СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МЕДЛЕННОРАСТУЩИХ МИКОБАКТЕРИЙ Российский патент 1998 года по МПК A61K39/04 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/32 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано, в частности, для культивирования медленнорастущих микобактерий и совершенствования бактериологической диагностики туберкулеза.

Из практики фтизиатрии известен способ культивирования микобактерий из патологического материала от больных туберкулезом на плотных яичных средах, чаще на среде Левенштейна-Йенсена (Драбкина Р.О. Микробиология туберкулеза, М.: Медгиз, 1963, с. 94-99). Микобактерии туберкулеза растут на искусственных средах медленно, и видимый рост появляется после 4-10 недель инкубирования в термостате. Известный способ не позволяет получить большого количества биомассы микроорганизмов, ингредиенты, входящие в состав среды Левенштейна-Йенсена являются дорогостоящими.

Известен также способ "Метод глубинного посева на кровяную среду" (Справочник фтизиатра, под ред. Н.А. Шмелева, М.: Медицина, 1975, с. 90-91), основанный на использовании среды Школьниковой с добавлением цитратной крови, лошадиной сыворотки, 5-ной фракции бычьего сывороточного альбумина. Максимальный рост микобактерий туберкулеза на подобной жидкой среде отмечается на 15-20 сутки.

К существенным недостаткам этого способа относятся следующие очень низкая эффективность посева для микобактерий туберкулеза и других видов микобактерий, выделенных из инфицированных тканей и окружающей среды, а также осуществление известного способа требует применения дорогостоящих добавок.

Эти способы приняты в качестве аналогов для предлагаемого способа культивирования микобактерий in vitro.

Наиболее близким предлагаемому является способ культивирования микобактерий на жидкой, синтетической среде Сотона [1], пригодной, в основном, для культивирования вакцинного штамма BCG и лабораторных штаммов микобактерий. Однако известный способ имеет следующие недостатки:
- рост микобактерий с ограниченным выходом биомассы;
- отсутствие роста при посеве патологического материала от больных туберкулезом;
- длительный срок выращивания.

Целью изобретения является увеличение выхода жизнеспособных микобактерий и ускорение их роста при культивировании in vitro.

Поставленная цель достигается тем, что для выращивания микобактерий используют жидкую среду, состоящую из среды Сотона и катодной фракции электрохимически активированной солевой композиции.

Отличительной особенностью предлагаемого способа является использование катодной фракции электрохимически активированной солевой композиции как компонента жидкой питательной среды для культивирования медленнорастущих микобактерий.

Как известно, медленнорастущие микобактерии нуждаются для своего роста in vitro в средах, содержащих большое количество минеральных веществ и органических компонентов. В частности, микобактерии туберкулеза, выделенные непосредственно из патологического материала, нередко характеризующиеся сниженной жизнеспособностью, а после назначения больному химиотерапии вообще не способны культивироваться на стандартных средах, что в значительной степени осложняет бактериологическую диагностику туберкулеза.

В то же время в последнее десятилетие появились сообщения об использовании анодной и катодной фракций электрохимически активированных растворов в различных областях биологии и медицины. Установлено, что катодная (щелочная) фракция способствует регенерации тканей, стимулируя метаболические процессы в биологических объектах. Щелочная фракция электрохимически активированной воды успешно применялась для сохранения клеток некоторых видов микроорганизмов. Разработан новый способ культивирования микобактерий на основе использования катодной фракции электрохимически активированной солевой композиции, которая представляет собой среду Сотона без добавления глицерина, обработанную в реакторе погружного типа. Катодная фракция добавляется в среду Сотона и в этой системе осуществляется культивирование микобактерий. Для определения величин популяции и подсчета живых микроорганизмов на 3, 5, 7 и 9 сутки содержимое испытуемых пробирок переносится на плотную яичную среду Левенштейна-Йенсена.

