например, с применением частицы rAAV, описанной в данном документе) до проявления симптомов (например, утраты клеток ЦНС) для предупреждения проявления симптомов HD и/или их прогрессирования. У пациентов с HD может проявляться уменьшение размеров хвостатого ядра и/или скорлупы чечевицеобразного ядра и/или увеличение желудочков, как показано путем визуализации головного мозга. Эти симптомы в комбинации с HD в семейном анамнезе и/или клиническими симптомами могут указывать на HD.
Средства для определения уменьшения интенсивности симптомов HD известны из уровня техники. Например, для оценки двигательной функции, когнитивной функции, аномалий поведения и функциональной способности можно применять унифицированную шкалу оценки болезни Хантингтона (UHDRS) (см., например, Huntington Study Group (1996) Movement Disorders 11:136-42). Эта шкала оценки была разработана для обеспечения универсального всестороннего теста для множественных аспектов патологии, связанной с заболеванием, включающего элементы таких тестов, как шкала оценки активности и повседневной жизни при HD, шкала оценки тяжести хореи Марсдена-Квинна, шкалы оценки нетрудоспособности и физической независимости, шкала оценки двигательной функции при HD (HDMRS), шкала оценки функциональной способности при HD (HDFCS) и количественное неврологическое исследование (QNE). Другие тесты, применимые для определения уменьшения интенсивности симптомов HD, могут включать без ограничения монреальскую шкалу оценки когнитивных функций, визуализацию головного мозга (например, MRI), тест на скорость определения категорий, тест с построением маршрута, тест поиска по карте, тест на чтение слов Струпа, тест "постукивания" с выполнением задания в ускоренном режиме и тест на сопоставление символов и цифр.
Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения способы и композиции применяют для лечения людей с HD. Как описано выше, HD наследуется по аутосомно-доминантному типу и обуславливается экспансией повтора CAG в гене HTT. Ювенильная HD чаще всего наследуется по отцовской линии. Фенотипы, сходные с фенотипом болезни Хантингтона, также коррелировали с другими генными локусами, такими как HDL1, PRNP, HDL2, HDL3 и HDL4. Полагают, что другие генные локусы могут модифицировать проявление симптомов HD, в том числе мутации в генах GRIN2A, GRIN2B, MSX1, GRIK2 и APOE.
В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает улучшенное средство для RNAi для целенаправленного воздействия на мРНК htt у млекопитающего с болезнью Хантингтона. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит первую нить, предусматривающую первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3' (SEQ ID NO:1), вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность5'- CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3' (SEQ ID NO:2). Средство для RNAi, описанное в данном документе (например, в виде части вектора на основе rAAV), может найти применение, среди прочего, в лечении болезни Хантингтона.
В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает улучшенное средство для RNAi для целенаправленного воздействия на мРНК htt у млекопитающего с болезнью Хантингтона. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит первую нить, предусматривающую первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3' (SEQ ID NO:7), и вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'- UGCUUGUCAACCACACCGACU-3' (SEQ ID NO:8). Средство для RNAi, описанное в данном документе (например, в качестве части вектора на основе rAAV) может найти применение, среди прочего, при лечении болезни Хантингтона.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения средство для RNAi улучшено для обеспечения снижения уровня нецелевого сайленсинга генов. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит один или несколько CpG-мотивов. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит один или несколько CpG-мотивов в пределах затравочной области.
В некоторых вариантах осуществления первая нить содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся любым из значений идентичности, составляющих приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с SEQ ID NO:1, но сохраняет CpG-мотив. В некоторых вариантах осуществления вторая нить содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся любым из значений идентичности, составляющих приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с SEQ ID NO:2, но сохраняет CpG-мотив.
В некоторых вариантах осуществления первая нить содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся любым из значений идентичности, составляющих приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с SEQ ID NO:7, но сохраняет CpG-мотив. В некоторых вариантах осуществления вторая нить содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся любым из значений идентичности, составляющих приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с SEQ ID NO:8, но сохраняет CpG-мотив.
В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi представляет собой малую ингибирующую РНК (siRNA) микроРНК (miRNA) или малую шпилечную РНК (shRNA). Малая ингибирующая или интерферирующая РНК (siRNA) известна в данной области техники как молекула двухнитевой РНК длиной примерно 19-25 (например, 19-23) пар оснований, которая индуцирует RNAi в клетке. Малая шпилечная РНК (shRNA) известна в данной области техники как молекула РНК, содержащая примерно 19-25 (например, 19-23) пар оснований в двухнитевой РНК, соединенной короткой петлей (например, ~4-11 нуклеотидов), которая индуцирует RNAi в клетке.
В некоторых вариантах осуществления miRNA содержит направляющую последовательность, которая на приблизительно 90% идентична SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления miRNA содержит направляющую последовательность, которая характеризуется любым значением из приблизительно 90% идентичности, 91% идентичности, 92% идентичности, 93% идентичности, 94% идентичности, 95% идентичности, 96% идентичности, 97% идентичности, 98% идентичности, 99% идентичности или 100% идентичности с SEQ ID NO:1.
В некоторых вариантах осуществления miRNA содержит последовательность, не являющуюся направляющей, которая на приблизительно 90% идентична SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления miRNA содержит последовательность, не являющуюся направляющей, которая характеризуется любым значением из приблизительно 90% идентичности, 91% идентичности, 92% идентичности, 93% идентичности, 94% идентичности, 95% идентичности, 96% идентичности, 97% идентичности, 98% идентичности, 99% идентичности или 100% идентичности с SEQ ID NO:2.
В некоторых вариантах осуществления miRNA содержит направляющую последовательность, которая на приблизительно 90% идентична SEQ ID NO:7. В некоторых вариантах осуществления miRNA содержит направляющую последовательность, которая характеризуется любым значением из приблизительно 90% идентичности, 91% идентичности, 92% идентичности, 93% идентичности, 94% идентичности, 95% идентичности, 96% идентичности, 97% идентичности, 98% идентичности, 99% идентичности или 100% идентичности с SEQ ID NO:7.
В некоторых вариантах осуществления miRNA содержит последовательность, не являющуюся направляющей, которая на приблизительно 90% идентична SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления miRNA содержит последовательность, не являющуюся направляющей, которая характеризуется любым значением из приблизительно 90% идентичности, 91% идентичности, 92% идентичности, 93% идентичности, 94% идентичности, 95% идентичности, 96% идентичности, 97% идентичности, 98% идентичности, 99% идентичности или 100% идентичности с SEQ ID NO:8.
В некоторых вариантах осуществления первая нить и вторая нить соединены посредством РНК, способной образовывать петлевую структуру. Как общеизвестно в данной области техники, петлевая структура на основе РНК (например, стебель-петля или шпилька) образуется в случае, когда молекула РНК содержит две последовательности РНК, основания которых образуют пары друг с другом, разделенные последовательностью РНК, основания которой не образуют пары друг с другом. Например, петлевая структура может образовываться в молекуле РНК с последовательностями A-B-C, если последовательности A и C являются комплементарными или частично комплементарными, ввиду чего их основания образуют пары друг с другом, а основания в последовательности B не образуют пары друг с другом.
В некоторых вариантах осуществления РНК, способная образовывать петлевую структуру, содержит от 4 до 50 нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления РНК, способная образовывать петлевую структуру, содержит 13 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления РНК, способная к образованию петлевой структуры, содержит нуклеотидную последовательность GUUUUGGCCACUGACUGAC (SEQ ID NO:13). В некоторых вариантах осуществления геном вектора содержит нуклеотидную последовательность, которая характеризуется любой из величин идентичности, составляющих по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичности, с последовательностью SEQ ID NO:13.
В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает способы, включающие введение млекопитающему (например, млекопитающему с HD) средства для RNAi, содержащего первую нить, предусматривающую первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3' (SEQ ID NO:1), и вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'- CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3' (SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная вирусная частица содержит средство для RNAi. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная вирусная частица представляет собой частицу AAV с заключенным в капсид вектором на основе rAAV, аденовирусную частицу с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного аденовируса, лентивирусную частицу с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного лентивируса или частицу HSV с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного HSV, где вектор на основе rAAV, вектор на основе аденовируса, вектор на основе лентивируса или вектор на основе HSV кодирует средство для RNAi.
В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает способы, включающие введение млекопитающему (например, млекопитающему с HD) средства для RNAi, содержащего первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3' (SEQ ID NO:7), и вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'- UGCUUGUCAACCACACCGACU-3' (SEQ ID NO:8). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная вирусная частица содержит средство для RNAi. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная вирусная частица представляет собой частицу AAV с заключенным в капсид вектором на основе rAAV, аденовирусную частицу с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного аденовируса, лентивирусную частицу с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного лентивируса или частицу HSV с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного HSV, где вектор на основе rAAV, вектор на основе аденовируса, вектор на основе лентивируса или вектор на основе HSV кодирует средство для RNAi.
В некоторых вариантах осуществления доставка рекомбинантных вирусных частиц осуществляется посредством инъекции вирусных частиц в головной мозг. В некоторых вариантах осуществления доставка рекомбинантных вирусных частиц осуществляется посредством инъекции вирусных частиц в полосатое тело. Интрастриарное введение обеспечивает доставку рекомбинантных вирусных частиц в область головного мозга, полосатое тело (включая скорлупу чечевицеобразного ядра и хвостатое ядро), которая в значительной степени поражается HD. Кроме того, не ограничиваясь какой-либо теорией, предполагается, что рекомбинантные вирусные частицы (например, частицы rAAV), введенные посредством инъекции в полосатое тело, также могут распространяться (например, посредством ретроградного транспорта) в другие области головного мозга, в том числе без ограничения сенсорные зоны (например, коры головного мозга). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные вирусные частицы доставляются посредством усиленной конвекцией доставки (например, усиленной конвекцией доставки в полосатое тело).
В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает способы лечения болезни Хантингтона у млекопитающего, включающие введение млекопитающему фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает способы подавления накопления htt в клетке млекопитающего с болезнью Хантингтона, включающие введение млекопитающему фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает способы подавления экспрессии htt у млекопитающего с болезнью Хантингтона, включающие введение млекопитающему фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления htt представляет собой мутантный htt (например, htt, содержащий более 35, более 36, более 37, более 38, более 39, более 40, более 41 или более 42 повторов CAG). В некоторых вариантах осуществления также ингибируется экспрессия и/или накопление htt дикого типа. Как описано в данном документе, и не ограничиваясь какой-либо теорией, предполагается, что подавление экспрессии и/или накопления мутантного htt у млекопитающего с HD является весьма благоприятным, при этом подавление экспрессии и/или накопления htt дикого типа у того же млекопитающего в качестве побочного эффекта (например, средства для RNAi согласно настоящему изобретению) может хорошо переноситься (например, вызывать некоторые из нежелательных побочных эффектов или вовсе не вызывать их).
В некоторых вариантах осуществления клетка содержит вектор (например, вектор, содержащий экспрессионную конструкцию, кодирующую средство для RNAi согласно настоящему изобретению). В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор на основе rAAV. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденовируса, вектор на основе рекомбинантного лентивируса или вектор на основе рекомбинантного вируса простого герпеса (HSV). В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку центральной нервной системы (ЦНС).
В некоторых вариантах осуществления введение эффективного количества рекомбинантных вирусных частиц, содержащих вектор, кодирующий средство для RNAi согласно настоящему изобретению, обеспечивает трансдукцию нейронов (например, нейронов полосатого тела, например шипиковых нейронов) в участке введения или вблизи него. В некоторых вариантах осуществления доля нейронов, предусматривающая любую величину из более чем приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% или 100% нейронов, подвергается трансдуцированию. В некоторых вариантах осуществления от приблизительно 5% до приблизительно 100%, от приблизительно 10% до приблизительно 50%, от приблизительно 10% до приблизительно 30%, от приблизительно 25% до приблизительно 75%, от приблизительно 25% до приблизительно 50% или от приблизительно 30% до приблизительно 50% нейронов подвергаются трансдуцированию. Способы идентификации нейронов, трансдуцированных рекомбинантными вирусными частицами, экспрессирующими miRNA, известны из уровня техники; например, для выявления экспрессии можно применять иммуногистохимический анализ, выявление РНК (например, qPCR, нозерн-блоттинг, секвенирование РНК, гибридизацию in situ и т. п.) или использование совместно экспрессируемого маркера, такого как усиленный зеленый флуоресцентный белок.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способы предусматривают введение в головной мозг млекопитающего эффективного количества рекомбинантных вирусных частиц, содержащих вектор, кодирующий средство для RNAi согласно настоящему изобретению, для лечения млекопитающего с HD, например человека. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят посредством инъекции в одно или несколько местоположений в головном мозге для обеспечения экспрессии средства для RNAi согласно настоящему изобретению по меньшей мере в нейронах. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят посредством инъекции в любое из одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти или более десяти местоположений в головном мозге. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят посредством инъекции в полосатое тело. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят посредством инъекции в дорсальную часть полосатого тела. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят посредством инъекции в скорлупу чечевицеобразного ядра. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят посредством инъекции в хвостатое ядро. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят посредством инъекции в скорлупу чечевицеобразного ядра и в хвостатое ядро.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные вирусные частицы вводят в одно полушарие головного мозга. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные вирусные частицы вводят в оба полушария головного мозга.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные вирусные частицы вводят в более чем одно местоположение одновременно или последовательно. В некоторых вариантах осуществления многократные инъекции рекомбинантных вирусных частиц проводят с интервалом не более чем в один час, два часа, три часа, четыре часа, пять часов, шесть часов, девять часов, двенадцать часов или 24 часа.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения человека с HD путем введения эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей вектор на основе рекомбинантного вируса, кодирующий средство для RNAi согласно настоящему изобретению для подавления активности мутантного HTT. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит одно или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.
В некоторых вариантах осуществления способы предусматривают введение эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей вектор на основе рекомбинантного вируса, кодирующий средство для RNAi согласно настоящему изобретению для подавления активности мутантного HTT. В некоторых вариантах осуществления значение вирусного титра вирусных частиц (например, частиц rAAV) составляет любое из по меньшей мере приблизительно 5 × 1012, 6 × 1012, 7 × 1012, 8 × 1012, 9 × 1012, 10 × 1012, 11 × 1012, 15 × 1012, 20 × 1012, 25 × 1012, 30 × 1012, или 50 × 1012 копий генома/мл. В некоторых вариантах осуществления значение вирусного титра вирусных частиц (например, частиц rAAV) составляет любое из приблизительно 5 × 1012 до 6 × 1012, 6 × 1012 до 7 × 1012, 7 × 1012 до 8 × 1012, 8 × 1012 до 9 × 1012, 9 × 1012 до 10 × 1012, 10 × 1012 до 11 × 1012, 11 × 1012 до 15 × 1012, 15 × 1012 до 20 × 1012, 20 × 1012 до 25 × 1012, 25 × 1012 до 30 × 1012, 30 × 1012 до 50 × 1012 , или 50 × 1012 до 100 × 1012 копий генома/мл. В некоторых вариантах осуществления значение вирусного титра вирусных частиц (например, частиц rAAV) составляет любое из приблизительно 5 × 1012 до 10 × 1012, 10 × 1012 до 25 × 1012, или 25 × 1012 до 50 × 1012 копий генома/мл. В некоторых вариантах осуществления значение вирусного титра вирусных частиц (например, частиц rAAV) составляет любое из по меньшей мере приблизительно 5 × 109, 6 × 109, 7 × 109, 8 × 109, 9 × 109, 10 × 109, 11 × 109, 15 × 109, 20 × 109, 25 × 109, 30 × 109, или 50 × 109 трансдуцирующих единиц/мл. В некоторых вариантах осуществления значение вирусного титра вирусных частиц (например, частиц rAAV) составляет любое из приблизительно 5 × 109 до 6 × 109, 6 × 109 до 7 × 109, 7 × 109 до 8 × 109, 8 × 109 до 9 × 109, 9 × 109 до 10 × 109, 10 × 109 до 11 × 109, 11 × 109 до 15 × 109, 15 × 109 до 20 × 109, 20 × 109 до 25 × 109, 25 × 109 до 30 × 109, 30 × 109 до 50 × 109 или 50 × 109 до 100 × 109 трансдуцирующих единиц/мл. В некоторых вариантах осуществления значение вирусного титра вирусных частиц (например, частиц rAAV) составляет любое из приблизительно 5 × 109 до 10 × 109, 10 × 109 до 15 × 109, 15 × 109 до 25 × 109, или 25 × 109 до 50 × 109 трансдуцирующих единиц/мл. В некоторых вариантах осуществления значение вирусного титра вирусных частиц (например, частиц rAAV) составляет любое из по меньшей мере приблизительно 5 × 1010, 6 × 1010, 7 × 1010, 8 × 1010, 9 × 1010, 10 × 1010, 11 × 1010, 15 × 1010, 20 × 1010, 25 × 1010, 30 × 1010, 40 × 1010, или 50 × 1010 инфекционных единиц/мл. В некоторых вариантах осуществления значение вирусного титра вирусных частиц (например, частиц rAAV) составляет любое из по меньшей мере приблизительно 5 × 1010 до 6 × 1010, 6 × 1010 до 7 × 1010, 7 × 1010 до 8 × 1010, 8 × 1010 до 9 × 1010, 9 × 1010 до 10 × 1010, 10 × 1010 до 11 × 1010, 11 × 1010 до 15 × 1010, 15 × 1010 до 20 × 1010, 20 × 1010 до 25 × 1010, 25 × 1010 до 30 × 1010, 30 × 1010 до 40 × 1010, 40 × 1010 до 50 × 1010, или 50 × 1010 до 100 × 1010 инфекционных единиц/мл. В некоторых вариантах осуществления значение вирусного титра вирусных частиц (например, частиц rAAV) составляет любое из по меньшей мере приблизительно 5 × 1010 до 10 × 1010, 10 × 1010 до 15 × 1010, 15 × 1010 до 25 × 1010, или 25 × 1010 до 50 × 1010 инфекционных единиц/мл.
