ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ И НОКАРДИОФОРМНЫХ АКТИНОМИЦЕТОВ Российский патент 2008 года по МПК C12N1/20 C12R1/32 C12R1/365 

Изобретение относится к микробиологическим исследованиям, касается питательной среды для культивирования микобактерий и нокардиоформных актиномицетов и может быть использовано для изучения культурально-биохимических, хемотаксономических и генотипических свойств культур.

Для роста микобактерий из-за их неспособности синтезировать различные химические вещества самостоятельно необходимы полноценные, богатые белком, углеводом, минеральными веществами и стимуляторами роста питательные среды. В медицинской и ветеринарной практике используют преимущественно плотные среды Левенштейна-Йенсена и Финн-2, содержащие солевую основу (среда Левенштейна-Йенсена - однозамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний, лимоннокислый магний, аспарагин, глицерин химически чистый; среда Финн-2 - магний сернокислый, натрий лимоннокислый, квасцы железоаммиачные, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий глютаминовокислый однозамещенный глицерин, яйца и малахитовую зелень (в качестве деконтаминанта) [1]. Для научных целей предпочтительными являются питательные среды, содержащие солевую основу и агар с добавлением в них в качестве стимуляторов роста сывороток крови человека или животных (кроличья или бычья - среда Kirchner, лошадиная сыворотка - модифицированная среда Sauton), крови (венозная кровь - среда Pryce, цитратная кровь - среда Школьниковой), олеиновой кислоты (среда Dubos и Middlebrook) или комплексов, включающих витамины, жирные кислоты и др. (среда Bacto-Middlbrook) [2]. Многообразие питательных сред (плотных, жидких, полужидких), разнообразных по сложности составов и способам изготовления, свидетельствует об отсутствии универсальной питательной среды, что обусловливает актуальность поиска новых питательных средств, обеспечивающих хороший рост культур, включая культуры первой генерации, и визуализацию начального роста колоний.

В качестве аналогов нами рассматриваются жидкая питательная среда Sauton, содержащая L-аспарагин, двузамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, глицерин и дистиллированную воду [3], и модифицированная жидкая питательная среда Sauton, содержащая дополнительно питательный агар (до 0,35%) и лошадиную сыворотку (25%) [4]. Известную модификацию питательной среды Sauton применяют для ускоренного определения лекарственной устойчивости клинических штаммов микобактерий туберкулеза к изониациду, стрептомицину, рифампицину, однако наличие в ней компонентов крови и жидкая консистенция не позволяют применять ее для научных целей, в частности для изучения ферментативной активности.

Техническим результатом является повышение ростовых свойств питательной среды.

Технический результат достигается тем, что питательная среда, содержащая L-аспарагин, двузамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, глицерин и дистиллированную воду, содержит 3,0% агара и дополнительно 9,0-9,5% гумивита.

Гумивит - щелочной гидролизат низинных сортов торфа (выпускается ООО Агропром), представляет собой высокодисперсный золь натриевых солей комплекса гумусных кислот - гуминовых, гуматомелановых и фульвокислот [5]. Раствор солей гуминовых кислот состоит из длинных фрагментарных цепочек с различными функциональными группами, важнейшими из которых являются карбоксильные (СООН) и фенольные (ОН), способные образовывать хелатные комплексы с микроэлементами, что обеспечивает их высокую обменную емкость и транспорт в клетку микроорганизмов [6, 7]. Гумивит - жидкость темно-коричневого до черного цвета со специфическим сладковатым запахом, благодаря чему готовая среда имеет интенсивно коричневый цвет, на фоне которого хорошо видны даже мелкие колонии в начальной фазе роста.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. Для приготовления среды в химически чистую стерильную колбу емкостью 2,0 л наливали 300,0 мл дистиллированной воды, прогревали на водяной бане до 75-85°С. В воде растворяли последовательно 2,0 г лимонной кислоты, 4,0 г L-аспарагина, 0,5 г сернокислого магния, 0,5 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 0,05 г лимоннокислого аммиачного железа, 40,0 г глицерина, 90,0 мл гумивита и 30,0 г агара. Каждый компонент добавляли после полного растворения предыдущего. После внесения всех компонентов общий объем доводили до 1000,0 мл стерильной дистиллированной водой. Устанавливали рН 7,1-7,2 добавлением 1н. NaOH или 1н. HCl. Раствор автоклавировали в течение 30 минут при 1 атм. Горячую среду разливали по пробиркам по 3 мл и скашивали.

Пример 2. В таблице 1 приведены варианты питательной среды в соответствии с изобретением.

