Способ определения чувствительности неферментирующих бактерий к дезинфицирующим средствам с применением масс-спектрометрии Российский патент 2019 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к области микробиологии и касается способа определения чувствительности неферментирующих бактерий (НФБ) к дезинфицирующим средствам (дезинфектантам).

В настоящее время инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи (ИСМП), являются актуальной медицинской проблемой, при этом в микробном пейзаже в отделениях лечебно-профилактических учреждений различного профиля доминируют НФБ. Частота выделения НФБ из клинического материала достигает 15% от всех аэробных и факультативно-анаэробных грамотрицательных бактерий, из них около 70% приходится на долю P. aeruginosa, Acinetobacter spp. и Stenotrophomonas maltophilia. Указанные бактерии могут существовать в любой из экологических ниш - почве, воде, воздухе, тканях и органах растений и животных, а также обладают способностью распространяться горизонтально через предметы или руки больных и медперсонала, т.е. быть возбудителями госпитальных инфекций. Эти возможности НФБ обеспечиваются наличием высокой частоты резистентности к различным классам антимикробных препаратов, межклеточной сигнальной системой «quorum sensing», а также способностью формировать биопленку, структура и физиологические свойства которой обеспечивают повышение устойчивости к антибиотикам и дезинфектантам.

Изучение устойчивости бактерий к дезинфектантам тормозится, прежде всего, отсутствием унифицированных методов определения и несовершенством показателей оценки чувствительности - устойчивости бактерий к этой группе препаратов.

Известен способ определения чувствительности микроорганизмов к дезинфектанту (RU 2378363), в основе которого лежит оценка жизнеспособности микроорганизмов по росту микроорганизмов на питательной среде после обработки взвеси микробов дезинфектантом в течение времени, необходимого для проявления дезинфицирующего эффекта и последующего дозированного посева на плотную питательную среду. О чувствительности микроорганизмов к дезинфектанту судят по росту микроорганизмов на питательной среде, при этом, при росте до 100 КОЕ/мл судят о неполном бактерицидном действии, при росте 100-300 КОЕ/мл - о суббактерицидном действии, при росте более 300 КОЕ/мл - об устойчивости микроорганизмов к дезинфектанту.

Подсчет колоний жизнеспособных бактерий в данном способе проводят в ручном режиме, что носит субъективный характер. Данный способ не дает возможности одновременного определения чувствительности культур НФБ к разным дезинфекционным средствам, трудоемок в исполнении и требует дорогостоящих расходных материалов.

Целью предлагаемого изобретения явилась разработка способа, позволяющего исследовать чувствительность культур неферментирующих бактерий одновременно к разным дезинфекционным средствам, обеспечивающего объективность и стандартность процедуры, сокращение времени проведения исследований и расходные материалы.

Поставленная цель достигается использованием времяпролетной масс-спектрометрии с матрично- активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS), основанной на ионизации атомов и молекул, входящих в состав исследуемого образца, и регистрации спектра масс образовавшихся ионов, получил широкое распространение в идентификации микроорганизмов. Получаемые масс-спектр профили микроорганизмов (белковые профили) являются уникальной родо-, видоспецифичной характеристикой, и, соответственно, позволяют идентифицировать микроорганизм до рода, вида.

По окончании процесса автоматической идентификации на основании сравнения полученного исходного спектра с референсными спектрами базы данных программа отображает результат идентификации, приводя наиболее релевантную исходному спектру таксономическую единицу базы данных с указанием значения коэффициента соответствия (показатель уровня идентификации бактерий) - «Score». Чем выше данный коэффициент, тем вероятнее классификация вида. После завершения процесса идентификации результат выводится в таблицу классификации, показывающую наилучшие результаты идентификации полученных масс-спектров, достоверность которых подтверждается коэффициентом соответствия.

В предлагаемом способе для определения чувствительности НФБ к дезинфектантам используют времяпролетную масс-спектрометрию с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS), при которой чувствительность НФБ к дезинфицирующим средствам определяют по оценке степени денатурации белков бактерий, фиксируемой при сопоставлении масс-спектрометрических профилей культур НФБ, полученных до- и после воздействия дезинфектантами.

Способ осуществляют следующим образом.

Масс-спектрометрическим методом (идентификация молекул путем измерения отношения их массы к заряду (m/z) в ионизированном состоянии) с использованием настольного масс-спектрометра Microflex с базой данных MALDI Biotyper (Bruker Daltonics Germany) проводят исследования суточной бульонной чистой культуры НФБ до- и после воздействия дезинфектанта.

Изолированную колонию испытуемой культуры с чашки Петри вносят в пробирку с питательным микробиологическим бульоном и выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение суток. Каплю испытуемой суточной чистой культуры НФБ наносят на мишень в двух повторностях, сушат при комнатной температуре в течение 5-15 мин. На каждый образец наносят 1 μl матрицы СНСА (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid), просушивают. Образцы помещают в масс-спектрометр и подвергают воздействию лазерных импульсов (ионизация).