В некоторых вариантах осуществления доза вирусных частиц, вводимых индивидууму, составляет любое значение по меньшей мере от приблизительно 1×108 до приблизительно 1×1013 копий генома/кг веса тела. В некоторых вариантах осуществления доза вирусных частиц, вводимых индивидууму, составляет любое из значений от приблизительно 1 × 108 до приблизительно 1 × 1013 копий генома/кг веса тела.
В некоторых вариантах осуществления общее количество вирусных частиц, вводимых индивидууму, составляет по меньшей мере любое из значений от приблизительно 1×109 до приблизительно 1×1014 копий генома. В некоторых вариантах осуществления общее количество вирусных частиц, вводимых индивидууму, составляет любое из значений от приблизительно 1×109 до приблизительно 1×1014 копий генома.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения величина объема композиции, вводимой посредством инъекции в полосатое тело, превышает любую из величин, составляющих приблизительно 1 мкл, 2 мкл, 3 мкл, 4 мкл, 5 мкл, 6 мкл, 7 мкл, 8 мкл, 9 мкл, 10 мкл, 15 мкл, 20 мкл, 25 мкл, 50 мкл, 75 мкл, 100 мкл, 200 мкл, 300 мкл, 400 мкл, 500 мкл, 600 мкл, 700 мкл, 800 мкл, 900 мкл или 1 мл или любую величину в этом диапазоне.
В некоторых вариантах осуществления первый объем композиции вводят посредством инъекции в первую область головного мозга, а второй объем композиции вводят посредством инъекции во вторую область головного мозга. Например, в некоторых вариантах осуществления первый объем композиции вводят посредством инъекции в хвостатое ядро, а второй объем композиции вводят посредством инъекции в скорлупу чечевицеобразного ядра. В некоторых вариантах осуществления объем композиции, составляющий 1X, вводят посредством инъекции в хвостатое ядро, а объем композиции, составляющий 1,5X, 2X, 2,5X, 3X, 3,5X или 4X, вводят посредством инъекции в скорлупу чечевицеобразного ядра, где X представляет собой величину объема, которая превышает любую из величин, составляющих приблизительно 1 мкл, 2 мкл, 3 мкл, 4 мкл, 5 мкл, 6 мкл, 7 мкл, 8 мкл, 9 мкл, 10 мкл, 15 мкл, 20 мкл, 25 мкл, 50 мкл, 75 мкл, 100 мкл, 200 мкл, 300 мкл, 400 мкл, 500 мкл, 600 мкл, 700 мкл, 800 мкл, 900 мкл или 1 мл или любое значение в этом диапазоне.
Композиции по настоящему изобретению (например, рекомбинантные вирусные частицы, содержащие вектор, кодирующий средство для RNAi согласно настоящему изобретению) можно применять либо по отдельности, либо в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами для лечения HD. Интервал между последовательными введениями может измеряться в сроках, составляющих по меньшей мере (или, в качестве альтернативы, менее чем) минуты, часы или дни.
V. Экспрессионные конструкции и векторы на основе средства для RNAi
В настоящем изобретении предусматриваются экспрессионные конструкции, векторы и вирусные частицы для обеспечения экспрессии средства для RNAi, описанного в данном документе.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая средство для RNAi согласно настоящему изобретению, содержит каркас гетерологичной miRNA. В некоторых вариантах осуществления применение каркаса гетерологичной miRNA используют для модулирования экспрессии miRNA; например, для повышения уровня экспрессии miRNA или для снижения уровня экспрессии miRNA. Можно применять любой каркас miRNA, известный из уровня техники. В некоторых вариантах осуществления каркас miRNA получен из каркаса miR-155 (см., например, Lagos-Quintana, M. et al. (2002) Curr. Biol. 12:735-9 и набор BLOCK-iT™ от Invitrogen™ с вектором экспрессии Pol II miR RNAi от Life Technologies, Thermo Fisher Scientific; Уолтем, Массачусетс). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая средство для RNAi согласно настоящему изобретению, предусматривает каркас miRNA. В некоторых вариантах осуществления каркас miRNA представлен SEQ ID NO:14.
В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi нацелено на РНК, кодирующую полипептид, связанный с болезнью Хантингтона (например, мутантный HTT). Не ограничиваясь какой-либо теорией предполагается, что средство для RNAi можно применять для снижения или устранения экспрессии и/или активности полипептида, мутация типа приобретения функции которого была связана с болезнью Хантингтона (например, мутантный HTT).
В некоторых вариантах осуществления трансген (например, средство для RNAi согласно настоящему изобретению) функционально связан с промотором. Иллюстративные промоторы включают без ограничения немедленно-ранний промотор цитомегаловируса (CMV), LTR RSV, LTR MoMLV, промотор гена фосфоглицераткиназы-1 (PGK), промотор вируса обезьян 40 (SV40) и промотор CK6, промотор гена транстиретина (TTR), промотор TK, тетрациклин-чувствительный промотор (TRE), промотор HBV, промотор hAAT, LSP-промотор, химерные специфические для печени промоторы (LSP), промотор E2F, промотор гена теломеразы (hTERT); составной промотор энхансер цитомегаловируса/промотор гена бета-актина курицы/интрон гена β-глобина кролика (промотор CAG; Niwa et al., Gene, 1991, 108(2):193-9) и промотор фактора элонгации 1-альфа (EF1-альфа) (Kim et al., Gene, 1990, 91(2):217-23 и Guo et al., Gene Ther., 1996, 3(9):802-10). В некоторых вариантах осуществления промотор предусматривает промотор β-глюкуронидазы человека или энхансер цитомегаловируса, соединенный с промотором β-актина курицы (CBA). Промотор может представлять собой конститутивный, индуцируемый или репрессируемый промотор. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает рекомбинантный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологичный трансген согласно настоящему изобретению, функционально связанный с промотором CBA. Иллюстративные промоторы и их описания могут быть найдены, например, в публикации заявки на патент США № 20140335054. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой промотор CBA, минимальный промотор CBA, промотор CMV или промотор GUSB.
Примеры конститутивных промоторов включают без ограничения ретровирусный LTR-промотор вируса саркомы Рауса (RSV) (необязательно с энхансером RSV), промотор цитомегаловируса (CMV) (необязательно с энхансером CMV) [см., например, Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)], промотор SV40, промотор гена дигидрофолатредуктазы, промотор гена 13-актина, промотор гена фосфоглицеринкиназы (PGK) и промотор EF1a [Invitrogen].
Индуцируемые промоторы обеспечивают возможность регуляции экспрессии генов, и они могут регулироваться экзогенно вводимыми соединениями, факторами окружающей среды, такими как температура, или наличием конкретного физиологического состояния, например, острой фазы, определенного состояния дифференцировки клетки, или функционируют только в размножающихся клетках. Индуцируемые промоторы и индуцируемые системы доступны из ряда коммерческих источников, включающих без ограничения Invitrogen, Clontech и Ariad. Многие другие системы были описаны и могут быть без труда выбраны специалистом в данной области техники. Примеры индуцируемых промоторов, регулируемых экзогенно предоставляемыми соединениями, включают индуцируемый цинком промотор гена металлотионина овцы (MT), индуцируемый дексаметазоном (Dex) промотор вируса опухоли молочной железы у мышей (MMTV), промоторную систему полимеразы T7 (WO 98/10088); индуцируемый экдизоном промотор генов насекомых (No et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)), систему с тетрациклин-зависимой репрессией (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), систему с тетрациклин-зависимой индукцией (Gossen et al, Science, 268:1766-1769 (1995), см. также Harvey et al, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)), систему с RU486-зависимой индукцией (Wang et al, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) и Wang et al, Gene Ther., 4:432-441 (1997)) и систему с рапамицин-зависимой индукцией (Magari et al, J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)). Несколько других типов индуцируемых промоторов, которые могут быть применимыми в данном контексте, представляют собой промоторы, регулируемые конкретным физиологическим состоянием, например, температурой, острой фазой, определенным состоянием дифференцировки клетки, или функционирующие только в размножающихся клетках.
В другом варианте осуществления для трансгена будет применяться нативный промотор или его фрагмент. Нативный промотор может быть предпочтительным, в случае если требуется, чтобы экспрессия трансгена имитировала экспрессию нативного гена. Нативный промотор можно применять в тех случаях, когда экспрессия трансгена должна регулироваться во времени, или в зависимости от стадии развития, или тканеспецифичным образом, или в ответ на конкретные транскрипционные стимулы. В дополнительном варианте осуществления для имитации экспрессии нативного гена также можно применять другие нативные элементы, осуществляющие контроль экспрессии, такие как энхансерные элементы, сайты полиаденилирования или консенсусные последовательности Козак.
В некоторых вариантах осуществления регуляторные последовательности придают способность к тканеспецифичной экспрессии генов. В некоторых случаях тканеспецифичные регуляторные последовательности связывают тканеспецифичные факторы транскрипции, которые индуцируют транскрипцию тканеспецифичным образом. Такие тканеспецифичные регуляторные последовательности (например, промоторы, энхансеры и т. д.) хорошо известны из уровня техники. Иллюстративные тканеспецифичные регуляторные последовательности включают без ограничения следующие тканеспецифичные промоторы: промоторы генов нейронов, такие как промотор гена нейрон-специфической енолазы (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)), промотор гена легкой цепи нейрофиламента (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)) и промотор нейрон-специфического гена vgf (Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)). В некоторых вариантах осуществления тканеспецифичный промотор представляет собой промотор гена, выбранного из гена нейронального ядерного белка (NeuN), гена глиофибриллярного кислого белка (GFAP), гена, обуславливающего аденоматозный полипоз толстой кишки (APC), и гена адаптерной молекулы 1, связывающей ионизированный кальций (Iba-1). Другие подходящие тканеспецифичные промоторы будут очевидны специалисту в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой промотор гена бета-актина курицы (CBA).
В некоторых вариантах осуществления промотор обеспечивает экспрессию гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетке ЦНС. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления терапевтический полипептид или терапевтическую нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению можно применять для лечения нарушения со стороны ЦНС. В некоторых вариантах осуществления промотор обеспечивает экспрессию гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетке головного мозга. Клетка головного мозга может относиться к любой клетке головного мозга, известной из уровня техники, в том числе без ограничения к нейрону (такому как чувствительный нейрон, двигательный нейрон, вставочный нейрон, дофаминергический нейрон, срединный шипиковый нейрон, холинергический нейрон, GABA-эргический нейрон, пирамидальный нейрон и т. д.), глиальной клетке (такой как клетка микроглии, макроглии, астроциты, олигодендроциты, клетки эпендимы, радиальной глии и т. д.), клетке паренхимы головного мозга, клетке микроглии, клетке эпендимы и/или клетке Пуркинье. В некоторых вариантах осуществления промотор обеспечивает экспрессию гетерологичной нуклеиновой кислоты в нейроне и/или глиальной клетке. В некоторых вариантах осуществления нейрон представляет собой срединный шипиковый нейрон хвостатого ядра, срединный шипиковый нейрон скорлупы чечевицеобразного ядра, нейрон слоя IV коры больших полушарий и/или нейрон слоя V коры больших полушарий.
Различные промоторы, которые обеспечивают экспрессию транскриптов (например, гетерологичного трансгена) в клетках ЦНС, клетках головного мозга, нейронах и глиальных клетках, известны из уровня техники и описаны в данном документе. Такие промоторы могут предусматривать последовательности контроля, которые обычно ассоциированы с выбранным геном, или гетерологичные последовательности контроля. Зачастую применимые гетерологичные последовательности контроля включают последовательности, полученные из последовательностей, кодирующих гены млекопитающих или вирусов. Примеры включают без ограничения ранний промотор SV40, LTR-промотор вируса опухоли молочной железы мыши, поздний основной промотор аденовируса (MLP Ad), промотор вируса простого герпеса (HSV), промотор цитомегаловируса (CMV), такой как участок немедленно-раннего промотора CMV (CMVIE), промотор вируса саркомы Рауса (RSV), синтетические промоторы, гибридные промоторы и т. д. Кроме того, также можно применять последовательности, полученные из генов, отличных от вирусных, таких как ген металлотионеина мыши. Такие промоторные последовательности являются коммерчески доступными, например от Stratagene (Сан-Диего, Калифорния). Можно применять ЦНС-специфические промоторы и индуцируемые промоторы. Примеры ЦНС-специфических промоторов включают без ограничения промоторы, выделенные из ЦНС-специфических генов, таких как ген основного белка миелина (MBP), ген глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и ген нейрон-специфической енолазы (NSE). Примеры индуцируемых промоторов включают ДНК-элементы отклика, среди прочего, на экдизон, тетрациклин, металлотионеин и гипоксию.
В настоящем изобретении рассматривается применение рекомбинантного вирусного генома для включения одной или нескольких последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующей средство для RNAi, описанное в данном документе, или упаковки в вирусную частицу AAV. Рекомбинантный вирусный геном может содержать любой элемент для осуществления экспрессии средства для RNAi, например всю или функциональную часть последовательности промотора, интрона (например, химерного интрона), гетерологичной нуклеиновой кислоты, ITR, элемента связывания рибосомы, терминатора, энхансера, селективного маркера, интрона, сигнала поли-А и/или точки начала репликации. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе rAAV содержит одно или несколько из энхансера, интрона (например, пары донор сплайсированного фрагмента/акцептор сплайсированного фрагмента), сайта прикрепления к матрице или сигнала полиаденилирования. Различные интроны для применения в настоящем изобретении известны специалистам в данной области техники и включают интрон MVM, усеченный интрон 1 F IX, SD β-глобина/SA тяжелой нити иммуноглобина, SD аденовируса/SA иммуноглобина, поздние SD/SA SV40 (19S/16S) и SD гибридного аденовируса/SA IgG. (Wu et al. 2008, Kurachi et al., 1995, Choi et al. 2014), Wong et al. 1985, Yew et al. 1997, Huang и Gorman (1990).
В некоторых вариантах осуществления введение эффективного количества частиц rAAV, содержащих вектор, кодирующий средство для RNAi, обеспечивает трансдукцию клеток (например, клеток ЦНС, клеток головного мозга, нейронов и/или глиальных клеток) в участке введения или вблизи него (например, полосатое тело и/или кора головного мозга) или в более дистальном участке относительно участка введения. В некоторых вариантах осуществления доля нейронов, предусматривающая любую величину из более чем приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% или 100% нейронов, подвергается трансдуцированию. В некоторых вариантах осуществления от приблизительно 5% до приблизительно 100%, от приблизительно 10% до приблизительно 50%, от приблизительно 10% до приблизительно 30%, от приблизительно 25% до приблизительно 75%, от приблизительно 25% до приблизительно 50% или от приблизительно 30% до приблизительно 50% нейронов подвергаются трансдуцированию. Способы идентификации нейронов, трансдуцированных рекомбинантными вирусными частицами, экспрессирующими miRNA, известны из уровня техники; например, для выявления экспрессии можно применять иммуногистохимический анализ, выявление РНК (например, qPCR, нозерн-блоттинг, секвенирование РНК, гибридизацию in situ и т. п.) или использование совместно экспрессируемого маркера, такого как усиленный зеленый флуоресцентный белок.
В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает вирусные частицы, содержащие рекомбинантный самокомплементарный геном (например, самокомплементарный вектор на основе rAAV). Вирусные частицы AAV с самокомплементарными геномами векторов и способы применения самокомплементарных геномов AAV описаны в патентах США №№ 6596535; 7125717; 7465583; 7785888; 7790154; 7846729; 8093054 и 8361457; а также Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105-2111, каждый из которых включен в данный документ с помощью ссылки во всей своей полноте. rAAV, содержащий самокомплементарный геном, будет быстро образовывать двухнитевую молекулу ДНК благодаря своим частично комплементарным последовательностям (например, комплементарным кодирующим и некодирующим нитям гетерологичной нуклеиновой кислоты). В некоторых вариантах осуществления вектор содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую гетерологичную нуклеиновую кислоту, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую комплементарную последовательность нуклеиновой кислоты, где первая последовательность нуклеиновой кислоты может образовывать внутринитевые пары оснований со второй последовательностью нуклеиновой кислоты на протяжении большей части или всей ее длины.
В некоторых вариантах осуществления первая гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей средство для RNAi, и вторая гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей комплементарную последовательности средства для RNAi последовательность, соединены с помощью мутантного ITR (например, правого ITR). В некоторых вариантах осуществления ITR содержит полинуклеотидную последовательность
Мутантный ITR характеризуется делецией D-области, содержащей последовательность концевого разрешения. В результате, при репликации вирусного генома AAV белки rep не будут расщеплять вирусный геном по мутантному ITR, и в связи с этим в вирусный капсид будет упакован рекомбинантный вирусный геном, содержащий следующее в порядке от 5'- к 3'-концу: ITR AAV, первую гетерологичную полинуклеотидную последовательность, в том числе регуляторные последовательности, мутантный ITR AAV, второй гетерологичный полинуклеотид в обратной ориентации по отношению к первому гетерологичному полинуклеотиду и третий ITR AAV.
