Способ предварительной идентификации нетуберкулезных микобактерий с использованием универсальной хромогенной среды Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 C12R1/01 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для предварительной идентификации нетуберкулезных микобактерий с использованием универсальной хромогенной среды.

Уровень техники

Культивирование нетуберкулезных микобактерий представляет сложную микробиологическую задачу в связи со значительным разнообразием данной группы микроорганизмов. Предлагаемые способы культивирования как правило основываются на культивировании по схемам работы с микобактериями туберкулезного комплекса.

Классификация, предложенная для предварительной идентификации нетуберкулезных микобактерий основана на скорости роста и способности к пигментообразованию при различных условиях и делит их на четыре группы: фотохромогенные, скотохромогенные, нефотохромогенные, быстрорастущие микобактерий [Runyon EH (1959) Anonymous mycobacteria in pulmonary disease. Med Clin North Am 43:273-290]. Данное разделение на группы широко используется в микробиологической практике, однако оно также основано на культуральных свойствах при культивировании на специализированных средах туберкулезных микобактерий и в некоторых случаях не позволяет четко разделить данные микроорганизмы по группам, из-за схожих сроков появления роста для некоторых быстро и медленнорастущих микобактерий, а также неспецифичных культуральных свойств, в частности сложности разделения фотохромогенных и нефотохромогенных в случае выделения культурой неярко выраженного пигмента бледно-желтого или бежевого цветов.

Использование сред с высоким содержанием белков (Левенштейна-Йенсена, Финн-2) не исключает роста на них других микроорганизмов из порядка Actinomycetales, даже в случае проведения предварительной деконтаминации. Культуральные свойства выросших микроорганизмов значительно затрудняют дальнейшую дифференциацию нетуберкулезных микобактерий от других кислотоустойчивых представителей порядка Actinomycetales, т.к. они могут давать схожие по морфологии колонии. Микроскопический метод для данных микроорганизмов также малоинформативен: среди нетуберкулезных микобактерий есть некислотоустойчивые штаммы, среди Nocardia spp., Gordonia spp.и других актиномицет широко распространены кислотоустойчивые штаммы [J.H. Jorgensen, М.А. Pfaller, Karen С.С. et al. Manual of clinical microbiology. 11th ed./ Washington, DC: ASM Press, cop.2015. 2 vol.]. Данный факт также значительно затрудняет предварительную идентификацию нетуберкулезных микобактерий.

В связи с вышеописанными особенностями необходим поиск новых способов предварительной идентификации нетуберкулезных микобактерий.

Известен способ предварительной идентификации нетуберкулезных микобактерий по скорости роста и условиям пигментообразования при культивировании на яичных средах [Runyon EH (1959) Anonymous mycobacteria in pulmonary disease. Med Clin North Am 43:273-290].

Недостатками данного способа является необходимость использования при первичной идентификации специальных сред для культивирования микобактерий туберкулезного комплекса, и, как следствие, отсутствие возможности идентификации данной группы микроорганизмов в условиях микробиологической лаборатории не профильной по работе с туберкулезными микобактериями. Данный способ не позволяет провести предварительную дифференциацию нетуберкулезных микобактерий от других кислотоустойчивых представителей порядка Actinomycetales.

Известны способы, описывающие возможность использования универсальных хромогенных сред для культивирования и выделения из первичного материала микроорганизмов, первоначально не заявленных производителем данных сред [Evaluation of the Chromogenic Medium (CPS) in the Isolation and Identification of Urinary Tract Pathogens, Reham Raafat, Reham Dwedar, Eman E1-Seidi. Egyptian Journal of Medical Microbiology Volume 24 / No. 2 /April 2015 29-34].

Известен способ посева клинического материала, представленного раневым отделяемым, для получения предварительных результатов идентификации, на плотные питательные среды, предназначенные для культивирования уропатогенов [Опыт применения микробиологических методов исследований при инфекционных осложнений тяжелых травм. С.А. Свистунов, А.А. Кузин, Т.Н. Суборова, Д.А. Жарков, Инфекция и иммунитет, Т.6, №4, 2016, с. 373-387].

Недостатками данного способа является отсутствие информации о возможности использования данного способа в отношении нетуберкулезных микобактерий.

Также описан способ культивирования бактерий рода Leptotrichia на поверхности пластинчатой среды «Уриселект», позволяющий проводить их предварительную идентификацию по культуральным свойствам [Патент на изобретение №2441908 RU, Способ культивирования бактерий рода Leptotrichia - резидентов микрофлоры полости рта]. Данный способ принимается за прототип.

Недостатком данного способа является отсутствие данных о возможностях предварительной идентификации нетуберкулезных микобактерий при культивировании на универсальных хромогенных средах.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа предварительной идентификации нетуберкулезных микобактерий с использованием универсальной хромогенной среды «Uriselect 4».

