ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ КОМБИНАЦИИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ КОНЪЮГАТЫ НА ОСНОВЕ АНТИТЕЛА К CEACAM5, ТРИФЛУРИДИН И ТИПИРАЦИЛ Российский патент 2025 года по МПК A61K47/68 A61K45/06 A61K31/513 A61K31/7072 A61P1/00 A61P35/00 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к конъюгатам на основе антитела, содержащим антитело к СЕАСАМ5, предназначенным для применения в лечении рака в комбинации с трифлуридином и типирацилом (TAS-102). Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям и наборам, состоящим из компонентов, содержащим антитело к СЕАСАМ5 в комбинации с трифлуридином и типирацилом (TAS-102), предназначенным для применения в лечении рака.

Канцероэмбриональный антиген (СЕА) представляет собой гликопротеин, вовлеченный в адгезию клеток. Впервые СЕА был идентифицирован в 1965 году (Gold and Freedman, J Exp Med, 121, 439, 1965) как белок, в норме экспрессируемый в кишечнике плода в первые шесть месяцев беременности и выявляемый при разных видах рака поджелудочной железы, печени и толстого кишечника. Семейство СЕА относится к суперсемейству иммуноглобулинов. Семейство СЕА, которое состоит из 18 генов, подразделяется на две подгруппы белков: подгруппа молекул клеточной адгезии, связанных с канцероэмбриональный антигеном (СЕАСАМ), и подгруппа гликопротеинов, специфических для беременности (Kammerer & Zimmermann, ВМС Biology 2010, 8:12).

У людей подгруппа СЕАСАМ состоит из 7 представителей: СЕАСАМ1, СЕАСАМ3, СЕАСАМ4, СЕАСАМ5, СЕАСАМ6, CEACAM7, СЕАСАМ8. Многочисленные исследования продемонстрировали, что СЕАСАМ5, идентичный первоначально идентифицированному СЕА, с высокими уровнями экспрессируется на поверхности клеток колоректальных опухолей, опухолей желудка, легкого, молочной железы, предстательной железы, яичника, шейки матки и мочевого пузыря и с низкими уровнями экспрессируется в нескольких нормальных эпителиальных тканях, например, в столбчатых эпителиальных и бокаловидных клетках в толстом кишечнике, слизистых шеечных клетках в желудке и плоских эпителиальных клетках в пищеводе и шейке матки et al, 2002, in "Tumor markers, Physiology, Pathobiology, Technology and Clinical Applications" Eds. Diamandis E. P. et al., AACC Press, Washington pp 375). Таким образом, CEACAM5 могут представлять собой терапевтическую мишень, подходящую для подходов на основе опухолеспецифического нацеливания, например подходов с использованием иммуноконъюгатов.

Внеклеточные домены представителей семейства СЕАСАМ состоят из повторяющихся иммуноглобулин-подобных (Ig-подобных) доменов, которые разделили на 3 типа (А, В и N) в соответствии с гомологиями последовательностей. СЕАСАМ5 содержит семь таких доменов, а именно N, A1, B1, А2, В2, A3 и В3. Домены A1, А2 и A3 СЕАСАМ5, с одной стороны, и домены B1, В2 и В3 СЕАСАМ5 с другой стороны, демонстрируют высокие уровни гомологии последовательностей, домены А СЕАСАМ5 человека проявляют от 84% до 87% сходства парных последовательностей, и домены В - от 69% до 80%. Кроме того, другие представители СЕАСАМ человека, демонстрирующие домены А или/и В в своей структуре, а именно СЕАСАМ1, СЕАСАМ6, СЕАСАМ7 и CEACAM8, демонстрируют гомологию с СЕАСАМ5 человека. В частности, домены А и В белка СЕАСАМ6 человека проявляют уровни гомологии последовательностей с доменами А1 и A3 и с любыми из доменов В1 - В3 СЕАСАМ5 человека соответственно, которые еще выше, чем наблюдаемые среди доменов А и доменов В СЕАСАМ5 человека.

Многочисленные антитела к СЕА получали с учетом диагностических и терапевтических целей, направленных на СЕА. Специфичность к родственным антигенам всегда упоминали в качестве проблемы в данной области техники, как, например, в Sharkey et al. (1990, Cancer Research 50, 2823). Из-за уровней гомологии, упомянутых выше, некоторые из ранее описываемых антител могут демонстрировать связывание с повторяющимися эпитопами СЕАСАМ5, присутствующими в разных доменах иммуноглобулина, и/или демонстрируют перекрестную реактивность по отношению к другим представителям СЕАСАМ, таким как СЕАСАМ1, СЕАСАМ6, СЕАСАМ7 или СЕАСАМ8, не обладая специфичностью к СЕАСАМ5. Специфичность антитела к СЕАСАМ5 является необходимой с учетом средств терапии, нацеленных на СЕА так, что оно связывается с опухолевыми клетками человека, экспрессирующими СЕАСАМ5, но не связывается с некоторыми нормальными тканями, экспрессирующими другие представители СЕАСАМ. Следует отметить, что СЕАСАМ1, СЕАСАМ6 и СЕАСАМ8 были описаны как экспрессируемые нейтрофилами человека и отличных от человека приматов (Ebrahiminnejad et al, 2000, Exp Cell Res, 260, 365; Zhao et al, 2004, J Immunol Methods 293, 207; Strickland et al, 2009 J Pathol, 218, 380), где, как было показано, они регулируют гранулоцитопоэз и играют роль в иммунном ответе.

В международной патентной заявке, опубликованной как WO 2014/079886, раскрыто антитело, связывающееся с доменом А3-В3 белков СЕАСАМ5 человека и Масаса fascicular is и не являющееся в значительной степени перекрестно-реактивным в отношении СЕАСАМ1 человека, СЕАСАМ6 человека, СЕАСАМ7 человека, СЕАСАМ8 человека, СЕАСАМ1 Масаса fascicularis, СЕАСАМ6 Масаса fascicularis и СЕАСАМ8 Масаса fascicularis. Данное антитело было конъюгировано с майтанзиноидом, за счет чего обеспечивается получение иммуноконъюгата, обладающего значительной цитотоксической активностью в отношении клеток рака желудка человека MKN45 со значениями IC₅₀ ≤ 1 нМ.

Иммуноконъюгаты на основе антитела состоят из антитела, присоединенного к цитостатическому лекарственному средству. В одном варианте осуществления антитело присоединено к цитостатическому лекарственному средству через химический линкер. Эти иммуноконъюгаты обладают большим потенциалом в химиотерапии рака и обеспечивают возможность избирательной доставки высокоактивного цитостатика к целевым раковым клеткам, что приводит к повышению эффективности, снижению системной токсичности и улучшению фармакокинетики, фармакодинамики и биораспределения по сравнению с традиционной химиотерапией. На сегодняшний день разработаны сотни разнообразных иммуноконъюгатов против различных видов рака, из которых несколько были одобрены для применения у человека.

Большинство схем химиотерапии в настоящее время направлены на введение комбинации цитотоксических лекарственных средств, каждое из которых обладает своим механизмом действия и благоприятными синергическими эффектами, вызывая гибель раковых клеток. Такая схема химиотерапии обычно определяется используемыми цитотоксическими лекарственными средствами, их дозировкой, частотой и продолжительностью введения. На протяжении десятилетий для лечения онкологических заболеваний разрабатывались новые и совершенствовались существующие схемы химиотерапии.

Однако по данным Всемирной организации здравоохранения рак является второй ведущей причиной смерти во всем мире и стал причиной смерти примерно 9,6 миллионов людей в 2018 году. Поэтому существует постоянная потребность в обеспечении улучшенных комбинаций лекарственных средств и схем лечения рака.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к иммуноконъюгату, содержащему антитело к СЕАСАМ5, предназначенному для применения в комбинации с трифлуридином и типирацилом (TAS-102) для лечения рака.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей иммуноконъюгат, содержащий антитело к СЕАСАМ5, и трифлуридин и типирацил, и, кроме того, к применению фармацевтической композиции для лечения рака.

Также настоящее изобретение относится к набору, содержащему (i) фармацевтическую композицию, содержащую иммуноконъюгат, который содержит антитело к СЕАСАМ5, и (ii) одну или несколько фармацевтических композиций, содержащих трифлуридин и типирацил, в отдельных или комбинированных составах.

Дополнительно настоящее изобретение относится к применению набора для лечения рака.

Хотя далеко не все возможные комбинации цитостатических средств проявляют дополнительный улучшенный терапевтический эффект, авторы настоящего изобретения определили, что конкретный иммуноконъюгат, содержащий антитело к СЕАСАМ5, в комбинации с TAS-102 демонстрирует благоприятную активность в лечении рака по сравнению с введением антитела к СЕАСАМ5 или TAS-102 по отдельности.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

"Антитело" может представлять собой природное или традиционное антитело, в котором две тяжелые цепи соединены друг с другом дисульфидными связями, при этом каждая тяжелая цепь соединена с легкой цепью дисульфидной связью. Существует два типа легких цепей: лямбда (1) и каппа (k). Существуют пять основных классов (или изотипов) тяжелых цепей, которые определяют функциональную активность молекулы антитела: IgM, IgD, IgG, IgA и IgE. Каждая цепь содержит домены с разной последовательностью. Легкая цепь содержит два домена или области: вариабельный домен (VL) и константный домен (CL). Тяжелая цепь содержит четыре домена: вариабельный домен (VH) и три константных домена (CH1, СН2 и СН3, в совокупности называемых СН). Вариабельные области как легких (VL), так и тяжелых (VH) цепей определяют распознавание при связывании и специфичность к антигену. Домены константных областей легких (CL) и тяжелых (СН) цепей обеспечивают важные биологические свойства, такие как объединение цепей антитела, секреция, трансплацентарное перемещение, связывание комплемента и связывание с Fc-рецепторами (FcR). Fv-фрагмент представляет собой N-концевую часть Fab-фрагмента иммуноглобулина и состоит из вариабельных частей одной легкой цепи и одной тяжелой цепи. Специфичность антитела заключается в структурной комплементарности между паратопом антитела и антигенной детерминантой. Паратопы антител составлены остатками главным образом из гипервариабельных или определяющих комплементарность областей (CDR). Остатки из негипервариабельных или каркасных областей (FR) иногда влияют на общую структуру домена и, следовательно, паратоп. Определяющие комплементарность области или CDR, таким образом, относятся к аминокислотным последовательностям, которые совместно определяют аффинность связывания и специфичность природной Fv-области нативного связывающего участка иммуноглобулина. Каждая из легких и тяжелых цепей иммуноглобулина имеет три CDR, обозначенные как CDR1-L, CDR2-L, CDR3-L и CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H соответственно. Следовательно, антигенсвязывающий участок традиционного антитела содержит шесть CDR, которые включают набор CDR из каждой из V-области тяжелой и легкой цепей.