VI. Вирусные частицы и способы получения вирусных частиц
В настоящем изобретении предусматриваются, среди прочего, рекомбинантные вирусные частицы, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi согласно настоящему изобретению, а также способы их применения для лечения заболевания или нарушения у млекопитающего; например болезни Хантингтона.
Вирусные частицы
В настоящем изобретении предусматриваются вирусные частицы, содержащие средство для RNAi, раскрытое в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусматриваются вирусные частицы для доставки средства для RNAi по настоящему изобретению, раскрытого в данном документе. Например, в настоящем изобретении предусматриваются способы применения рекомбинантных вирусных частиц для доставки средства для RNAi для лечения заболевания или нарушения у млекопитающего; например частиц rAAV, содержащих средство для RNAi для лечения HD. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная вирусная частица представляет собой частицу рекомбинантного AAV. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица представляет собой частицу рекомбинантного AAV, содержащую нуклеиновую кислоту, предусматривающую последовательность, кодирующую средство для RNAi согласно настоящему изобретению, фланкированную одним или двумя ITR. Нуклеиновая кислота заключена в капсид частицы AAV. Частица AAV также содержит капсидные белки. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит представляющую(представляющие) интерес кодирующую(кодирующие) последовательность(последовательности) (например, нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi), функционально связанные компоненты, расположенные в направлении транскрипции, последовательности контроля, в том числе последовательности инициации и терминации транскрипции, с образованием, таким образом, кассеты экспрессии. Кассета экспрессии фланкирована на 5'- и 3'-конце по меньшей мере одной функциональной последовательностью ITR AAV. Под "функциональными последовательностями ITR AAV" подразумевается, что последовательности ITR функционируют надлежащим образом для обеспечения спасения, репликации и упаковки вириона AAV. См. Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)3428-32; Passini et al., J. Virol., 2003, 77(12):7034-40 и Pechan et al., Gene Ther., 2009, 16:10-16, все из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Для практического осуществления некоторых аспектов настоящего изобретения рекомбинантные векторы содержат по меньшей мере все из последовательностей AAV, необходимых для обеспечения заключения в капсид, и физические структуры для обеспечения инфицирования rAAV. ITR AAV для применения в векторах по настоящему изобретению не обязательно должны характеризоваться нуклеотидной последовательностью дикого типа (например, описанную в Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801), и они могут быть изменены посредством вставки, делеции или замены нуклеотидов, или ITR AAV могут быть получены из любого из нескольких серотипов AAV. На сегодняшний день известно более 40 серотипов AAV, и продолжают идентифицировать новые серотипы и варианты существующих серотипов. См. Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6; Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):6081-6; и Bossis et al., J. Virol., 2003, 77(12):6799-810. Применение AAV любого серотипа рассматривается в пределах объема настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе rAAV представляет собой вектор, полученный из серотипа AAV, в том числе без ограничения с ITR AAV с капсидом серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, AAV козы, AAV крупного рогатого скота или AAV мыши и т. п. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в AAV содержит ITR AAV с капсидом серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, AAV козы, AAV крупного рогатого скота или AAV мыши и т. п. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в AAV дополнительно кодирует средство для RNAi, описанное в данном документе. Например, нуклеиновая кислота в AAV может содержать по меньшей мере один ITR AAV любого серотипа, рассматриваемого в данном документе, и может дополнительно кодировать средство для RNAi, содержащее одну нить, которая содержит направляющую область, и другую нить, которая содержит область, не являющуюся направляющей. В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота в AAV может содержать по меньшей мере один ITR AAV любого серотипа и может дополнительно кодировать средство для RNAi, содержащее первую нить, предусматривающую первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3' (SEQ ID NO:1), и вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'- CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3' (SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в AAV предусматривает нуклеиновую кислоту, кодирующую в направлении от 5'- к 3'-концу следующее: ITR (например, ITR AAV2), промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi, раскрытое в данном документе, сигнал полиаденилирования и ITR AAV (например, ITR AAV2). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в AAV предусматривает нуклеиновую кислоту, кодирующую в направлении от 5'- к 3'-концу следующее: ITR (например, ITR AAV2), промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi, содержащее первую нить, предусматривающую первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3' (SEQ ID NO:1), и вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'- CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3' (SEQ ID NO:2),, сигнал полиаденилирования и ITR AAV (например, ITR AAV2). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в AAV предусматривает нуклеиновую кислоту, кодирующую в направлении от 5'- к 3'-концу следующее: ITR (например, ITR AAV2), промотор CBA, нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi, раскрытое в данном документе, сигнал полиаденилирования (например, поли-А бычьего гормона роста) и ITR AAV (например, ITR AAV2). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в AAV предусматривает нуклеиновую кислоту, кодирующую в направлении от 5'- к 3'-концу следующее: всю или функциональную часть последовательности ITR (например, ITR AAV2), промотора CBA, интрона (например, химерного интрона), нуклеиновой кислоты, кодирующей средство для RNAi, содержащей первую нить, предусматривающую первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3' (SEQ ID NO:1),, и вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'- CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3' (SEQ ID NO:2),, сигнала полиаденилирования (например, поли-А бычьего гормона роста) и ITR AAV (например, ITR AAV2). В некоторых вариантах осуществления первая нить и вторая нить образуют дуплекс. В некоторых вариантах осуществления первая нить связана со второй нитью с помощью линкера. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:13.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в AAV предусматривает нуклеиновую кислоту, кодирующую в направлении от 5'- к 3'-концу следующее: ITR (например, ITR AAV2), промотор CBA, нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi, содержащее первую нить, предусматривающую первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'- CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3' (SEQ ID NO:2),, и вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3' (SEQ ID NO:1),, сигнал полиаденилирования (например, поли-А бычьего гормона роста) и ITR AAV (например, ITR AAV2). В некоторых вариантах осуществления первая нить и вторая нить образуют дуплекс. В некоторых вариантах осуществления первая нить связана со второй нитью с помощью линкера. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:13.
В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота в AAV может содержать по меньшей мере один ITR AAV любого серотипа, рассматриваемого в данном документе, и может дополнительно кодировать средство для RNAi, содержащее первую нить, предусматривающую первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3' (SEQ ID NO:7), и a вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность5'- UGCUUGUCAACCACACCGACU-3' (SEQ ID NO:8). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в AAV предусматривает нуклеиновую кислоту, кодирующую в направлении от 5'- к 3'-концу следующее: ITR (например, ITR AAV2), промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi, раскрытое в данном документе, сигнал полиаденилирования и ITR AAV (например, ITR AAV2). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в AAV предусматривает нуклеиновую кислоту, кодирующую в направлении от 5'- к 3'-концу следующее: ITR (например, ITR AAV2), промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi, содержащее первую нить, предусматривающую первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3' (SEQ ID NO:7), и вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'- UGCUUGUCAACCACACCGACU-3' (SEQ ID NO:8),, сигнал полиаденилирования и ITR AAV (например, ITR AAV2). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в AAV предусматривает нуклеиновую кислоту, кодирующую в направлении от 5'- к 3'-концу следующее: ITR (например, ITR AAV2), промотор CBA, химерный интрон, нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi, раскрытое в данном документе, сигнал полиаденилирования (например, поли-А бычьего гормона роста) и ITR AAV (например, ITR AAV2). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в AAV предусматривает нуклеиновую кислоту, кодирующую в направлении от 5'- к 3'-концу следующее: ITR (например, ITR AAV2), промотор CBA, химерный интрон, нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi, содержащее первую нить, предусматривающую первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3' (SEQ ID NO:7),, и вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'- UGCUUGUCAACCACACCGACU-3' (SEQ ID NO:8, сигнал полиаденилирования (например, поли-А бычьего гормона роста) и ITR AAV (например, ITR AAV2). В некоторых вариантах осуществления первая нить и вторая нить образуют дуплекс. В некоторых вариантах осуществления первая нить связана со второй нитью с помощью линкера. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:13.
В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота в AAV может содержать по меньшей мере один ITR AAV любого серотипа, рассматриваемого в данном документе, и может дополнительно кодировать средство для RNAi, содержащее первую нить, предусматривающую первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'- UGCUUGUCAACCACACCGACU-3' (SEQ ID NO:8), и вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3' (SEQ ID NO:7). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в AAV содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую в направлении от 5'- к 3'-концу следующее: ITR (например, ITR AAV2), промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi, раскрытое в данном документе, сигнал полиаденилирования и ITR AAV (например, ITR AAV2). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в AAV предусматривает нуклеиновую кислоту, кодирующую в направлении от 5'- к 3'-концу следующее: ITR (например, ITR AAV2), промотор, интрон, нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi, содержащее первую нить, предусматривающую первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'- UGCUUGUCAACCACACCGACU-3' (SEQ ID NO:8), и вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3' (SEQ ID NO:7),, сигнал полиаденилирования и ITR AAV (например, ITR AAV2). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в AAV предусматривает нуклеиновую кислоту, кодирующую в направлении от 5'- к 3'-концу следующее: ITR (например, ITR AAV2), промотор CBA, нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi, раскрытое в данном документе, сигнал полиаденилирования (например, поли-А бычьего гормона роста) и ITR AAV (например, ITR AAV2). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в AAV предусматривает нуклеиновую кислоту, кодирующую в направлении от 5'- к 3'-концу следующее: ITR (например, ITR AAV2), промотор CBA, интрон, нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi, содержащее первую нить, предусматривающую первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'- UGCUUGUCAACCACACCGACU-3',, и вторую нить, предусматривающую вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 5'-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3' (SEQ ID NO:7),, сигнал полиаденилирования (например, поли-А бычьего гормона роста) и ITR AAV (например, ITR AAV2). В некоторых вариантах осуществления первая нить и вторая нить образуют дуплекс. В некоторых вариантах осуществления первая нить связана со второй нитью с помощью линкера. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:13.
В некоторых вариантах осуществления вектор может включать в себя (одну или несколько) спейсерную последовательность нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты может предусматривать последовательность, которая кодирует репортерный полипептид. Специалисту в данной области техники будет понятно, что спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты может быть расположена в различных областях вектора и может состоять из непрерывной последовательности (например, одной спейсерной последовательности нуклеиновой кислоты в одном положении) или множества последовательностей (например, более чем одной спейсерной последовательности нуклеиновой кислоты в более чем одном положении (например, 2 положениях, 3 положениях и т. д.) в пределах вектора. В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты может быть расположена ниже последовательности средства для RNAi. В вариантах осуществления спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты может быть расположена выше последовательности средства для RNAi (например, между промотором и нуклеиновой кислотой, кодирующей средство для RNAi). Специалистам в данной области техники также будет понятно, что в качестве спейсерной последовательности нуклеиновой кислоты могут применяться разнообразные нуклеиновые кислоты. В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты содержит всю или часть спейсерной последовательности альфа-1-антитрипсина человека (AAT) или спейсерной последовательности C16 P1 из хромосомы 16, клона P1 (C16 человека). В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность содержит весь или часть гена. Например, спейсерная последовательность содержит часть последовательности AAT человека. Специалисту в данной области техники будет понятно, что различные части гена (например, последовательность AAT человека) могут использоваться как фрагмент спейсерной последовательности. Например, фрагмент спейсерной последовательности может быть получен из 5'-конца гена, 3'-конца гена, средины гена, некодирующей части гена (например, интрона), кодирующей области гена (например, экзона) или смеси некодирующих и кодирующих частей гена. Специалисту в данной области техники также будет понятно, что всю или часть спейсерной последовательности можно применять в качестве спейсерной последовательности. В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность содержит нуклеотидную последовательность под SEQ ID NO:18.
В дополнительных вариантах осуществления частица rAAV содержит капсидные белки AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh8R, AAVrh.10, AAV11, AAV12 или мутанты этих капсидных белков. В некоторых вариантах осуществления мутантный капсидный белок сохраняет способность образовывать капсид AAV. В некоторых вариантах осуществления частица rAAV содержит мутантный по тирозину капсид AAV5 (Zhong L. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci U S A 105(22):7827-7832). В дополнительных вариантах осуществления частица rAAV содержит капсидные белки AAV определенного серотипа из клад A-F (Gao, et al., J. Virol. 2004, 78(12):6381).
Для оптимизации трансдукции определенных клеток-мишеней или для нацеливания на специфические типы клеток в пределах определенной ткани-мишени (например, пораженной болезнью ткани) используются различные серотипы AAV. Частица rAAV может содержать белки вируса и нуклеиновые кислоты вируса одного и того же серотипа или смешанного серотипа. Например, в некоторых вариантах осуществления частица rAAV может содержать капсидные белки AAV1 и по меньшей мере один ITR AAV2, или она может содержать капсидные белки AAV2 и по меньшей мере один ITR AAV1. В данном документе для получения частицы rAAV предусматривается любая комбинация серотипов AAV, как если бы каждая комбинация была описана в данном документе в явной форме. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусматриваются частицы rAAV, содержащие капсид AAV1 и вектор на основе rAAV согласно настоящему изобретению (например, кассету экспрессии, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi согласно настоящему изобретению), фланкированный по меньшей мере одним ITR AAV2. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусматриваются частицы rAAV, содержащие капсид AAV2.
В некоторых аспектах в настоящем изобретении предусматриваются вирусные частицы, содержащие рекомбинантный самокомплементарный геном. Вирусные частицы AAV с самокомплементарными геномами и способы применения самокомплементарных геномов AAV описаны в патентах США №№ 6596535; 7125717; 7465583; 7785888; 7790154; 7846729; 8093054 и 8361457; и Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105-2111, каждый из которых включен в данный документе с помощью ссылки во всей своей полноте. Благодаря своим частично комплементарным последовательностям (например, комплементарным кодирующим и некодирующим нитям трансгена), rAAV, предусматривающий самокомплементарный геном, будет быстро образовывать двухнитевую молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает вирусную частицу AAV, содержащую геном AAV, где геном rAAV содержит первую гетерологичную полинуклеотидную последовательность (например, средство для RNAi по настоящему описанию) и вторую гетерологичную полинуклеотидную последовательность (например, антисмысловую нить средства для RNAi по настоящему описанию), при этом первая гетерологичная полинуклеотидная последовательность может образовывать вутринитевые пары оснований со второй полинуклеотидной последовательностью на протяжении большей части или всей ее длины. В некоторых вариантах осуществления первая гетерологичная полинуклеотидная последовательность и вторая гетерологичная полинуклеотидная последовательность соединены с помощью последовательности, которая способствует внутринитевому спариванию оснований, например шпилечная структура ДНК. Шпилечные структуры известны в данной области техники, например, в молекулах miRNA или siRNA. В некоторых вариантах осуществления первая гетерологичная полинуклеотидная последовательность и вторая гетерологичная полинуклеотидная последовательность связаны с помощью мутантного ITR (например, правого ITR). В некоторых вариантах осуществления ITR содержит полинуклеотидную последовательность
Мутантный ITR характеризуется делецией D-области, содержащей последовательность концевого разрешения. В результате, при репликации вирусного генома AAV белки rep не будут расщеплять вирусный геном по мутантному ITR, и в связи с этим в вирусный капсид будет упакован рекомбинантный вирусный геном, содержащий следующее в порядке от 5'- к 3'-концу: ITR AAV, первую гетерологичную полинуклеотидную последовательность, в том числе регуляторные последовательности, мутантный ITR AAV, второй гетерологичный полинуклеотид в обратной ориентации по отношению к первому гетерологичному полинуклеотиду и третий ITR AAV. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусматриваются вирусные частицы AAV, содержащие рекомбинантный вирусный геном, содержащий функциональный ITR AAV2, первую полинуклеотидную последовательность, кодирующую средство для RNAi согласно настоящему изобретению, мутантный ITR AAV2, характеризующийся делецией D-области и лишенный функциональной последовательности концевого разрешения, вторую полинуклеотидную последовательность, предусматривающую последовательность, комплементарную последовательности, кодирующей средство для RNAi согласно настоящему изобретению, в первой полинуклеотидной последовательности и функциональный ITR AAV2.
В некоторых вариантах осуществления вирусная частица представляет собой аденовирусную частицу. В некоторых вариантах осуществления аденовирусная частица представляет собой рекомбинантную аденовирусную частицу, например полинуклеотидный вектор, содержащий последовательность, кодирующую средство для RNAi согласно настоящему изобретению, находящуюся между двух ITR. В некоторых вариантах осуществления в аденовирусной частице отсутствует или она содержит дефектную копию одного или нескольких генов E1, которые делают аденовирус дефектным по репликации. Аденовирусы содержат линейный двухнитевой ДНК-геном внутри крупного (~950Å) не имеющего оболочки икосаэдрического капсида. Аденовирусы имеют крупный геном, который может включать в себя более 30 т. п. о. гетерологичной последовательности (например, вместо области E1 и/или E3), что делает их исключительно подходящими для применения с более крупными гетерологичными генами. Известно также, что они инфицируют делящиеся и неделящиеся клетки и обычно не интегрируются в геном хозяина (хотя гибридные варианты могут обладать такой способностью). В некоторых вариантах осуществления вектор на основе аденовируса может представлять собой вектор на основе аденовируса первого поколения с гетерологичной последовательностью вместо E1. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе аденовируса может представлять собой вектор на основе аденовируса второго поколения с дополнительными мутациями или делециями в E2A, E2B и/или E4. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе аденовируса может представлять собой вектор на основе аденовируса третьего поколения или "выпотрошенный" вектор на основе аденовируса, в котором отсутствуют все кодирующие вирус гены с сохранением только ITR и сигнала упаковки, и для репликации и упаковки которого требуется наличие аденовируса-помощника в транс-положении. Аденовирусные частицы исследовали в отношении возможности применения в качестве векторов для транзиентной трансфекции клеток млекопитающих, а также в качестве векторов для генной терапии. Для дополнительного описания см., например, Danthinne, X. и Imperiale, M.J. (2000) Gene Ther. 7:1707-14 и Tatsis, N. и Ertl, H.C. (2004) Mol. Ther. 10:616-29.
