Средство, проявляющее гепатопротекторную, липидрегулирующую, противоишемическую и нейротропную активность Российский патент 2019 года по МПК C07D213/65 A61K31/44 A61P9/10 A61P25/28 A61P3/00 A61P1/16 

Изобретение относится к области химии, медицины и клинической фармакологии.

Перспективным направлением химии органических соединений, является изыскание и создание инновационных отечественных лекарственных препаратов в ряду производных гидроксипиридина, проявляющих широкий спектр фармакологической активности.

В настоящее время в клинической практике используются такие производные 3-гидроксипиридина как мексидол, эмоксипин (Г.И. КЛЕБАНОВ и др. АНТИОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА ПРОИЗВОДНЫХ 3-ОКСИПИРИДИНА: МЕКСИДОЛА, ЭМОКСИПИНА И ПРОКСИПИНА, Вопросы медицинской химии №3 2001). Данные препараты оказывают антиоксидантное, антигипоксическое, ноотропное, противосудорожное, анксиолитическое действие.

Известно лекарственное средство Этоксидол - 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиний гидроксибутандиоат в форме рацемата, обладающее противоишемической, церебропротекторной, нейротропной и липидрегулируемой активностями (RU 2377237), формулы:

а также фармацевтические композиции на его основе.

Указанный патент может быть выбран в качестве ближайшего аналога-прототипа.

Целью изобретения является создание нового средства, проявляющего гепатопротекторную липидрегулирующую, противоишемическую и нейротропную активность и представляющее собой соединение -L-энантиомер 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-гидроксибутандиоата (соединение 1):

Соединение 1 может быть введено в виде различных лекарственных форм в виде композиции с фармацевтически приемлемыми носителями (целевой добавкой). Соединение применяется в терапевтически эффективных дозах, которые будут зависеть от веса, пола, возраста пациентов, этиологии и тяжести заболевания. Предпочтительно дозы составляют от 20 до 300 мг.

Технический результат: эффективное применение нового производного 3-гидроксипиридина, а именно L-энантиомера 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-гидроксибутандиоата для лечения и профилактики широкого спектра заболеваний в качестве средства, проявляющее гепатопротекторную липидрегулирующую, противоишемическую и нейротропную активность, которое обеспечивает пролонгирующий период биоэлектрической активности миокарда, по сравнению с рацематом.

Изобретение может быть проиллюстрировано следующими ниже представленными примерами осуществления изобретения.

Пример 1 Синтез L-энантиомера 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-гидроксибутандиоата.

К 13,7 г (0,1 м) 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина присыпают 13,41 г (0,1 м) L-гидроксибутандиовой кислоты, массу тщательно перемешивают и нагревают до плавления при 100-110°С. К полученному плаву постепенно при перемешивании приливают 120 мл воды, полученный раствор фильтруют, отгоняют 60-70% воды в вакууме, к полученному остатку приливают 80 мл ацетона, массу кристаллизуют, полученный осадок отфильтровывают и сушат в вакууме. Получают 23,8 г белого кристаллического вещества, обладающего высокой гигроскопичностью, расплывается на воздухе. C12H17N06

Найдено, %: С 53,07; Н 6,38; N 5,11.

Вычислено, %: С 53,14; Н 6,27; N 5,17.

ИК-спектр, ν см-1: 3510, 3230, 1660, 1610, 1560, 1292, 1161.

УФ-спектр, нм: 228,291 (вода)

Угол вращения [α]D20 -13,6 (4,5% ацетонитрил).

Пример 2 Раствор для инъекций (вес/об.)

L-энантиомера 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-гидроксибутандиоата 5,00%

Натрия метабисульфит 1,0%

1 М раствор хлористоводородной кислоты до рН 4,5

Вода для инъекций до 100%

Пример 3 Капсулы

L-энантиомера 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-гидроксибутандиоата - 30 масс. %

Крахмал - 25 масс. %

Поливинилпирролидон - 3,5 масс. %

Микрокристаллическая целлюлоза - 12,5 масс. %

Лактоза - 29,0 масс. %

Пример 4 Изучение липидрегулирующего действия L-энантиомера.

Исследования проведены на экспериментальной модели дислипидемии у крыс линии Вистар (самцы, масса 250-280 г, по 10 животных в группе). Модель холестериновой дислипидемии индуцирована введением масляного раствора холестерина в дозе 40 мг/кг и витамина D₃ в дозе 25000 МЕ/кг (введение животным ежедневно в течение 20 суток).

До начала опыта и в динамике (через 20 и 30 суток) у крысы определялись следующие показатели:

1. Содержание общего холестерина (ОХС) в плазме крови,

2. β-липопротеидов (β-ЛП),

3. Холестерина липопротеидов высокой плотности (ХС ЛПВП),

4. Содержание триглицеридов (ТГ),

5. Индекс атерогенности (ИА).

ИА рассчитывали по формуле: ИА = (ОХС - ХС ЛПВП)/ХС ЛПВП.

