Способ выявления микобактерий туберкулеза Советский патент 1990 года по МПК C12Q1/02 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к лабораторной диагностике туберкулеза животных, и может быть использовано в медицинских и ветеринарных бактериологических лабораториях для обнаружения возбудителя туберкулеза и выделения культуры в чистом виде,

Цель изобретения - ускорение и упрощение способа.

Пример 1. Исследуемый патологический материал измельчают ножницами и тщательно растирают фарфоровым пестиком со стерильным песком в стерильной фарфоровой ступке8 добавляя к нему (в равном объеме) используемую жидкую минеральную или элективную питательную среду. Растертый патологический материал фильтруют

через двойной слой стерильной марли в стеклянную коническую колбу (емкостью 50,0 мл) в объеме 5 ил и добавляют равный объем этой же стерильной жидкой питательной среды. Затем проводят обогащение микобактериями туберкулеза исследуемых патологических материалов флотацией с помощью парафина, который используют одним из приведенных способов.

Первый способ. К полученной смеси питательной среды и исследуемого патологического материала пастеровской пипеткой с баллончиком добавляют по 20-30 капель расплавленного до 50- 55°С стерильного парафина, которые, застывая на поверхности смеси, образуют парафиновые диски до 0,5 см, изолированно расположенные один отСПСИ

ЬяД &

.«А,

носительно другого на поверхности смеси.

Второй способ. Готовят по прописи минеральную или элективную жидкую питательную среду, разливают ее по 5 мл в стерильные стеклянные колбыч (емкостью 50,0 мл) и в каждую добавляют кусочек парафина (величиной с горошину), затем среду стерилизуют в автоклаве при 1 атм 20 мин, после остывания которой при комнатной температуре поверхность среды покрыта тонким прозрачным слоем парафина в виде сплошной пленки, под которую добавляют равное количество (5 мл) суспензии растертого в этой же среде стерильной средой исследуемого патологического материала.

После посева патологического материала одним из способов колбу закрывают стерильной ватно-марлевой пробкой и оставляют при комнатной температуре на 60-90 мин для флотации микобактерий туберкулеза парафином (дисками или пленкой) из суспензии исследуемого патологического материала, находящегося в колбе. По

.истечении указанного срока из колбы бактериологической петлей снимают 1парафиновых диска или кусочек пленки парафина переносят на стерильное предметное стекло и производят легко втирание, для чего несколько раз проводят нижней поверхностью диска по предметному стеклу или бактериологической петлей соскабливают Микобактерий туберкулеза с нижней поверхности парафинового диска или пленки и готовят мазок, его подсушивают, фиксируют над пламенем горелки, окрашивают по Цилю-Нильсену, микроскопирую и изучают морфологию микобактерий до инкубирования. Независимо от результатов микроскопии колбу с парафиновыми дисками или пленкой ставят в термостат при 37,5-38,5°С для выращивания микобактерий и ежедневно проверя. ют .появление первичного роста микобактерий туберкулеза, для чего наблюдают за формированием колоний, который независимо от вида микобактерий легко обнаруживаются невооружен- ным глазом на нижней поверхности и краях парафиновых дисков или пленки в течение 1 - 3 - 7 - 10 дней в виде мелких, круглых от бледно-желтого до грязно-серого цвета изолированных колоний, обильно покрывающих нижнюю

5

0

5

0

5

0

5

0

5

поверхность парафиновых дисков или пленки. В этот период нижняя поверхность парафиновых дисков или пленки как бы посыпана манной крупой. К 3 - 5 - 7 - 10 дню (срок зависит от уровня микобактериальной обсемейности используемых патологических материалов) инкубировайия колоний микобактерий увеличиваются в размерах и покрывают нижнюю поверхность дисков или пленки сплошным налетом, а по краям дисков или пленки образуют сплошной ободок, выступающий на поверхности дисков или пленки. В эти же сроки формируется между дисками вначале прозрачная пленка, хорошо обнаруживаемая и не разбивающаяся при легком встряхивании колбы, при этом все диски, объединены ею и представляют монолитную массу, полностью покрывающую поверхность питательной среды в колбе.

В мазках, изготовленных с дисков или кусочков пленки парафина и окрашенных по Цилю-Нильсену, микобактерий туберкулеза в этот период физиологически молоды, хороша и равномерно окрашиваются, имеют типичную морфологию.В мазках, изготовленных из прозрачной пленки, микобактерий мелкие, имеют коккообразную форму, окрашиваются равномерно.

К 5-Ю дню пленка между дисками становится стеориноподобной, морщинистой, хорошо различимой, а позднее - мощной, выступающей над поверхностью дисков, окраска ее идентична цвету колоний на диске. На парафиновых дисках или пленке парафина в эти сроки накапливается значительное количество бактериальной массы и виде толстого слоя. На мазках, изготовленных с дисков и пленки парафина и окрашенных по Цилю-Нильсену, микобактерий имеют типичную морфологию, хорошо окрашиваются.