В некоторых вариантах осуществления вирусная частица представляет собой рекомбинантную аденовирусную частицу, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi согласно настоящему изобретению. Применение аденовируса любого серотипа рассматривается в пределах объема настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе рекомбинантного аденовируса представляет собой вектор, полученный из серотипа аденовируса, включающего без ограничения AdHu2, AdHu3, AdHu4, AdHu5, AdHu7, AdHu11, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad крупного рогатого скота типа 3, Ad собачьих типа 2, Ad овцы или Ad свиньи типа 3. Аденовирусная частица также содержит капсидные белки. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные вирусные частицы предусматривают аденовирусную частицу в комбинации с одним или несколькими капсидными белками стороннего вируса. Такие комбинации могут быть обозначены как псевдотипированные рекомбинантные аденовирусные частицы. В некоторых вариантах осуществления капсидные белки стороннего вируса, применяемые в создании псевдотипированных рекомбинантных аденовирусных частиц, получены из стороннего вируса или аденовируса другого серотипа. В некоторых вариантах осуществления капсидные белки стороннего вируса получены, в том числе без ограничения, из реовируса типа 3. Примеры комбинаций векторов и капсидных белков, применяемых в получении псевдотипированных аденовирусных частиц, можно найти в следующих литературных источниках (Tatsis, N. et al. (2004) Mol. Ther. 10(4):616-629 и Ahi, Y. et al. (2011) Curr. Gene Ther. 11(4):307-320). Для оптимизации трансдукции конкретных клеток-мишеней или для нацеливания на специфические типы клеток в пределах определенной ткани-мишени (например, ткани, пораженной заболеванием) можно применять аденовирусы различных серотипов. Ткани или клетки, на которые целенаправленно воздействуют аденовирусы конкретных серотипов, включают без ограничения ткани или клетки легкого (например, HuAd3), селезенки и печени (например, HuAd37), гладких мышц, синовиоциты, дендритные клетки, клетки сердечно-сосудистой системы, линии клеток опухолей (например, HuAd11) и дендритные клетки (например, HuAd5, псевдотипированные реовирусом типа 3, HuAd30 или HuAd35). Для дополнительного описания см. Ahi, Y. et al. (2011) Curr. Gene Ther. 11(4):307-320, Kay, M. et al. (2001) Nat. Med. 7(1):33-40 и Tatsis, N. et al. (2004) Mol. Ther. 10(4):616-629. Аденовирусные векторы вводили посредством интрастриарного введения (см., например, Mittoux, V. et al. (2002) J. Neurosci. 22:4478-86).
В некоторых вариантах осуществления вирусная частица представляет собой лентивирусную частицу. В некоторых вариантах осуществления лентивирусная частица представляет собой рекомбинантную лентивирусную частицу, например полинуклеотидный вектор, кодирующий средство для RNAi согласно настоящему изобретению, находящееся между двух LTR. Лентивирусы представляют собой ретровирусы с положительно-смысловой ssRNA с размером генома примерно 10 т. п. о. Известно, что лентивирусы интегрируются в геном делящихся и неделящихся клеток. Лентивирусные частицы можно получить, например, путем трансфекции множеством плазмид (обычно геном лентивируса и гены, необходимые для репликации и/или упаковки, разделены для предотвращения репликации вируса) в пакующую линию клеток, в которых модифицированный геном лентивируса пакуется в лентивирусные частицы. В некоторых вариантах осуществления лентивирусная частица может относиться к вектору первого поколения, у которого отсутствует ген белка оболочки. В некоторых вариантах осуществления лентивирусная частица может относиться к вектору второго поколения, у которого отсутствуют все гены, за исключением областей gag/pol и tat/rev. В некоторых вариантах осуществления лентивирусная частица может относиться к вектору третьего поколения, который содержит только эндогенные гены rev, gag и pol и имеет химерный LTR для трансдукции без гена tat (см. Dull, T. et al. (1998) J. Virol. 72:8463-71). Для дополнительного описания см. Durand, S. and Cimarelli, A. (2011) Viruses 3:132-59.
В некоторых вариантах осуществления вирусная частица представляет собой рекомбинантную лентивирусную частицу, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi согласно настоящему изобретению. Применение любого лентивирусного вектора рассматривается в пределах объема настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор получен из лентивируса, в том числе без ограничения вируса иммунодефицита человека 1 (HIV-1), вируса иммунодефицита человека 2 (HIV-2), вируса иммунодефицита обезьян (SIV), вируса иммунодефицита кошек (FIV), вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV), вируса иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV), вируса заболевания Джембрана (JDV), вируса Висна (VV) и вируса артрита-энцефалита коз (CAEV). Лентивирусная частица также содержит капсидные белки. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные вирусные частицы содержат вектор на основе лентивируса в комбинации с одним или несколькими капсидными белками стороннего вируса. Такие комбинации могут быть обозначены как псевдотипированные рекомбинантные лентивирусные частицы. В некоторых вариантах осуществления капсидные белки стороннего вируса, применяемые в создании псевдотипированных рекомбинантных лентивирусных частиц, получены из стороннего вируса. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок стороннего вируса, применяемый в создании псевдотипированных рекомбинантных лентивирусных частиц, представляет собой гликопротеин вируса везикулярного стоматита (VSV-GP). VSV-GP взаимодействует с универсальным клеточным рецептором, обеспечивая широкий тканевый тропизм для псевдотипированных рекомбинантных лентивирусных частиц. Кроме того, считается, что VSV-GP обеспечивает более высокую стабильность псевдотипированных рекомбинантных лентивирусных частиц. В других вариантах осуществления капсидные белки стороннего вируса получены, в том числе без ограничения, из вируса Чандипура, вируса бешенства, вируса Мокола, вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), вируса реки Росс (RRV), вируса Синдбис, вируса леса Семлики (SFV), вируса венесуэльского энцефалита лошадей, эболавируса Рестон, эболавируса Заир, вируса Марбург, вируса Ласса, вируса лейкоза птиц (ALV), ретровируса легочного аденоматоза овец (JSRV), вируса лейкоза мышей Молони (MLV), вируса лейкоза гиббонов (GALV), эндогенного ретровируса кошек (RD114), Т-лимфотропного вируса человека 1 (HTLV-1), пенящегося вируса человека, вируса Меди-Висна (MVV), SARS-CoV, вируса Сендай, респираторно-синцитиального вируса (RSV), вируса парагриппа человека типа 3, вируса гепатита С (HCV), вируса гриппа, вируса чумы домашней птицы (FPV) или вируса множественного ядерного полиэдроза Autographa californica (AcMNPV). Примеры комбинаций векторов и капсидных белков, применяемых в создании псевдотипированных лентивирусных частиц, можно найти, например, в Cronin, J. et al. (2005). Curr. Gene Ther. 5(4):387-398. Для оптимизации трансдукции определенных клеток-мишеней или для нацеливания на специфичные типы клеток в пределах определенной ткани-мишени (например, пораженной заболеванием ткани) можно использовать различные псевдотипированные рекомбинантные лентивирусные частицы. Например, ткани, на которые целенаправленно воздействуют конкретными псевдотипированными рекомбинантными лентивирусными частицами, включают без ограничения ткань печени (например, псевдотипированными F-белком VSV-G, LCMV, RRV или SeV), легкого (например, псевдотипированными белком вирусов Эбола, Марбург, F-белком и HN-белком SeV или белком JSRV), островковые клетки поджелудочной железы (например, псевдотипированными белком LCMV), ткань центральной нервной системы (например, псевдотипированными белком VSV-G, LCMV, вируса бешенства или Мокола), ткань сетчатки (например, псевдотипированными белком VSV-G или вируса Мокола), моноциты или мышцы (например, псевдотипированными белком вируса Мокола или Эбола), ткань гематопоэтической системы (например, псевдотипированными белком RD114 или GALV) или раковые клетки (например, псевдотипированными белком GALV или LCMV). Для дополнительного описания см. Cronin, J. et al. (2005). Curr. Gene Ther. 5(4):387-398 и Kay, M. et al. (2001) Nat. Med. 7(1):33-40.
В некоторых вариантах осуществления вирусная частица представляет собой частицу вируса простого герпеса (HSV). В некоторых вариантах осуществления частица HSV представляет собой частицу rHSV, например полинуклеотидный вектор, кодирующий средство для RNAi согласно настоящему изобретению, находящееся между двух TR. HSV представляет собой вирус с двухнитевой ДНК, покрытой оболочкой, с размером генома примерно 152 т. п. о. Преимущественно, примерно половина его генов является несущественной и может быть удалена, чтобы вместить гетерологичную последовательность. Частицы HSV инфицируют неделящиеся клетки. Кроме того, в норме они переходят в неактивное состояние в нейронах, перемещаются с помощью ретроградного транспорта и могут переноситься через синапсы, что делает их преимущественными для трансфекции нейронов и/или для подходов на основе генной терапии, задействующих нервную систему. В некоторых вариантах осуществления частица HSV может быть дефектной по репликации или репликационно компетентной (например, компетентной в отношении одного цикла репликации посредством инактивации одного или нескольких "поздних" генов). Для дополнительного описания см. Manservigi, R. et al. (2010) Open Virol. J. 4:123-56.
В некоторых вариантах осуществления частица rHSV содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi согласно настоящему изобретению. Применение любого вектора на основе HSV рассматривается в пределах объема настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе HSV получен из серотипа HSV, в том числе без ограничения HSV-1 и HSV-2. Частица HSV также содержит капсидные белки. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные вирусные частицы содержат вектор на основе HSV в комбинации с одним или несколькими капсидными белками стороннего вируса. Такие комбинации могут быть обозначены как псевдотипированные частицы rHSV. В некоторых вариантах осуществления капсидные белки стороннего вируса, применяемые в создании псевдотипированных частиц rHSV, получены из стороннего вируса или HSV другого серотипа. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок стороннего вируса, применяемый в создании псевдотипированной частицы rHSV, представляет собой гликопротеин вируса везикулярного стоматита (VSV-GP). VSV-GP взаимодействует с универсальным клеточным рецептором, обеспечивая широкий тканевый тропизм для псевдотипированных частиц rHSV. Кроме того, считается, что VSV-GP обеспечивает более высокую стабильность псевдотипированных частиц rHSV. В других вариантах осуществления капсидный белок стороннего вируса может происходить из HSV другого серотипа. Например, вектор HSV-1 может содержать один или несколько капсидных белков HSV-2. Для оптимизации трансдукции определенных клеток-мишеней или для нацеливания на специфичные типы клеток в пределах определенной ткани-мишени (например, пораженной заболеванием ткани) можно использовать HSV различных серотипов. Ткани или клетки, на которые целенаправленно воздействуют аденовирусы конкретных серотипов, включают без ограничения ткани и клетки центральной нервной системы и нейроны (например, HSV-1). Для дополнительного описания см. Manservigi, R. et al. (2010) Open Virol J 4:123-156, Kay, M. et al. (2001) Nat. Med. 7(1):33-40 и Meignier, B. et al. (1987) J. Infect. Dis. 155(5):921-930.
Получение вирусных частиц
Частицы rAAV можно получать с помощью способов, известных из уровня техники. См., например, патенты США №№ 6566118; 6989264 и 6995006. При практическом осуществлении настоящего изобретения клетки-хозяева для продуцирования частиц rAAV включают в себя клетки млекопитающих, клетки насекомых, растительные клетки, микроорганизмы и дрожжи. Клетки-хозяева также могут представлять собой упаковывающие клетки, в которых гены rep и cap AAV стабильно сохраняются в клетке-хозяине или клетках-продуцентах, в которых стабильно сохраняется геном вектора AAV. Иллюстративные упаковывающие клетки и клетки-продуценты получены из клеток 293, A549 или HeLa. Векторы AAV очищают и составляют с помощью стандартных методик, известных из уровня техники.
Из уровня техники известны способы получения векторов на основе rAAV, в том числе без ограничения трансфекция, получение стабильных линий клеток и применение продуцирующих систем на основе инфекционных гибридных вирусов, которые включают гибриды аденовирус-AAV, гибриды герпесвирус-AAV (Conway, JE et al., (1997) J. Virology 71(11):8780-8789) и гибриды бакуловирус-AAV. Для всех продуцирующих культур rAAV для продуцирования вирусных частиц rAAV требуются: 1) подходящие клетки-хозяева, в том числе, например, линии клеток, полученные от человека, такие как клетки HeLa, A549 или 293 или линии клеток, полученные от насекомых, такие как SF-9, в случае продуцирующих систем на основе бакуловирусов; 2) подходящие функциональные элементы вируса-помощника, обеспечиваемые аденовирусом дикого типа или мутантным аденовирусом (таким как термочувствительный аденовирус), вирусом герпеса, бакуловирусом или плазмидной конструкцией, обеспечивающей вспомогательные функции; 3) гены и продукты генов rep и cap AAV; 4) нуклеиновая кислота (такая как терапевтическая нуклеиновая кислота), фланкированная по меньшей мере одной последовательностью ITR AAV; и 5) подходящие среды и компоненты сред, обеспечивающие возможность продуцирования rAAV. В некоторых вариантах осуществления продукты генов rep и cap AAV могут происходить из AAV любого серотипа. В целом, но не обязательно, продукт гена rep AAV относится к тому же серотипу, что и ITR из генома вектора на основе rAAV, при условии, что продукты гена rep могут обеспечивать возможность репликации и упаковки генома rAAV. Для получения векторов на основе rAAV можно применять подходящие среды, известные из уровня техники. Эти среды включают без ограничения среды, производимые Hyclone Laboratories и JRH, в том числе модифицированную среду Игла (MEM), среду Игла, модифицированную по Дульбекко (DMEM), изготавливаемые по заказу составы, такие как описанные в патенте США № 6566118, и среду Sf-900 II SFM, описанную в патенте США № 6723551, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, в особенности в отношении изготавливаемых по заказу составов сред для применения в получении рекомбинантных векторов на основе AAV. В некоторых вариантах осуществления функциональные элементы помощника AAV представлены аденовирусом или HSV. В некоторых вариантах осуществления функциональные элементы помощника AAV представлены бакуловирусом, и клетка-хозяин представляет собой клетку насекомого (например, клетки Spodoptera frugiperda (Sf9)).
В некоторых вариантах осуществления частицы rAAV можно получать с помощью способа тройной трансфекции, такого как иллюстративный способ тройной трансфекции, приведенный ниже. Вкратце, плазмиду, содержащую ген rep и ген капсида, вместе с аденовирусной плазмидой-помощником можно ввести путем трансфекции (например, с применением способа с использованием фосфата кальция) в линию клеток (например, клетки HEK-293), и вирус можно собирать и необязательно очищать. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления частица rAAV была получена с помощью введения путем тройной трансфекции нуклеиновой кислоты, кодирующей вектор на основе rAAV, нуклеиновой кислоты, кодирующей rep и cap AAV, и нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональные элементы вируса-помощника AAV, в клетку-хозяина, при этом введение путем трансфекции нуклеиновых кислот в клетки-хозяева приводит к получению клетки-хозяина, способной продуцировать частицы rAAV.
В некоторых вариантах осуществления частицы rAAV могут быть получены с помощью способа с использованием линии клеток-продуцентов, такого как иллюстративный способ с использованием линии клеток-продуцентов, приведенный ниже (см. также упоминаемый в Martin et al., (2013) Human Gene Therapy Methods 24:253-269). Вкратце, линию клеток (например, линию клеток HeLa) можно стабильно трансфицировать плазмидой, содержащей ген rep, ген капсидного белка и промотор-гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты. Линии клеток можно подвергать скринингу для выбора лидерного клона для продуцирования rAAV, который можно затем размножать в производственном биореакторе и инфицировать аденовирусом (например, аденовирусом дикого типа) в качестве хелпера для инициирования продуцирования rAAV. Вирус можно затем собирать, аденовирус можно инактивировать (например, под действием тепла) и/или удалять, а частицы rAAV можно очищать. В связи с этим, в некоторых вариантах осуществления частицу rAAV получали с помощью линии клеток-продуцентов, содержащих одну или несколько из нуклеиновой кислоты, кодирующей вектор на основе rAAV, нуклеиновой кислоты, кодирующей rep и cap AAV, и нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональные элементы вируса-помощника AAV.