Содержание холестерина липопротеидов высокой плотности определяли по методу Абеля после гепарин-марганцовой преципитации и осаждения из сыворотки липопротеидов низкой плотности. Содержание триглицеридов определяли при помощи диагностических наборов.

Результаты исследований приведены в таблице 1.

Достоверность различий по сравнению с интактнымии контрольными животными в пределах р<0,001 и р<0,01 соответственно.

Полученные результаты свидетельствуют, что введение холестерина в сочетании с витамином D₃ вызывает негативные сдвиги в спектре плазмы крови животных, характерные для дислипидемии IIA (по классификации ВОЗ). Через 20 суток эти нарушения проявлялись в существенном повышении уровня β-ЛП (р<0,001) и увеличении ИА (р<0,001). Через 30 суток у животных контрольной группы помимо этих проатерогенных изменений наблюдалось также повышение ТГ (р<0,01) и ОХС (р<0,01).

Кроме того, наблюдали выраженный дисбаланс оксидантно-антиоксидантной системы. Уровень каталазы в плазме крови существенно снижался. Обнаружено накопление продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Введение животным, получавшим предварительно холестерин с витамином D₃,L-энантиомера в дозе 25 мг/кг перорально (с 20 по 30 сутки) оказывало выраженное липидкоррегирующее действие: существенно увеличилась фракция ХС ЛПВП, снизилось содержание ОХС, β-ЛП и уменьшился ИА до нормы (уровень интактных животных).

Таким образом, L-энантиомер является эффективным липидрегулирующим средством.

Пример 5 Исследования острой токсичности и антигипоксической активности

Исследования проведены на 69 белых SHK мышах самцах, 69 белых SHK мышах самках весом 20-22 г. Формирование групп животных по 6 мышей каждого пола для проведения эксперимента по изучению острой токсичности и антигипоксической активности является репрезентативной выборкой и позволяет по многолетнему опыту токсикологических исследований получить статистически достоверные данные. Во время эксперимента животные содержались в контролируемых условиях: температура окружающего воздуха 20-24°С, относительная влажность 50-60%.

В настоящем исследовании острую токсичность оценивали на мышах обоего пола при однократном внутривенном введении соединения 1 и препарата сравнения. Белым аутбредным мышам (по 6 голов каждого пола в группе) вводили соединение 1 или препарат сравнения в нарастающих дозах 300, 400, 500, 600, 700 мг/кг веса животного в виде раствора в воде для инъекций общим объемом 0,5 мл, допустимого для данного вида животных.

Наблюдение за животными проводили в течение не менее 14 дней после введения. О токсичности препаратов судили по гибели животных и общей картине интоксикации. Фиксировали общее состояние животных: особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и характер судорог, координацию движений, тонус скелетных мышц, реакцию на тактильные, болевые раздражители, частоту и глубину дыхательных движений, состояние волосяного и кожного покрова. Производили подсчет количества погибших животных в ходе эксперимента.

Полученные данные обрабатывались общепринятым методом вариационной статистики с вычислением среднего значения (М) и стандартной ошибки среднего значения (m). В качестве критерия оценки достоверности различия средних величин использовали парный критерий t Стьюдента с поправкой Бонферрони при уровне значимости Р<0,05, для определения достоверности различий абсолютных величин использовали непараметрический критерий «хи-квадрат», при объеме выборки менее 10 - точный критерий Фишера, для определения достоверности различий до и после введения фармакологического агента использовали критерий Уилкоксона.

На основании полученных результатов определяли характеристики «острой» токсичности с помощью пробит-анализа по Миллеру и Тейнтеру. Клиническая картина интоксикации у мышей при введении обоих сравниваемых фармакологических агентов была идентичной. При введении токсических доз соединения 1 и препарата сравнения «Этоксидол (рацемат)», Россия отмечалось снижение двигательной активности животных. При увеличении дозы наблюдался кратковременный (2-3 мин) период гиперкинезии с явлениями беспокойства. Координация движений нарушалась, тонус скелетных мышц был повышен, наблюдались тонические и клонические судороги. В этот период наблюдались непроизвольные акты дефекации и мочеиспускания. Часть животных погибала на фоне судорог. Выжившие животные находились в «заторможенном» состоянии, что выражалось в сниженной реакции на световые, звуковые, тактильные и болевые раздражители (раздражение корня хвоста), при этом наблюдались судорожные подергивания мышц, снижение аппетита, диарея или обстипация на фоне возрастающего водопотребления. Дыхание было учащенным и поверхностным, регистрировали гипертермию. В указанном выше состоянии животные находились в течение первых двух суток, после чего постепенно принимали исходное физиологическое положение.

В течение последующих 14 суток явления интоксикации у животных проявлялись в сниженной реакции на раздражители. Волосяной покров терял блеск, характерный для здоровых животных, кожные покровы оставались без изменений. В дальнейшем состояние животных постепенно возвращалось к норме.

При динамическом наблюдении за животными в течение 14 суток гибели среди выживших животных не отмечали.

