СПОСОБ УГНЕТЕНИЯ РОСТА МЕЛАНОМЫ У МЫШЕЙ-ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕЙ Российский патент 2024 года по МПК A61K47/04 A61K31/495 A61K35/13 A61P43/00 G09B23/28 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для совершенствования практических подходов к лечению рака, понимания фундаментальных явлений, связанных с природой опухолевого роста, а именно для повышения выживаемости и уменьшения объема опухоли у мышей при меланоме.

Онкологические заболевания - это особая разновидность вторичного иммунодефицита, при котором значительно увеличивается численность и активность клеток с иммуносупрессивной активностью. Эти популяции клеток иммунной системы препятствуют развитию эффективного иммунного ответа против опухоли. Задача иммунотерапии при онкологии - активировать иммунную систему, снять имеющиеся блоки, запустить процесс распознавания и уничтожения опухолевых клеток.

Азоксимера бромид, продаваемый под торговым названием Полиоксидоний® (далее - ПО), представляет собой смесь двух полиэлектролитов (сополимер N-окси-1,4-этиленпиперазина и (N-карбокси) - 1,4-этиленпиперозиния бромида), способных к ионизации в растворе. Показано, что под его влиянием приходят в движение все звенья защиты организма от чужеродных агентов антигенной природы: фагоцитоз, Т- и В-система иммунитета, причем первичными мишенями для действия ПО являются нейтрофилы, моноциты/макрофаги и естественные киллеры [Петров Р.В. и др. Полиоксидоний: механизм действия и клиническое применение //Медицинская иммунология. - 2000. - Т. 2. - №. 3. - С. 271-278.]. Он обладает потенциалом для повышения индивидуальной резистентности к местным и общим инфекциям и показан для лечения вирусных инфекций, а также продемонстрировал клиническую эффективность при лечении различных вторичных иммунодефицитов [Лусс Л.В. Полиоксидоний® - современный препарат для эффективной иммунотропной терапии заболеваний, протекающих с дисфункциями иммунной системы //Эффективная фармакотерапия. - 2015. - №. 20. - С. 16-22.].ПО активирует миграцию макрофагов фагоцитоз и переваривание патогенных бактерий, способствуя захвату и удалению чужеродных микрочастиц из циркулирующей крови. Это связано с повышенной продукцией антител в ответ на различные типы антигенов за счет увеличения эффективности взаимодействия между Т- и В-лимфоцитами [Dambaeva S.V., Mazurov D.V., Golubeva N.M., D'yakonova V.A., Pinegin B.V., Khaitov R.M. Effectofpolyoxidoniumonthephagocyticactivityofhumanperipheralbloodleukocytes // Russianjournalofimmunology. 2003. - №. 8. - С.53-60; Dyakonova V.A. et al. Study of interaction between the polyoxidoniumimmunomodulator and the human immune system cells // International immunopharmacology. - 2004. - Т. 4. - №. 13. - С. 1615-1623].

По счастливой случайности было замечено, что ПО усиливает образование, миграцию и распространение стволовых клеток - предшественников и функциональных иммунных клеток. Это может способствовать будущему клиническому развитию ПО при лечении рака [Alexia C. et al. Polyoxidonium activates cytotoxic lymphocyte responses through dendritic cell maturation: clinical effects in breast cancer // Frontiers in immunology. - 2019. - Т. 10. - С. 2693.doi:10.3389/fimmu.2019.02693].

Интересные данные получены при назначении ПО и без такового после хирургического лечения меланомы кожи. Трехлетняя выживаемость пациентов с меланомой кожи при только хирургическом лечении составила 13,3%, а при применении ПО послехирургического вмешательства - 92,5% [Monakhov A.S., Anisimov V.V., Barchuk A.S.ClinicalandCytogeneticEffectofImmunotherapybyPolyoxidoniuminPatientsWithSkinMelanoma (PreliminaryResults) // Immunology. - 2005. - T. 26. - №. 4. - С. 231-35.].

К недостаткам очевидно можно отнести тот факт, что не было проанализировано наличие у пациентов метастазов. Эти опухоли отличаются высокой степенью злокачественности, то есть для них характерен быстрый рост и раннее метастазирование.