Таблица 1Состав разных вариантов питательных средСоставВариант новой среды1-й2-й3-й4-йL-аспарагин, г4,04,04,04,0Двузамещенный фосфорнокислый калий, г0,50,50,50,5Сернокислый магний, г0,50,50,50,5Лимонная кислота, г2,02,02,02,0Лимоннокислое аммиачное железо, г0,050,050,050,05Глицерин, г40,040,040,040,0Агар, г30,030,030,030,0Гумивит, мл85,090,095,0100,0Дистиллированная вода, млдо 1000,0до 1000,0до 1000,0до 1000,0

Пример 3. Для определения эффективности среды для культивирования микобактерий использовали референс-штаммы микобактерий M.bovis (шт.Valle и BCG), M.tuberculosis (шт.Academia), Н₃₇Ra, М.avium (шт.ГИСК, 44, 659), M.smegmatis (шт.53), М.phlei. Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Посевы культур производили нанесением 10 мкл суспензии микобактерий, содержавшей 30-60 КОЕ при посеве на среду Левенштейна-Иенсена, на все сравниваемые варианты среды в соответствии с изобретением. Посев каждого штамма проводили на 3-5 пробирок. При оценке роста культур учитывали сроки появления первичных колоний, интенсивность роста (±слабый, +средний, ++обильный) и изучали культурально-морфологические свойства. Контроль - традиционно применяемая среда Левенштейна-Йенсена. Полученные результаты (таблица 2 и 3) показали, что оптимальными являются варианты 2 и 3 питательной среды в соответствии с изобретением, обеспечивавшие более ранние сроки появления и более высокую интенсивность роста относительно варианта 1 питательной среды в соответствии с изобретением и сравнимые с таковыми на среде Левенштейна-Йенсена. Повышение количества гумивита (вариант 4 питательной среды в соответствии с изобретением) не сокращало срок появления роста и не влияло на интенсивность роста. Культурально-морфологические свойства и цвет выросших колоний штаммов не отличались от таковых на исходной среде.

Таблица 2Сроки появления первичного роста микобактерий на средах разных вариантовШтаммыСроки появления роста, днейСреда в соответствии с изобретениемСреда Левенштейна-ЙенсенаВариант 1Вариант 2Вариант 3Вариант 4M.bovis (шт.Vallee)1513121214М.bovis (BCG)1515151515М.tuberculosis (шт.Academia)1311101010М.tuberculosis (шт.H₃₇Ra)1311101010М.avium (шт.ГИСК)97777М.avium шт.441210997М.avium шт.659111010108М.phlei43222М.smegmatis, 5343222

Таблица 3Массивность роста микобактерий на средах разных вариантов:СредаШтаммы микобактерийМ.bovis ValleeМ.bovis BCGM.tub. AcademiaM.tub. Н₃₇RaМ.avium ГИСКМ.avium 44М.avium 659М.phleiМ.smegmatis 53Массивность роста3 недели роста1 неделя ростаВариант 1±±±+±±±4-+Вариант 2±+++++++++++--Вариант 3±+++++++++++++Вариант 4±+++++++++++++Среда Левен-штейна-Йенсена±+++++++++++++

Пример 4. Для определения эффективности среды для культивирования нокардиоформных актиномицетов использовали референс-штамм Nocardia asteroids и четыре штамма родококков, выделенные от свиней и идентифицированные в лабораторных условиях. Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Посевы культур и учет результатов проводили как в примере 3. Контроль - традиционно применяемая среда Левенштейна-Йенсена. Результаты представлены в таблицах 4 и 5.

Таблица 4Сроки появления первичного роста нокардиоформных актиномицетов на средах разных вариантовШтаммыСроки появления роста, днейСреда в соответствии с изобретениемСреда Левенштейна-ЙенсенаВариант 1Вариант 2Вариант 3Вариант 4Rhodococcus equi, шт.1232222Rhodococcus equi, шт.1342222Rhodococcus equi, шт.532222Rhodococcus equi, шт.633222Nocardia asteroids32222

Таблица 5Массивность роста нокардиоформных актиномицетов на средах разных вариантовСредаШтаммы нокардиоформных актиномицетовRhodococcus equi 12Rhodococcus equi 13Rhodococcus equi 14Rhodococcus equi 15Nocardia asteroidsМассивность ростаВариант 1±+++±Вариант 2++++++++Вариант 3+++++++++Вариант 4+++++++++Контроль+++++++++

Пример 5. Для сравнительного изучения информативности среды в соответствии с изобретением (вариант 3) и сред Левенштейна-Йенсена, Финн-2, Гельберга, ФАСТ-ЗЛ и Петраньяни использовали референс-штаммы микобактерий M.bovis (шт.Vallee, Ravenal БЦЖ), M.tuberculosis (шт.Academia), М.avium (шт.ГИСК и 659), M.smegmatis (шт.4), М.fortuitum и биологический материал от положительно реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота неблагополучных по туберкулезу хозяйств с характерными поражениями в органах и лимфатических узлах. Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Биологический материал предварительно обрабатывали по методу Аликаевой. Посевы культур производили нанесением одной капли суспензии микобактерий, содержавшей 30-60 КОЕ при посеве на известные среды и на среду в соответствии с изобретением. Посев каждого штамма проводили на 3-5 пробирок. При оценке роста культур учитывали сроки появления первичных колоний и изучали культурально-морфологические свойства. Интенсивность роста изучали при посеве культуры М.bovis (шт.Vallee) на все анализируемые среды. Результаты представлены в таблицах 6 и 7.