"Каркасными областями" (FR) называют аминокислотные последовательности, расположенные между CDR, т.е. те части вариабельных областей легких и тяжелых цепей иммуноглобулина, которые являются относительно консервативными среди различных иммуноглобулинов у одного вида. Каждая из легких и тяжелых цепей иммуноглобулина имеет четыре FR, обозначенные соответственно как FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L и FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H. Каркасная область человека представляет собой каркасную область, которая по сути идентична (на приблизительно 85% или больше, в частности, на 90%, 95%, 97%, 99% или 100%) каркасной области встречающегося в природе антитела человека.

В контексте настоящего изобретения определение CDR/FR в легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина следует давать на основании определения согласно IMGT (Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1):55-77; www.imgt.org).

Используемый в данном документе термин "антитело" означает традиционные антитела и их фрагменты, а также однодоменные антитела и их фрагменты, в частности, вариабельные области тяжелых цепей однодоменных антител, и химерные, гуманизированные, биспецифические или полиспецифические антитела.

Используемые в данном документе антитело или иммуноглобулин также включают "однодоменные антитела", которые были описаны лишь недавно и которые представляют собой антитела, у которых определяющие комплементарность области являются частью однодоменного полипептида. Примеры однодоменных антител включают антитела, состоящие только из тяжелых цепей, антитела, в естественных условиях не имеющие легких цепей, однодоменные антитела, полученные из традиционных антител с четырьмя цепями, сконструированные однодоменные антитела. Однодоменные антитела могут быть получены из любого вида, в том числе без ограничения мыши, человека, верблюда, ламы, козы, кролика, крупного рогатого скота. Однодоменные антитела могут представлять собой встречающиеся в природе однодоменные антитела, известные как антитела, состоящие только из тяжелых цепей, не имеющие легких цепей. В частности, виды семейства Camelidae, например, верблюд, дромедар, лама, альпака и гуанако, продуцируют антитела, состоящие только из тяжелых цепей, в естественных условиях не имеющие легких цепей. У антител верблюдовых, состоящих только из тяжелых цепей, также отсутствует домен СН1.

Вариабельная область тяжелой цепи этих однодоменных антител, не имеющих легких цепей, известна из уровня техники как " VHH" или "наноантитело". Подобно традиционным VH-доменам, VHH содержат четыре FR и три CDR. Наноантитела обладают преимуществами по сравнению с традиционными антителами: они приблизительно в десять раз меньше, чем молекулы IgG, и, как следствие, правильно уложенные функциональные наноантитела можно получать посредством экспрессии in vitro с достижением высокого выхода. Кроме того, наноантитела являются очень стабильными и устойчивыми к действию протеаз. Обзор свойств и получения наноантител был приведен в Harmsen and De Haard HJ (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007 Nov;77(1):13-22).

Используемым в данном документе термином "моноклональное антитело" или "mAb" обозначают молекулу антитела с единой аминокислотной последовательностью, которая направлена против специфического антигена, и его не следует истолковывать как требующий получения антитела любым конкретным способом. Моноклональное антитело может быть получено из одного клона В-клеток или гибридомы, но также может быть рекомбинантным, т.е. полученным с помощью белковой инженерии.

Термином "гуманизированное антитело" называют антитело, которое полностью или частично происходит не от человека и которое было модифицировано для замены определенных аминокислот, в частности в каркасных областях VH- и VL-доменов, чтобы избежать или минимизировать иммунный ответ у людей. Константные домены гуманизированного антитела в большинстве случаев представляют собой СН- и CL-домены человека.

"Фрагменты" (традиционных) антител содержат часть интактного антитела, в частности, антиген-связывающую область или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антитела включают Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, диантитела, биспецифические и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Фрагмент традиционного антитела также может представлять собой однодоменное антитело, такое как антитело, состоящее только из тяжелых цепей или VHH.

Термин "Fab" означает фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу приблизительно 50000 и антигенсвязывающую активность, в котором приблизительно половина N-концевой части тяжелой цепи и вся легкая цепь связаны друг с другом с помощью дисульфидной связи. Его обычно выделяют из фрагментов путем обработки IgG протеазой, такой как папаин.

Термином "F(ab')2" называют фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу приблизительно 100000 и антигенсвязывающую активность, который является несколько большим, чем 2 идентичных Fab-фрагмента, связанные с помощью дисульфидной связи шарнирной области. Его обычно выделяют из фрагментов путем обработки IgG протеазой, такой как пепсин.

Термином "Fab" называют фрагмент антитела с молекулярной массой, составляющей приблизительно 50000, и антигенсвязывающей активностью, который получают путем разрезания дисульфидной связи шарнирной области F(ab')2.

Одноцепочечный полипептид Fv ("scFv") представляет собой соединенный ковалентными связями гетеродимер VH::VL, который обычно экспрессируется продуктом генного слияния, содержащим гены, кодирующие VH и VL, соединенные линкером, кодирующим пептид. scFv-фрагмент человека по настоящему изобретению содержит CDR, удерживаемые в надлежащей конформации, в частности, путем применения методик рекомбинации генов. Бивалентные и поливалентные фрагменты антител могут образовываться или спонтанно путем объединения моновалентных scFv, или их можно получать путем соединения моновалентных scFv пептидным линкером, как, например, в случае бивалентного sc(Fv)2. "dsFv" представляет собой гетеродимер VH::VL, стабилизированный дисульфидной связью. "(dsFv)2" обозначает два dsFv, соединенных пептидным линкером.

Термин "биспецифическое антитело" или "BsAb" означает антитело, в котором антигенсвязывающие участки двух антител объединены в одной молекуле. Таким образом, BsAb способны связываться с двумя разными антигенами одновременно. Для разработки, модификации и получения антител или производных антител с необходимым набором связывающих свойств и эффекторных функций все чаще используют генную инженерию, как описано, например, в ЕР 2050764 А1.

Термин "полиспецифическое антитело" означает антитело, в котором антигенсвязывающие участки двух или более антител объединены в одной молекуле.

Термином "диантитела" называют небольшие фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими участками, при этом данные фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в составе одной и той же полипептидной цепи (VH-VL). За счет использования линкера, слишком короткого для обеспечения спаривания между двумя доменами одной цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и образовывать два антигенсвязывающих участка.

Аминокислотная последовательность, которая "на по меньшей мере 85% идентична референтной последовательности", представляет собой последовательность, характеризующуюся по своей полной длине 85% или большей, в частности 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с полноразмерной референтной аминокислотной последовательностью.

Процент "идентичности последовательностей" между аминокислотными последовательностями можно определить путем сравнения двух последовательностей, оптимальным образом выровненных в окне сравнения, где часть полинуклеотидной или полипептиднои последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. гэпы) по сравнению с референтной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент рассчитывают путем определения количества положений, в которых в обеих последовательностях встречается идентичное основание нуклеиновой кислоты или идентичный аминокислотный остаток, с получением количества положений с совпадениями, деления количества положений с совпадениями на общее количество положений в окне сравнения и умножения результата на 100 с получением процента идентичности последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения проводят путем глобального попарного выравнивания, например, с помощью алгоритма Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970). Процент идентичности последовательностей можно легко определить, например, с применением программы Needle с помощью матрицы BLOSUM62 и следующих параметров: штраф за открытие гэпа=10, штраф за продолжение гэпа=0,5.

"Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком, содержащим R-группу боковой цепи со сходными химическими свойствами (например, зарядом, размером или гидрофобностью). Как правило, консервативная аминокислотная замена практически не будет изменять функциональные свойства белка. Примеры групп аминокислот, которые содержат боковые цепи со сходными химическими свойствами, включают: 1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; 2) алифатические боковые цепи с гидроксильными группами: серии и треонин; 3) амидосодержащие боковые цепи: аспарагин и глутамин; 4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; 5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин; 6) кислые боковые цепи: аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; и 7) серосодержащие боковые цепи: цистеин и метионин. Группы замены консервативных аминокислот можно также определять на основании размера аминокислот.

Под "очищенный" и "выделенный" подразумевают, при упоминании полипептида (т.е. антитела по настоящему изобретению) или нуклеотидной последовательности, что указанная молекула присутствует при фактическом отсутствии других биологических макромолекул того же типа. Термин "очищенный", используемый в данном документе, в частности означает, что присутствует по меньшей мере 75%, 85%, 95% или 98% по весу биологических макромолекул одного типа. "Выделенной" молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует конкретный полипептид, называют молекулу нуклеиновой кислоты, которая по сути не содержит других молекул нуклеиновой кислоты, которые не кодируют заявляемый полипептид; однако молекула может включать некоторые дополнительные основания или фрагменты, которые не оказывают вредного воздействия на основные характеристики состава.

Используемый в данном документе термин "субъект" обозначает млекопитающее, такое как грызун, представитель кошачьих, представитель собачьих и примат. В частности, субъектом согласно настоящему изобретению является человек.

