ШТАММ БАКТЕРИЙ CAMPYLOBACTER JEJUNI ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, касается раздела определения чувствительности микроорганизмов к противомикробным препаратам и может быть использовано при микробиологических исследованиях для определения чувствительности бактерий Campylobacter к следующим антибактериальным препаратам: доксициклину, азитромицину, гентамицину, ципрофлоксацину.

Микроорганизмы рода Campylobacter в качестве этиологического фактора возникновения кишечных инфекций встречаются чаще, чем сальмонеллы, Значимость проблемы распространения кампилобактериоза подтверждает тот факт, что ВОЗ включила эту инфекцию в национальную программу по борьбе с инфекционными заболеваниями в 108 странах мира, в том числе и в России [1-4].

Как правило, генетические факторы антибиотикорезистентности бактерий ассоциированы с мобильной частью бактериального генома, а именно с плазмидами, интегронами, транспозонами, профагами, геномными островками и др. Именно этот факт приводит к возможности горизонтального переноса генов резистентности между таксономически и экологически отдаленными микроорганизмами, например, между микробиомами животных и человека, а также между бактериями в природных экосистемах [5-6].

Похожими свойствами обладают штаммы Campylobacter jejuni subsp. jejuni (Jones et al.) Veron and Chatelain (ATCC BAA-373), Campylobacter jejuni subsp. jejuni (Jones et al.) Veron and Chatelain (ATCC BAA-374), Campylobacter jejuni subsp. jejuni (Jones et al.) Veron and Chatelain (ATCC BAA-375), резистентные к фторхинолонам, используемые в исследованиях устойчивости к противомикробным препаратам, разработке лекарственных средств, исследовании кишечных и инфекционных болезней.

Предлагаемый в качестве изобретения штамм имеет более широкий спектр устойчивости к различным антибактериальным препаратам, что делает его применение в микробиологических исследованиях более универсальным.

Изобретение направлено на разработку контрольного штамма Campylobacter jejuni ВКШМ-Б-897М, необходимого для контроля устойчивости к широкому спектру антибактериальных препаратов, при этом имеющего достоверно подтвержденные генетические факторы резистентности.

Задача настоящего изобретения - создание стабильно-сохраняющего свойства референтного штамма для контроля микробиологических исследований, связанных с определением чувствительности к антибактериальным препаратам.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является использование в качестве контрольного штамма Campylobacter jejuni применяемого для контроля устойчивости к антибактериальным препаратам - доксициклину, азитромицину, гентамицину, ципрофлоксацину, - .

Указанный технический результат изобретения достигается выделением штамма Campylobacter jejuni для контроля устойчивости к антибактериальным препаратам. Штамм депонирован во «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» под номером ВКШМ-Б-897М.

Исследования проводили, руководствуясь ГОСТ ISO 10272-1-2013 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Методы обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp. Часть 1. Метод обнаружения», МУК 4.2.2321-08 «Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах». «Методические указания по лабораторной диагностике кампилобактериоза (вибриоза) сельскохозяйственных животных», утв. ГУВ МСХ и П РБ 17.06.2008 (№ 10-1-5/613), МУ «Идентификация микроорганизмов с применением масс-спектрометра Maldi Biotyper microflex при исследовании продовольственного сырья и пищевых продуктов».

Характеристика штамма Campylobacter jejuni ВКШМ-Б-897М.

Данный штамм выделен из биологического материала - фекалии крупного рогатого скота в Калининградской области.

Данный штамм выделен из биологического материала - фекалии крупного рогатого скота.

Морфологические свойства: Бактерии рода Campylobacter - грамотрицательные мелкие, тонкие палочки с одним или более завитками. В мазке имеют вид запятой, буквы S, либо галочки при соединении двух клеток. В стареющих культурах (через 48-72 ч инкубации на твердой среде) могут обнаруживаться кокковидные клетки. Спор и капсул не образуют. Рост в микроаэрофильных условиях. Подвижные бактерии.