При культивировании микобактерий предлагаемым способом достигается увеличение выхода жизнеспособных микобактерий, что установлено подсчетом количества колониеобразующих единиц на среде Левенштейна-Йенсена, а в части случаев микобактерии размножаются только при культивировании предлагаемым способом. Кроме того, предлагаемым способом достигается ускорение роста микобактерий, что проявляется появлением в более ранние сроки (на 6-10 сутки) поверхностной пленки и придонного осадка по сравнению с прототипом.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Для культивирования микобактерий использовалась жидкая среда, состоящая из 95% среды Сотона и 5% катодной фракции электрохимически активированной солевой композиции, а также из 25% среды Сотона и 75% катодной фракции электрохимически активированной солевой композиции.

Состав солевой композиции мас,%:
Двузамещенный фосфорнокислый калий - 0,05
Сернокислый магний - 0,05
Лимонная кислота - 0,2
Лимоннокислое аммиачное железо - 0,005
L-аспарагин - 0,4.

Перед соединением с жидкой средой Сотона солевая композиция подвергалась электрохимической обработке в реакторе погружного типа, который представляет собой электролизер с графитными электродами и источником постоянного тока, позволяющим создать плотность тока 5000 Ам/м² графитного электрода. Полученную катодную фракцию стерилизовали автоклавированием при 0,5 атм в течение 15 мин. В качестве контроля использовали стандартную среду Сотона.

Объектом исследования служили: M. avium, музейный штамм; 3 штамма M.tuberculosis, выделенные от больных туберкулезом легких (N 1-3); M.lufu - неклассифицированная микобактерия, выделенная из почвы в Заире;
M. 01 и M.011 - неклассифицированные растущие штаммы микобактерий, выделенные из лепром больных лепрой.

Преимущества способа, сущность которого изложена выше, иллюстрируется табл. 1, где представлены результаты культивирования пяти видов медленнорастущих микобактерий в течение 7 суток на предлагаемой среде, содержащей 75% электрохимически активированной катодной фракции солевой композиции, и на среде Сотона (контроль).

Из табл. 1 видно, что по сравнению с прототипом применение предлагаемого способа позволяет получить на 7 день увеличение выхода жизнеспособных M.lufu на один порядок, M.Ol - на 5 порядков, M.tuberculosis (1) - на три порядка, а при культивировании M.tuberculosis (3) и M.avium рост отмечается только на предлагаемой нами среде с добавлением 75% катодной фракции электрохимически активированной солевой композиции. На стандартной среде Сотона M.tuberculosis (3) и M.avium теряли способность к размножению.

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию в лаборатории микробиологии НИИ по изучению лепры Минздравмедпрома РФ в течение 1992-1994 гг. на 7 штаммах микобактерий при многократных пересевах. Ниже приводятся результаты апробации способа применительно к изученным видам микобактерий.

Пример 1. Материалом для посева служили три штамма микобактерий, выделенные от больных туберкулезом легких. Все культуры микобактерий перед посевом разводили по стандарту мутности до 10^o микробных тел/мл и вносили 0,2 мл на 2 мл испытуемой среды. На 3, 5, 7 и 9 сутки по 1 мл из каждой пробирки с жидкой испытуемой среды переносили на плотную среду Левенштейна-Йенсена (после того, как брали материал для пересева пробирка уже не использовалась). Результаты оценивались по количеству колоний, выросших на плотной среде. При необходимости в случае обильного роста микобактерий, перед посевом на плотную питательную среду содержащие микобактерии пробы из испытуемых сред предварительно разводили в 10 раз, потом еще в 10 раз и т.д.

Полученные данные представлены в табл. 2, 3, 4.

