Способ прогнозирования рецидивирования Эпштейна-Барр вирусной инфекции у детей Российский патент 2019 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, а именно, к педиатрии и иммунологии и может быть использовано для прогнозирования рецидива Эпштейна-Барр вирусной инфекции (ЭБВИ) у детей.

В настоящее время установлено, что вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ), как и другие представители семейства герпес-вирусов, может вызывать хронические и стертые формы заболеваний, протекающие по типу хронического мононуклеоза. Установлено, что около 90 - 98% взрослого населения планеты имеют в крови антитела к вирусу Эпштейна-Барр (Macsween K.F. Infectious mononucleosis in university students in the United kingdom: evaluation of the clinical features and consequences of the disease / K.F. Macsween, C.D. Higgins, K.A. McAulay et al. // Clinical Infectious Diseases: An office, of the Infectious diseases s-ty of Amer. a. the HIV medicine assoc. - Chicago: The University of Chicago press, 2010 - Vol. 50, №5. - P. 699-706; Chan C.W. Epstein-Barr virus-associated infectious mononucleosis in Chinese children / C.W. Chan, A.K. Chiang, K.H. Chan, A.S. Lau // The Pediatric Infectious Disease Journal. - Baltimore, Md.: Williams & Wilkins, 2003. - Vol. 22, №11. - P. 974-978; Crawford D.H. Sexual history and Epstein-Barr virus infection / D.H. Crawford, A.J. Swerdlow, C. Higgins et al. // The Journal of Infectious Diseases: An office, publ. of the Infections diseases s-ty of America. - Chicago: Univ. of Chicago press, 2002. - Vol. 186, №6. - P. 731-736].

Известно также, что в последние годы регистрируют рецидивирующие и хронические формы ЭБВИ [Иванова О.Н. Лечение хронической инфекции вируса Эпштейна-Барр у детей / О.Н. Иванова // Якутский медицинский журнал. - 2017. - №4 (60). - С. 63-64; Симованьян Э.Н. Эффективность применения инозина пранобекс у часто болеющих детей с хронической Эпштейна-Барр вирусной инфекцией: результаты рандомизированного исследования / Э.Н. Симованьян, В.Б. Денисенко, А.В. Григорян // Вопросы современной педиатрии, 2011, Т. 10, №. 2, С. 16-21].

Высокая частота выделения ВЭБ среди населения и наличие рецидивирующих и хронических форм ЭБВИ является основанием для разработки способов прогнозирования рецидивов этой вирусной инфекции.

Нами в периодической литературе способов прогнозирования рецидивов ЭБВИ в период вирусоносительства не выявлено.

В патентной литературе описан способ прогнозирования течения инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барр, у детей [Патент RU 2285262 С1 от 10.10.2006. Бюл. №28], взятый нами в качестве прототипа. Способ включает оценку иммунологических параметров методом ИФА в ранних сроках заболевания, в период разгара болезни и в период ранней реконвалесценции и по иммунологическим показателям авторы прогнозируют развитие рецидивирующего течения инфекционного мононуклеоза.

Недостатком предложенного способа является то, что прогнозирование проводится в острый период инфекционного процесса.

Описано несколько аналогов по использованию иммунологических данных для диагностики заболевания, вызванного ВЭБ. Содано ряд изобретений [Патент RU №2360254 С1 от 27.06.2009. Бюл. №18; Патент RU №2279677 С1 от 10.07.2006. Бюл №19]. Авторы изобретений проводят дифференциальную диагностику заболеваний и прогнозируют степень тяжести течения острого периода инфекционной болезни.

Задачей настоящего изобретения является выявить критерии, позволяющие прогнозировать развитие рецидива ЭБВИ в период вирусоносительства возбудителя ЭБВИ у детей по уровню иммунологических показателей.

Научное обоснование предложенного способа прогнозирования рецидивов ЭБВИ у детей нашло отражение в периодической литературе. Так, хроническое персистирование вируса в организме сопровождалось развитием иммунодефицитных состояний у пациентов [Кетлинский С.А. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции реакции воспаления и иммунитета / с.а. Кетлинский, Н.М. Калинина // Иммунология. - 1995.- №3. - С. 30-44; Петров Р.В. Иммунореабилитация и стратегия медицины / Р.В. Петров. // Intemationfl J. Immunoreabilitation. - 1994. - №1. - С. 5-6; Перадзе Х.Д. Клинико-лабораторные особенности острых и хронических форм Эпштейна-Барр вирусной инфекции (инфекционного мононуклеоза) у подростков и лиц молодого возраста: автореф. дис. … канд. мед. наук / Перадзе Хатума Джемалиевна. - СПб. 2003, 23 с.].