Иммуноконъюгат, содержащий антитело к СЕАСАМ5

Настоящее изобретение относится к иммуноконъюгату, содержащему антитело к СЕАСАМ5, который применяют в комбинации с трифлуридином и типирацилом (TAS-102) для лечения рака.

Иммуноконъюгат, как правило, содержит антитело к СЕАСАМ5 и по меньшей мере одно цитостатическое средство. В частности, в иммуноконъюгате антитело к СЕАСАМ5 ковалентно присоединено посредством расщепляемого или нерасщепляемого линкера к по меньшей мере одному цитостатическому средству.

Антитело к СЕАСАМ5

Согласно одному варианту осуществления иммуноконъюгат содержит гуманизированное антитело к CEACAM5.

Согласно одному варианту осуществления иммуноконъюгат содержит антитело к СЕАСАМ5, где антитело к СЕАСАМ5 содержит CDR-H1, состоящую из последовательности под SEQ ID NO: 1, CDR-Н2, состоящую из последовательности под SEQ ID NO: 2, CDR-H3, состоящую из последовательности под SEQ ID NO: 3, CDR-L1, состоящую из последовательности под SEQ ID NO: 4, CDR-L2, состоящую из аминокислотной последовательности NTR, и CDR-L3, состоящую из последовательности под SEQ ID NO: 5.

В следующем варианте осуществления иммуноконъюгат содержит антитело к СЕАСАМ5, где антитело к СЕАСАМ5 содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), состоящий из последовательности под SEQ ID NO: 6, и вариабельный домен легкой цепи (VL), состоящий из последовательности под SEQ ID NO: 7.

В следующем варианте осуществления иммуноконъюгат содержит антитело к СЕАСАМ5, которое содержит:

- вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательности EVQLQESGPGLVKPGGSLSL

SCAASGFVFSSYDMSWVRQTPERGLEWVAYISSGGGITYAPSTVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMNSLTSEDTAVYYCAAHYFGSSGPFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 6, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), в которой FR1-H охватывает положения аминокислот 1-25, CDR1-H охватывает положения аминокислот 26-33 (SEQ ID NO: 1), FR2-H охватывает положения аминокислот 34-50, CDR2-H охватывает положения аминокислот 51-58 (SEQ ID NO: 2), FR3-H охватывает положения аминокислот 59-96, CDR3-H охватывает положения аминокислот 97-109 (SEQ ID NO: 3), и FR4-H охватывает положения аминокислот 110-120, и

- вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательности

DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCRASENIFSYLAWYQQKPGKSPKLLVYNTRTLAEGVPSFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 7, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), в которой FR1-L охватывает положения аминокислот 1-26, CDR1-L охватывает положения аминокислот 27-32 (SEQ ID NO: 4), FR2-L охватывает положения аминокислот 33-49, CDR2-L охватывает положения аминокислот 50-52, FR3-L охватывает положения аминокислот 53-88, CDR3-L охватывает положения аминокислот 89-97 (SEQ ID NO: 5), и FR4-L охватывает положения аминокислот 98-107.

В следующем варианте осуществления иммуноконъюгат также содержит антитело к СЕАСАМ5, где антитело к СЕАСАМ5 содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью с последовательностью под SEQ ID NO: 6, и вариабельный домен легкой цепи (VL), характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью с последовательностью под SEQ ID NO: 7, где CDR1-H состоит из последовательности под SEQ ID NO: 2, CDR2-H состоит из последовательности под SEQ ID NO: 3, CDR3-H состоит из последовательности под SEQ ID NO: 4, CDR1-L состоит из последовательности под SEQ ID NO: 6, CDR2-L состоит из аминокислотной последовательности NTR, и CDR3-L состоит из последовательности под SEQ ID NO: 7.

В следующем варианте осуществления иммуноконъюгат содержит антитело к СЕАСАМ5, где антитело к СЕАСАМ5 содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), характеризующийся по меньшей мере 92%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% идентичностью с последовательностью под SEQ ID NO: 6, и вариабельный домен легкой цепи (VL), характеризующийся по меньшей мере 92%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% идентичностью с последовательностью под SEQ ID NO: 7, где CDR1-H состоит из последовательности под SEQ ID NO: 2, CDR2-H состоит из последовательности под SEQ ID NO: 3, CDR3-H состоит из последовательности под SEQ ID NO: 4, CDR1-L состоит из последовательности под SEQ ID NO: 6, CDR2-L состоит из аминокислотной последовательности NTR, и CDR3-L состоит из последовательности под SEQ ID NO: 7.

В следующем варианте осуществления иммуноконъюгат содержит антитело к СЕАСАМ5, где антитело к СЕАСАМ5 содержит тяжелую цепь (VH), состоящую из последовательности под SEQ ID NO: 8, и легкую цепь (VL), состоящую из последовательности под SEQ ID NO: 9.

В следующем варианте осуществления иммуноконъюгат содержит антитело к СЕАСАМ5, где антитело к СЕАСАМ5 содержит тяжелую цепь (VH), характеризующуюся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с последовательностью под SEQ ID NO: 8, и легкую цепь (VL), характеризующуюся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с последовательностью под SEQ ID NO: 9, где CDR1-H состоит из последовательности под SEQ ID NO: 2, CDR2-H состоит из последовательности под SEQ ID NO: 3, CDR3-H состоит из последовательности под SEQ ID NO: 4, CDR1-L состоит из последовательности под SEQ ID NO: 6, CDR2-L состоит из аминокислотной последовательности NTR, и CDR3-L состоит из последовательности под SEQ ID NO: 7.

В следующем варианте осуществления иммуноконъюгат содержит антитело к СЕАСАМ5, где антитело к СЕАСАМ5 содержит тяжелую цепь (VH), характеризующуюся по меньшей мере 92%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с последовательностью под SEQ ID NO: 8, и легкую цепь (VL), характеризующуюся по меньшей мере 92%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с последовательностью под SEQ ID NO: 9, где CDR1-H состоит из последовательности под SEQ ID NO: 2, CDR2-H состоит из последовательности под SEQ ID NO: 3, CDR3-H состоит из последовательности под SEQ ID NO: 4, CDR1-L состоит из последовательности под SEQ ID NO: 6, CDR2-L состоит из аминокислотной последовательности NTR, и CDR3-L состоит из последовательности под SEQ ID NO: 7.

Антитело к СЕАСАМ5, содержащееся в иммуноконъюгате, также может представлять собой однодоменное антитело или его фрагмент. В частности, фрагмент однодоменного антитела может состоять из вариабельной области тяжелой цепи (VHH), которая содержит CDR1-Н, CDR2-H и CDR3-H антител, описанных выше. Антитело также может представлять собой антитело, состоящее только из тяжелой цепи, т.е. антитело, не имеющее легкой цепи, которое может содержать или может не содержать СН1-домен.

Однодоменное антитело или его фрагмент также может содержать каркасные области из однодоменного антитела верблюдовых и необязательно константный домен из однодоменного антитела верблюдовых.

Антитело к СЕАСАМ5, содержащееся в иммуноконъюгате, также может представлять собой фрагмент антитела, в частности фрагмент гуманизированного антитела, выбранный из группы, состоящей из Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2 и диантител.

Антитело также может быть биспецифическим или мультиспецифическим антителом, образованным из фрагментом антител, по меньшей мере одним фрагментом антитела, являющимся фрагментом антитела по настоящему изобретению. Полиспецифические антитела представляют собой поливалентные белковые комплексы, описываемые, например, в ЕР 2050764 А1 или US 2005/0003403 A1.

Антитело к СЕАСАМ5 и его фрагменты, содержащиеся в иммуноконъюгате, могут быть получены посредством любой методики, хорошо известной из уровня техники. В частности, указанные антитела получены посредством методик, описанных далее в данном документе.

Антитело к СЕАСАМ5 и его фрагменты, содержащиеся в иммуноконъюгате, могут быть использованы в виде выделенных (например, очищенных) форм или содержащихся в переносчике, таком как мембрана или липидная везикула (например, липосома).

Антитело к СЕАСАМ5 и его фрагменты, содержащиеся в иммуноконъюгате, могут быть получены посредством любой методикой, известной из уровня техники, такой как без ограничения любая химическая, биологическая, генетическая или ферментативная методика, либо отдельно, либо в комбинации.

Будучи ознакомленным с аминокислотной последовательностью требуемой последовательности, специалист в данной области техники может легко получить антитело к СЕАСАМ5 и его фрагменты посредством стандартных методик получения полипептидов. К примеру, их можно синтезировать с применением хорошо известного твердофазного способа, в частности, с применением коммерчески доступного устройства для синтеза пептидов (такого как производимое Applied Biosys terns, Фостер-Сити, Калифорния) и следуя инструкциям производителя. В качестве альтернативы антитело к СЕАСАМ5 и его фрагменты можно синтезировать с помощью методик рекомбинантной ДНК, хорошо известных из уровня техники. Например, эти фрагменты можно получать в виде продуктов экспрессии ДНК после встраивания последовательностей ДНК, кодирующих требуемый (поли)пептид, в векторы экспрессии и введения таких векторов в подходящих эукариотических или прокариотических хозяев, которые будут экспрессировать требуемый полипептид, из которых их позже можно выделить с использованием хорошо известных методик.

Антитело к СЕАСАМ5 и его фрагменты хорошо отделяются от культуральной среды посредством стандартных процедур очистки иммуноглобулинов, таких как, например, применение белка А-сефарозы, хроматография с гидроксиапатитом, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

Способы получения гуманизированных антител на основе стандартных методик рекомбинантной ДНК и трансфекции генов, хорошо известны из уровня техники (см, например, Riechmann L. et al. 1988; Neuberger MS. et al. 1985). Антитела можно гуманизировать с использованием разнообразных методик, известных из уровня техники, в том числе, например, методики, раскрытой в заявке WO 2009/032661, привития CDR (ЕР 239400; публикации согласно РСТ WO 91/09967; патентах США №5225539; 5530101 и 5585089), маскировки поверхностных остатков или изменения поверхности (ЕР 592106; ЕР 519596; Padlan ЕА (1991); Studnicka GM et al. (1994); Roguska MA. et al. (1994)) и шаффлинга цепей (патент США №5565332). Также известна общая технология рекомбинантной ДНК для получения таких антител (см. европейскую патентную заявку ЕР 125023 и международную патентную заявку WO 96/02576).