Исходный (до воздействия дезинфектантами) масс-спектрометрический профиль рассматривают, как показатель уровня идентификации НФБ и оценивают в соответствии с полученным коэффициентом соответствия:

- при коэффициенте соответствия 2,300-3,000 - высокая вероятность идентификации вида;

- 2,000-2,299 - надежная идентификация рода, вероятная идентификация вида;

- 1,700-1,999 - вероятная идентификация рода;

- 0,00-1,699 - ненадежная идентификация.

Определяют масс-спектрометрический профиль суточной бульонной чистой культуры НФБ после воздействия дезинфицирующих средств.

Суточные бульонные чистые культуры НФБ подвергают воздействию разных дезинфектантов: 6% перекись водорода, 70° этанол; препарат «Ультрадон» (Россия); препарат «Сульфохлорантин Д» (Россия), используя концентрации рабочих растворов дезинфектантов, и, в качестве сублетальной дозы, 10-кратное разведение их рабочих растворов. Тестируемые культуры выдерживают в растворах препаратов при экспозиции, рекомендованной соответствующими инструкциями. Действие дезинфектантов останавливают 0,5% раствором тиосульфата натрия (10 мкл 0,5% раствора тиосульфата натрия + 90 мкл взвеси культуры в дез.средстве) в течение 15 мин при 20°С. Затем подращивают 3 час при 37°С в питательном бульоне (НПО «Микроген») в соотношении 1 мл взвеси микроорганизма с дезинфектантом + 1 мл питательного бульона, и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. Осадок микроорганизмов наносят на мишень (10 мкл) и анализируют масс-спектрометрическим методом (Bruker Daltonik MALDI Biotyper) по описанной выше схеме.

Параллельно из растворов культур с дезинфектантами проводят дозированные посевы на микробиологический агар (НПО «Микроген») для подсчета жизнеспособных бактериальных клеток.

Проводят оценку варьирования распределения пиков различной длины пролета в полученных профилях. Пики различной длины пролета условно разделяют на группы, в зависимости от отношения массы иона к заряду (m/z):

- высоко-пролетные - (m/z≥5000), мажорные;

- средне-пролетные - (m/z от 5000 до 2500), промежуточные;

- низко-пролетные (m/z≤2500), минорные.

Масс-спектрометрический профиль различных штаммов Р. aeruginosa до воздействия дезинфектантов представлен на рисунке 1.

Описание способа

1. Используемые штаммы:

1) P. aeruginosa - 35,

2) Acinetobacter iwoffii -1,

3) Acinetobacter baumannii - 2,

4) Stenotrophomonas maltofilia - 2.

2. Используемые дезинфекционные средства

1) 6% перекись водорода

2) 70° этанол;

3) «Ультрадон» (Россия);

4) препарат «Сульфохлорантин Д» (Россия).

Этап 1. Подготовка культур.

Приготовление рабочей взвеси. Суточные бульонные чистые культуры неферментирующих бактерий используют для приготовления основной рабочей взвеси с использованием стандарта оптической плотности, соответствующего 1 млрд мт/мл в изотоническом растворе хлорида натрия.

Этап 2 Подготовка дезинфекционных средств.

Подготовка рабочих стандартных растворов дезинфектантов. Рабочие растворы дезинфектантов приготавливают из концентрированных растворов в соответствии с инструкциями.

Подготовка сублетальных концентраций растворов дезинфектантов. Из рабочих растворов дезинфектантов приготавливают раствор 1:10 последовательным разведением в изотоническом растворе хлорида натрия. При этом 1 мл рабочего раствора дезинфектанта соединяют и перемешивают с 9 мл изотонического раствора хлорида натрия.

Таким образом, для исследования устойчивости к препаратам используют 2 концентрации тестируемого дезсредства: рабочий стандартный раствор и 1:10.

Этап 3 Осуществление способа

1. Суточную бульонную чистую культуру бактерий подготавливают в соответствии с инструкцией по проведению биотипирования бактерий с использованием масс-спектрометра. Получают исходный (контрольный) масс-спектрометрический профиль штамма.

2. Культуры бактерий (микробная взвесь-1 млрд мт/мл) подвергают воздействию разных дезинфектантов (6% перекись водорода, 70° этанол; препарат «Ультрадон» (Россия); препарат «Сульфахлорантин Д» (Россия), в рабочей и сублетальной концентрациях препаратов.

3. Тестируемые культуры выдерживают в растворах препаратов при экспозиции, рекомендованной соответствующими инструкциями, при 20°С.

4. Действие дезинфектантов останавливают 0,5% раствором тиосульфата натрия. Затем подращивают 3 час при 37°С в питательном бульоне (НПО «Микроген»), добавляя к 1,0 мл взвеси 3,0 мл питательной среды. Затем центрифугируют при 13000 об/мин-10 мин.