В некоторых аспектах предусмотрен способ получения любой частицы rAAV, раскрытой в данном документе, включающий (a) культивирование клетки-хозяина в условиях, которые обеспечивают получение частиц rAAV, где клетка-хозяин содержит (i) один или несколько генов AAV, обеспечивающих упаковку, при этом каждый указанный ген AAV, обеспечивающий упаковку, кодирует белок AAV, участвующий в репликации и/или заключении в капсид; (ii) провектор на основе rAAV, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi согласно настоящему изобретению, описанное в данном документе, фланкированную по меньшей мере одним ITR AAV, и (iii) хелперный функциональный элемент AAV; и (b) извлечение частиц rAAV, продуцируемых клеткой-хозяином. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi содержит нуклеотидную последовательность под SEQ ID NO:7. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один указанный ITR AAV выбран из группы, состоящей из ITR AAV с капсидом серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, AAV козы, AAV крупного рогатого скота или AAV мыши т. п. В некоторых вариантах осуществления указанный белок, участвующий в заключении в капсид, выбран из группы, состоящей из белков AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 (например, капсида AAV6 дикого типа или капсида вариантного AAV6, такого как ShH10, как описано в публикации заявки на патент США 2012/0164106), AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9 (например, капсида AAV9 дикого типа или капсида модифицированного AAV9, как описано в публикации заявки на патент США 2013/0323226), AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, мутантного по тирозину капсида, мутантного капсида с гепарин-связывающим мотивом, капсида AAV2R471A, капсида AAVAAV2/2-7m8, капсида AAV DJ (например, капсида AAV-DJ/8, капсида AAV-DJ/9 или любого другого из капсидов, описанных в публикации заявки на патент США 2012/0066783, опубликованной до выдачи патента), капсида AAV2 N587A, капсида AAV2 E548A, капсида AAV2 N708A, капсида AAV V708K, капсида AAV козы, химерного капсида AAV1/AAV2, капсида AAV крупного рогатого скота, капсида AAV мыши, капсида rAAV2/HBoV1, капсида AAV, как описано в патенте США № 8283151 или в Международной публикации № WO/2003/042397. В некоторых вариантах осуществления мутантный капсидный белок сохраняет способность образовывать капсид AAV. В некоторых вариантах осуществления белок, участвующий в заключении в капсид, представляет собой мутантный по тирозину белок AAV5, участвующий в заключении в капсид. В дополнительных вариантах осуществления частица rAAV содержит капсидные белки серотипа AAV из клад A-F. В некоторых вариантах осуществления частицы rAAV содержат капсид AAV1 и рекомбинантный геном, содержащий ITR AAV2, ITR мутантного AAV2 и нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi согласно настоящему изобретению. В дополнительном варианте осуществления частицы rAAV подвергают очистке. Термин "очищенный", используемый в данном документе, подразумевает препарат на основе частиц rAAV, в котором отсутствуют по меньшей мере некоторые другие компоненты, которые могут также присутствовать в среде, где частицы rAAV находятся в естественном состоянии или из которой они изначально получены. Таким образом, например, выделенные частицы rAAV можно получать с использованием методики очистки для обогащения ими исходной смеси, такой как лизат культуры или надосадочная жидкость культуры для продуцирования. Обогащение можно измерять с помощью множества способов, таких как, например, по доле устойчивых к ДНКазе частиц (DRP) или по числу копий генома (gc), присутствующих в растворе, или по инфекционности, либо его можно измерять по отношению ко второму потенциально мешающему веществу, присутствующему в исходной смеси, такому как загрязняющие вещества, в том числе загрязняющие вещества из культуры для продуцирования или загрязняющие вещества, образуемые в ходе продуцирования, включающие в себя вирус-помощник, компоненты среды и т. п.
Множество способов получения частиц, представляющих собой аденовирусные векторы, известны из уровня техники. Например, в случае "выпотрошенного" аденовирусного вектора, геном аденовирусного вектора и геном аденовируса-помощника можно вводить путем трансфекции в пакующую линию клеток (например, линию клеток 293). В некоторых вариантах осуществления геном аденовируса-помощника может содержать сайты рекомбинации, фланкирующие его сигнал упаковки, и оба генома можно вводить путем трансфекции в пакующую линию клеток, которые экспрессируют рекомбиназу (например, можно применять систему Cre/loxP), вследствие чего вектор на основе аденовируса, представляющий интерес, упаковывается более эффективно, чем аденовирус-помощник (см., например, Alba, R. et al. (2005) Gene Ther. 12 Suppl 1:S18-27). Аденовирусные векторы можно собирать и очищать с использованием стандартных способов, таких как описанные в данном документе.
Из уровня техники известно множество способов получения частиц, представляющих собой лентивирусные векторы. Например, в случае вектора на основе лентивируса третьего поколения, вектор, содержащий лентивирусный геном, представляющий интерес, с генами gag и pol, вместе с вектором, содержащим ген rev, можно ввести путем совместной трансфекции в пакующую линию клеток (например, линию клеток 293). Лентивирусный геном, представляющий интерес, также содержит химерный LTR, который способствует осуществлению транскрипции в отсутствие Tat (см. Dull, T. et al. (1998) J. Virol. 72:8463-71). Лентивирусные векторы можно собирать и очищать с использованием способов (например, Segura MM, et al., (2013) Expert Opin Biol Ther. 13(7):987-1011), описанных в данном документе.
Из уровня техники известно множество способов получения частиц HSV. Векторы на основе HSV можно собирать и очищать с использованием стандартных способов, таких как описанные в данном документе. Например, в случае вектора на основе дефектного по репликации HSV, геном HSV, представляющий интерес, в котором отсутствуют все немедленно-ранние (IE) гены, можно вводить путем трансфекции в дополняющую линию клеток, которые предоставляют гены, необходимые для продуцирования вирусов, как например ICP4, ICP27 и ICP0 (см., например, Samaniego, L.A. et al. (1998) J. Virol. 72:3307-20). Векторы на основе HSV можно собирать и очищать с использованием описанных способов (например, Goins, WF et al., (2014) Herpes Simplex Virus Methods in Molecular Biology 1144:63-79).
Также в данном документе предусматриваются фармацевтические композиции, содержащие рекомбинантную вирусную частицу, содержащую трансген, кодирующий средство для RNAi согласно настоящему изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции могут подходить для любого способа введения, описанного в данном документе. Фармацевтическую композицию на основе рекомбинантной вирусной частицы, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi согласно настоящему изобретению, можно вводить в головной мозг. Например, рекомбинантную вирусную частицу, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi согласно настоящему изобретению, можно вводить интрастриарным путем. Можно применять любую из рекомбинантных вирусных частиц согласно настоящему изобретению, в том числе rAAV, аденовирусные, лентивирусные и HSV-частицы.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции, содержащие рекомбинантную вирусную частицу, содержащую трансген, кодирующий средство для RNAi согласно настоящему изобретению, описанное в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель, являются подходящими для введения человеку. Такие носители хорошо известны из уровня техники (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, pp. 1035-1038 и 1570-1580). В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции, содержащие частицу rAAV, описанную в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель, являются подходящими для введения посредством инъекции в головной мозг млекопитающего (например, посредством интрастриарного введения). В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции, содержащие рекомбинантную лентивирусную частицу, описанную в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель, являются подходящими для введения посредством инъекции в головной мозг млекопитающего (например, посредством интрастриарного введения). В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции, содержащие рекомбинантную аденовирусную частицу, описанную в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель, являются подходящими для введения посредством инъекции в головной мозг млекопитающего (например, посредством интрастриарного введения). В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции, содержащие рекомбинантную частицу HSV, описанную в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель, являются подходящими для введения посредством инъекции в головной мозг млекопитающего (например, посредством интрастриарного введения).
Такими фармацевтически приемлемыми носителями могут быть стерильные жидкости, такие как вода и масло, в том числе масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло и т. п. В качестве жидких носителей, в частности для инъекционных растворов, также могут использоваться солевые растворы и водные растворы декстрозы, полиэтиленгликоля (PEG) и глицерина. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать дополнительные ингредиенты, например, консерванты, буферы, вещества, регулирующие тоничность, антиоксиданты и стабилизаторы, неионные смачивающие или осветляющие средства, загустители и т. п. Фармацевтические композиции, описанные в данном документе, могут быть упакованы в единичные дозированные формы или в многодозовые формы. Как правило, композиции составляют в виде стерильного и по сути изотонического раствора.
VII. Изделия и наборы
Также предусматриваются наборы или изделия для применения в способах, описанных в данном документе. В определенных аспектах наборы содержат композиции, описанные в данном документе (например, рекомбинантную вирусную частицу согласно настоящему изобретению, такую как частица rAAV, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi согласно настоящему изобретению), находящиеся в подходящей упаковке. Подходящая упаковка для описанных в данном документе композиций (таких как композиции для интрастриарного введения), известна в данной области техники и включает, например, флаконы (такие как запечатанные флаконы), сосуды, ампулы, бутылки, банки, гибкую упаковку (например герметизированные пакеты Майлара или пластиковые пакеты) и т. п. Такие изделия можно дополнительно стерилизовать и/или герметизировать.
В настоящем изобретении также предусматриваются наборы, содержащие описанные в данном документе композиции, и они могут дополнительно содержать инструкцию(инструкции) по способам применения композиции, таким как способы применения, описанные в данном документе. Наборы, описанные в данном документе, могут дополнительно содержать другие материалы, требуемые с коммерческой и потребительской точки зрения, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши с инструкциями для выполнения любых способов, описанных в данном документе. Например, в некоторых вариантах осуществления набор содержит композицию на основе рекомбинантных вирусных частиц, содержащих трансген, кодирующий средство для RNAi согласно настоящему изобретению, для доставки по меньшей мере 1 × 109 копий генома в головной мозг млекопитающего (например, посредством интрастриарного введения) примату, описанному в данном документе, фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для инъекции в головной мозг примата, и одно или несколько из буфера, разбавителя, фильтра, иглы, шприца и вкладыша с инструкциями по выполнению инъекций в головной мозг примата (например, посредством интрастриарного введения). В некоторых вариантах осуществления набор содержит инструкции по лечению болезни Хантингтона с помощью рекомбинантных вирусных частиц, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления набор содержит инструкции по применению рекомбинантных вирусных частиц, описанных в данном документе, в соответствии с любым из способов, описанных в данном документе.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение будет более понятным со ссылкой на следующие примеры. Тем не менее, их не следует истолковывать как ограничивающие объем настоящего изобретения. Понятно, что описанные в данном документе примеры и варианты осуществления служат только в качестве иллюстрации, и что различные модификации или изменения с их учетом будут понятны специалистам в данной области техники, и они должны быть включены в сущность и содержание данной заявки, а также объем прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1. AAV2/1-miRNA-Htt снижает уровень экспрессии Htt in vitro
РНК-интерференция (RNAi) обеспечивает подход для лечения многих заболеваний у человека. Однако безопасность терапевтических средств для RNAi может ограничиваться способностью малых ингибирующих РНК (siRNA) связываться с мРНК, не являющимися мишенями, и снижать уровень их экспрессии, при этом данный эффект известен как нецелевой сайленсинг генов. Нецелевое воздействие главным образом происходит при спаривании затравочной области (нуклеотиды 2-8 малой РНК) с последовательностями в 3′-UTR мРНК, не являющихся мишенями, что приводит при этом к трансляционной репрессии и дестабилизации данных транскриптов. На сегодняшний день последовательности большинства терапевтических средств для RNAi выбирают, в первую очередь, для обеспечения эффективности сайленсинга генов, а затем оценивают их в отношении безопасности. Для лечения болезни Хантингтона (HD), доминантного нейродегенеративного нарушения, получали две siRNA с минимальным потенциалом нецелевого воздействия (т. е. последовательности с недостаточной комплементарностью затравочной последовательности в отношении всех известных 3′-UTR человека и обезьяны-резуса), которые демонстрировали эффективный сайленсинг хантингтина в головном мозге мыши с низким профилем нецелевого воздействия in silico (таблица 1, фиг. 1A). Тестировали способность одной последовательности (207) восстанавливать поведенческие фенотипы на модели HD на основе мышей YAC128. Доставка AAV2/1-miRNA-Htt-207 в полосатое тело не только уменьшает уровни мРНК Htt и белка в головном мозге, но также корректирует аномальные поведенческие профили у мышей YAC128, и демонстрирует большую активность направляющей нити и точный 5'-процессинг, минимизируя возможные эффекты нецелевого воздействия.
ТАБЛИЦА 1. Последовательности miRNA и обратного комплемента (мишени) для 206 и 207, а также верхняя и нижняя последовательности для встраивания, включая выступающие участки, представляющие собой сайты рестрикции
(смысловая, 5'→3')
CGGTTTTGGCCACTGACTGA
CCGGGTCCAATGGACGGCCA
CGGUUUUGGCCACUGACUGA
CCGGGUCCAAUGGACGGCCA
GACCCGGTTTTGGCCACTGA
CTGACCGGGTCCAATGGACG
GCCA
CCG
GTCAGTCAGTGGCCAAA
ACCGGGTCCAAGATGGACGG
CCAC
(смысловая, 5'→3')
GTTTTGGCCACTGACTGACTG
CTTGTCCCACACCGACT
GUUUUGGCCACUGACUGACUG
CUUGUCCCACACCGACU
CAAGCAGTTTTGGCCACTGA
CTGACTGCTTGTCCCACACC
GACT
GCA
GTCAGTCAGTGGCCAAA
ACTGCTTGTCAACCACACCG
ACTC
*Для последовательностей для встраивания выступающие участки, представляющие собой сайты рестрикции, для встраивания являются подчеркнутыми; последовательности miRNA выделены жирным; петлевая последовательность приведена с помощью обычного текста; основания 1-8 miRNA обратного комплемента выделены жирным курсивом; основания 11-21 (11-20 для 170XX) обратного комплемента miRNA выделены курсивом.
Способность AAV2/1-miRNA-Htt 206 и 207 опосредовать снижение мРНК человеческого хантингтина тестировали in vitro с применением клеток эмбриональной почки человека (HEK293). Клетки HEK293 трансфицировали (8 повторов на обработку) плазмидами экспрессии AAV2/1-miRNA-206 и 207, а также плазмидами (170XA), представляющими собой положительный контроль, содержащими последовательность miRNA, ранее демонстрировавшей обеспечение уменьшения уровней Htt на примерно 50%. Клетки трансфицировали с применением реагента для трансфекции Fugene, и собирали их спустя 48 часов. Общую РНК выделяли с применением набора TaqMan® Cells-to-CT™ (Ambion). Уровни РНК измеряли с помощью количественной RT-PCR в режиме реального времени (которую выполняли и анализировали на ABI Prism 7500 Sequence Detector (Applied Biosystems)). Уровни экспрессии нормализовали по уровням PPIA (пептидил-пролил-изомеразы) человека. Как показано на фиг. 2, уровни мРНК Htt человека уменьшались после транфекции как плазмидой 206, так и плазмидой 207 по сравнению с необработанными необработанными контролями. Уровень снижения Htt был почти эквивалентен в сравнении с положительным контролем 170XA.
Пример 2. AAV2/1-miRNA-Htt снижает уровень экспрессии Htt in vivo
Тестировали способность AAV2/1-miRNA-206 и 207 уменьшать уровни белка HTT в полосатом теле мышей YAC128 с HD. Взрослые мыши YAC128 получали билатеральные интрастриарные инъекции AAV2/1-miRNA-Htt 206 (1e10 vg/участок), или AAV2/1-miRNA-Htt 207 (1e10 vg/участок), или AAV2/1-CTL3 (контроль в виде некодирующей miRNA) (1e10 vg/участок). Через один месяц после инъекции AAV животных умерщвляли и проводили перфузию с помощью PBS. Образцы головного мозга собирали для гистологических и биохимических анализов. Для биохимических анализов область полосатого тела одного полушария подвергали микродиссекции и мгновенной заморозке в жидком азоте. Уровни мРНК мутантного Htt человека и мыши, а также уровни мутантного белка HTT человека и мыши в полосатом теле оценивали с помощью QPCR и вестерн-блоттинга соответственно. Уровни мРНК мутантного Htt человека и Htt мыши были значительно снижены у мышей, которым вводили AAV2/1-miRNA-Htt 206 и AAV2/1-miRNA-Htt 207, по сравнению с контрольными животными, которым вводили CTL3 (фиг. 3A). PPIA служил в качестве контрольного гена для нормализации для всех анализов QPCR. Уровни мутантного белка HTT человека и мыши были значительно снижены у всех мышей, которым вводили AAV2/1-miRNA-Htt, по сравнению с контрольными животными, которым вводили CTL3, и при этом отмечали эквивалентную степень снижения (примерно 50%, p<0,05) для всех обработок (фиг. 3B). Бета-тубулин служил в качестве контрольного гена для нормализации для всех вестерн-блот-анализов.
Оценивали эффект AAV2/1-miRNA-Htt 206 и 207 в отношении веса головного мозга и тела мышей YAC128. Вес тел животных в день хирургии сравнивали с весом тел в день умерщвления, через 1 месяц после иньекции (фиг. 4A). Не наблюдали отличий между AAV2/1-miRNA-Htt 206 и 207 по сравнению с CTL3-контролем. Все мыши выглядели здоровыми, активными и восприимчивыми через один месяц после обработки, и не наблюдалось потери веса в любой группе с обработкой. После перфузии PBS и препарирования головного мозга регистрировали показатели веса головного мозга. Наблюдали статистически значимое повышение в показателях веса головного мозга мышей YAC128, обработанных AAV2/1-miRNA-Htt 206 и 207, в сравнении с контрольными мышами, которых обрабатывали CTL3 (фиг. 4B).