Это достигается тем, что в отличие от известных способов предварительной идентификации нетуберкулезных микобактерий чистая культура микроорганизмов, по культуральным свойствам и срокам роста соответствующая признакам, характерным для нетуберкулезных микобактерий, выросшая на плотных или жидких питательных средах, пересевается на плотную питательную среду «Uriselect 4» методом штрихов, с последующим культивированием до появления роста изолированных колоний.

Осуществление изобретения

Сущность предложенного способа заключается в следующем: чистая культура микроорганизмов, по культуральным свойствам и срокам роста соответствующая признакам, характерным для нетуберкулезных микобактерий, выросшая на плотных или жидких питательных средах, используемых для первичного выделения микобактерий из клинического материала, пересевается на плотную питательную среду «Uriselect 4» методом штрихов и инкубируется при температуре 28°С до появления роста изолированных колоний. После появления роста изолированных колоний производится описание их культуральных свойств: размер колоний, цвет, сроки появления роста, на основании которых проводится предварительная идентификация.

Предлагаемый способ позволяет провести предварительную идентификацию нетуберкулезных микобактерий по культуральным свойствам при культивировании на универсальной хромогенной среде «Uriselect 4». При этом фотохромогенные медленнорастущие нетуберкулезные микобактерий дают рост в виде точечных прозрачных колоний размером 1-2 мм в течение 7-14 дней; скотохромогенные медленнорастущие нетуберкулезные микобактерий дают рост в виде точечных колоний размером 1-2 мм желтого или оранжевого цвета в течение 7-14 дней; нефотохромогенные микобактерий дают рост в виде точечных желтоватых или кремовых колоний размером 1-2 мм в течение 7-28 дней; быстрорастущие нетуберкулезные микобактерий дают рост в виде крупных колоний до 5 мм различных оттенков синего цвета, не врастающих в среду, на 5-7 сутки культивирования. Рост других представителей порядка Actinomycetales характеризуется появлением колоний синего цвета на 2-7 сутки культивирования в виде R-колоний, врастающих в среду или отсутствие роста при заявленных в способе условиях.

Предлагаемый способ позволяет получить более точные данные о принадлежности выросших культур к фотохромогенным, скотохромогенным, нефотохромогенным медленнорастущим и быстрорастущим нетуберкулезным микобактериям.

Использование предлагаемого способа не требует применения дорогостоящего оборудования, позволяет получить данные предварительной идентификации в отношении наиболее распространенных видов нетуберкулезных микобактерий и провести их дифференциацию с другими кислотоустойчивыми представителями порядка Actinomycetales.

Предлагаемым способом было предварительно идентифицировано 331 штамм нетуберкулезных микобактерий следующих видов, первоначально выделенных из клинического материала на плотных и жидких питательных средах, используемых для первичного выделения микобактерий:

Для всех тестируемых штаммов были получены результаты предварительной идентификации по культуральным свойствам, описанные в предлагаемом способе.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Предложен способ предварительной идентификации нетуберкулезных микобактерий. Способ включает пересев чистой культуры нетуберкулезных микобактерий на плотную питательную среду «Uriselect 4» методом штрихов и инкубирование при 28°С до появления роста изолированных колоний. Затем проводят предварительную идентификацию нетуберкулезных микобактерий по культуральным свойствам: размеру колоний, цвету, срокам появления роста. Способ обеспечивает повышение точности дифференциации нетуберкулезных микобактерий.

Способ предварительной идентификации нетуберкулезных микобактерий с использованием универсальной хромогенной среды, характеризующийся тем, что чистая культура микроорганизмов, по культуральным свойствам и срокам роста соответствующая признакам, характерным для нетуберкулезных микобактерий, выросшая на плотных или жидких питательных средах, используемых для первичного выделения микобактерий из клинического материала, пересевается на плотную питательную среду «Uriselect 4» методом штрихов и инкубируется при температуре 28°С до появления роста изолированных колоний с последующим описанием культуральных свойств, при этом фотохромогенные медленнорастущие нетуберкулезные микобактерии дают рост в виде точечных прозрачных колоний размером 1-2 мм в течение 7-14 дней; скотохромогенные медленнорастущие нетуберкулезные микобактерии дают рост в виде точечных колоний размером 1-2 мм желтого или оранжевого цвета в течение 7-14 дней; нефотохромогенные микобактерии дают рост в виде точечных желтоватых или кремовых колоний размером 1-2 мм в течение 7-28 дней; быстрорастущие нетуберкулезные микобактерии дают рост в виде крупных колоний до 5 мм различных оттенков синего цвета, не врастающих в среду, на 5-7 сутки культивирования.