5. Осадок микроорганизмов повторно анализируют методом масс-спектрометрии (Bruker Daltonik MALDI Biotyper).

Этап 4 Учет масс-спектрометрических профилей.

Сопоставляют полученные масс-спектрометрические профили с помощью программы MALDI-TOF Biotyper и затем проводят визуальный анализ произошедших изменений.

Пример 1. Изучение масс-спектрометрического профиля неферментирующих бактерий после воздействия этанолом.

Изменения, произошедшие под влиянием этанола для P. aeruginosa представлены на рисунке 2.

Для рабочего раствора этанола было выявлено практически полное исчезновение высоко-пролетных пиков, отсутствие средне-пролетных и превалирование низко-пролетных пиков. Для сублетальной концентрации - все пики были низко-пролетными. При этом отмечен переход величин первоначальных пиков к более низким значениям (отметка 1), либо их полным исчезновением (отметка 2).

В целом, наблюдается сглаживание масс-спектрометрического профиля с переходом в низко-пролетный интервал, что свидетельствует о денатурирующем действии препарата.

Пример 2. Изучение масс-спектрометрических профилей неферментирующих бактерий после воздействия перекиси водорода.

Масс-спектрометрический профиль P. aeruginosa после действия перекиси водорода приобретает вид, изображенный на рисунке 3.

Масс-спектрометрический профиль неферментирующих бактерий после воздействия рабочего раствора перекиси водорода не представлен, это определяется тем, что дезинфектант в большинстве случаев (97,3%) был летален для культур. Воздействие сублетальной концентрации привело у P. aeruginosa к снижению числа высоко- (отметка 1) и среднепролетных пиков (отметка 2); они трансформировались в пики с более низким значениями пролетности, что свидетельствует об эффективности действия препарата.

Пример 3. Изучение масс-спектрометрических профилей неферментирующих бактерий после действия «Сульфохлорантина Д».

Изменения масс-спектрометрического профиля на примере Р. aeruginosa после воздействия «Сульфохлорантина Д» представлены на рисунке 4.

Как видно из рисунка 4 масс-спектрометрический профиль Р. aeruginosa для рабочего раствора и сублетальной концентрации «Сульфохлорантина Д» приводит к сокращению числа высоко- (отметка 1), средне-пролетных пиков (отметка 2) и переходу их к низко- пролетным значениям.

Пример 4. Изучение масс-спектрических профилей неферментирующих бактерий после действия «Ультрадона».

Наблюдаемые перемены масс-спектрометрического профиля Р. aeruginosa показаны на рисунке 5.

При применении «Ультрадона», как видно на рисунке 5 происходило снижение числа высоко- и средне-пролетных пиков (отметка 1), а также исчезновение некоторых низко- пролетных (отметка 2).

Пример 5. Изучение масс-спектрометрических профилей у разных неферментирующих бактерий под действием разных концентраций дезинфектантов

В таблице 1 приведены данные изучения масс-спектрометрических профилей у разных неферментирующих бактерий по действием разных концентраций этанола, перекиси водорода, «Сульфохлорантина Д», «Ультрадона» по сравнению с методом серийных разведений с контрольным посевом

В целом, полученные результаты показали, что способы достоверно сходны.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для определения чувствительности неферментирующих бактерий (НФБ) к нескольким дезинфицирующим средствам одновременно. Для этого чувствительность НФБ определяют до и после воздействия дезинфицирующими средствами масс-спектрометрическим методом. Для чего сопоставляют профили культур НФБ по распределению пиков различной длины пролета в полученных профилях. Высоко-пролетные пики имеют отношения массы иона к заряду > 5000 m/z, средне-пролетные - от 5000 до 2500 m/z и низко-пролетные - ≤ 2500 m/z. При сокращении или полном исчезновении высоко- и средне-пролетных пиков и при сглаживании масс-спектрометрического профиля с переходом в низко-пролетный интервал делают вывод о чувствительности бактерий к дезсредству. Изобретение позволяет определять чувствительность НФБ одновременно к нескольким дезинфектантам. 1 табл., 5 ил., 5 пр.

Способ определения чувствительности неферментирующих бактерий (НФБ) к нескольким дезинфицирующим средствам одновременно, при котором чувствительность их определяют до и после воздействия дезинфицирующими средствами масс-спектрометрическим методом путем сопоставления профилей культур НФБ, по распределению пиков различной длины пролета в полученных профилях, где высоко-пролетные пики имеют отношения массы иона к заряду > 5000 m/z, средне-пролетные - от 5000 до 2500 m/z и низко-пролетные - ≤ 2500 m/z, и при сокращении или полном исчезновении высоко- и средне-пролетных пиков и при сглаживании масс-спектрометрического профиля с переходом в низко-пролетный интервал делают вывод о чувствительности бактерий к данному дезсредству.