Fab антитела к СЕАСАМ5 можно получать путем обработки антитела, которое специфически реагирует с СЕАСАМ5, протеазой, такой как папаин. Также Fab антитела к СЕАСАМ5 можно получать путем вставки последовательностей ДНК, кодирующих обе цепи Fab антитела к СЕАСАМ5, в вектор для экспрессии в прокариотической клетке или для экспрессии в эукариотическои клетке и введения вектора в прокариотические или эукариотические клетки (в соответствующих случаях) для обеспечения экспрессии Fab антитела к СЕАСАМ5.

F(ab') 2 антитела к СЕАСАМ5 можно получать путем обработки антитела, которое специфически реагирует с СЕАСАМ5, протеазой, такой как пепсин. Также F(ab')2 антитела к СЕАСАМ5 можно получать путем связывания Fab', описанного ниже, посредством тиоэфирной связи или дисульфидной связи.

Fab' антитела к СЕАСАМ5 можно получать посредством обработки F(ab')2, который специфически реагирует с СЕАСАМ5, восстанавливающим средством, таким как дитиотреитол. Также Fab' антитела к СЕАСАМ5 можно получать путем вставки последовательностей ДНК, кодирующих цепи Fab' из антитела, в вектор для экспрессии в прокариотической клетке или в вектор для экспрессии в эукариотической клетке и введения вектора в прокариотические или эукариотические клетки (в соответствующих случаях) для обеспечения его экспрессии.

scFv антитела к СЕАСАМБ можно получать путем синтеза последовательностей CDR или VH- и VL-доменов, описываемых ранее, конструирования ДНК, кодирующей scFv-фрагмент, вставки ДНК в вектор экспрессии для прокариотической или эукариотической клетки и последующего введения вектора экспрессии в прокариотические или эукариотические клетки (в соответствующих случаях) для экспрессии scFv. Для получения гуманизированного scFv-фрагмента можно применять хорошо известную технологию, называемую привитие CDR, которая предусматривает отбор определяющих комплементарность областей (CDR) в соответствии с настоящим изобретением и привитие их на каркас scFv-фрагмента человека с известной трехмерной структурой (см., например, WO 98/45322; WO 87/02671; US 5859205; US 5585089; US 4816567; ЕР 0173494).

Цитостатические средства

Иммуноконъюгат для применения по настоящему изобретению, как правило, содержит по меньшей мере одно цитостатическое средство. Цитостатическое средство, используемое в данном документе, относится к средству, которое уничтожает клетки, в том числе раковые клетки. Такие средства эффективно останавливают деление и рост раковых клеток и приводят к уменьшению размеров опухолей. Термин "цитостатическое средство" используется в данном документе взаимозаменяемо с терминами "химиотерапевтическое средство", "цитотоксическое средство" или "цитостатик".

В следующем варианте осуществления цитостатическое средство выбрано из группы, состоящей из радиоактивных изотопов, белковых токсинов, низкомолекулярных токсинов и их комбинаций.

Радиоактивные изотопы включают радиоактивные изотопы, подходящие для лечения рака. Такие радиоактивные изотопы обычно испускают в основном бета-излучение. В следующем варианте осуществления радиоактивные изотопы выбраны из группы, состоящей из At²¹¹, Bi²¹², Er¹⁶⁹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, In¹¹¹, P³², Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Sr⁸⁹, радиоактивных изотопов Lu и их комбинаций. В одном варианте осуществления радиоактивный изотоп представляет собой изотоп, который испускает альфа-излучение, более конкретно Th²²⁷, который испускает альфа-излучение.

В следующем варианте осуществления низкомолекулярные токсины выбраны из антиметаболитов, средств, алкилирующих ДНК, средств, сшивающих ДНК, средств, интеркалирующих ДНК, ингибиторов сборки микротрубочек, ингибиторов топоизомеразы и их комбинаций.

В следующем варианте осуществления ингибитор сборки микротрубочек выбран из группы, состоящей из таксанов, алкалоидов барвинка, майтанзиноидов, колхицина, подофиллотоксина, гризеофульвина и их комбинаций.

В следующем варианте осуществления майтанзиноиды выбраны из майтанзинола, аналогов майтанзинола и их комбинаций.

Примеры подходящих аналогов майтанзинола включают те, которые имеют модифицированное ароматическое кольцо, и те, которые имеют модификации в других положениях. Такие подходящие майтанзиноиды раскрыты в патентах США №4424219; 4256746; 4294757; 4307016; 4313946; 4315929; 4331598; 4361650; 4362663; 4364866; 4450254; 4322348; 4371533; 6333410; 5475092; 5585499 и 5846545.

Конкретные примеры подходящих аналогов майтанзинола, имеющих модифицированное ароматическое кольцо, включают:

(1) С-19-дехлорпроизводное (патент США №4256746) (получаемое путем восстановления ансамитоцина Р2 с помощью LAH);

(2) С-20-гидроксипроизводное (или С-20-деметилпроизводное) +/-С-19-дехлорпроизводное (патент США №4361650 и 4307016) (получаемое посредством деметилирования с использованием Streptomyces или Actinomyces или дехлорирования с помощью LAH); и

(3) С-20-деметоксипроизводное, С-20-ацилоксипроизводное (-OCOR), +/-дехлорпроизводное (патент США №4294757) (получаемое посредством ацилирования с помощью хлорангидридов).

Конкретные примеры подходящих аналогов майтанзинола, имеющих модификации в других положениях, включают:

(1) С-9-SH-производное (патент США №4424219) (получаемое посредством реакции майтанзинола с H2S или P2S5);

(2) C-14-алкоксиметильное (деметокси/CH2OR) производное (патент США №4331598);

(3) C-14-гидроксиметильное или ацилоксиметильное (CH2OH или CH2OAc) производное (патент США №4450254) (получаемое из Nocardia);

(4) C-15-гидрокси / ацилоксипроизводное (патент США №4364866) (получаемое посредством конверсии майтанзинола с помощью Streptomyces);

(5) C-15-метоксипроизводное (патент США №4313946 и 4315929) (выделенное из Trewia nudiflora);

(6) С-18-N-деметильное производное (патент США №4362663 и 4322348) (получаемое посредством деметилирования майтанзинола с помощью Streptomyces); и

(7) 4,5-дезоксипроизводное (патент США №4371533) (получаемое путем восстановления майтанзинола с помощью трихлорида титана/LAH).

В следующем варианте осуществления в конъюгатах по настоящему изобретению в качестве цитотоксического средства используется тиолсодержащий майтанзиноид (DM1), имеющий официальное название N2'-деацетил-N2'-(3-меркапто-1-оксопропил)-майтанзин. DM1 представлен следующей структурной формулой (I):

В следующем варианте осуществления в цитотоксических конъюгатах по настоящему изобретению в качестве цитотоксического средства используется тиолсодержащий майтанзиноид DM4, имеющий официальное название N2'-деацетил-N-2'(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)-майтанзин. DM4 представлен следующей структурной формулой (II):

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения можно применять другие майтанзины, в том числе тиол- и дисульфидсодержащие майтанзиноиды, которые имеют моно- или диалкильное замещение атома углерода, несущего атом серы. К ним относятся майтанзиноид, имеющий в С-3 C-14-гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20-дезметил, ацилированную боковую цепь аминокислоты с ацильной группой, несущей пространственно затрудненную сульфгидрильную группу, где атом углерода ацильной группы, несущий тиольную функциональную группу, имеет один или два заместителя, при этом указанные заместители представляют собой СН3, С2Н5, линейный или разветвленный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 составляющих, и любой агрегат, который может присутствовать в растворе.

Соответственно, в следующем варианте осуществления майтанзиноиды выбраны из группы, состоящей из N2'-деацетил-N2'-(3-меркапто-1-оксопропил)-майтанзина (DM1) или N2'-деацетил-N-2'(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)-майтанзина (DM4) и их комбинаций.

В следующем варианте осуществления в иммуноконъюгате антитело к СЕАСАМ5 ковалентно присоединено посредством расщепляемого или нерасщепляемого линкера к по меньшей мере одному цитостатическому средству.

В следующем варианте осуществления линкер выбран из группы, состоящей из N-сукцинимидилпиридилдитиобутирата (SPDB), 4-(пиридин-2-илдисульфанил)-2-сульфомасляной кислоты (сульфо-SPDB) и сукцинимидил-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилата (SMCC).

В следующем варианте осуществления линкер связывается с остатком лизина в Fc-области антитела к СЕАСАМ5. В следующем варианте осуществления линкер образует дисульфидную связь или тиоэфирную связь с майтанзином.

В частности, иммуноконъюгат антитела к СЕАСАМ5 может быть выбран из группы, состоящей из следующего:

иммуноконъюгат антитело к CEACAM5-SPDB-DM4 формулы (III)

ii) иммуноконъюгат антитело к СЕАСАМ5-сульфо-SPDB-DM4 формулы (IV):

и

iii) иммуноконъюгат антитело к CEACAM5-SMCC-DM1 формулы (V):

В следующем варианте осуществления иммуноконъюгат по настоящему изобретению содержит антитело к СЕАСАМ5, которое содержит тяжелую цепь (VH) под SEQ ID NO: 8 и легкую цепь (VL) под SEQ ID NO: 9 (huMAb2-3), где huMAb2-3 ковалентно связано с N2'-деацетил-N-2'(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)-майтанзином (DM4) через N-сукцинимидил-пиридилдитиобутират (SPDB). За счет этого получают иммуноконъюгат huMAb2-3-SPDB-DM4.