Пример 3. AAV2/1-miRNA-Htt корректирует поведенческие и координационные нарушения у мышей YAC128
Оценивали способность доставки AAV2/1-miRNA-Htt-207 в полосатое тело корректировать аномальные поведенческие фенотипы у мышей YAC128. Также оценивали влияние опосредованного AAV2/1-miRNA-Htt 207 снижения уровней мутантного Htt на хорошо изученные фенотипические нарушения, имеющие место в модели HD на основе мышей YAC128. Подобранные по возрасту (3 месяца) мыши YAC128 и FVB дикого типа из одного помета получали билатеральные интрастриарные инъекции либо AAV2/1-miRNA-Htt-207 (2e10 vg/участок), либо контрольного вектора AAV2/1-CTL3 (2e10 vg/участок). Мышей подвергали поведенческому тестированию и умерщвляли через 3 месяца после обработки. Вестерн-блот анализ гомогенатов головного мозга показал, что уровни белков мутантного HTT человека были существенно снижены в полосатом теле мышей YAC128 и мышей FVB дикого типа из одного помета, которым вводили AAV2/1-miRNA-Htt-207 (примерно 50% снижение, p<0,01), по сравнению с контрольными мышами, которых обрабатывали AAV2/1-CTL3. Уровни мышиного белка HTT не подвергались значительному уменьшению в данном исследовании (фиг. 5A и 5B). Анализ с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени показал, что также достигалось соответствующее снижение уровней мРНК (фиг. 5С и 5D).
Сообщалось, что у мышей YAC128 обнаруживались нарушения моторной координации (которые можно было выявить с помощью теста "вращающийся стержень") и депрессивный фенотип (который можно было выявить с помощью теста "вынужденного плавания" по Порсолту) начиная с 3-месячного возраста (Slow et al., 2003, Van Raamsdonk et al., 2007). Тестирование с вращающимся стержнем мышей YAC128, которых обрабатывали AAV2/1-CTL3, через 3 месяца после инъекции показало наличие серьезных нарушения моторной координации по сравнению с мышами дикого типа из одного помета, обработанными AAV2/1-CTL3 (ANOVA, p<0,05) (фиг. 6A). Однако в случае мышей YAC128, которых обрабатывали AAV2/1-miRNA-Htt-207, наблюдали показатели функционирования, которые были неотличимы от таковых у мышей дикого типа (ANOVA, апостериорный критерий Тьюки, 207 WT по сравнению с 207 YAC128, p=NS; WT CTL3 по сравнению с YAC128 CTL3, p <0,05). Следовательно, частичное снижение уровней мутантного Htt было достаточным для коррекции двигательных нарушений у мышей YAC128. Значимых различий по результатам теста с вращающимся стержнем между мышами дикого типа, которые получали AAV2/1-miRNA-Htt-207, и мышами дикого типа, которые получали AAV2/1-CTL3, не наблюдалось. В предыдущих сообщениях отмечалось, что у мышей YAC128 проявлялся депрессивный фенотип, который можно было выявить с применением теста "вынужденного плавания" по Порсолту (Pouladi et al., 2009). Считалось, что у животных проявляется депрессивное состояние, если они неподвижны в течение длительного периода времени после помещения их в контейнер с водой. Используя базовый тест на скорость плавания (когда измеряется латентный период плавания до достижения платформы), исследователи продемонстрировали, что депрессивный фенотип в тесте "вынужденного плавания" по Порсолту не связан с со способностью мышей YAC128 к плаванию и не зависит от хорошо известных нарушений моторной координации, наблюдаемых в этой модели (Pouladi et al., 200). Трехмесячным мышам YAC128 и WT из одного помета вводили векторы, предусматривающие AAV2/1-miRNA-Htt-207 или AAV2/1-CTL3, и тестировали спустя 3 месяца с помощью теста "вынужденного плавания" по Порсолту. Для мышей YAC128, обработанных CTL3, наблюдался увеличенный период времени пребывания в неподвижном состоянии по сравнению либо с мышами YAC, обработанными AAV2/1-miRNA-Htt-207, либо животными дикого типа, обработанными AAV2/1-CTL3 (фиг. 6B, ANOVA p <0,05). Опять же, значимых различий по результатам в случае мышей дикого типа, которые получали либо AAV2/1-miRNA-Htt, либо AAV2/1-CTL3, не наблюдалось. Мыши YAC128, которым вводили AAV2/1-miRNA-Htt-207, проводили значительно меньше времени в неподвижном состоянии, чем контрольные мыши, обработанные AAV2/1-CTL3. Действительно, показатели у мышей YAC128, обработанных AAV2/1-miRNA-Htt-207, были схожими с таковыми у их однопометников дикого типа, что свидетельствует о практически полной коррекции этого аномального фенотипа (ANOVA, апостериорный критерий Тьюки, 207 YAC по сравнению с CTL3 YAC, p<0,05).
Оценивали эффект AAV2/1-miRNA-Htt 207 в отношении веса головного мозга и тела мышей YAC128. Вес тел животных в день хирургии сравнивали с весом тел в день умерщвления, через 3 месяца после инъекции. Не наблюдали отличий в весе тела между мышами, обработанными AAV2/1-miRNA-Htt 207, по сравнению с контрольными мышами, обработанными CTL3 (фиг. 7A). Все мыши выглядели здоровыми, активными и восприимчивыми через три месяца после обработки, и не наблюдалось потери веса в любой группе с обработкой. После перфузии PBS и препарирования головного мозга регистрировали показатели веса головного мозга. Не наблюдали отличий в весе головного мозга между мышами YAC128, обработанными AAV2/1-miRNA-Htt 207, по сравнению с контрольными мышами, обработанными CTL3 (фиг. 7B).
Пример 4. miRNA демонстрирует высокую активность направляющей нити и точный 5'-процессинг после доставки in vivo
Мышей YAC128 обрабатывали AAV2/1-miRNA-Htt 206 или AAV2/1-miRNA-Htt 207 с помощью внутричерепной инъекции. После обработки удаляли полосатое тело и выделяли общую РНК. Конструировали библиотеки малой РНК для секвенирования с применением набора для получения библиотек малых РНК NEBNext (New England Biolabs), и секвенирование проводили с помощью прибора Illumina MiSeq. Образцы, полученные от 2 отдельных мышей, анализировали для каждой обработки. В данном документе показан общий показатель прочтений для всех miRNA, включая эндогенные последовательности, а также общий показатель прочтений для направляющей и сопровождающей нитей для каждого вектора обработки. Обработку вектором AAV2/1-miRNA-Htt 202T включали в данный эксперимент в качестве контроля, так как его секвенировали ранее. Процент ожидаемого начального положения для каждой направляющей и сопровождающей нити составлял >99%, и вектор 207 имел высокое соотношение направляющая:сопровождающая нить, составляющее 76,1% и 79,3%.
Таблица 2. Активность направляющей нити и 5'-процессинг
Пример 5. Самокомплементарный вектор miRHtt207
Кассета экспрессии miRHtt 207 может быть упакована как самокомплементарный геном вектора. Для достижения этого плазмиды с ITR сконструированы так, чтобы их размер составлял 2,3 т. п. о., это облегчает упаковку димерного вектора размером 4,6 т. п. о.; причем 4,6 т. п. о. представляет собой пакующую способность вектора AAV. Плазмиды с ITR могут быть сконструированы с наличием 5'WT ITR и усеченного мутантного 3 ‘ITR (∆ ITR) с делецией D-области, как изображено на фиг. 8. Прогнозируемые геномы векторов, которые могут быть упакованы, представляют собой самокомплементарный геном вектора, размер которого составляет 3165 п. о. и который будет содержать 5' и 3' WT ITR и третий внутренний дельта ITR (например, химерный интрон). Дополнительно ожидается, что некоторые мономерные геномы векторов могут быть упакованы и их размер будет составлять 1656 п. о.
Альтернативный подход для получения самокомплементарного вектора на основе AAV miRHtt 207, т. е. упаковки двух геномов векторов на капсид, будет предусматривать образование однонитевого, т. е. с размером 1755 п. о., генома вектора, в результате чего две копии геномов векторов подвергаются упаковке в виде промежуточных молекул репликации размером 3365 п. о. (фиг. 9). В этом примере плазмиды с ITR будут содержать 5' и 3' WT ITR, а промежуточная молекула репликации размером 3365 п. о. будет содержать три WT ITR, предусматривающих по одному с 5'- и 3'-концов и один внутренний ITR. Одноцепочечные молекулы генома вектора размером 1755 п. о. также можно подвергать упаковке.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
Все полипептидные последовательности представлены в направлении от N-конца к C-концу, если не указано иначе. Все последовательности нуклеиновых кислот представлены в направлении от 5'- к 3'-концу, если не указано иначе.
Последовательность ДНК каркаса miRNA
ctggaggcttgctgaaggctgtatgctgttagacaatgattcacacggtgttttggccactgactgacaccgtgtgtcattgtctaacaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcc (SEQ ID NO:14)
Вариант ITR AAV для векторов на основе scAAV
CCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGA (SEQ ID NO:15).
ssAAV2/1miRHtt.de
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTCTATATTACCCTGCTAGGCAATTGGATCCCGGACCGTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTTCGAAAGATCTGCTAGCCTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGAGTCGGTGTGGTTGACAAGCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGCTTGTCCCACACCGACTCAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGCCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGCTAGAGTCGACCGGACCGGTGGAAGTCCTCTTCCTCGGTGTCCTTGACTTCAAAGGGTCTCTCCCATTTGCCTGGAGAGAGGGGAAGGTGGGCATCACCAGGGGTGAGTGAAGGTTTGGAAGAGTGTAGCAGAATAAGAAACCATGAGTCCCCTCCCTGAGAAGCCCTGAGCCCCCTTGACGACACACATCCCTCGAGGCTCAGCTTCATCATCTGTAAAAGGTGCTGAAACTGACCATCCAAGCTGCCGAAAAAGATTGTGTGGGGATAATTCAAAACTAGAGGAAGATGCAGAATTTCTACATCGTGGCGATGTCAGGCTAAGAGATGCCATCGTGGCTGTGCATTTTTATTGGAATCATATGTTTATTTGAGGGTGTCTTGGATATTACAAATAAAATGTTGGAGCATCAGGCATATTTGGTACCTTCTGTCTAAGGCTCCCTGCCCCTTGTTAATTGGCAGCTCAGTTATTCATCCAGGGCAAACATTCTGCTTACTATTCCTGAGAGCTTTCCTCATCCTCTAGATTGGCAGGGGAAATGCAGATGCCTGAGCAGCCTCCCCTCTGCCATACCAACAGAGCTTCACCATCGAGGCATGCAGAGTGGACAGGGGCCTCAGGGACCCCTGATCCCAGCTTTCTCATTGGACAGAAGGAGGAGACTGGGGCTGGAGAGGGACCTGGGCCCCCACTAAGGCCACAGCAGAGCCAGGACTTTAGCTGTGCTGACTGCAGCCTGGCTTGCCTCCACTGCCCTCCTTTGCCTCAAGAGCAAGGGAGCCTCAGAGTGGAGGAAGCAGCCCCTGGCCTTGCCTCCCACCTCCCCTCCCCTATGCTGTTTTCCTGGGACAGTGGGAGCTGGCTTAGAATGCCCTGGGGCCCCCAGGACCCTGGCATTTTAACCCCTCAGGGGCAGGAAGGCAGCCTGAGATACAGAAGAGTCCATCACCTGCTGTATGCCACACACCATCCCCACAGTTACGTACTAGTTCGAAGCCACGCGGACCGTTATAGTTACGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAAAGATCT
(SEQ ID NO:16)
Последовательность ДНК mIR207 выделена жирным текстом (SEQ ID NO:17)
Спейсерная последовательность выделена курсивом (SEQ ID NO:18)
Часть гена A1AT
aattcgcccttgggcctaggcaattggatccgccggcagagaaaacatcccagggatttacagatcacatgcaggcagggaccagctcaacccttctttaatgtcatccagggagggggccagggatggaggggaggggttgaggagcgagaggcagttatttttgggtgggattcaccacttttcccatgaagaggggagacttggtattttgttcaatcattaagaagacaaagggtttgttgaacttgacctcgggggggatagacatgggtatggcctctaaaaacatggccccagcagcttcagtccctttctcgtcgatggtcagcacagccttatgcacggcctggaggggagagaagcagagacacgttgtaaggctgatcccaggcctcgagcaaggctcacgtggacacctcccaggaagcgctcactccccctggacggccctggccctgcacatcctctccctccctgtcacataggccttgctcctcctcaaggctttggctgatggggctggctcccctctgtccatcttcctgacaagcgcctctccccctgctcaggtgcacccacaactcagaacagggaagagcatcgtcactccacgtctgcctccagggctctctcctttctagtacacggcttgaagctccttgaggacacggaccctggcagtgaccttcacagtgcccagaccccaagataatgcagccattcatggaactgcaggttgttcattggtcgcctttagttttccaaaataagtgtcactttagctgaaatcattcattaattcagacaccaaatctcacagatcgaaggagtcagaaattcctttgaaacaacttagcccaaacctttctgtgtcagtatggataaatcaaggcccaatgtctagaaggtcttgggcaaagttgaaattcagggtcagtgacacaacctcaagggaggccccgaaagtgccagctgcacagcagcccctgcctggctttgctgtttgcccaccgtcccgtgtcagtgaatcacgggcatcttcaggagctcagcctgggtcttcatttgtttccctcggccccttcctcagcctcaggacagtgctgcagcccccacacattcttccctacagataccatggtgcaacaaggtcgtcagggtgatctcaccttggagagcttcaggggtgcctcctctgtgaccccggagaggtcagccccattgctgaagaccttagtgatgcccagttgacccaggacgctcttcagatcataggttccagtaatggacagtttgggtaaatgtaagctggcagacctgtcgtgcagaaaagaaattcaaggcatggcacagcattcctcttgttcttctgggacccaccacagtgcaagtgttttcttttctgattatttctgccacttactcctgtgtcctccacccacactaagatgggaactcggctttggtttgttctacttttagctcttctacattgagtcaaagaatgttaacatcgaatgaatcacaaaagcttgaaatgccacctcctctgatattctaggtgtcctggaagcctgtctcatcttgccctgtagtgttgggtcacctggcccccagcctgtaacatccccagggccctacacccagagaaacacggggctggtggcagtgcccagtgacaaccgtttagtggataagagaagagtgaccacaccaggctgagtgctcctctctggttttccatggggagacaatgccaccctgagcagggtctggtgtgagcggcagctggctctgggctctctgatccgttaccctctcagcctctttgttctttctcaacccctggagcagagacctcaggaggtgctggcatggaacagagaaattccagcctcgattcctattatgaacccgacaccttttgtattttcatcttggttttacagtgtacaaaacgaactagatcagcagggcatgggcataatcacgaatgcacacacatacactaatgtgtggctcatgtttaagtatcacttactacaggacacccaatctaacagcaccgataaagtgacagagaaacgcaagccttctgcgaacatggcctggctgttccaattccgaaccttgcttttctgggccttgccacacaggctcttcccccgtccccccagggacattctacccttgaactccacactccactgctgcctttgccaggaagcccatctgttcctttttggttctgccagaacgtgtggtggtgctgctgtccctgccttgggcactggatattgggaagggacagtgtccacactggagtgggaagttcccagggacgagacctttacctcctcaccctgggtactgttctcctcatggagcatggacggcgctgcctgaactcagtggtggcctcattctggaagccaagtttatacagagtagcagtgacccagggatgtggggttcaccctcctcagccctctggccagtcctgatgggcctcagtcccaacatggctaagaggtgtgggcagcttcttggtcaccctcaggttggggaatcaccttctgtcttcattttccaggaacttggtgatgatatcgtgggtgagttcatttaccaggtgctgtagtttcccctcatcaggcaggaagaagatggcggtggcattgcccaggtatttcatcagcagcacccagctggacagcttcttacagtgctggatgttaaacatgcctaaacgcttcatcataggcaccttcacggtggtcacctggtccacgtggaagtcctcttcctcggtgtccttgacttcaaagggtctctcccatttgcctggagagaggggaaggtgggcatcaccaggggtgagtgaaggtttggaagagtgtagcagaataagaaaccatgagtcccctccctgagaagccctgagcccccttgacgacacacatccctcgaggctcagcttcatcatctgtaaaaggtgctgaaactgaccatccaagctgccgaaaaagattgtgtggggataattcaaaactagaggaagatgcagaatttctacatcgtggcgatgtcaggctaagagatgccatcgtggctgtgcatttttattggaatcatatgtttatttgagggtgtcttggatattacaaataaaatgttggagcatcaggcatatttggtaccttctgtctaaggctccctgccccttgttaattggcagctcagttattcatccagggcaaacattctgcttactattcctgagagctttcctcatcctctagattggcaggggaaatgcagatgcctgagcagcctcccctctgccataccaacagagcttcaccatcgaggcatgcagagtggacaggggcctcagggacccctgatcccagctttctcattggacagaaggaggagactggggctggagagggacctgggcccccactaaggccacagcagagccaggactttagctgtgctgactgcagcctggcttgcctccactgccctcctttgcctcaagagcaagggagcctcagagtggaggaagcagcccctggccttgcctcccacctcccctcccctatgctgttttcctgggacagtgggagctggcttagaatgccctggggcccccaggaccctggcattttaacccctcaggggcaggaaggcagcctgagatacagaagagtccatcacctgctgtatgccacacaccatccccacagttacgtactagttcgaagccacgcgtccgaagggcgaatt
(SEQ ID NO:20)
Спейсерная последовательность, применяемая в некоторых вариантах осуществления, подчеркнута
Последовательность химерного интрона дельта
ggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattcctcgaagatccggtacccaattccggggccccacgctgcgcatccgcg
(SEQ ID NO:21)
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ДЖЕНЗИМ КОРПОРЕЙШН
<120> ВАРИАНТ СРЕДСТВА ДЛЯ РНКi
<130> 159792014740
<140> Не присовен
<141> Одновременно
<150> US 62/561,843
<151> 2017-09-22
<160> 22
<170> FastSEQ для Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 1
uggccgucca ucuuggaccc g 21
<210> 2
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 2
cggguccaag auggacggcc a 21
<210> 3
<211> 60
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 3
gtggccgtcc atcttggacc cggttttggc cactgactga ccgggtccaa tggacggcca 60
<210> 4
<211> 60
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 4
guggccgucc aucuuggacc cgguuuuggc cacugacuga ccggguccaa uggacggcca 60
<210> 5
<211> 64
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 5
tgctgtggcc gtccatcttg gacccggttt tggccactga ctgaccgggt ccaatggacg 60
gcca 64
<210> 6
<211> 64
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 6