Следовательно, по изменению параметров иммунологических показателей можно выявить иммунологические критерии для прогнозирования рецидивов ЭБВИ.

Способ прогнозирования рецидивирования Эпштейна-Барр вирусной инфекции у детей был разработан в результате расширенного иммунологического обследования 147 детей в возрасте от 3 до 17 лет, находившихся на обследовании у ГБУЗ ТО ОИКБ г. Тюмень. Результаты исследований представлены в таблице 1 и обработаны методами параметрической статистики с помощью программ Microsoft Excel и Statistica 10.0. Достоверность различий рассчитывали по критерию Манна-Уитни (р<0,05). В материалы заявки включены только основные иммунологические показатели, свидетельствующие о возможности возникновения рецидива ЭБВИ у детей. Иммунологические показатели трудно воспроизводимые, неспецифические и обладающие низкой специфичностью к ВЭБ не были включены в материалы настоящей заявки. Из серологических показателей использован специфический маркер - индекс позитивности антител к нуклеарному антигену вируса - EBNA IgG, указывающий на длительную персистенцию вируса в организме ребенка.

Технический результат предложенного способа основан на определении антител к нуклеарному антигену вируса Эпштейна-Барр класса IgG и абсолютного количества CD3⁺, CD7⁺, CD8⁺ лимфоцитов.

Технический результат достигается тем, что способ прогнозирования рецидивирования Эпштейна-Барр вирусной инфекции у детей, включающий определение иммунологических параметров методом иммуноферментного анализа, согласно изобретения при наличии антител к нуклеарному антигену вируса Эпштейна-Барр класса IgG и в указанных пределах абсолютного количества показателей CD3⁺ 2,1-6,2×10⁹/л, CD7⁺ 2,0-4,3×10⁹/л, CD8⁺ 0,2-0,8×10⁹/л проведено прогнозирование развития клинических проявлений рецидива Эпштейна-Барр вирусной инфекции.

Сравнительная характеристика положительного и экономического эффекта предложенной заявки на изобретение по сравнению с прототипом представлена в таблице 2.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Из локтевой вены пациента берут гепаринизированную венозную кровь (25 ЕД/мл), в объеме 10 мл. Забор крови проводят утром натощак в интервале с 8.00 до 8.30.

Сыворотку крови пациента исследуют методом иммуноферментного анализа (ИФА) с выявлением антител классов IgG к ядерному антигену (EBNA). Исследование проводят на тест-системах фирмы «Вектор-Бест» (г.Новосибирск, РФ). Для определения титра антител вычисляют индекс позитивности (ИП) по формуле:

при ИП>1 сыворотка считалась позитивной.

Лимфоциты выделяют, используя центрифугирование на градиенте фиколл-верографина в течение 10 минут при 300g (1000 об/мин). К оставшимся в осадке лимфоцитам добавляют 5 мкл тестируемого моноклонального антитела (ТОО «Сорбент», г. Москва), инкубируют в течение 30-40 минут. В полученную смесь добавляют 150 мл раствора Хенкса и центрифугируют еще 5 минут. После удаления супернатанта, а к осадку отмытых клеток добавляют 50 мкл F(ab)2 - фрагментов овечьих антител, меченных ФИТЦ. Клетки суспензируют 30 минут при температуре +4°С, затем дважды отмывают физиологическим раствором. Определение субпопуляций лимфоцитов проводят на проточном лазерном цитофлуорометре FASCAN фирмы «BectonDickinson» (USA).

При наличии антител к нуклеарному антигену вируса Эпштейна-Барр класса IgG и абсолютном количестве показателей CD3⁺ 2,1-6,2×10⁹/л, CD7⁺ 2,0-4,3×10⁹/л, CD8⁺ 0,2-0,8×10⁹/л в указанных пределах прогнозировали развитие клинических проявлений рецидива Эпштейна-Барр вирусной инфекции.

Способ прогнозирования рецидива ЭБВИ можно проиллюстрировать на конкретных примерах.

Пример 1. Больной Д., 3-х лет. Диагноз при поступлении: Острое респираторное заболевание. В анамнезе больного перенесенный в прошлом год назад инфекционный мононуклеоз, вызванный ВЭБ. Пациент обследован на возможность развития рецидива ЭБВИ.