"Линкер", применяемый в данном документе, означает химический компонент, содержащий ковалентную связь или цепь атомов, ковалентно присоединяющую полипептид к компоненту-лекарственному средству.

Конъюгаты можно получать с помощью способов in vitro. Для соединения лекарственного средства или пролекарства с антителом применяют связывающую группу. Подходящие связывающие группы хорошо известны из уровня техники и включают дисульфидные группы, тиоэфирные группы, кислотонеустойчивые группы, фотолабильные группы, группы, неустойчивые к действию пептидаз, и группы, неустойчивые к действию эстераз. Конъюгирование антитела по настоящему изобретению с цитотоксическими средствами или с ингибиторами роста можно осуществлять с применением разнообразных бифункциональных средств для связывания белков, включающих без ограничения N-сукцинимидилпиридилдитиобутират (SPDB), 4-[(5-нитро-2-пиридинил)дитио]-2,5-диоксо-1-пирролидиниловый сложный эфир бутановой кислоты (нитро-SPDB), 4-(пиридин-2-илдисульфанил)-2-сульфомасляную кислоту (сульфо-SPDB), N-сукцинимидил-(2-пиридилдитио)-пропионат (SPDP), сукцинимидил-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCL), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис-(п-азидобензоил)-гександиамин)), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)-этилендиамин)), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бисфторсоединения активного фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин на основе рицина можно получать, как описано в Vitetta et al. (1987). Меченая углеродом 1-изотиоцианатобензил-метилдиэтилен триаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) представляет собой иллюстративное хелатирующее средство для конъюгирования радионуклеотида с антителом (WO 94/11026).

Линкер может представлять собой "расщепляемый линкер", облегчающий высвобождение в клетке цитотоксического средства или средства для подавления роста. Например, можно применять кислотонеустойчивый линкер, линкер, лабильный к действию пептидаз, линкер, неустойчивый к действию эстераз, фотолабильный линкер или дисульфидсодержащий линкер (см, например, патент США №5208020). Линкер также может представлять собой "нерасщепляемый линкер" (например, линкер SMCC), который в некоторых случаях может обеспечивать лучшую переносимость.

Как правило, конъюгат можно получить с помощью способа, включающего стадии:

(i) приведения необязательно забуференного водного раствора средства, связывающегося с клетками (например, антитела в соответствии с настоящим изобретением), в контакт с растворами линкера и цитотоксического соединения;

(ii) последующего необязательного отделения конъюгата, образовавшегося на (i) от не вступившего в реакцию средства, связывающегося с клетками.

Водный раствор средства, связывающегося с клетками, можно буферизировать посредством буферов, таких как, например, фосфат калия, ацетат, цитрат или N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота (буфер Hepes). Буфер зависит от природы средства, связывающегося с клетками. Цитотоксическое соединение присутствует в растворе в органическом полярном растворителе, например, диметилсульфоксиде (DMSO) или диметилацетамиде (DMA).

Температура реакции обычно составляет от 20 до 40°С. Время реакции может варьироваться от 1 до 24 часов. Реакция между средством, связывающимся с клетками, и цитотоксическим средством может контролироваться посредством эксклюзионной хроматографии (SEC) с рефрактометрическим и/или УФ-детектором. Если выход конъюгата является слишком низким, время реакции можно увеличить.

Специалист в данной области техники может применять ряд различных хроматографических методов для осуществления разделения на стадии (ii): конъюгат можно очистить, например, посредством SEC, адсорбционной хроматографии (такой как ионообменная хроматография, IEC), хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), аффинной хроматографии, хроматографии на смешанных носителях, такой как хроматография на гидроксиапатите, или высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Также можно применять очистку посредством диализа или диафильтрации.

Используемый в данном документе термин "агрегаты" означает скопления, которые могут образовывать два или более средств, связывающихся с клетками, при этом указанные средства являются или не являются модифицированными посредством конъюгирования. Агрегаты могут образовываться под влиянием большого количества параметров, таких как высокая концентрация средства, связывающегося с клетками, в растворе, рН раствора, высокие сдвиговые усилия, количество связанных димеров и их гидрофобная природа, температура (см. Wang & Gosh, 2008, J. Membrane Sci., 318: 311-316 и литературные источники, цитируемые там); следует отметить, что относительное влияние некоторых из этих параметров четко не установлено. В случае белков и антител специалист в данной области техники обратится к Cromwell et al. (2006) AAPS Journal, 8(3): E572-E579). Содержимое агрегатов можно определить с помощью методик, хорошо известных специалисту в данной области техники, таких как SEC (см. Walter et al., 1993, Anal. Biochem., 212(2): 469-480).

После стадии (i) или (ii) раствор, содержащий конъюгат, можно подвергнуть дополнительной стадии (iii) хроматографии, ультрафильтрации и/или диафильтрации.

Конъюгат извлекают в конце данных стадий в водном растворе.

В следующем варианте осуществления иммуноконъюгат по настоящему изобретению характеризуется "соотношением лекарственного средства и антитела" (или "EAR") в диапазоне от 1 до 10, или от 2 до 5, или от 3 до 4. Как правило, это относится к конъюгатам, содержащим молекулы майтанзиноидов.

Этот показатель DAR может варьировать в зависимости от природы антитела и лекарственного средства (т.е. ингибитора роста), применяемых наряду с экспериментальными условиями, используемыми для конъюгирования (таких как соотношение средство для ингибирования роста / антитело, время реакции, природа растворителя и сорастворителя, если он присутствует). Таким образом, контакт между антителом и средством для подавления роста приводит к образованию смеси, содержащей несколько конъюгатов, отличающихся друг от друга различными соотношениями лекарственного средства и антитела; необязательно "голое" антитело, необязательно агрегаты. Определяемое DAR, таким образом, является средним значением.

Способ, который можно применять для определения DAR, заключается в спектрофотометрическом измерении соотношения поглощения раствора по сути очищенного конъюгата при λD и 280 нм. 280 нм является длиной волны, обычно применяемой для измерения концентрации белка, такой как концентрация антитела. Длина волны λD выбрана таким образом, чтобы обеспечить способность различать лекарственное средство и антитело, т.е., как хорошо известно специалисту в данной области техники, λD представляет собой длину волны, при которой лекарственное средство характеризуется высокой величиной поглощения, и значение λD достаточно удалено от 280 нм во избежание значительного перекрытия пиков поглощения лекарственного средства и антитела. В случае молекул майтанзиноидов может быть выбрана λD, составляющая 252 нм. Способ расчета DAR может быть получен из Antony S. Dimitrov (ed), LLC, 2009, Therapeutic Antibodies and Protocols, vol 525, 445, Springer Science.

Величины поглощения для конъюгата при λD (AλD) и при 280 нм (А280) измеряются либо на мономерных пиках анализа эксклюзионной хроматографии (SEC) (обеспечивая расчет параметра "DAR(SEC)"), либо с применением классического спектрофотометрического аппарата (обеспечивая расчет параметра "DAR(UV)"). Величины поглощения можно выразить следующим образом:

AλD=(cD х εDλD) + (сА х εAλD)

A280=(cD х εD280) + (сА х εА280),

где

• cD и сА соответственно представляют собой концентрации лекарственного средства и антитела в растворе,

• εDλD и εD280 представляют собой, соответственно, молярные коэффициенты экстинкции лекарственного средства при λD и 280 нм,

• εAλD и εA280 представляют собой, соответственно, молярные коэффициенты экстинкции антитела при λD и 280 нм.

Решение этих двух уравнений с двумя неизвестными приводит к следующим уравнениям:

cD=[(εA280 х AλD) - (εAλD х А280)] / [(εDλD х εА280) - (εAλD х εD280)]

сА=[А280 - (cD х εD280)] / εA280.

Среднее DAR затем рассчитывают из соотношения концентрации лекарственного средства и концентрации антитела: DAR=cD/cA.

TAS-102

Иммуноконъюгат, содержащий антитело к СЕАСАМ5, предназначен для применения в комбинации с TAS-102 в лечении рака.

Собственно TAS-102 представляет собой известный химиотерапевтический лекарственный препарат, утвержденный для применения у человека, который обеспечивает комбинированное введение трифлуридина и типирацила и который обычно вводят в течение 4-недельных циклов. В TAS-102 в комбинацию объединены трифлуридин и типирацил, и его использовали для лечения колоректального рака.

В качестве модифицированного дезоксиуридина трифлуридин (регистрационный номер CAS 70-00-8) представляет собой аналог нуклеозида, который встраивается в ДНК. Модифицированная ДНК связывается с тимидилат-синтазой, ингибируя активность данного фермента. Типирацил (регистрационный номер CAS 183204-74-2) представляет собой аналог тимина, который предотвращает деградацию трифлуридина посредством тимидин-фосфорилазы.

Комбинированное лечение

В соответствии с настоящим изобретением иммуноконъюгат, содержащий антитело к СЕАСАМ5, предназначен для применения в лечении рака в комбинации с трифлуридином и типирацилом (TAS-102). Настоящее изобретение также относится к трифлуридину и типирацилу (TAS-102), предназначенным для применения в лечении рака в комбинации с иммуноконъюгатом, содержащим антитело к СЕАСАМ5.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака у нуждающегося в этом субъекта, предусматривающему введение иммуноконъюгата, содержащего антитело к СЕАСАМ5, и последующее введение трифлуридина и типирацила нуждающемуся в этом субъекту.

Настоящее изобретение также относится к иммуноконъюгату, содержащему антитело к СЕАСАМ5, предназначенному для применения в лечении рака у нуждающегося в этом субъекта, который получает отдельно или одновременно TAS-102, где дополнительно трифлуридин и типирацил могут вводиться по отдельности или одновременно.

В одном варианте осуществления рак представляет собой солидную опухоль. В соответствии с одним вариантом осуществления рак выбран из группы, состоящей из колоректального рака и рака желудка.