cctgtggccg tccattggac ccggtcagtc agtggccaaa accgggtcca agatggacgg 60
ccac 64
<210> 7
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 7
agucggugug guugacaagc a 21
<210> 8
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 8
ugcuugucaa ccacaccgac u 21
<210> 9
<211> 59
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 9
agtcggtgtg gttgacaagc agttttggcc actgactgac tgcttgtccc acaccgact 59
<210> 10
<211> 59
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 10
agucggugug guugacaagc aguuuuggcc acugacugac ugcuuguccc acaccgacu 59
<210> 11
<211> 64
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 11
tgctgagtcg gtgtggttga caagcagttt tggccactga ctgactgctt gtcccacacc 60
gact 64
<210> 12
<211> 64
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 12
cctgagtcgg tgtgggacaa gcagtcagtc agtggccaaa actgcttgtc aaccacaccg 60
actc 64
<210> 13
<211> 19
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 13
guuuuggcca cugacugac 19
<210> 14
<211> 132
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 14
ctggaggctt gctgaaggct gtatgctgtt agacaatgat tcacacggtg ttttggccac 60
tgactgacac cgtgtgtcat tgtctaacag gacacaaggc ctgttactag cactcacatg 120
gaacaaatgg cc 132
<210> 15
<211> 113
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 15
ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 60
gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag gga 113
<210> 16
<211> 3510
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 16
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg 60
cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctctata ttaccctgct aggcaattgg atcccggacc 180
gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 240
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 300
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 360
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 420
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 480
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 540
tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca 600
tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag 660
cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc 720
ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt 780
ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg 840
cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc 900
cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc 960
ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt ttcttttctg tggctgcgtg 1020
aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg gagcggctcg gggggtgcgt 1080
gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc gctgcccggc ggctgtgagc 1140
gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt gcgcgagggg agcgcggccg 1200
ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa caaaggctgc gtgcggggtg 1260
tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt cgggctgcaa ccccccctgc 1320
acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg tgcggggctc cgtacggggc 1380
gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca ggtgggggtg ccgggcgggg 1440
cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg cggcggcccc cggagcgccg 1500
gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg 1560
cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca 1620
ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg 1680
agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc tctccagcct cggggctgtc 1740
cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg 1800
tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 1860
tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt tggcaaagaa ttcttcgaaa 1920
gatctgctag cctggaggct tgctgaaggc tgtatgctga gtcggtgtgg ttgacaagca 1980
gttttggcca ctgactgact gcttgtccca caccgactca ggacacaagg cctgttacta 2040
gcactcacat ggaacaaatg gccatgcatc tagagggccc tattctatag tgtcacctaa 2100
atgctagagc tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 2160
gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 2220
aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 2280
tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggagctag 2340
agtcgaccgg accggtggaa gtcctcttcc tcggtgtcct tgacttcaaa gggtctctcc 2400
catttgcctg gagagagggg aaggtgggca tcaccagggg tgagtgaagg tttggaagag 2460
tgtagcagaa taagaaacca tgagtcccct ccctgagaag ccctgagccc ccttgacgac 2520
acacatccct cgaggctcag cttcatcatc tgtaaaaggt gctgaaactg accatccaag 2580
ctgccgaaaa agattgtgtg gggataattc aaaactagag gaagatgcag aatttctaca 2640
tcgtggcgat gtcaggctaa gagatgccat cgtggctgtg catttttatt ggaatcatat 2700
gtttatttga gggtgtcttg gatattacaa ataaaatgtt ggagcatcag gcatatttgg 2760
taccttctgt ctaaggctcc ctgccccttg ttaattggca gctcagttat tcatccaggg 2820
caaacattct gcttactatt cctgagagct ttcctcatcc tctagattgg caggggaaat 2880
gcagatgcct gagcagcctc ccctctgcca taccaacaga gcttcaccat cgaggcatgc 2940
agagtggaca ggggcctcag ggacccctga tcccagcttt ctcattggac agaaggagga 3000
gactggggct ggagagggac ctgggccccc actaaggcca cagcagagcc aggactttag 3060
ctgtgctgac tgcagcctgg cttgcctcca ctgccctcct ttgcctcaag agcaagggag 3120
cctcagagtg gaggaagcag cccctggcct tgcctcccac ctcccctccc ctatgctgtt 3180
ttcctgggac agtgggagct ggcttagaat gccctggggc ccccaggacc ctggcatttt 3240
aacccctcag gggcaggaag gcagcctgag atacagaaga gtccatcacc tgctgtatgc 3300
cacacaccat ccccacagtt acgtactagt tcgaagccac gcggaccgtt atagttacga 3360
ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 3420
cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg 3480
agcgcgcaga gagggagtgg ccaaagatct 3510
<210> 17
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 17
agtcggtgtg gttgacaagc a 21
<210> 18
<211> 989
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 18
gtggaagtcc tcttcctcgg tgtccttgac ttcaaagggt ctctcccatt tgcctggaga 60
gaggggaagg tgggcatcac caggggtgag tgaaggtttg gaagagtgta gcagaataag 120
aaaccatgag tcccctccct gagaagccct gagccccctt gacgacacac atccctcgag 180
gctcagcttc atcatctgta aaaggtgctg aaactgacca tccaagctgc cgaaaaagat 240
tgtgtgggga taattcaaaa ctagaggaag atgcagaatt tctacatcgt ggcgatgtca 300
ggctaagaga tgccatcgtg gctgtgcatt tttattggaa tcatatgttt atttgagggt 360
gtcttggata ttacaaataa aatgttggag catcaggcat atttggtacc ttctgtctaa 420
ggctccctgc cccttgttaa ttggcagctc agttattcat ccagggcaaa cattctgctt 480
actattcctg agagctttcc tcatcctcta gattggcagg ggaaatgcag atgcctgagc 540
agcctcccct ctgccatacc aacagagctt caccatcgag gcatgcagag tggacagggg 600
cctcagggac ccctgatccc agctttctca ttggacagaa ggaggagact ggggctggag 660
agggacctgg gcccccacta aggccacagc agagccagga ctttagctgt gctgactgca 720
gcctggcttg cctccactgc cctcctttgc ctcaagagca agggagcctc agagtggagg 780
aagcagcccc tggccttgcc tcccacctcc cctcccctat gctgttttcc tgggacagtg 840
ggagctggct tagaatgccc tggggccccc aggaccctgg cattttaacc cctcaggggc 900
aggaaggcag cctgagatac agaagagtcc atcacctgct gtatgccaca caccatcccc 960
acagttacgt actagttcga agccacgcg 989
<210> 19
<211> 3510
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 19
aaccggtgag ggagagacgc gcgagcgagc gagtgactcc ggcgggcccg tttcgggccc 60
gcagcccgct ggaaaccagc gggccggagt cactcgctcg ctcgcgcgtc tctccctcac 120
cggttgaggt agtgatcccc aaggagatat aatgggacga tccgttaacc tagggcctgg 180
cagctgtaac taataactga tcaataatta tcattagtta atgccccagt aatcaagtat 240
cgggtatata cctcaaggcg caatgtattg aatgccattt accgggcgga ccgactggcg 300
ggttgctggg ggcgggtaac tgcagttatt actgcataca agggtatcat tgcggttatc 360
cctgaaaggt aactgcagtt acccacctca taaatgccat ttgacgggtg aaccgtcatg 420
tagttcacat agtatacggt tcatgcgggg gataactgca gttactgcca tttaccgggc 480
ggaccgtaat acgggtcatg tactggaata ccctgaaagg atgaaccgtc atgtagatgc 540
ataatcagta gcgataatgg taccagctcc actcggggtg caagacgaag tgagaggggt 600
agaggggggg gaggggtggg ggttaaaaca taaataaata aaaaattaat aaaacacgtc 660
gctacccccg cccccccccc ccccccgcgc gcggtccgcc ccgccccgcc ccgctccccg 720
ccccgccccg ctccgcctct ccacgccgcc gtcggttagt ctcgccgcgc gaggctttca 780
aaggaaaata ccgctccgcc gccgccgccg ccgggatatt tttcgcttcg cgcgccgccc 840
gccctcagcg acgcgcgacg gaagcggggc acggggcgag gcggcggcgg agcgcggcgg 900
gcggggccga gactgactgg cgcaatgagg gtgtccactc gcccgccctg ccgggaagag 960
gaggcccgac attaatcgcg aaccaaatta ctgccgaaca aagaaaagac accgacgcac 1020
tttcggaact ccccgaggcc ctcccgggaa acacgccccc ctcgccgagc cccccacgca 1080
cgcacacaca cacgcacccc tcgcggcgca cgccgaggcg cgacgggccg ccgacactcg 1140
cgacgcccgc gccgcgcccc gaaacacgcg aggcgtcaca cgcgctcccc tcgcgccggc 1200
ccccgccacg gggcgccacg ccccccccga cgctcccctt gtttccgacg cacgccccac 1260
acacgcaccc ccccactcgt cccccacacc cgcgcagcca gcccgacgtt gggggggacg 1320
tggggggagg ggctcaacga ctcgtgccgg gccgaagccc acgccccgag gcatgccccg 1380
caccgcgccc cgagcggcac ggcccgcccc ccaccgccgt ccacccccac ggcccgcccc 1440
gccccggcgg agcccggccc ctcccgagcc ccctccccgc gccgccgggg gcctcgcggc 1500
cgccgacagc tccgcgccgc tcggcgtcgg taacggaaaa taccattagc acgctctccc 1560
gcgtccctga aggaaacagg gtttagacac gcctcggctt tagaccctcc gcggcggcgt 1620
gggggagatc gcccgcgccc cgcttcgcca cgccgcggcc gtccttcctt tacccgcccc 1680
tcccggaagc acgcagcggc gcggcggcag gggaagaggg agaggtcgga gccccgacag 1740
gcgcccccct gccgacggaa gccccccctg ccccgtcccg ccccaagccg aagaccgcac 1800
actggccgcc gagatctcgg agacgattgg tacaagtacg gaagaagaaa aaggatgtcg 1860
aggacccgtt gcacgaccaa taacacgaca gagtagtaaa accgtttctt aagaagcttt 1920
ctagacgatc ggacctccga acgacttccg acatacgact cagccacacc aactgttcgt 1980
caaaaccggt gactgactga cgaacagggt gtggctgagt cctgtgttcc ggacaatgat 2040
cgtgagtgta ccttgtttac cggtacgtag atctcccggg ataagatatc acagtggatt 2100
tacgatctcg agcgactagt cggagctgac acggaagatc aacggtcggt agacaacaaa 2160
cggggagggg gcacggaagg aactgggacc ttccacggtg agggtgacag gaaaggatta 2220
ttttactcct ttaacgtagc gtaacagact catccacagt aagataagac cccccacccc 2280
accccgtcct gtcgttcccc ctcctaaccc ttctgttatc gtccgtacga cccctcgatc 2340
tcagctggcc tggccacctt caggagaagg agccacagga actgaagttt cccagagagg 2400
gtaaacggac ctctctcccc ttccacccgt agtggtcccc actcacttcc aaaccttctc 2460
acatcgtctt attctttggt actcagggga gggactcttc gggactcggg ggaactgctg 2520
tgtgtaggga gctccgagtc gaagtagtag acattttcca cgactttgac tggtaggttc 2580
gacggctttt tctaacacac ccctattaag ttttgatctc cttctacgtc ttaaagatgt 2640
agcaccgcta cagtccgatt ctctacggta gcaccgacac gtaaaaataa ccttagtata 2700
caaataaact cccacagaac ctataatgtt tattttacaa cctcgtagtc cgtataaacc 2760
atggaagaca gattccgagg gacggggaac aattaaccgt cgagtcaata agtaggtccc 2820
gtttgtaaga cgaatgataa ggactctcga aaggagtagg agatctaacc gtccccttta 2880
cgtctacgga ctcgtcggag gggagacggt atggttgtct cgaagtggta gctccgtacg 2940
tctcacctgt ccccggagtc cctggggact agggtcgaaa gagtaacctg tcttcctcct 3000
ctgaccccga cctctccctg gacccggggg tgattccggt gtcgtctcgg tcctgaaatc 3060
gacacgactg acgtcggacc gaacggaggt gacgggagga aacggagttc tcgttccctc 3120
ggagtctcac ctccttcgtc ggggaccgga acggagggtg gaggggaggg gatacgacaa 3180
aaggaccctg tcaccctcga ccgaatctta cgggaccccg ggggtcctgg gaccgtaaaa 3240
ttggggagtc cccgtccttc cgtcggactc tatgtcttct caggtagtgg acgacatacg 3300
gtgtgtggta ggggtgtcaa tgcatgatca agcttcggtg cgcctggcaa tatcaatgct 3360
ccttggggat cactacctca accggtgagg gagagacgcg cgagcgagcg agtgactccg 3420
gcccgctggt ttccagcggg ctgcgggccc gaaacgggcc cgccggagtc actcgctcgc 3480
tcgcgcgtct ctccctcacc ggtttctaga 3510
<210> 20
<211> 3798
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 20
aattcgccct tgggcctagg caattggatc cgccggcaga gaaaacatcc cagggattta 60
cagatcacat gcaggcaggg accagctcaa cccttcttta atgtcatcca gggagggggc 120
cagggatgga ggggaggggt tgaggagcga gaggcagtta tttttgggtg ggattcacca 180
cttttcccat gaagagggga gacttggtat tttgttcaat cattaagaag acaaagggtt 240
tgttgaactt gacctcgggg gggatagaca tgggtatggc ctctaaaaac atggccccag 300
cagcttcagt ccctttctcg tcgatggtca gcacagcctt atgcacggcc tggaggggag 360
agaagcagag acacgttgta aggctgatcc caggcctcga gcaaggctca cgtggacacc 420
tcccaggaag cgctcactcc ccctggacgg ccctggccct gcacatcctc tccctccctg 480
tcacataggc cttgctcctc ctcaaggctt tggctgatgg ggctggctcc cctctgtcca 540
tcttcctgac aagcgcctct ccccctgctc aggtgcaccc acaactcaga acagggaaga 600
gcatcgtcac tccacgtctg cctccagggc tctctccttt ctagtacacg gcttgaagct 660
ccttgaggac acggaccctg gcagtgacct tcacagtgcc cagaccccaa gataatgcag 720
ccattcatgg aactgcaggt tgttcattgg tcgcctttag ttttccaaaa taagtgtcac 780
tttagctgaa atcattcatt aattcagaca ccaaatctca cagatcgaag gagtcagaaa 840
ttcctttgaa acaacttagc ccaaaccttt ctgtgtcagt atggataaat caaggcccaa 900
tgtctagaag gtcttgggca aagttgaaat tcagggtcag tgacacaacc tcaagggagg 960
ccccgaaagt gccagctgca cagcagcccc tgcctggctt tgctgtttgc ccaccgtccc 1020
gtgtcagtga atcacgggca tcttcaggag ctcagcctgg gtcttcattt gtttccctcg 1080
gccccttcct cagcctcagg acagtgctgc agcccccaca cattcttccc tacagatacc 1140
atggtgcaac aaggtcgtca gggtgatctc accttggaga gcttcagggg tgcctcctct 1200
gtgaccccgg agaggtcagc cccattgctg aagaccttag tgatgcccag ttgacccagg 1260
acgctcttca gatcataggt tccagtaatg gacagtttgg gtaaatgtaa gctggcagac 1320
ctgtcgtgca gaaaagaaat tcaaggcatg gcacagcatt cctcttgttc ttctgggacc 1380
caccacagtg caagtgtttt cttttctgat tatttctgcc acttactcct gtgtcctcca 1440
cccacactaa gatgggaact cggctttggt ttgttctact tttagctctt ctacattgag 1500
tcaaagaatg ttaacatcga atgaatcaca aaagcttgaa atgccacctc ctctgatatt 1560
ctaggtgtcc tggaagcctg tctcatcttg ccctgtagtg ttgggtcacc tggcccccag 1620
cctgtaacat ccccagggcc ctacacccag agaaacacgg ggctggtggc agtgcccagt 1680
gacaaccgtt tagtggataa gagaagagtg accacaccag gctgagtgct cctctctggt 1740
tttccatggg gagacaatgc caccctgagc agggtctggt gtgagcggca gctggctctg 1800
ggctctctga tccgttaccc tctcagcctc tttgttcttt ctcaacccct ggagcagaga 1860
cctcaggagg tgctggcatg gaacagagaa attccagcct cgattcctat tatgaacccg 1920
acaccttttg tattttcatc ttggttttac agtgtacaaa acgaactaga tcagcagggc 1980
atgggcataa tcacgaatgc acacacatac actaatgtgt ggctcatgtt taagtatcac 2040
ttactacagg acacccaatc taacagcacc gataaagtga cagagaaacg caagccttct 2100
gcgaacatgg cctggctgtt ccaattccga accttgcttt tctgggcctt gccacacagg 2160
ctcttccccc gtccccccag ggacattcta cccttgaact ccacactcca ctgctgcctt 2220
tgccaggaag cccatctgtt cctttttggt tctgccagaa cgtgtggtgg tgctgctgtc 2280
cctgccttgg gcactggata ttgggaaggg acagtgtcca cactggagtg ggaagttccc 2340
agggacgaga cctttacctc ctcaccctgg gtactgttct cctcatggag catggacggc 2400
gctgcctgaa ctcagtggtg gcctcattct ggaagccaag tttatacaga gtagcagtga 2460
cccagggatg tggggttcac cctcctcagc cctctggcca gtcctgatgg gcctcagtcc 2520
caacatggct aagaggtgtg ggcagcttct tggtcaccct caggttgggg aatcaccttc 2580
tgtcttcatt ttccaggaac ttggtgatga tatcgtgggt gagttcattt accaggtgct 2640
gtagtttccc ctcatcaggc aggaagaaga tggcggtggc attgcccagg tatttcatca 2700
gcagcaccca gctggacagc ttcttacagt gctggatgtt aaacatgcct aaacgcttca 2760
tcataggcac cttcacggtg gtcacctggt ccacgtggaa gtcctcttcc tcggtgtcct 2820
tgacttcaaa gggtctctcc catttgcctg gagagagggg aaggtgggca tcaccagggg 2880
tgagtgaagg tttggaagag tgtagcagaa taagaaacca tgagtcccct ccctgagaag 2940
ccctgagccc ccttgacgac acacatccct cgaggctcag cttcatcatc tgtaaaaggt 3000
gctgaaactg accatccaag ctgccgaaaa agattgtgtg gggataattc aaaactagag 3060
gaagatgcag aatttctaca tcgtggcgat gtcaggctaa gagatgccat cgtggctgtg 3120
catttttatt ggaatcatat gtttatttga gggtgtcttg gatattacaa ataaaatgtt 3180
ggagcatcag gcatatttgg taccttctgt ctaaggctcc ctgccccttg ttaattggca 3240
gctcagttat tcatccaggg caaacattct gcttactatt cctgagagct ttcctcatcc 3300
tctagattgg caggggaaat gcagatgcct gagcagcctc ccctctgcca taccaacaga 3360
gcttcaccat cgaggcatgc agagtggaca ggggcctcag ggacccctga tcccagcttt 3420