Наиболее близким к данному изобретению является способ подавления роста меланомы В16 у лабораторных животных (RU 2784443 C2). Было доказано, что синтетический иммуномодулятор Галавит (натриевая соль аминофталазина) при отсроченной на неделю терапии с момента прививки опухоли меланомы В 16в дозе 5 мг/мышь дважды в неделю (10 инъекций) оказала положительное влияние, значительно повышая показатели выживаемости и подавляя вероятность прививки опухоли на месте их трансплантации, а также развитие отдаленных метастазов. В то время как терапия аминодигидрофталазиндионом натрия сразу после прививки отрицательную динамику, превосходящую по смертности и метастазированию даже контроль.

Недостатком данной работы является недостаточная информативность: будет ли повторятся данный феномен при применении аналогичного синтетического иммуномодулятора (например Полиоксидония).

Задачей данного изобретения является разработка нового эффективного способа для увеличения продолжительности жизни и угнетения роста первичного узла меланомы мышей-опухоленосителей.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств для подавления роста злокачественных опухолей и повышения длительности и качества жизни мышей-опухоленосителей путем введения азоксимера бромида.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается за счет того, что также, как и в известном способе, животным вводят внутрибрюшинно инъекционный водный раствор азоксимера бромида.

Особенностью заявляемого способа является то, что препарат вводят через 7 суток после трансплантации опухоли в дозе 100 мкг/мышь два раза в неделю общим курсом 10 инъекций.

Сущность изобретения заключается в противоопухолевой активности внутрибрюшинного применения соединения азоксимера бромида в эксперименте на мышах с привитой подкожно меланомой В16.

Изобретение поясняется подробным описанием, экспериментальными данными, таблицами и иллюстрацией, на которой изображено:

Фиг. 1 - диаграмма 80%выживаемости мышей в III группе при отсроченной терапии Полиоксидонием: I группа (контроль) - красный цвет; II группа - зеленый цвет; III группа - синий цвет.

Изобретение осуществляют следующим способом.

В эксперименте использованы мыши-гибриды F1 (CBAxC57BL/6), которые содержались в стандартных пластиковых клетках на стандартном пищевом рационе. Все манипуляции с мышами выполняли в соответствии с требованиями нормативно - правовых актов о порядке экспериментальной работы и гуманном отношении к животным (Euroguideontheaccommodationandcareofanimalsusedforexperimentalandotherscientificpurposes.London: FELASA, 2007). Культура клеток В16-F10 была предоставлена ГУЗ «Московский НИИ медицинской экологии». Клетки культивировали в среде RPMI-1640 («ПанЭко», Россия) с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки («Biosera», Франция); 0,01 мг/мл гентамицина («ПанЭко», Россия). Exvivo экспансированные клетки меланомы В16-F10 прививали мышам по следующей схеме: введение подкожно с двух сторон от позвоночника в две точки, по 1х10⁶ клеток/точку, соответственно по 2х10⁶клеток/мышь в 100мклфизиологического раствора.

Через 7 суток после прививки опухоли, лабораторным животным для лечения меланомы В16, внутрибрюшинно вводили Полиоксидоний (активное вещество - азоксимера бромид) в дозе 100 мкг/мышь 2 раза в неделю общим курсом 10 инъекций.

Экспериментальные данные, подтверждающие эффективность лечения меланомы В16.

Были сформированы следующие 3 группы по 10 мышей в каждой:

Группа 1. Контроль (подкожная трансплантация клеток меланомы В16).

Группа 2.Сразу после трансплантации клеток меланомы животным внутрибрюшинно вводили Полиоксидоний в дозе 100мкг/мышь два раза в неделю, всего 10 инъекций.

Группа 3. Через 7 суток после трансплантации клеток меланомы животным внутрибрюшинно вводили Полиоксидоний в дозе 100мкг/мышь два раза в неделю, всего 10 инъекций.

Оценивали формирование опухолевого узла, интенсивность его роста (объем опухоли) на 10-60 сутки, выживаемость мышей до 60 суток и развитие отдаленных метастазов на фоне иммунотерапии препаратом Полиоксидоний. Результаты оценивали по χ² (хи-квадрат)-критерию, а достоверность различий оценивали по t-критерию. Различия значений считали достоверными при p<0,05.

Установлено, что в группе контроля (I группа) с 30-х по 60-е сутки наблюдали постепенное увеличение смертности мышей, 60-суточная выживаемость составила 50%. Во II группе 60-суточная выживаемость составила 40%, а в III группе при отсроченной терапии Полиоксидонием наблюдали 80% выживаемость мышей (Фиг. 1).

