Способ одновременного определения степеней окисления и алкилирования азоксимера бромида - действующего вещества полиоксидония - методом C спектроскопии ЯМР Российский патент 2020 года по МПК G01N24/08 

Изобретение относится к области контроля качества лекарственных средств и может быть использовано для идентификации фармацевтической субстанции «Полиоксидоний» (подтверждения наличия основных структурных фрагментов и определения их молярных долей - степеней окисления и алкилирования) и лекарственных форм на ее основе.

Полиоксидоний применяется как иммуномодулятор и детоксикант, а также как иммуностимулирующий и пролонгирующий носитель фармакологически активных соединений [1-8]. Фармацевтическая субстанция «Полиоксидоний» представляет собой смесь действующего вещества (азоксимера бромида) и вспомогательных веществ (маннитола и повидона К17). Лекарственные формы полиоксидония могут содержать дополнительные вспомогательные вещества, например, таблетки полиоксидония - лактозы моногидрат, крахмал картофельный, стеариновую кислоту; суппозитории вагинальные и ректальные - масло какао.

Азоксимера бромид по своему строению представляет собой сополимер N-оксида 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиметил)-1,4-этиленпиперазиний бромида (Фиг. 1). Доли (N-карбоксиметил)-1,4-этиленпиперазиния (степень алкилирования, q) и N-оксида 1,4-этиленпиперазина (степень окисления, z) в сополимерной цепи азоксимера бромида являются структурными параметрами, характеризующими его состав, и определяют свойства препарата в целом (эффективность воздействия, токсичность и безопасность применения) [6, 7]. Интервал величин q и z в полиоксидоний составляет 0,2-0,4 и 0,4-0,8 соответственно [8].

Известны способы определения степени окисления азоксимера бромида методом хромометрического титрования и степени алкилирования азоксимера бромида методом инфракрасной спектроскопии (полоса 1735 см^-1) [1]. Недостатками указанных способов является то, что:

- они применимы к изолированному азоксимера бромиду, а не к смеси азоксимера бромида с маннитолом и повидоном К17;

- они применимы к оценке только одного из двух структурных параметров (степени окисления или степени алкилирования);

- отсутствует описание методик определения степеней окисления и алкилирования в рамках этих способов в литературе.

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является способ определения степеней окисления и алкилирования методом ¹Н спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) по отношению интегральных интенсивностей сигналов спектра азоксимера бромида в области 2,5-4,5 м.д. [1].

Недостатком данного способа является его неприменимость к смеси азоксимера бромида с маннитолом и повидоном К17, так как в спектре ¹Н фармацевтической субстанции «Полиоксидоний» перекрываются сигналы основного и вспомогательных веществ. Повидон К17 не отделяется от азоксимера бромида ни экстракцией с использованием различных растворителей, ни ультрафильтрацией. Кроме того, в литературе отсутствует описание методик определения степеней окисления и алкилирования методом ¹Н спектроскопии ЯМР.

Техническим результатом изобретения является одновременное определение степеней окисления и алкилирования азоксимера бромида в присутствии маннитола и повидона К17 в фармацевтической субстанции «Полиоксидоний» и лекарственных формах на ее основе без использования стандартных образцов.

Достижение технического результата обеспечивается благодаря такому техническому решению, как использование ядра ¹³С, что приводит к сужению областей перекрывания сигналов действующего и вспомогательного веществ полиоксидония и упрощению процедуры расшифровки спектральных данных.

Сущность заявляемого способа заключается в соотнесении сигналов спектра ¹³С полиоксидония конкретным метиленовым группам N-оксида 1,4-этиленпиперазина (А) и (N-карбоксиметил)-1,4-этиленпиперазиния (В), выявлении характеристических сигналов А и В и измерении значений их нормированных интегральных интенсивностей. Значения величин z (степень окисления) и q (степень алкилирования) равны величинам нормированных интегральных интенсивностей сигналов одинакового числа метиленовых групп А и В. В качестве эталона для калибровки шкалы химических сдвигов используется сигнал метиленовой группы маннитола (δ=63,18 м.д.).