Результаты исследований показали: ОП = 1,107/0,404. ИП = 2,74. В крови пациента обнаружены IgG к EBNA. По данным иммунограммы количество CD3⁺, CD7⁺ и CD8⁺ в сыворотке крови пациента определялось в количестве 2,5×10⁹/л, 3,5×10⁹/л и 0,9×10⁹/л соответственно.

У пациента прогнозировано развитие рецидива ЭБВИ.

Дальнейшее клиническое и лабораторное обследование подтвердило данные прогнозирования рецидива ЭБВИ.

Общее состояние средней степени тяжести. Кожные покровы бледно-розовые, чистые, умеренной влажности. Заднешейные лимфоузлы мелкие, множественные, переднешейные и тонзиллярные увеличены до 1,5 см. Носовое дыхание умеренно затруднено, отделяемое из носовых ходов скудное, слизистого характера. Дыхание везикулярное, хрипы не выслушиваются. ЧДД 26 в минуту. Тоны сердца ясные, ритмичные, шумов нет. Пульс удовлетворительных качеств с частотой 120 ударов в минуту. В зеве не яркая разлитая гиперемия слизистых, миндалины 2 степени гипертрофии, налетов в лакунах нет. Язык чистый, влажный. Живот мягкий, безболезненный, доступен глубокой пальпации во всех отделах. Печень выступает на 1,5 см из-под края реберной дуги. Селезенка выступает из-под края реберной дуги на 1,0 см. Стул оформленный, регулярный. Мочеиспускание свободное, безболезненное. В стационаре был выполнен биохимический анализ крови: общий билирубин 8,14 мкмоль/л, прямой билирубин 2,42 мкмоль/л, АлТ 21,6 Е/л, АсТ 27,9 Е/л. ПЦР крови к ВПГ I, II типа - отр. ПЦР крови на ДНК ЦМВ - отр. ПЦР крови на ДНК ВЭБ - положит. ПЦР крови на ДНК ВГЧ VI типа - отр.

Окончательный диагноз: Эпштейна-Барр вирусный инфекционный мононуклеоз, рецидив, средней степени тяжести.

Пример 2. Больная О., 11 лет. Поступила в ГБУЗ ТО ОИКБ с предварительным диагнозом: Лакунарная ангина. В анамнезе имел место перенесенный в 5 лет инфекционный мононуклеоз. Пациент обследован на возможность развития рецидива ЭБВИ. Результаты исследований показали: ОП = 1,107/0,404. ИП = 2,74, В крови пациента обнаружены IgG к EBNA. По данным иммунограммы количество CD3⁺, CD7⁺ и CD8⁺ в сыворотке крови пациента определялось в количестве 2,37×10⁹/л, 1,83×10⁹/л и 1,64×10⁹/л соответственно.

У пациентки прогнозировано развитие рецидива ЭБВИ.

Дальнейшее клиническое и лабораторное обследование подтвердило данные прогнозирования рецидива ЭБВИ. В динамике заболевания отмечена фебрильная лихорадка в течение 5 суток, общее состояние средней степени тяжести. Кожные покровы бледно-розовые, чистые, умеренной влажности. Заднешейные лимфоузлы мелкие, тонзиллярные увеличены до 1,0 см. Носовое дыхание умеренно затруднено, отделяемого из носовых ходов нет. Дыхание везикулярное, проводится по всем легочным полям, хрипы не выслушивались. ЧДД 22 в минуту. Тоны сердца ясные, ритмичные, шумов нет. ЧСС 140 в минуту. АД 105/60 мм.рт.ст. Пульс удовлетворительных качеств с частотой 140 ударов в минуту. В зеве умеренная разлитая гиперемия слизистых, миндалины 2 степени гипертрофии, в лакунах умеренное количество белых налетов. Налеты легко снимались шпателем, поверхность миндалин после снятия налета не кровоточила. Отека в зеве и отека подкожной жировой клетчатки шеи не было. Язык чистый, влажный. Живот мягкий, безболезненный, доступен глубокой пальпации во всех отделах. Печень на 2,0 см выступала из-под края реберной дуги. Селезенка не пальпировалась. Стул оформленный, регулярный. Мочеиспускание свободное, безболезненное. Биохимический анализ крови общий билирубин 15,0 мкмоль/л, прямой билирубина нет, АлТ 10,2 Е/л, АсТ 45,8 Е/л. ПЦР крови к ВПГ I, II типа - отр. ПЦР крови на ДНК ЦМВ - отр. ПЦР крови на ДНК ВЭБ - положит. ПЦР крови на ДНК ВГЧ VI типа - отр.