Патогенные свойства: штамм патогенный для человека, III группа патогенности согласно СП 3.3686-21.

Культуральные свойства: pH среды 7,0-7,2. Оптимум роста при температуре 41,5 °C в течение (44 +/- 4) ч.

Рост на бульоне Болтона: гомогенное помутнение среды, наличие осадка. Типичные колонии на агаре CCDA с добавлением угля, на котором характерные для кампилобактерий колонии мелкие, бледные, полупрозрачные. Разрастание колоний менее выражено на более сухих поверхностях агара. Возможно образование других форм колоний. На колумбийском агаре с добавлением 7%-ной дефибринированной крови барана кампилобактерии также представляют собой мелкие, росинчатые колонии, серовато-белого цвета, полупрозрачные, зоны гемолиза не образуют. На среде Престон образуют влажные серые плоские колонии, имеющих тенденцию к слипанию.

Ферментативные свойства: не утилизируют углеводы, каталазоположительные, оксидазоположительные (Не рекомендуется проводить постановку данной реакции с колониями, выращенными на угольном агаре, т.к. они могут не давать характерной окраски (сиреневой, фиолетовой или синей). Campylobacter jejuni способны к гидролизу гиппурата.

Полногеномное секвенирование штамма Campylobacter jejuni ВКШМ-Б-897М осуществлено на платформе Illumina (MiSeq), тагментацию и индексирование проводили согласно инструкции Illumina «NexteraXT DNA Library Prep Kit. Reference Guide» с использованием набора реактивов NexteraXT. Нормализацию и денатурацию проводили согласно инструкции Illumina «Denature and Dilute Libraries Guide». Оценку качества тагментации ДНК и расчет молярной концентрации очищенных ПЦР продуктов осуществляли с использованием системы микрокассетного электрофореза TapeStation 4200. Подготовку образцов, электрофоретичекое разделение ПЦР продуктов проводили в соответствии с руководством по эксплуатации прибора и инструкциям G2991-90030 / G2991-90050. Анализ данных и расчет молярной концентрации очищенных ПЦР продуктов осуществляется автоматически с помощью встроенного программного обеспечения Agilent TapeStation Analisis.

Для биоинформатического анализа данных полногеномного секвенирования и сборки геномов de novo использовались следующие программы: FastQC 0.11.17, Trimmomatic v.0.36, SPAdes 2.11.1, QUAST 4.6.3, MAUVE v.20150226, IntegronFinder v5. Аннотация геномов была выполнена с помощью сервера RAST на открытой платформе для сравнительного анализа геномов SEED. Для поиска основных факторов вирулентности в геномах использовали базу данных The Virulence Factor Database (VFDB).

У штамма выявлены:

- генетические детерминанты устойчивости аминогликозидам (ампициллин - blaOXA-193) и фторхинолонам (ципрофлоксацин - gyrA p.T86I);

- факторы вирулентности pseE/maf5, flgM, pseF/G/A;

- плазмидные контиги: NODE_11_length_51929 и NODE_2_length_303009;

Пример.

Для приготовления исходной суспензии испытуемую пробу (1 г фекалий) вносили в девятикратный объем обогатительной среды - бульон Болтона с тем, чтобы получить соотношение проба/обогатительная среда 1:10 и гомогенизировали. Затем инкубировали в микроаэрофильных условиях при температуре 37°С в течение 4-6 ч, а далее при температуре 41,5 °С в течение (44±4) ч. После инкубации при помутнении среды, культуры пересевали на селективные среды: агар Престона и агар CCDA параллельно используя тест-систему Singlepath Campylobacter, (Merck, Германия) с целью получения предварительной информации о наличии кампилобактерий в испытуемом образце. Результаты теста учитывали только при наличии четкой красной линии в контрольной зоне (С) через 20 минут. Образец считали положительным, если в течение 20 минут или ранее образовались красные линии как в тестовой (Т), так и в контрольной (С) зонах.