В заявляемом изобретении способ одновременного определения степеней окисления и алкилирования азоксимера бромида - действующего вещества полиоксидония - методом ¹³С спектроскопии ЯМР реализуется следующим образом.

Пробоподготовка

Зависит от типа лекарственной формы исследуемого образца и заключается в получении раствора азоксимера бромида в дейтерированной воде. При этом вспомогательные вещества фармацевтической субстанции «Полиоксидоний» (маннитол, повидон К17) также переходят в раствор.

Параметры эксперимента

Регистрация спектров проводится на спектрометре ЯМР Agilent DD2 NMR System 600 с 5-мм мультиядерным датчиком, оснащенным градиентной катушкой или на аналогичном спектрометре ЯМР с рабочей частотой по протонам не менее 500 МГц.

Температура - 27°С, ширина спектра - 200 м.д., угол поворота намагниченности - 45°, время релаксации - 1 с, количество накоплений сигнала свободной индукции - 10000, число точек аналого-цифрового преобразования - 64к, экспоненциальное умножение - 3,0 Гц, автоматическая коррекция базовой линии спектра, ручная настройка фазы.

Учет результатов

1) Фиксируют сигналы структурных компонентов основного и вспомогательных веществ:

N-оксид 1,4-этиленпиперазин (Фиг. 2):

^l3C(D₂O), δ, м.д.: 67,3-64,6 (1С, N⁺-CH₂), 64,6-63,3 (1С, N⁺-CH₂), 59,1-58,3 (1С, N⁺-CH₂), 52,2-51,6 (1С, N-CH₂), 49,9-48,9 (1С, N-CH₂), 47,2-46,0 (1С, N-CH₂).

(N-карбоксиметил)-1,4-этиленпиперазиния бромид (Фиг. 2):

¹³C(D₂O), δ, м.д.: 168,8-167,7 (1С, СО), 62,9-61,9 (1С, СН₂-СО), 59,8-59,1 (2С, N⁺-CH₂), 54,4-52,9 (1С, N⁺-CH₂), 52,9-52,2 (1С, N-CH₂), 51,6-50,5 (2С, N-CH₂).

Маннитол (Фиг. 2):

¹³C(D₂O), δ, м.д.: 70,77 (2С, 2СН), 69,19 (2С, 2СН), 63,18 (2С, 2СН₂).

Повидон К17 (Фиг. 2):

¹³C(D₂O), δ, м.д.: 178,2-176,9 (1С, СО), 46,0-44,0 (1С, N-CH₂), 43,4-41,2 (1С, N-CH), 36,2-32,0 (1С, СН₂ ацикл.), 31,9-30,5 (1С, O=С-СН₂), 18,0-16,7 (1С, СН₂ цикл.).

2) Выявляют характеристические сигналы азоксимера бромида: синглетные сигналы в областях 59,0-58,3 и 47,1-46,2 м.д. (две метиленовые группы мономерного звена А) и синглетный сигнал в области 59,8-59,0 м.д. (две метиленовые группы пиперазинового цикла мономерного звена В) и измеряют значения их нормированных интегральных интенсивностей.

3) Величину степени окисления (z) приравнивают к измеренной сумме значений нормированных интегральных интенсивностей синглетных сигналов в областях 59,0-58,3 и 47,1-46,2 м.д.

4) Величину степени алкилирования (q) приравнивают к измеренному значению нормированной интегральной интенсивности синглетного сигнала в области 59,8-59,0 м.д.

Существенными отличительными признаками заявляемого изобретения являются:

1) Одновременное определение степеней окисления и алкилирования в азоксимера бромиде без его предварительного выделения из смеси с маннитолом и повидоном К17.

2) Возможность идентификации полиоксидония без использования стандартных образцов.