Такая последовательность характера роста типична для всех видов микобактерий, при этом скорость появления первичного роста и количество накапливающейся на парафиновой пленке или дисках бактериальной массы прямо пропорциональны уровню обсемененности исследуемых патологических материалов микобактериями туберкулеза. Кроме того, у быстрорастущих вариантов первичный рост на парафиновых дисках или пленке появляется к 1 - 2 дню

31

инкубирования, а прозрачная пленка между ними - к 1 - 3 дню, у медленнорастущих, вариантов микобактерий первичный рост и прозрачная пленка между ними появляются к 5 - 7 дню.

Предварительный результат по индикации различных видов микобактерий получают через 60-90 мин после внесения парафиновых дисков в жидкую питательную среду, зараженную патологическим материалом, или после посева патологического материала под пленку парафина путем микроскопии мазков, изготовленных соскабливанием флотированных микобактерий с нижней поверхности парафиновых дисков или пленки. Окончательный результат индикации микобактерий туберкулеза можно получить через 1-3-5-7 дней, при низкой обсемененности инфицированных патологических материалов - к 10 - 12 дню путем обнаружения характерного первичного роста микобактерий} инкубируемых на парафиновых пленке и дисках в жидкой минеральной или элективной питательной среде, и микроскопии окрашенных по Циль-Нильсену мазков, изготовленных соскабливанием, или пленки.

Пример 2„ Для получения значительного количества массы микобактерий туберкулеза проводят пересев на 3 - 5 пробирок со средой Левен- штейна-Иенсена путем втирания нижней поверхностью парафиновых дисков или кусочков пленки. Обильное накопление биомассы наблюдают через 18-24 ч.

Пример 3. Для интенсивного накопления и длительного хранения бактериальной массы различных видов микобактерий в колбу после появления характерного роста их на парафиновых дисках (через 3-5 дней) добавляют 10 - 20 мл стерильной элективной жидкой питательной среды, которую каждый 2-3 мес. заменяют, доливая свежей в том же объеме, предварительно удаляя старую.

Пример 4. Для выяснения способности микобактерий к пигментооб- разованию суспензии исследуемого патологического материала, полученную растиранием его в ступке, разливают по 5 мл сразу в две стерильные колбы емкостью 50 мл, в которые доливают в равном объеме (.5 мл) жидкую элективную питательную среду. К этой смеси пастеровской пипеткой с баллончиком

57166

добавляют расплавленного до 50-56 С

парафина по 30-40 капель в каждую ; колбу, которые застывают на их поверхности в виде дисков Р до 0,5 см. Колбы закрывают стерильными пробками и на одной из них надписывают

10

30

40

45

50

свет, на другой - темнота, последнюю заворачивают в темную бумагу,

обе колбы ставят в термостат при о/

37,5-38,5 С. Если после инкубации в. течение 1 - 3 - 5 - 7 дней в обеих колбах на парафиновых дисках будут обнаружены колонии микобактерий с

. г оранжевой окраской независимо от действия света, то это скотохромогенная культура микобактерий, если же после такого срока инкубирования обе колбы содержат колонии микобактерий с

20 различной окраской (в колбе свет - желтоватая культура, в колбе темнота - кремовая), то последнюю колбу без черной бумаги нужно поставить на солнечный свет и цвет колоний че25 рез 2-3 дня приобретет желтую окраску 5 т.е. если пигментация колоний на дисках появляется только под действием света, то это фотохромогенная культура микобактерий.

Определение способности микобактерий к пигментообразованию позволяет сократить срок дифференциации микобактерий этим тестом в 3-4 раза за счет упрощения приемов исследований, так как исключает длительное раздель35 ное выделение микобактерий из патологических материалов, затем их культивирование в субкультурах на элективных твердых, яичных средах ддя накопления бактериальной массы,дополнительного пересева на эти же яичные среды для изучения способности к пигментообразованию. Формула изобретения

Способ выявления микобактерий туберкулеза, включающий гомогенизацию исследуемого материала, внесение парафина, посев в жидкую питательную среду, инкубирование с последующим выделением чистой культуры,о т-

целью ускорения и упрощения способа, непосредственно после гомогенизации добавляют питательную среду, после чего вносят расплавленный твердый парафин, инкубированию подвергают полученную смесь, а выделение чистоЯ культуры осуществляют из застывшего парафинового слоя,,

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к лабораторной диагностике туберкулеза животных, и может быть использовано в медицинских и ветеринарных бактериологических лабораториях для обнаружения возбудителя туберкулеза и выделения культуры в чистом виде. Целью изобретения является ускорение и упрощение способа. Для этого различные патологические материалы подвергают одновременному обогащению флотацией микобактериями туберкулеза парафином (дисками или пленкой) и последующему культивированию микобактериями до получения культуры в чистом виде на поверхности жидкой питательной среды. Дифференциацию туберкулезных микобактерий от нетуберкулезных осуществляют по способности к пигментообразованию и по скорости появления характерного первичного роста на парафиновых дисках и пленке в жидких питательных средах и в субкультурах на яичных питательных средах.