ctcattggac agaaggagga gactggggct ggagagggac ctgggccccc actaaggcca 3480
cagcagagcc aggactttag ctgtgctgac tgcagcctgg cttgcctcca ctgccctcct 3540
ttgcctcaag agcaagggag cctcagagtg gaggaagcag cccctggcct tgcctcccac 3600
ctcccctccc ctatgctgtt ttcctgggac agtgggagct ggcttagaat gccctggggc 3660
ccccaggacc ctggcatttt aacccctcag gggcaggaag gcagcctgag atacagaaga 3720
gtccatcacc tgctgtatgc cacacaccat ccccacagtt acgtactagt tcgaagccac 3780
gcgtccgaag ggcgaatt 3798
<210> 21
<211> 350
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 21
ggagtcgctg cgcgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg 60
ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct 120
ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa 180
agccttgagg ggctccggga gctagagcct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt 240
tcctacagct cctgggcaac gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat 300
tcctcgaaga tccggtaccc aattccgggg ccccacgctg cgcatccgcg 350
<210> 22
<211> 59
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 22
tggccgtcca tcttggaccc ggttttggcc actgactgac cgggtccaat ggacggcca 59
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ ХАНТИНГТОНА | 2015 |
|
RU2711147C2 |
| АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫЕ ВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МИОЦИЛИНОВОЙ (MYOC) ГЛАУКОМЫ | 2015 |
|
RU2746991C2 |
| АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫЕ ВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МИОЦИЛИНОВОЙ (MYOC) ГЛАУКОМЫ | 2015 |
|
RU2718047C2 |
| ГЕННОЕ РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЛУБОКИХ ИНТРОННЫХ МУТАЦИЙ | 2016 |
|
RU2759335C2 |
| ВЕКТОРНЫЕ КОМПОЗИЦИИ С МОДИФИЦИРОВАННЫМ АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫМ ВИРУСОМ | 2013 |
|
RU2679843C2 |
| СПОСОБЫ ВЫЯВЛЕНИЯ AAV | 2017 |
|
RU2771622C2 |
| ВЕКТОРЫ НА ОСНОВЕ АДЕНОАССОЦИИРОВАННОГО ВИРУСА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МУКОЛИПИДОЗА ТИПА II | 2016 |
|
RU2742612C2 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ И ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ДЕГЕНЕРАЦИИ ЖЕЛТОГО ПЯТНА | 2015 |
|
RU2703145C2 |
| ГЕНОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ ВИЛЬСОНА | 2020 |
|
RU2807158C2 |
| ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ ОФТАЛЬМОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ | 2016 |
|
RU2762747C2 |
Изобретение относится к области биохимии, в частности к средству для RNAi, содержащему первую нить и вторую нить, где первая нить и вторая нить образуют дуплекс, первая нить содержит направляющую область и вторая нить содержит область, не являющуюся направляющей, а также к содержащей его экспрессионной конструкции, вектору, клетке и частице. Также раскрыты набор и композиция, содержащие вышеуказанное средство. Изобретение эффективно для лечения болезни Хантингтона у млекопитающего. 14 н. и 14 з.п. ф-лы, 9 ил., 2 табл., 5 пр.
1. Средство для RNAi для лечения болезни Хантингтона, содержащее первую нить и вторую нить, где
a) первая нить и вторая нить образуют дуплекс;
b) первая нить содержит направляющую область, при этом направляющая область содержит последовательность нуклеиновой кислоты 5'-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3' (SEQ ID NO: 1) или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся приблизительно 90% идентичностью с SEQ ID NO: 1; или 5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’ (SEQ ID NO: 7) или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся приблизительно 90% идентичностью с SEQ ID NO: 7; и
c) вторая нить содержит область, не являющуюся направляющей.
2. Средство для RNAi по п.1, где
(i) нуклеиновая направляющая область содержит последовательность нуклеиновой кислоты 5'-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3' (SEQ ID NO: 1) или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся приблизительно 90% идентичностью с SEQ ID NO: 1; и область, не являющаяся направляющей, содержит последовательность 5'-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3' (SEQ ID NO: 2) или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся приблизительно 90% идентичностью с SEQ ID NO: 2; или
(ii) нуклеиновая направляющая область содержит последовательность нуклеиновой кислоты 5'-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3' (SEQ ID NO: 7) или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся приблизительно 90% идентичностью с SEQ ID NO: 7; и область, не являющаяся направляющей, содержит последовательность 5'-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3' (SEQ ID NO: 8) или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся приблизительно 90% идентичностью с SEQ ID NO: 8.
3. Средство для RNAi по п.1 или 2, где первая нить и вторая нить соединены посредством РНК-линкера, способного образовывать петлевую структуру, при этом необязательно:
(i) РНК-линкер содержит от 4 до 50 нуклеотидов; и/или
(ii) петлевая структура содержит от 4 до 20 нуклеотидов; и/или
(iii) средство для RNAi содержит в направлении от 5'- к 3'-концу вторую нить, РНК-линкер и первую нить; или
(iv) средство для RNAi содержит в направлении от 5'- к 3'-концу первую нить, РНК-линкер и вторую нить.
4. Средство для RNAi по п.3, где средство для RNAi содержит в направлении от 5'- к 3'-концу первую нить, РНК-линкер и вторую нить и где средство для RNAi содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 10 или нуклеотидную последовательность, на приблизительно 90% идентичную нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 10.
5. Средство для RNAi по любому из пп. 1-4, где средство для RNAi представляет собой малую ингибирующую РНК (siRNA), микроРНК (miRNA) или малую шпилечную РНК (shRNA).
6. Средство для RNAi по любому из пп. 1-5, где средство для RNAi нацелено на РНК, кодирующую полипептид, связанный с болезнью Хантингтона, при этом необязательно полипептид представляет собой хантингтин, и при этом необязательно хантингтин характеризуется мутацией, связанной с болезнью Хантингтона.
7. Экспрессионная конструкция, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi по любому из пп. 1-6, причем нуклеиновая кислота, кодирующая средство для RNAi, функционально связана с промотором.
8. Экспрессионная конструкция по п.7, где
(i) нуклеиновая кислота, кодирующая средство для RNAi, предусматривает каркас miRNA; и/или
(ii) нуклеиновая кислота, кодирующая средство для RNAi, функционально связана с промотором, при этом промотор необязательно выбран из немедленно-раннего промотора цитомегаловируса (CMV), LTR RSV, LTR MoMLV, промотора гена фосфоглицераткиназы-1 (PGK), промотора вируса обезьян 40 (SV40), промотора CK6, промотора гена транстиретина (TTR), промотора TK, тетрациклин-чувствительного промотора (TRE), промотора HBV, промотора hAAT, LSP-промотора, химерного специфического для печени промотора (LSP), промотора E2F, промотора гена теломеразы (hTERT); составного промотора энхансер цитомегаловируса/промотор гена бета-актина курицы/интрон гена β-глобина кролика (CAG), промотора фактора элонгации 1-альфа (EF1-альфа), промотора гена β-глюкуронидазы человека, промотора гена β-актина курицы (CBA), ретровирусного LTR-промотора вируса саркомы Рауса (RSV), промотора гена дигидрофолатредуктазы и промотора гена 13-актина; и/или
(ii) экспрессионная конструкция дополнительно содержит интрон, при этом интрон необязательно представляет собой химерный интрон, и при этом вектор экспрессии необязательно представляет собой самокомплементарный вектор, а интрон представляет собой химерный интрон дельта; и/или
(iii) экспрессионная конструкция дополнительно содержит сигнал полиаденилирования, при этом сигнал полиаденилирования необязательно представляет собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста, сигнал полиаденилирования SV40 или pA TK HSV.
9. Вектор для лечения болезни Хантингтона, содержащий экспрессионную конструкцию по любому из пп. 7 или 8.
10. Вектор по п.9, где
(i) вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденовируса, и при этом вектор на основе рекомбинантного аденовируса необязательно получен из аденовируса серотипа 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad крупного рогатого скота типа 3, Ad собачьих типа 2, Ad овцы или Ad свиньи типа 3; или
(ii) вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного лентивируса, при этом вектор на основе рекомбинантного лентивируса необязательно получен из лентивируса, псевдотипированного вирусом везикулярного стоматита (VSV), вирусом лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), вирусом реки Росс (RRV), вирусом Эбола, вирусом Марбург, вирусом Мокола, вирусом бешенства, RD114 или их вариантами; или
(iii) вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного вируса простого герпеса (HSV), при этом вектор на основе rHSV необязательно получен из rHSV-1 или rHSV-2.
11. Вектор по п.9, где вектор представляет собой вектор на основе rAAV.
12. Вектор по п.11, где экспрессионная конструкция фланкирована одной или несколькими последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR) AAV, при этом необязательно
(i) экспрессионная конструкция фланкирована двумя ITR AAV; и/или
(ii) ITR AAV представляют собой ITR серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, AAV козы, AAV крупного рогатого скота или AAV мыши, при этом необязательно ITR AAV представляют собой ITR AAV2.
13. Вектор по п.11 или 12, где вектор дополнительно содержит спейсерную последовательность нуклеиновой кислоты, при этом спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты расположена выше или ниже нуклеиновой кислоты, кодирующей средство для RNAi.
14. Вектор по любому из пп. 11-13, где вектор представляет собой самокомплементарный вектор на основе rAAV, при этом вектор необязательно содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую средство для RNAi, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность, комплементарную последовательности средства для RNAi, при этом первая последовательность нуклеиновой кислоты может образовывать внутринитевые пары оснований со второй последовательностью нуклеиновой кислоты на протяжении большей части или всей ее длины, и при этом необязательно первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая последовательность нуклеиновой кислоты соединены мутантным ITR AAV, при этом мутантный ITR AAV характеризуется делецией D-области и характеризуется мутацией последовательности концевого разрешения.
15. Клетка для лечения болезни Хантингтона, содержащая вектор по любому из пп. 9-14.
16. Вирусная частица, содержащая вектор по п.9, для лечения болезни Хантингтона, где
(i) вирусная частица представляет собой частицу AAV с заключенным в капсид вектором на основе rAAV, при этом аденовирусная частица необязательно содержит капсид от аденовируса серотипа 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad крупного рогатого скота типа 3, Ad собачьих типа 2, Ad овцы или Ad свиньи типа 3; или
(ii) вирусная частица представляет собой аденовирусную частицу с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного аденовируса, при этом аденовирусная частица необязательно содержит капсид аденовируса серотипа 2 или капсид варианта аденовируса серотипа 5; или
(iii) вирусная частица представляет собой лентивирусную частицу с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного лентивируса, при этом лентивирусная частица необязательно содержит капсид, псевдотипированный вирусом везикулярного стоматита (VSV), вирусом лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), вирусом реки Росс (RRV), вирусом Эбола, вирусом Марбург, вирусом Мокола, вирусом бешенства, RD114 или их вариантами; или
(iv) вирусная частица представляет собой частицу HSV с заключенным в капсид вектором на основе рекомбинантного HSV, при этом частица HSV необязательно представляет собой частицу rHSV-1 или частицу rHSV-2.
17. Рекомбинантная частица AAV, содержащая вектор по любому из пп. 11-14, для лечения болезни Хантингтона, где необязательно
(i) вирусная частица AAV содержит капсид серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV2-HBKO, AAVDJ8, AAVPHP.B, AAVPHP.eB, AAVBR1, AAVHSC15, AAVHSC17, AAV козы, химерного AAV1/AAV2, AAV крупного рогатого скота или капсид AAV мыши, rAAV2/HBoV1; и/или
(ii) ITR и капсид вирусной частицы rAAV получены из одного и того же серотипа AAV; или
(iii) ITR и капсид вирусной частицы rAAV получены из разных серотипов AAV, при этом необязательно ITR получен из AAV2, а капсид частицы rAAV получен из AAV1.
18. Композиция для лечения болезни Хантингтона, содержащая эффективное количество вирусной частицы по п.16 или рекомбинантной частицы rAAV по п.17.
19. Набор для лечения болезни Хантингтона, содержащий средство для RNAi по любому из пп. 1-6, вирусную частицу по п.16, частицу AAV по п.17 или композицию по п.18 и инструкции по применению средства для RNAi, вирусной частицы, частицы AAV или композиции.
20. Способ лечения болезни Хантингтона у млекопитающего, включающий введение млекопитающему средства для RNAi по любому из пп. 2-6, вирусной частицы по п.16, частицы AAV по п.17 или композиции по п.18.
21. Средство для RNAi по любому из пп. 2-6, вирусная частица по п.16, частица AAV по п.17 или композиция по п.18 для лечения болезни Хантингтона у млекопитающего.
22. Применение средства для RNAi по любому из пп. 2-6, вирусной частицы по п.16, частицы AAV по п.17 или композиции по п.18 в получении лекарственного средства для лечения болезни Хантингтона у млекопитающего.
23. Способ ингибирования экспрессии htt в клетке у млекопитающего с болезнью Хантингтона, включающий введение млекопитающему средства для RNAi по любому из пп. 2-6, вирусной частицы по п.16, частицы AAV по п.17 или композиции по п.18.
24. Средство для RNAi по любому из пп. 2-6, вирусная частица по п.16, частица AAV по п.17 или композиция по п.18 для ингибирования экспрессии htt в клетке у млекопитающего с болезнью Хантингтона.
25. Применение средства для RNAi по любому из пп. 2-6, вирусной частицы по п.16, частицы AAV по п.17 или композиции по п.18 в получении лекарственного средства для ингибирования экспрессии htt в клетке у млекопитающего с болезнью Хантингтона.
26. Способ ингибирования аккумуляции htt в клетке у млекопитающего с болезнью Хантингтона, включающий введение млекопитающему средства для RNAi по любому из пп. 2-6, вирусной частицы по п.16, частицы AAV по п.17 или композиции по п.18.
27. Средство для RNAi по любому из пп. 2-6, вирусная частица по п.16, частица AAV по п.17 или композиция по п.18 для ингибирования аккумуляции htt в клетке у млекопитающего с болезнью Хантингтона.
28. Применение средства для RNAi по любому из пп. 2-6, вирусной частицы по п.16, частицы AAV по п.17 или композиции по п.18 в получении лекарственного средства для ингибирования аккумуляции htt в клетке у млекопитающего с болезнью Хантингтона.
| WO 2016130589 A2, 18.08.2016 | |||
| MINIARIKOVA J | |||
| et al., AAV5-miHTT gene therapy demonstrates suppression of mutant huntingtin aggregation and neuronal dysfunction in a rat model of Huntington’s disease, Gene Therapy, 16 June 2017, Vol.24, pp.630-639 | |||
| WO 2016102664 A1, 30.06.2016 | |||
| WO 2015168666 A2, 02.05.2015 | |||
| RU 2014138989 A, 20.04.2016. |