3) Повышение точности количественных измерений z и q за счет ликвидации неопределенности измерения, связанной с перекрыванием сигналов сополимерных звеньев и вспомогательных веществ.

4) Возможность определения степеней окисления и алкилирования в азоксимера бромиде во всех существующих лекарственных формах полиоксидония.

Краткое описание чертежей и иных материалов (Приложения 1-6):

Фиг. 1. Структурная формула азоксимера бромида.

Фиг. 2. ¹³C спектр субстанции-раствора «Полиоксидоний».

Фиг. 3. Фрагмент ¹³C спектра субстанции-раствора «Полиоксидоний» с нормированными интергальными интенсивностями характеристических сигналов N-оксида 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиметил)-1,4-этиленпиперазиния бромида.

Фиг. 4. Фрагмент ¹³C спектра лиофилизата «Полиоксидоний» с нормированными интергальными интенсивностями характеристических сигналов N-оксида 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиметил)-1,4-этиленпиперазиния бромида.

Фиг. 5. Фрагмент ¹³C спектра таблеток «Полиоксидоний» с нормированными интергальными интенсивностями характеристических сигналов N-оксида 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиметил)-1,4-этиленпиперазиния бромида.

Фиг. 6. Фрагмент ¹³C спектра суппозиториев «Полиоксидоний» с нормированными интергальными интенсивностями характеристических сигналов N-оксида 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиметил)-1,4-этиленпиперазиния бромида.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. Определение степеней окисления и алкилирования азоксимера бромида в субстанции-растворе «Полиоксидоний».

Пробоподготовка

К 500 мкл субстанции добавляют 150 мкл дейтерированной воды (D₂O). Раствор используют для получения спектра ¹³C.

Параметры эксперимента соответствуют описанию изобретения

Учет результатов

Измеряют значения нормированных интегральных интенсивностей синглетных сигналов в областях 59,0-58,3 и 47,1-46,2 м.д. и суммируют их. Значение суммы соответствует величине z (Фиг. 3).

z=0,39+0,39=0,78

Измеренное значение нормированной интегральной интенсивности синглетного сигнала в области 59,8-59,0 м.д. соответствует величине q (Фиг. 3).

q=0,22

Значения величин z и q соответствуют представленным в литературе [1, 8].

Пример 2. Определение степеней окисления и алкилирования азоксимера бромида в лиофилизате для приготовления лекарственных форм и вакцин «Полиоксидоний».

Пробоподготовка

25 мг испытуемого образца (точная навеска не обязательна) растворяют в 0,5 мл D₂O. Раствор используют для получения спектра ¹³C.

Параметры эксперимента соответствуют описанию изобретения

Учет результатов

Измеряют значения нормированных интегральных интенсивностей синглетных сигналов в областях 59,0-58,3 и 47,1-46,2 м.д. и суммируют их. Значение суммы соответствует величине z (Фиг. 4).

z=0,40+0,40=0,80

Измеренное значение нормированной интегральной интенсивности синглетного сигнала в области 59,8-59,0 м.д. соответствует величине q (Фиг. 4).

q=0,20

Значения величин z и q соответствуют представленным в литературе [1, 8].

Пример 3. Определение степеней окисления и алкилирования азоксимера бромида в таблетках «Полиоксидоний».

Пробоподготовка

48 мг испытуемого образца (4 таблетки по 12 мг) растирают до порошкообразного состояния, добавляют 1,2 мл D₂O и интенсивно встряхивают в течение 10 мин. Полученную суспензию фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Фильтрат используют для получения спектра ¹³C.

Параметры эксперимента соответствуют описанию изобретения

Учет результатов

Измеряют значения нормированных интегральных интенсивностей синглетных сигналов в областях 59,0-58,3 и 47,1-46,2 м.д. и суммируют их. Значение суммы соответствует величине z (Фиг. 5).

z=0,40+0,40=0,80

Измеренное значение нормированной интегральной интенсивности синглетного сигнала в области 59,8-59,0 м.д. соответствует величине q (Фиг. 5).

q=0,20

Значения величин z и q соответствуют представленным в литературе [1, 8].