Таким образом, добавление к среде Сотона катодной фракции электрохимически активированной солевой композиции приводит к достоверному увеличению выхода жизнеспособных M.tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом легких. Наиболее интенсивное размножение штаммов на испытуемых средах наблюдалось на 7-9 сутки, причем к этому времени количество живых микобактерий на средах с добавлением катодной фракции на 2-4 порядка было больше, чем в контроле, рост штамма от больного (3) отмечался только на предложенных средах. Появление видимого придонного роста микобактерий от больных (1) и (2) наблюдалось на 6 сутки инкубации в средах, содержащих катодную фракцию, в то время как штаммы от больных (3) и (1) на контрольной среде практически не демонстрировали придонного роста. Достоверной разницы в количестве микробов, выращенных на средах 5% или 75% катодной фракции, не отмечено.

Пример 2. Производили культивирование музейного штамма M.avium, характеризовавшегося крайне медленным ростом и низкой эффективностью посева in vitro. Подготовка данного штамма, его культивирование и подсчет результатов опыта (табл. 5) осуществлись аналогично примеру 1.

Таким образом, испытание предложенного способа показало, что при полном отсутствии роста на стандартной среде Сотона возможно размножение микобактерий на средах с добавлением катодной фракции электрохимически активированной солевой композиции.

Пример 3. Предлагаемый способ применялся также для культивирования M.lufu, M.01 и M.011. Указанные штаммы поддерживались в лаборатории института в течение 10-18 месяцев путем пересевов на плотной среде Левенштейна-Йенсена и характеризовались обильным ростом на этой среде. В табл. 6, 7 и 8 представлены результаты выращивания этих штаммов микобактерий.

Таким образом, и все три обычно размножающихся тест-штамма микобактерий показали значительное преобладание выхода жизнеспособных клеток в случае применения предлагаемого способа культивирования по сравнению с прототипом. На 7-9 сутки количество колониеобразующих единиц этих микобактерий на средах с катодной фракцией было на 1-5 порядков выше, чем на стандартной среде Сотона. M. lufu на среде 5% катодной фракции и M.011 с 75% катодной фракции уже на 4 сутки культивирования давали видимый придонный рост в пробирке, в то время как на стандартной среде Сотона видимый рост M.lufu появлялся на 6 сутки, а рост M. 01 и M011 был едва заметным даже на 9 сутки. Для M.lufu отмечена тенденция большей стимуляции размножения микробных клеток на среде с 5% катодной фракции, по сравнению со средой, содержащей 75% катодной фракции (P<0,05).

Предлагаемым способом достигается увеличение количества жизнеспособных микобактерий по сравнению с прототипом на 2-4 порядка и позволяет получить рост некоторых штаммов микобактерий при отсутствии его на стандартной среде Сотона. Предлагаемым способом достигается также ускорение роста микобактерий на 2-3 суток по сравнению с прототипом. Осуществление предлагаемого способа не требует добавления в среду культивирования дорогостоящих белковых препаратов (плазмы, белковые фракции), которые используются при осуществлении известного способа.

Предлагаемый способ может быть использован для получения больших количеств биомассы, необходимой для наработки вакцинных и диагностических биопрепаратов из микобактерий, а также для совершенствования культуральной диагностики туберкулеза и разработки тестов для определения чувствительности микроорганизмов к лекарственным препаратам, что позволяет осуществлять коррекцию индивидуальной этиотропной терапии туберкулеза и других микобактериозов.

Предлагаемый способ может быть рекомендован в микробиологические лаборатории и противотуберкулезные учреждения системы здравоохранения страны.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для культивирования медленнорастущих микобактерий. Для выращивания микобактерий используют жидкую среду, состоящую из среды Сотона и катодной фракции электрохимически активированной солевой композиции среды Сотона. Способ увеличивает выход жизнеспособных микобактерий и ускоряет их рост при культивировании in vitro. 8 табл.

Способ культивирования медленнорастущих микобактерий, включающий выращивание микобактерий на жидкой синтетической среде Сотона, отличающийся тем, что в среду Сотона добавляют катодную фракцию электрохимически активированной солевой композиции среды Сотона.