Пример 6. Изучали жирнокислотный состав клеток колоний штаммов микобактерий туберкулеза BCG и Academia, снятых со сред Левенштейна-Йенсена, Павловского (оптимальной для получения бактериальной массы микобактерий и нокардиоформных актиномицетов для газохроматографического анализа) и питательной среды в соответствии с изобретением на газовом хроматографе Цвет-500. На хроматограммах эфиров жирных кислот клеток, снятых со среды Левенштейна-Йенсена, установлены следы жирных кислот яичной среды. Хроматограммы эфиров жирных кислот клеток, снятых со среды в соответствии с изобретением, отличались от хроматограмм эфиров жирных кислот клеток, снятых со среды Павловского, более четкими пиками.

Таблица 6Скорость роста микобактерий разных видов на плотных питательных средахПитательная средаСкорость роста, сут.М.bovis шт ValleeМ.bovis шт.RavenalМ.bovis шт.БЦЖМ.tuberculosis шт.AcademiaМ.avium шт.ГИСКM.avium шт.659М.smegmatis шт.4М.fortuitumБиоматериал от крупного рогатого скотаЛевенштейна-Йенсена13-1514-1616-1713-1510-1211-133-46-729-33Финн-213-1514-1616-1713-1510-1111-123-45-829-33Гельберга17-1917-1920-2117-1911-1213-132-3733-37ФАСТ-ЗЛ16-1816-1818-1915-1710113630-34Петраньяни19-2119-2119-2116-1810-1211-134-59-1036-40Заявленная среда11-1212-1416-1712-1310-1110-112526-28

Таблица 7Интенсивность роста М.bovis (шт.Vallee) на плотных питательных средахПитательная средаСутки791011121314151624Левенштейна-Йенсена-----+++++++++Финн-2-----+++++++++Гельберга------+++++++++ФАСТ-ЗЛ------+++++++++Петраньяни--==--+++++++++Заявленная среда---+++++++++++++++++Примечание: + - единичные колонии; ++ - 10-20 колоний: +++ - 21-50 колоний; ++++ - сплошной рост

Проведенные исследования подтвердили эффективность питательной среды в соответствии с изобретением для культивирования микобактерий и нокардиоформных актиномицетов (сроки появления первичного роста и массивность роста сравнимы с таковыми на традиционно применяемых средах). Заявленная питательная среда отличается дешевизной и технологичностью приготовления, а ее использование упрощает проведение бактериологических исследований благодаря визуализации начального роста колоний.

Источники информации

1. Туберкулез сельскохозяйственных животных / Под ред. Шишкова В.П., Урбана В.П. - М.: Агропромиздат, 1991. - С.120-121.

2. Васильев В.Н. Микобактериозы и микозы легких. - Софрия, 1971. - С.146-175.

3. Там же, С.156.

4. RU 2226398 C2, 2004.04.10.

5. Гришин Г.И., Слинина К.Н. Дар природы - гумивит // Практик. - 2004. - №3-4. - С.80-82.

6.Левинский Б.В. Все о гуматах. - Иркутск: ИП Макаров С.Е., 1999. - 198 с.

7. Сорокина Н.Ф. Физиология активности продуктов окисления торфа // Новые процессы и продукты переработки торфа. - Минск: Наука, 1982. - С.109-115.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Питательная среда содержит калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, L-аспарагин, глицерин, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, агар, гумивит и дистиллированную воду. Изобретение позволяет повысить ростовые свойства питательной среды. 7 табл.

Питательная среда для культивирования микобактерий и нокардиоформных актиномицетов, содержащая калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, L-аспарагин, глицерин, лимонную кислоту, лимонно-кислое аммиачное железо и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит агар и гумивит при следующем соотношении компонентов:

L-аспарагин4,0 гкалий фосфорнокислый двузамещенный0,5 гсернокислый магний0,5 глимонная кислота2,0 глимонно-кислое аммиачное железо0,05 гглицерин40,0 гагар30,0 ггумивит90,0-95,0 млдистиллированная водадо 1000,0 мл