В соответствии с одним вариантом осуществления пациент является пациентом со злокачественной опухолью, в частности со злокачественной солидной опухолью, и более конкретно с местно локализованной или метастатической солидной злокачественной опухолью.

В соответствии с одним вариантом осуществления иммуноконъюгат, содержащий антитело к СЕАСАМ5, и TAS-102 вводят одновременно нуждающемуся в этом субъекту.

В следующем варианте осуществления иммуноконъюгат, содержащий антитело к СЕАСАМ5, и TAS-102 составлены (i) в одной фармацевтической композиции, содержащей иммуноконъюгат и TAS-102, или (11) в форме по меньшей мере двух отдельных фармацевтических композиций, где по меньшей мере одна фармацевтическая композиция содержит иммуноконъюгат, содержащий антитело к СЕАСАМ5, и одна или несколько фармацевтических композиций содержат трифлуридин и типирацил, в отдельных или комбинированных составах. В случае составления иммуноконъюгата и TAS-102 в по меньшей мере двух отдельных фармацевтических композициях по меньшей мере две отдельные фармацевтические композиции вводят одновременно нуждающемуся в этом субъекту.

В соответствии с другим вариантом осуществления иммуноконъюгат, содержащий антитело к СЕАСАМ5, и TAS-102 вводят по отдельности или последовательно нуждающемуся в этом субъекту.

В соответствии с данным вариантом осуществления иммуноконъюгат, содержащий антитело к СЕАСАМ5, и TAS-102 составлены в форме по меньшей мере двух отдельных фармацевтических композиций, где (i) по меньшей мере одна фармацевтическая композиция содержит иммуноконъюгат, и (ii) одна или несколько фармацевтических композиций содержат трифлуридин и типирацил, в отдельных или комбинированных составах.

В одном варианте осуществления иммуноконъюгат вводят в дозе от 60 до 210 мг/м². В другом варианте осуществления TAS-102 вводят в дозе от 10 до 100 мг/м², где TAS-102 содержит трифлуридин и типирацил в молярном соотношении, составляющем от 1:0,4 до 1:0,6, например в молярном соотношении, составляющем 1:0,5.

В другом варианте осуществления вводят фармацевтическую композицию или комбинацию по настоящему изобретению, при этом антитело к СЕАСАМ5 вводят в дозе от 60 до 210 мг/м², и TAS-102 вводят в дозе от 10 до 100 мг/м² при молярном соотношении трифлуридина и типирацила, составляющем от 1:0,4 до 1:0,6, например 1:0,5. В одном аспекте данного варианта осуществления схема введения доз предусматривает введение дозы за период от 2 ч до 48 ч. В одном аспекте данного варианта осуществления частота введения доз варьируется от одного раза в неделю до пяти раз в неделю. В одном варианте осуществления продолжительность лечения составляет по меньшей мере 3 или 6 месяцев.

В следующем варианте осуществления иммуноконъюгат, содержащий антитело к СЕАСАМ5, и трифлуридин и типирацил (TAS-102) вводятся в течение 3-6 циклов. В соответствии с одним вариантом осуществления цикл представляет собой 4-недельный цикл. В соответствии с одним вариантом осуществления цикл предусматривает:

введение иммуно конъюгат а в дозе от 60 до 210 мг/м² по меньшей мере однократно в течение цикла;

введение TAS-102 в дозе от 10 до 100 мг/м²/день, где TAS-102 содержит трифлуридин и типирацил в молярном соотношении, составляющем от 1:0,4 до 1:0,6, по меньшей мере однократно в течение цикла.

В одном варианте осуществления иммуноконъюгат вводят в дозе от 60 до 210 мг/м² двукратно в течение цикла. В одном варианте осуществления иммуноконъюгат вводят в дозе от 60 до 210 мг/м² двукратно в течение цикла в дни 1 и 15. В одном варианте осуществления TAS-102 вводят в дозе от 10 до 100 мг/м², где TAS-102 содержит трифлуридин и типирацил в молярном соотношении, составляющем от 1:0,4 до 1:0,6, 10 раз в течение одного цикла. В одном варианте осуществления TAS-102 вводят в дозе от 10 до 100 мг/м², где TAS-102 содержит трифлуридин и типирацил в молярном соотношении, составляющем от 1:0,4 до 1:0,6, в дни 1-5 и 8-12 в течение одного цикла.

Единица измерения "мг/м²" означает количество вводимого соединения в мг/м² поверхности тела субъекта. Специалисту в данной области техники известно, как определить необходимое количество соединения для субъекта, подлежащего лечению, исходя из площади поверхности его тела, которая в свою очередь может быть рассчитана на основании роста и массы тела.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей иммуноконъюгат, содержащий антитело к СЕАСАМ5, и дополнительно содержащей трифлуридин и типирацил.

Кроме того, настоящее изобретение относится к набору, содержащему (i) фармацевтическую композицию, содержащую иммуноконъюгат, содержащий антитело к СЕАСАМ5, и (ii) одну или несколько фармацевтических композиций, содержащих трифлуридин и типирацил, в отдельных или комбинированных составах.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей иммуноконъюгат, содержащий антитело к СЕАСАМ5, и дополнительно содержащей трифлуридин и типирацил, предназначенной для применения в лечении рака.

Кроме того, настоящее изобретение относится к набору, содержащему (i) фармацевтическую композицию, содержащую иммуноконъюгат, содержащий антитело к СЕАСАМ5, и (ii) одну или несколько фармацевтических композиций, содержащих трифлуридин и типирацил, в отдельных или комбинированных составах для применения в лечении рака.

"Фармацевтическими" или "фармацевтически приемлемыми" называют молекулярные объекты и композиции, не вызывающие побочную, аллергическую или другую нежелательную реакцию при введении млекопитающему, в частности человеку, в соответствующих случаях. Фармацевтически приемлемым носителем или вспомогательным средством называют нетоксичный твердый, полутвердый или жидкий наполнитель, разбавитель, инкапсулирующий материал или вспомогательное вещество для составления любого типа.

Используемое в данном документе выражение "фармацевтически приемлемые носители" включают все возможные растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Примеры подходящих носителей, разбавителей и/или вспомогательных веществ включают один или несколько из воды, аминокислот, солевого раствора, забуференного фосфатом физиологического раствора, фосфатного буфера, ацетата, цитрата, сукцината; аминокислот и производных, таких как гистидин, аргинин, глицин, пролин, глицил-глицин; неорганических солей NaCl, хлорида кальция; сахаров и многоатомных спиртов, таких как декстроза, глицерин, этанол, сахароза, трегалоза, маннитол; поверхностно-активных веществ, таких как Полисорбат 80, полисорбат 20, полоксамер 188; и т.п., а также их комбинаций. Во многих случаях предпочтительным будет включение в композицию изотонических средств, таких как сахара, многоатомные спирты или хлорид натрия, и состав может также содержать антиоксидант, такой как триптамин, и стабилизирующее средство, такое как Tween 20.

Форма фармацевтических композиций, путь введения, дозировка и схема в норме зависят от состояния, подлежащего лечению, тяжести болезни, возраста, веса и пола пациента и т.д.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно составлять для местного, перорального, парентерального, интраназального, внутривенного, внутримышечного, подкожного или внутриглазного введения и т.п.

В частности, фармацевтические композиции содержат среды-носители, которые являются фармацевтически приемлемыми для состава, подлежащего инъецированию. Они могут представлять собой, в частности, изотонические стерильные солевые растворы (мононатрия или динатрия фосфата, хлорида натрия, калия, кальция или магния и т.п.или смесей таких солей) или сухие, в частности, высушенные сублимацией композиции, которые при добавлении, в зависимости от случая, стерилизованной воды или физиологического солевого раствора обеспечивают получение инъекционных растворов.

Фармацевтическую композицию можно вводить с помощью устройств для комбинации лекарственных средств.

Дозы, используемые для введения, можно адаптировать в зависимости от различных параметров и, в частности, в зависимости от используемого способа введения, от соответствующей патологии или в качестве альтернативы от необходимой продолжительности лечения.

Для получения фармацевтических композиций эффективное количество иммуноконъюгата, содержащего антитело к СЕАСАМ5, и трифлуридина и типирацила можно растворить или диспергировать в фармацевтически приемлемых носителе или водной среде.

Фармацевтические формы, подходящие для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы или дисперсии, составы, включающие кунжутное масло, арахисовое масло или водный раствор пропиленгликоля; и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий для немедленного приема. Во всех случаях форма должна быть стерильной и готовой к инъекции с помощью соответствующего устройства или системы для доставки без расщепления. Она должна быть стабильной в условиях производства и хранения, и ее необходимо предохранять от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы.

Растворы активных соединений в качестве свободного основания или фармакологически приемлемых солей можно получать в воде путем смешивания с поверхностно-активным веществом. Дисперсии также можно получать в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях, а также в маслах. В обычных условиях хранения и применения эти препараты содержат консервант для предупреждения роста микроорганизмов.

Иммуноконъюгат, содержащий антитело к СЕАСАМ5, может быть составлен в композиции в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли включают соли присоединения кислот (образованные с помощью свободных аминогрупп белка), и они образуются с помощью неорганических кислот, таких как, например, соляная или фосфорная кислоты, или таких органических кислот, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образованные свободными карбоксильными группами, также могут быть получены из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и органических оснований, таких как изопропиламин, триметиламин, глицин, гистидин, прокаин и т.п.

Носитель также может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащие, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси и растительные масла. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем применения покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Предупреждение действия микроорганизмов можно обеспечить с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимерозала и т.п. Во многих случаях будет предпочтительно включать изотонические средства, например, сахара или хлорид натрия. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций можно обеспечить путем применения в композициях средств, задерживающих всасывание, например, моностеарата алюминия и желатина.