Далее посевы инкубировали при температуре 41,5°С в течение 44±4 ч в микроаэрофильных условиях с целью обнаружения присутствия колоний, которые по своим характеристикам предположительно являются Campylobacter.

Микроскопию изолированных колоний проводили, используя окраску Фуксином Циля при разведении физиологическим раствором в соотношении 1:1 не более 10 мин. При наличии грамотрицательных множественных тонких коротких прямых, в форме «запятых», «галочек», а также длинных извитых палочек судили о наличии в образцах кампилобактерий.

Для дальнейшего подтверждения принадлежности характерных колоний к кампилобактериям отбирали не менее пяти колоний и пересевали их на чашки Петри с агаризованной средой таким образом, чтобы получить рост изолированных колоний. Посевы инкубировали при (37±1) °С в микроаэрофильных условиях в течение 24-48 ч.

Принадлежности характерных к кампилобактериям подтверждали при помощи времяпролетного масс-спектрометра MALDI Biotyper. Отбирали единичные похожие на кампилобактерии колонии. Нанесение колоний на мишень осуществляли с помощью одноразовой пластиковой петли диаметром 5 мм тонким слоем. В связи с высокой чувствительностью данного метода для прямого нанесения не требовалось большого количества испытуемого образца, для идентификации микроорганизмов весьма приемлемым было использование бактериальной массы 5 колоний кампилобактерий. Использовали одноразовые бактериологические петли с целью исключения перекрёстной контаминации сопутствующей микрофлорой.

После нанесения бактериальной массы ждали пока образец на мишени окончательно высохнет, после чего в течение 10 мин в каждую ячейку с образцом наносили по 1 мкл масс-спектрометрической матрицы НССА (a-циано-4-гидроксикоричная кислота, 99%), стараясь предотвратить перекрёстную контаминацию между образцами соседних ячеек, учитывая достаточно жидкое состояние матрицы. Затем подсушивали образцы с матрицей при комнатной температуре.

Исследуемые образцы на MALDI-мишень наносили следующим образом:

- с первой по третью ячейку каждого ряда вносили образцы, подготовленные методом прямого нанесения;

В отдельную ячейку вносили калибрант.

После помещения MALDI-мишени, используя программу Flex Control (получение спектров) осуществляли запуск оборудования и проводили идентификацию микроорганизмов. Для того, чтобы сократить время идентификации анализируемых образцов использовали автоматический режим. В программу компьютера вносили наименование исследуемых образцов и сопоставляли заданные варианты с полученными результатами.

Каждая строка таблицы соответствует одному анализируемому образцу. В каждой строке отображены № аналита, его ID, название микроорганизма и Score value (достоверность полученных результатов). Поля достоверности идентификации окрашены в соответствующие цвета: зелёный (+++) - высокая вероятность идентификации вида, зелёный (++) - гарантированная идентификация рода, жёлтый - (+) - возможная идентификация рода, красный (-) - отсутствие надёжной идентификации.

Полученные результаты были проанализированы с помощью программного обеспечения по величине логарифмического роста: в случае, если значение ниже 1.7 - микроорганизм не идентифицирован, от 1.7 до 2.0 - идентификация до рода, больше 2.0 - наиболее достоверные результаты, следовательно, микроорганизм идентифицирован.

ИХА-метод с применением тест-системы Singlepath Campylobacter; Merck (Германия) использовали в соответствии с МР «Методы выявления патогенных микроорганизмов с использованием хроматографических экспресс-тестов производства Merck (Германия)».

Для проверки резистентности штамма использовали метод серийных разведений (МУК 4.2.1890-04; VET01-A4 Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals, Approved Standard - Fourth Edition). В качестве питательной среды использовали бульон Мюллера-Хинтона с добавлением ионов кальция и магния.