Пример 4. Определение степеней окисления и алкилирования азоксимера бромида в суппозиториях вагинальных и ректальных «Полиоксидоний».

Пробоподготовка

Один суппозиторий помещают в коническую колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл воды, расплавляют на кипящей водяной бане в течение 5 мин при умеренном встряхивании. Смесь охлаждают до комнатной температуры, затем центрифугируют при 3000 об/мин и температуре 7°С в течение 20 мин. Водный экстракт фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, затем лиофилизируют. Лиофилизаты от четырех суппозиториев объединяют и растворяют в 0,5 мл D₂O. Раствор используют для получения спектра ¹³C.

Параметры эксперимента соответствуют описанию изобретения

Учет результатов

Измеряют значения нормированных интегральных интенсивностей синглетных сигналов в областях 59,0-58,3 и 47,1-46,2 м.д. и суммируют их. Значение суммы соответствует величине z (Фиг. 6).

z=0,40+0,40=0,80

Измеренное значение нормированной интегральной интенсивности синглетного сигнала в области 59,8-59,0 м.д. соответствует величине q (Фиг. 6).

q=0,20

Значения величин z и q соответствуют представленным в литературе [1, 8].

Представленные примеры не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения и служат только для цели иллюстрации.

Список литературы

1. Патент РФ 2073031 (1997).

2. Некрасов А.В., Пучкова Н.Г., Иванова А.С.Иммунология, 2000, 5; 19-23.

3. Dambaeva S.V., Mazurov D.V., Golubeva N.M. et al. Centr Eur J Immunol, 2003, 28(2), 127-33.

4. Dyakonova V.A., Dambaeva S.V., Pinegin B.V. et al. Intern Immunopharmacol, 2004, 4, 1623-1631.

5. Караулов A.B., Самойлова H.M., Кокушков Д.Б. Иммунология, 2007, №2, 93-95.

6. Булгакова В.А. Терапевтический архив, 2014, 12, 92-97.

7. Полиоксидоний в клинической практике. Под ред. А.В. Караулова. М: ГЭОТАР-Медиа, 2008; 135 с.

8. Патент РФ 2112542 (1998).

Использование: для одновременного определения степеней окисления и алкилирования азоксимера бромида. Сущность изобретения заключается в том, что, используя метод ¹³С спектроскопии ЯМР, соотносят сигналы спектра ¹³С полиоксидония конкретным метиленовым группам N-оксида 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиметил)-1,4-этиленпиперазиния, выявляют их характеристические сигналы и измеряют значения нормированных интегральных интенсивностей характеристических сигналов одинакового числа метиленовых групп N-оксида 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиметил)-1,4-этиленпиперазиния. Технический результат: обеспечение возможности идентифицировать фармацевтическую субстанцию «Полиоксидоний» и лекарственных форм на ее основе, подтвердив наличие основных структурных фрагментов и определив их молярные доли - степени окисления и алкилирования. 2 з.п. ф-лы, 6 ил.

1. Способ одновременного определения степеней окисления и алкилирования азоксимера бромида - действующего вещества полиоксидония - методом ¹³С спектроскопии ядерного магнитного резонанса в различных лекарственных формах полиоксидония, характеризующийся тем, что соотносят сигналы спектра ¹³С полиоксидония конкретным метиленовым группам N-оксида 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиметил)-1,4-этиленпиперазиния, выявляют их характеристические сигналы и измеряют значения нормированных интегральных интенсивностей характеристических сигналов одинакового числа метиленовых групп N-оксида 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиметил)-1,4-этиленпиперазиния.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что отсутствует предварительное выделение азоксимера бромида из смеси с маннитолом и повидоном К17.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что его применяют без использования стандартных образцов.