В группе контроля опухолевые узлы начинали явно выявляться с 30-х суток. Во II группе при терапии Полиоксидонием сразу с момента прививки опухолевых клеток были выявлены наиболее высокие темпы роста опухоли с 20 по 60 сутки. В III группе темпы роста опухоли при отсроченной терапии Полиоксидонием были значительно ниже по сравнению с I и II группами (Таблица 1).

Таблица 1 Темпы роста опухоли меланомы В16 у мышей под влиянием ПО (азоксимера бромид) Группа Объем опухоли, мм³ Сутки после перевивки 10 20 30 40 50 60 Контроль
(I группа) 1±0,3 16±4,5 167±23 306±47 749±77 1384±252 ПО 100 мкг/мышь сразу
(II группа) 4±0,4 166±16 315±43 883±71 1153±227 1640±362 ПО 100 мкг/мышь через неделю
(III группа) 4±0,5 9±1,2 50±6,6

Влияние азоксимера бромид на подавление роста опухоли (III группа) оценивали путем статистического сравнения объема опухолевых узлов в контрольной и подопытнойгруппах при разных сроках наблюдения, по длительности задержки роста опухоли и индексу торможения роста (ТРО), рассчитанному по следующей формуле:

,

где: V_к - средний объем опухолевых узлов в контрольной группе и V_э - средний объем опухолевых узлов в экспериментальной группе. Данные приведены в таблице 2.

Влияние азоксимера бромид на усиление роста опухоли (II группа) оценивали с применением индекса роста опухоли (ИР), рассчитанного по следующей формуле:

,

где: V_к - средний объем опухолевых узлов в контрольной группе и V_э - средний объем опухолевых узлов в экспериментальной группе (таблица 2).

Таблица 2 Влияние азоксимера бромид на рост опухоли Дни
после перевивки Индекс роста опухоли, %
(II группа) Торможение роста опухоли, %
(III группа) 40 288 98,6 50 153 98,7 60 118 96,3

При вскрытии животных на 60 сутки в контроле (I группа)отмечено, что у четырех из пяти выживших мышей при визуальном осмотре органов грудной и брюшной полостей были выявлены множественные метастатические узлы разных размеров.

Во II группе при терапии полиоксидонием сразу с момента прививки опухолевых клеток при вскрытии у всех оставшихся в живых 4 мышей были выявлены метастатические узлы во внутренних органах грудной и брюшной полостях.

При вскрытии в III группе у двух из восьми выживших были метастазы. У одной мыши узел в правой доли легкого, а у второй мыши узел в средостении.

Проведенные исследования показали, что именно отсроченная на неделю (III группа) с момента прививки клеток меланомы В 16 терапия азоксимерой бромидом в дозе 100 мкг/мышь дважды в неделю (10 инъекций) оказала положительное влияние, значительно повышая показатели выживаемости и подавляя вероятность прививки опухоли на месте их трансплантации, а также развитие отдаленных метастазов. В то время как терапия азоксимерой бромидом сразу после прививки (II группа)дала отрицательную динамику, превосходящую по смертности и метастазированию даже контроль. Аналогичный результат был получен при применении синтетического иммуномодулятора Галавита.

Злокачественные опухоли с одной стороны используют иммунную систему для поддержания роста, а с другой - блокируют, те компоненты иммунной защиты, которые способные привести к отторжению опухоли, поэтому иммунная система и особенности её ответа на опухоль рассматриваются в настоящее время как основной фактор, определяющий течение и исход заболевания.

Использование заявляемого способа позволит расширить наиболее современные средства терапии онкозаболеваний, повысить выживаемость и уменьшить объем опухоли при лечении меланомы В16 у лабораторных животных в эксперименте.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для совершенствования практических подходов к лечению рака. После формирования у животных меланомы B16 им через 7 суток после трансплантации опухоли вводят внутрибрюшинно инъекционный водный раствор азоксимера бромид. Препарат вводят в дозе 100 мкг/мышь два раза в неделю общим курсом 10 инъекций. Данный способ позволит расширить наиболее современные средства терапии онкозаболеваний, повысить выживаемость и уменьшить объем опухоли при лечении меланомы В16. 1 ил., 2 табл., 1 пр.

Способ подавления роста меланомы В16 у лабораторных животных, включающий внутрибрюшинное введение инъекционного водного раствора азоксимера бромид, отличающийся тем, что препарат вводят через 7 суток после трансплантации опухоли в дозе 100 мкг/мышь 2 раза в неделю общим курсом 10 инъекций.