Для приготовления инокулюма использовали суточную культуру исследуемого штамма Campylobacter jejuni (инкубированной при 37 °С). С поверхности чашек Петри брали 3 - 5 колоний и перемешивали в стерильном бульоне для получения мутности, эквивалентной 0,5 стандарта McFarland, что соответствует 1×10⁸ КОЕ/мл. Далее отрегулированный инокулюм, разводили в бульоне, чтобы получить окончательную концентрацию числа клеток 1×10⁶ КОЕ/мл, для этого перемещали 0,1 мл суспензии стандартизированного организма в пробирку, содержащую 9,9 мл бульона (разведение 1:100). Полученный инокулюм переносили в 96-ти луночные планшеты, в том же объеме, что и АБП (100 мкл). При этом конечная концентрация микроорганизмов равнялась 5×10⁵ КОЕ/мл.

После этого планшеты инкубировали при 37 °С в течение 24 часов. Учет результатов проводили визуально, сравнивая рост микроорганизма в присутствии АБП с ростом культуры в ячейке без АБП. За минимальную подавляющую концентрацию принимали концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста исследуемого штамма.

Контрольный штамм проявил выраженную устойчивость к доксициклину, азитромицину, гентамицину, ципрофлоксацину, уровень устойчивости расценивался как высокий.

Литературные источники

1. Šoprek S, Duvnjak S, Kompes G, Jurinović L, Tambić Andrašević A. Resistome Analysis of Campylobacter jejuni Strains Isolated from Human Stool and Primary Sterile Samples in Croatia. Microorganisms. 2022 Jul 13;10(7):1410. doi: 10.3390/microorganisms10071410. PMID: 35889129; PMCID: PMC9322926.

2. Santos-Ferreira N, Ferreira V, Teixeira P. Occurrence and Multidrug Resistance of Campylobacter in Chicken Meat from Different Production Systems. Foods. 2022 Jun 21;11(13):1827. doi: 10.3390/foods11131827. PMID: 35804643; PMCID: PMC9265442.

3. Linn KZ, Furuta M, Nakayama M, Masuda Y, Honjoh KI, Miyamoto T. Characterization and antimicrobial resistance of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolated from chicken and pork. Int J Food Microbiol. 2021 Dec 16;360:109440. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2021.109440. Epub 2021 Oct 16. PMID: 34673329.

4. Dmitry A. Makarov, Antimicrobial resistance of commensal Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium from food-producing animals in Russia / Dmitry A. Makarov, Olga E. Ivanova, Anastasia V. Pomazkova, Maria A. Egoreva, Olga V. Prasolova, Sergey V. Lenev, Maria A. Gergel, Nataliya K. Bukova, Sergey Yu. Karabanov // Veterinary World, 15(3): 611-621, DOI: 10.14202/vetworld.2022.611-621.

5. Прасолова О.В, Анализ полногеномной последовательности изолятов Campylobacters spp. с множественной лекарственной устойчивостью / Прасолова О.В., Тимофеева И.А., Иванова О.Е., Грицюк В.А. // Х юбилейная международная научно-практическая конференция «Молекулярная диагностика - 2021»: Сб. трудов / колл. авт. - Т. 2 - Тамбов: ООО фирма «Юлис, 2021. - С. 163.

6. Супотницкий М.В. Механизмы развития резистентности к антибиотикам у бактерий / М.В. Супотницкий // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. - 2011. - №. 2 (42). - С. 4-11.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм Campylobacter jejuni, выделенный из фекалий крупного рогатого скота, депонированный во «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» под номером ВКШМ-Б-897М. Штамм обладает фенотипической устойчивостью к доксициклину, азитромицину, гентамицину, ципрофлоксацину и содержит генетические детерминанты устойчивости к аминогликозидам (blaOXA-193) и фторхинолонам (gyrA p.T86I). 1 пр.

Штамм бактерий Campylobacter jejuni для микробиологических исследований, связанных с определением чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, депонированный во «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» под номером ВКШМ-Б-897М.