Стерильные инъекционные растворы получают путем включения активных соединений в требуемом количестве в соответствующий растворитель вместе с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, при необходимости с последующей стерилизацией путем фильтрации. Как правило, дисперсии получают путем включения различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильную среду-носитель, которая содержит основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты из тех перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов предпочтительные способы получения представляют собой методики вакуумной сушки и лиофильной сушки, которые обеспечивают получение порошка активного ингредиента с любым дополнительным требуемым ингредиентом из его раствора, предварительно подвергнутого стерилизации путем фильтрации.

Также предусмотрено приготовление более концентрированных или высококонцентрированных растворов для непосредственного введения, при этом считается, что применение DMSO в качестве растворителя приводит к очень быстрому проникновению, доставке высоких концентраций активных средств в небольшой участок опухоли.

После составления растворы будут вводить способом, соответствующим дозированному составу, и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным. Составы легко вводят в разнообразных дозированных формах, таких как тип инъекционных растворов, описанных выше, но также можно использовать капсулы с высвобождением лекарственного средства и т.п.

Для парентерального введения в виде водного раствора, например, раствор следует надлежащим образом забуферить при необходимости, а жидкий разбавитель вначале сделать изотоническим с помощью достаточного количества солевого раствора или глюкозы. Данные конкретные водные растворы особенно подходят для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения. В связи с этим стерильные водные среды, которые можно использовать, будут известны специалистам в данной области техники в свете настоящего изобретения. Например, одну дозу можно растворить в 1 мл изотонического раствора NaCl и либо добавить к 1000 мл жидкости гиподермоклизиса, либо инъецировать в предполагаемое место инфузии (см., например, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15-ое издание, стр. 1035-1038 и 1570-1580). Неизбежно будет иметь место некоторое изменение дозы в зависимости от состояния субъекта, подлежащего лечению. Лицо, ответственное за введение, в любом случае будет определять соответствующую дозу для отдельного субъекта.

Иммуноконъюгат, содержащий антитело к СЕАСАМ5, составляют для парентерального введения, такого как внутривенная или внутримышечная инъекция, при этом другие фармацевтически приемлемые формы включают, например, таблетки или другие твердые формы для перорального введения; капсулы с замедленным высвобождением и любую другую форму, используемую в настоящее время.

В определенных вариантах осуществления применение липосом и/или наночастиц предусмотрено для введения полипептидов в клетки-хозяева. Состав и применение липосом и/или наночастиц известны специалистам в данной области техники.

Нанокапсулы обычно могут удерживать соединения стабильным и воспроизводимым способом. Чтобы избежать побочных эффектов, обусловленных внутриклеточной перегрузкой полимером, обычно разрабатывают такие ультратонкодисперсные частицы (размером около 0,1 мкм) с применением полимеров, которые могут распадаться in vivo. Биоразлагаемые полиалкил-цианокрилатные наночастицы или биоразлагаемые наночастицы полилактида или сополимера полилактида и гликолида, которые соответствуют этим требованиям, предусмотрены для применения в настоящем изобретении, и такие частицы можно легко получить.

Липосомы образуются из фосфолипидов, которые диспергированы в водной среде и самопроизвольно образуют многослойные концентрические двухслойные везикулы (также называемые многослойные везикулы (MLV)). MLV обычно имеют диаметр от 25 нм до 4 мкм. Обработка MLV ультразвуком приводит к образованию малых однослойных везикул (SUV) с диаметром в диапазоне 200-500 А, содержащих водный раствор в сердцевине. Физические характеристики липосом зависят от рН, ионной силы и присутствия двухвалентных катионов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Под SEQ ID NO: 1-5 показаны последовательности CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L и CDR3-L антитела к СЕАСАМ5 (huMAb2-3).

Под SEQ ID NO: 6 показана последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH) антитела к СЕАСАМ5 (huMAb2-3).

Под SEQ ID NO: 7 показана последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL) антитела к СЕАСАМ5 (huMAb2-3).

Под SEQ ID NO: 8 показана последовательность тяжелой цепи антитела к СЕАСАМ5 (huMAb2-3).

Под SEQ ID NO: 9 показана последовательность легкой цепи антитела к СЕАСАМ5 (huMAb2-3).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1. Активность иммуноконъюгата huMAb2-3-SPDB-DM4 и TAS-102 в форме отдельных средств или в комбинации в отношении подкожно имплантированного мышам SCID ксенотрансплантата опухоли толстой кишки, полученного от пациента (PDX), PDX CR-IGR-0007Р. Динамика объема опухоли в зависимости от группы обработки. Кривые представляют собой медианы+или - MAD (медианное абсолютное отклонение) в каждый день для каждой группы.

Фигура 2. Активность иммуноконъюгата huMAb2-3-SPDB-DM4 и TAS-102 в форме отдельных средств или в комбинации в отношении подкожно имплантированного мышам SCID ксенотрансплантата опухоли толстой кишки, полученного от пациента, PDX CR-IGR-0011C. Динамика объема опухоли в зависимости от группы обработки. Кривые представляют собой медианы+или - MAD в каждый день для каждой группы.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Активность иммуноконъюгата huMAb2-3-SPDB-DM4 в комбинации с TAS-102 в отношении двух подкожно имплантированных мышам SCID ксенотрансплантатов опухолей толстой кишки, полученных от пациента, PDX CR-IGR-0007P и PDX CR-IGR-0011C

Порядок проведения эксперимента

Активность схемы обработки посредством huMAb2-3-SPDB-DM4 и TAS-102 оценивали как в режиме монотерапии каждым средством, так и в комбинации в отношении двух подкожных ксенотрансплантатов опухоли толстой кишки, полученных от пациента (PDX) (PDX CR-IGR-0007Р и PDX CR-IGR-0011C), п/к имплантированных самкам мышей SCID. Контрольные группы оставляли необработанными. Дозы используемых соединений приведены в мг/кг.

Для PDX CR-IGR-0007P обработки начинали в день 26 после имплантации опухоли, когда медианная опухолевая нагрузка достигла 166,0 мм³. huMAb2-3-SPDB-DM4 вводили в дозе 5 мг/кг с последующими 3 еженедельными циклами в/в введений в дни 26, 33 и 40. Готовили раствор TAS-102, содержащий трифлуридин и типирацил в молярном соотношении 1:0,5. Препарат TAS-102 вводили пероральным путем в дозе 100 мг/кг/день (в пересчете на дозу трифлуридина) два раза в день с прим. 6-часовыми интервалами в дни 26-30 и в дни 33-37.

Для PDX CR-IGR-0011C обработки начинали в день 19 после имплантации опухоли, когда медианная опухолевая нагрузка достигла 123,5 мм³. huMAb2-3-SPDB-DM4 вводили в дозе 5 мг/кг с последующими 3 еженедельными циклами в/в введений в дни 19, 26 и 33. Готовили раствор TAS-102, содержащий трифлуридин и типирацил в молярном соотношении 1:0,5. Препарат TAS-102 вводили пероральным путем в дозе 100 мг/кг/день (в пересчете на дозу трифлуридина) два раза в день с прим. 6-часовыми интервалами в дни 19-23 и в дни 26-30.

Для оценки противоопухолевой активности животных взвешивали ежедневно, и опухоли измеряли 2 раза в неделю штангенциркулем. Дозировку, приводящую к 20% снижению массы к моменту регистрации максимального показателя (среднее по группе), или вызывающую летальные исходы, обусловленные лекарственным средством, которые превышают 10% или больше, считали чрезмерно токсичной дозировкой. Массы тела животных включали значения массы опухолей. Объем опухоли рассчитывали с применением следующей формулы: масса (мм³)=[длина (мм) × ширина (мм) × ширина (мм)]/2. Основными конечными точками эффективности были ΔТ/ΔС, медианный процент регрессии, частичная и полная регрессии (PR и CR).

Изменения объема опухоли для каждой группы обработки (Т) и контрольной группы (С) рассчитывали для каждой опухоли путем вычитания объема опухоли в день первой обработки (день определения стадии) из объема опухоли в указанный день наблюдения. Медианный ΔТ рассчитывали для группы обработки, и медианный ΔС рассчитывали для контрольной группы. Затем рассчитывали соотношение ΔТ/ΔС и выражали в виде процентной доли: ΔТ/ΔС=(дельта Т/дельта С) х 100.

Дозу считали терапевтически активной, если ΔТ/ ΔС составляло менее 40%, и очень активной, если ΔТ/ ΔС составляло менее 10%. Если ΔТ/ ΔС составляло менее 0, дозу считали высокоактивной и определяли процентную долю регрессии (Plowman J, Dykes DJ, Hollingshead M, Simpson-Herren L and Alley MC. Human tumor xenograft models in NCI drug development. In: Feibig HH BA, editor. Basel: Karger.; 1999 p 101-125):

% регрессии опухоли определяли как % снижения объема опухоли в группе обработки в определенный день наблюдения по сравнению с ее объемом в первый день первой обработки.

В конкретный момент времени и для каждого животного рассчитывали % регрессии. Затем рассчитывали медианный % регрессии для группы.

Частичная регрессия (PR). Регрессии определяли как частичные, если объем опухоли уменьшался до 50% от объема опухоли в начале обработки.

Полная регрессия (CR). Полная регрессия достигалась, если объем опухоли=0 мм³ (CR учитывается, если объем опухоли не может быть зарегистрирован).

Результаты

Результаты для PDX CR-IGR-0007P представлены на фигуре 1 и в таблице 1 (ниже).

Одна мышь из контрольной группы была обнаружена мертвой в день 54; PDX CR-IGR-0007P является агрессивной опухолью и может приводит к истощению. huMAb2-3-SPDB-DM4 вводили в дозах ниже максимально переносимой дозы (MTD), при этом виды обработки хорошо переносились и не индуцировали токсичность. Препарат TAS-102 вводили при его MTD, которая была определена у мышей без привитых опухолей. У данных мышей с привитой опухолью PDX CR-IGR-0007P виды обработки цитотоксическими средствами по отдельности или в комбинации хорошо переносились, при этом потеря массы тела составила от 8,1 до 10,8%.

huMAb2-3-SPDB-DM4 в режиме монотерапии был неактивным с ΔТ/ΔС в день 49, равным 76%. Препарат TAS-102 в режиме монотерапии был неактивным с ΔТ/ΔС, равным 42%.