Соединение 1 пролонгировало период биоэлектрической активности миокарда, будучи вводимой мышам в дозе, составляющей 5% значения показателя LD50 до 696±10 с, что статистически значимо больше, чем в контроле и в группе препарата сравнения. Кроме того, под влиянием исследуемого вещества поддерживалась сократительная способность миокарда до 381±9 уд./мин. В то время как рацемат, применяемый в высшей терапевтической дозе, приводил к увеличению времени жизни подопытных животных - наименьшее время сохранения биоэлектрической активности составило 592 с, а наибольшее - 610 с.

Пример 6. Изучение противоишемической активности.

Эксперименты проведены на белых нелинейных крысах-самцах, мышах, кроликах и кошках.

Влияние на соотношение зоны некроза к зоне ишемии при ишемическом повреждении миокарда крыс изучали в дозе 5% от ЛД50. В той же дозе изучали влияние на развитие реперфузионных аритмий. Фибрилляцию желудочков вызывали окклюзией коронарных артерий. Определяли влияние препарата на кардиогемодинамику и перекисное окисление липидов (ПОЛ), индуцированные иммобилизационным стрессом.

Показано, что соединение 1 в дозе 5 мг/кг устраняет фибрилляцию желудочков при окклюзии коронарных артерий и снижает количество животных, у которых возникает фибрилляция желудочков до 1 из 10 опытных животных.

В условиях острой ишемии миокарда в дозе 10 мг/кг оказывает отчетливое кардиопротективное действие на кардиогемодинамику, приближая значения сократимости (dP/dt), АД и другие до уровня интактного контроля.

Пример 7. Изучение нейропротективной активности.

Активность подтверждена на модели «обучаемость условного рефлекса пассивного избегания крыс недоучек» и с помощью теста амнезии условного рефлекса пассивного избегания, вызванную скополамином у крыс.

Исследование выполнено на белых беспородных половозрелых крысах самцах массой 250-280 г.

Тест на воспроизведение обучаемости проводили через 24 ч после обучения, регистрировали латентный период захода животного в темное отделение и затем регистрировали число животных, совсем не зашедших в темный опасный отсек и остававшихся на освещенной висячей платформе (крысы, хорошо помнящие ситуацию).

Соединение 1 и препарат сравнения Этоксидол вводили однократно внутрь (интрагастрально) при помощи специального зонда в объеме 0,2 мл на 100 г веса крысы за 40 минут до обучения. Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду.

Все исследуемые вещества существенно не изменяли латентное время выполнения навыка захода в темную камеру. Латентный период захода в темную камеру при выполнении норкового рефлекса при первом помещении животных в камеру не изменялся по сравнению с контролем.

После этого осуществляли обучение УРПИ, для чего крыса получала в темной камере небольшое болевое раздражение.

Контрольные животные после обучения и при последующем воспроизведении обученного через 24 ч после обучения помнили о болевом раздражении, полученном в темной камере, и заходили туда с большим латентным периодом. Только 1 крыса из 15-ти совсем не зашла в темную камеру.

Согласно результатам соединение 1 в дозе 200 мг/кг улучшают обучение условному рефлексу пассивного избегания у крыс недоучек, что выражается в достоверном увеличении латентного времени захода в темную камеру при воспроизведении рефлекса. Препарат сравнения в дозе 200 мг/кг также улучшал обучение условному рефлексу пассивного избегания по показателю латентного периода выполнения рефлекса и по показателю увеличения процента животных, совсем не зашедших в темную камеру. Таким образом, препараты имеют сходную нейропротективную эффективность в дозе 200 мг/кг. В дозе 100 мг/кг энантиомер проявил большую активность, чем рацемат в той же дозе.

Пример 7 Изучение гепатопротекторных свойств

Исследование проведено у 30 пациентов-добровольцев с хроническим гепатитом, получавших стандартную терапию. Соединение 1 вводили в виде 5% раствора на 0,9% растворе натрия хлорида по 2 мл в/в 1 раз в сутки в течение 2 недель. У всех пациентов до и после назначенной терапии проводились биохимические исследования: АЛТ, ACT, ЦФ, ЛДГ, МДА, билирубин, общий белок и белковые фракции.

К 14 суткам у 22 больных наблюдалась нормализация активности АЛТ, и составила 1,30±0,2 ммоль/л, возросло содержание билирубина до нормы у 89% пациентов. На фоне введения соединения 1 индекс повреждения гепатоцитов был достоверно ниже контрольной серии (Этоксидол 5% раствор).

Таким образом, L-энантиомер 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-гидроксибутандиоата проявил гепатопротекторный эффект, превосходящий таковой у препарата сравнения Этоксидола.

Изобретение относится к области медицины и клинической фармакологии. Предложено применение L-энантиомера 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-гидроксибутандиоата в качестве средства, проявляющего гепатопротекторную, липидрегулирующую, противоишемическую и нейротропную активность. Соединение обеспечивает пролонгирующий период биоэлектрической активности миокарда, по сравнению с рацематом. 1 табл., 7 пр.

Применение L-энантиомера 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-гидроксибутандиоата формулы 1

в качестве средства, проявляющего гепатопротекторную липидрегулирующую, противоишемическую и нейротропную активность.