Окончательный диагноз: Эпштейна-Барр вирусный инфекционный мононуклеоз, рецидив, средней степени тяжести.

Пример 3. Больной А., 14 лет, поступил с диагнозом: Острое респираторное заболевание. Из анамнеза известно, что несколько лет назад при обследовании были обнаружены в крови антитела к вирусу Эпштейна-Барр.

Пациент обследован на возможность развития рецидива ЭБВИ. Результаты исследований показали: ОП = 1,319/0,217. ИП = 6,08. По данным иммунограммы количество CD3⁺, CD7⁺ и CD8⁺ в сыворотке крови пациента определялось в количестве 0,7×10⁹/л, 0,9×10⁹/л и 0,4×10⁹/л соответственно.

У пациента данных за развитие рецидива ЭБВИ не выявлено. Было сделано заключение об отсутствии активности вируса Эпштейна-Барр в момент обследования. При дальнейшем клиническом и лабораторном обследовании пациента не выявлено признаков активации ВЭБ.

Общее состояние пациента средней степени тяжести. Кожные покровы бледноватые, щеки гиперемированные, чистые, умеренной влажности. Заднешейные лимфоузлы мелкие, тонзиллярные увеличены до 1,5 см.. Инъекции склер, гиперемии конъюнктив, отделяемого из глаз нет. Носовое дыхание умеренно затруднено, отделяемого из носовых ходов нет. Дыхание везикулярное, проводится по всем легочным полям, хрипы не выслушивались. ЧДД 20 в минуту. Тоны сердца ясные, ритмичные, шумов нет. ЧСС 108 минуту. АД 120/70 мм.рт.ст. В зеве яркая разлитая гиперемия слизистых, миндалины 1 степени гипертрофии, в лакунах налетов нет. Язык чистый, влажный. Живот мягкий, безболезненный, доступен глубокой пальпации во всех отделах. Печень выступает на 0,5 см из-под края реберной дуги. Селезенка не пальпируется. Стул оформленный, регулярный. Мочеиспускание свободное, безболезненное. Биохимический анализ крови: общий билирубин 10,2 мкмоль/л, прямой билирубина нет, АлТ 24,5 Е/л, АсТ 16,0 Е/л. ПЦР крови к ВПГ I, II типа - отр. ПЦР крови на ДНК ЦМВ - отр. ПЦР крови на ДНК ВЭБ - отр. ПЦР крови на ДНК ВГЧ VI типа - отр.

Пациенту был поставлен окончательный диагноз: Острое респираторное заболевание средней степени тяжести.

Приведенные примеры иллюстрируют возможность применения предложенного способа для прогнозирования рецидива ЭБВИ у детей.

Результаты исследований легко воспроизводимы, не требуют больших материальных затрат. Предложенный способ позволяет прогнозировать возникновение рецидива ЭБВИ с точностью 95-100%.

Примечание:

Все показатели отличаются от контрольных значений.

* - р≤0,05; ** - р≤0,01; *** - р≤0,001.

ИП - индекс позитивности.

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии и иммунологии, и может быть использовано для прогнозирования рецидива ЭБВИ у детей. Способ прогнозирования рецидивирования Эпштейна-Барр вирусной инфекции у детей включает оценку иммунологических параметров методом иммуноферментного анализа и при наличии антител к нуклеарному антигену вируса Эпштейна-Барр класса IgG и в указанных пределах абсолютного количества показателей CD3⁺ 2,1-6,2×10⁹/л, CD7⁺ 2,0-4,3×10⁹/л, CD8⁺ 0,2-0,8×10⁹/л осуществляют прогнозирование развития клинических проявлений рецидива Эпштейна-Барр вирусной инфекции. Предложенный способ легко воспроизводим, не требует больших материальных затрат и при обследовании пациентов позволяет прогнозировать развитие рецидива ЭБВИ у детей в 95-100%. 2 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования рецидивирования Эпштейна-Барр вирусной инфекции у детей, включающий оценку иммунологических параметров методом иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что при наличии антител к нуклеарному антигену вируса Эпштейна-Барр класса IgG и в указанных пределах абсолютного количества показателей CD3⁺ 2,1-6,2×10⁹/л, CD7⁺ 2,0-4,3×10⁹/л, CD8⁺ 0,2-0,8×10⁹/л осуществляют прогнозирование развития клинических проявлений рецидива Эпштейна-Барр вирусной инфекции.