Схема обработки комбинацией huMAb2-3-SPDB-DM4 и TAS-102 показала высокую активность с ΔТ/ΔС, равным 9% (р < 0,0001). Эффект комбинации huMAb2-3-SPDB-DM4 и TAS-102 значимо отличался от эффекта huMAb2-3-SPDB-DM4 в режиме монотерапии от дня 40 до дня 62 и значимо отличался от эффекта TAS-102 в режиме монотерапии от дня 49 до дня 62.

И в заключение, в отношении PDX CR-IGR-0007P huMAb2-3-SPDB-DM4 после 3 еженедельных в/в введений в дозе 5 мг/кг был неактивным в режиме монотерапии. Препарат TAS-102 в режиме монотерапии также был неактивным, при этом обработка хорошо переносилась. Комбинация huMAb2-3-SPDB-DM4 и препарата TAS-102 показала значительно более высокую активность, чем обработка данными средствами по отдельности.

Результаты для PDX CR-IGR-0011C представлены на фигуре 2 и в таблице 2 (ниже).

У мышей контрольной группы наблюдали отрицательные изменения массы тела (с зарегистрированным максимальным показателем -6,7% в день 32); PDX CR-IGR-0011C является агрессивной опухолью и может приводить к истощению. huMAb2-3-SPDB-DM4 вводили в дозах ниже максимально переносимой дозы (MTD), при этом виды обработки хорошо переносилось и не индуцировали токсичность.

Препарат TAS-102 вводили при его MTD, которая была определена у мышей без привитых опухолей. У данных мышей с привитой опухолью PDX CR-IGR-0011C, которая приводила к потере массы тела, обработки цитотоксическими средствами по отдельности или в комбинации индуцировали дополнительную потерю массы тела, поэтому в день 24 рацион лабораторных грызунов в каждой группе обогащали высококалорийной пищевой добавкой. Препарат TAS-102 в режиме монотерапии или в комбинации индуцировал потерю массы тела, превышающую 20%, и в день 34 вызвал гибель животных группы, обработанной только TAS-102.

huMAb2-3-SPDB-DM4 в режиме монотерапии был высокоактивным с ΔТ/ΔС в день 35 меньше 0% (р < 0,0001), регрессией опухоли 29% и 2 PR (частичной регрессией).

Препарат TAS-102 в режиме монотерапии показал высокую активность с ΔТ/ΔС, равным 29% (р < 0,0027).

Комбинация huMAb2-3-SPDB-DM4 и препарата TAS-102 показала высокую активность с ΔТ/ΔС меньше 0% (р < 0,0001), регрессией опухоли 83%, 4 PR и 2 CR (полная регрессия). Эффект комбинации huMAb2-3-SPDB-DM4 1 с TAS-102 значимо отличался от эффекта huMAb2-3-SPDB-DM4 в режиме монотерапии от дня 27 до дня 33 и значимо отличался от эффекта TAS-102 в режиме монотерапии от дня 30 до дня 35.

И в заключение, в отношении PDX CR-IGR-0001C huMAb2-3-SPDB-DM4 после 3 еженедельных в/в введений в дозе 5 мг/кг был высокоактивным в режиме монотерапии. Препарат TAS-102 был также активным в режиме монотерапии. Комбинация HUMAB2-3-SPDB-DM4 и TAS-102 была значительно более активной, чем данные средства по отдельности.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены способы лечения рака, экспрессирующего СЕАСАМ5, которые включают от 3 до 6 циклов введения, где один цикл предусматривает: введение иммуноконъюгата, содержащего антитело к СЕАСАМ5, в дозе от 60 до 210 мг/м² по меньшей мере однократно в течение цикла и введение трифлуридина и типирацила (TAS-102) в дозе от 10 до 100 мг/м², где TAS-102 содержит трифлуридин и типирацил в молярном соотношении, составляющем от 1:0,4 до 1:0,6, по меньшей мере однократно в течение цикла. Изобретение применяется для лечения рака. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 1 пр.

1. Способ лечения рака, экспрессирующего СЕАСАМ5, включающий от 3 до 6 циклов введения, где один цикл предусматривает:

введение иммуноконъюгата, содержащего антитело к СЕАСАМ5, в дозе от 60 до 210 мг/м² по меньшей мере однократно в течение цикла; и

введение трифлуридина и типирацила (TAS-102) в дозе от 10 до 100 мг/м², где TAS-102 содержит трифлуридин и типирацил в молярном соотношении, составляющем от 1:0,4 до 1:0,6, по меньшей мере однократно в течение цикла;

где антитело к СЕАСАМ5 содержит CDR-H1, состоящую из последовательности под SEQ ID NO: 1, CDR-H2, состоящую из последовательности под SEQ ID NO: 2, CDR-H3, состоящую из последовательности под SEQ ID NO: 3, CDR-L1, состоящую из последовательности под SEQ ID NO: 4, CDR-L2, состоящую из аминокислотной последовательности NTR, и CDR-L3, состоящую из последовательности под SEQ ID NO: 5,

где иммуноконъюгат содержит по меньшей мере одно цитостатическое средство.

2. Способ по п. 1, где антитело к СЕАСАМ5 содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), состоящий из последовательности под SEQ ID NO: 6, и вариабельный домен легкой цепи (VL), состоящий из последовательности под SEQ ID NO: 7.

3. Способ по п. 1 или 2, где антитело к СЕАСАМ5 содержит тяжелую цепь (VH), состоящую из последовательности под SEQ ID NO: 8, и легкую цепь (VL), состоящую из последовательности под SEQ ID NO: 9.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где цитостатическое средство выбрано из группы, состоящей из радиоактивных изотопов, белковых токсинов, низкомолекулярных токсинов и их комбинаций.

5. Способ по п. 4, где низкомолекулярные токсины выбраны из антиметаболитов, средств, алкилирующих ДНК, средств, сшивающих ДНК, средств, интеркалирующих ДНК, ингибиторов сборки микротрубочек, ингибиторов топоизомеразы и их комбинаций.

6. Способ по п. 5, где ингибитор сборки микротрубочек выбран из группы, состоящей из таксанов, алкалоидов барвинка, майтанзиноидов, колхицина, подофиллотоксина, гризеофульвина и их комбинаций.

7. Способ по п. 6, где майтанзиноиды выбраны из группы, состоящей из N2'-деацетил-N2'-(3-меркапто-1-оксопропил)-майтанзина (DM1) или N2'-деацетил-N-2'-(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)-майтанзина (DM4) и их комбинаций.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где антитело к СЕАСАМ5 ковалентно присоединено посредством расщепляемого или нерасщепляемого линкера к по меньшей мере одному цитотоксическому средству.

9. Способ по п. 8, где указанный линкер выбран из группы, состоящей из N-сукцинимидилпиридилдитиобутирата (SPDB), 4-(пиридин-2-илдисульфанил)-2-сульфомасляной кислоты (сульфо-SPDB) и сукцинимидил-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилата (SMCC).

10. Способ по любому из пп. 1-9, содержащий антитело к СЕАСАМ5, которое содержит тяжелую цепь (VH), состоящую из последовательности под SEQ ID NO: 8, и легкую цепь (VL), состоящую из последовательности под SEQ ID NO: 9 (huMAb2-3), и которое ковалентно связано с N2'-деацетил-N-2'-(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)-майтанзином (DM4) через N-сукцинимидилпиридилдитиобутират (SPDB).

11. Способ по любому из пп. 1-10, где иммуноконъюгат характеризуется соотношением лекарственного средства и антитела (DAR) в диапазоне от 1 до 10.

12. Способ по любому из пп. 1-11, где рак представляет собой солидную опухоль.

13. Способ по любому из пп. 1-12, где рак выбран из группы, состоящей из колоректального рака и рака желудка.

14. Способ по любому из пп. 1-13, где иммуноконъюгат и TAS-102 вводятся одновременно нуждающемуся в этом субъекту.

15. Способ по п. 14, где иммуноконъюгат и TAS-102 составлены в (i) одной фармацевтической композиции, содержащей иммуноконъюгат и TAS-102, или (ii) в форме по меньшей мере двух отдельных фармацевтических композиций, где по меньшей мере одна фармацевтическая композиция содержит иммуноконъюгат и одна или несколько фармацевтических композиций содержат трифлуридин и типирацил в отдельных или комбинированных составах.

16. Способ по любому из пп. 1-13, где иммуноконъюгат и TAS-102 вводятся по отдельности или последовательно нуждающемуся в этом субъекту.

17. Способ по п. 16, где иммуноконъюгат и TAS-102 составлены в форме по меньшей мере двух отдельных фармацевтических композиций, где (i) по меньшей мере одна фармацевтическая композиция содержит иммуноконъюгат и (ii) одна или несколько фармацевтических композиций содержат трифлуридин и типирацил в отдельных или комбинированных составах.

18. Способ лечения рака, экспрессирующего СЕАСАМ5, включающий от 3 до 6 циклов введения, где один цикл предусматривает:

введение иммуноконъюгата, содержащего антитело к СЕАСАМ5, в дозе от 60 до 210 мг/м² по меньшей мере однократно в течение цикла; и

введение трифлуридина и типирацила (TAS-102) в дозе от 10 до 100 мг/м², где TAS-102 содержит трифлуридин и типирацил в молярном соотношении, составляющем от 1:0,4 до 1:0,6, по меньшей мере однократно в течение цикла;

где антитело к СЕАСАМ5 содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), состоящий из последовательности под SEQ ID NO: 8, и вариабельный домен легкой цепи (VL), состоящий из последовательности под SEQ ID NO: 9,

где иммуноконъюгат содержит по меньшей мере одно цитостатическое средство.