Противопаразитарное средство для лечения и профилактики животных вольным вскармливанием Российский патент 2020 года по МПК A61K31/365 A61K47/10 A61K47/58 A61K47/36 A61P33/10 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к ветеринарной паразитологии и может использовано для лечения и профилактики лошадей табунного содержания, а также диких животных в заповедниках (зубры, олени, кабаны, лошади Пржевальского) при паразитозах.

Многие хозяйства перешли на воспроизводство поголовья лошадей и специализируются на разведении лошадей мясного и молочного направления (высокая биологическая ценность конины и молока), как продуктивных животных, имеющих низкие затраты труда и материальных средств на единицу продукции. С увеличением поголовья животных, повышалась инвазированность их различными видами патогенных гельминтов. Если при стойлово-выгульном содержании проводятся лечебно-профилактические дегельминтизации, то лошади табунного содержания и дикие животные в заповедниках из-за сложности организации мероприятий остаются не обработанными, и в природе накапливается инвазия, что приводит к заражению все большего количества животных и экономическому ущербу.

К паразитированию животных приспособилось большое количество различных гельминтов, которые при определенных условиях локализации и интенсивности инвазии вызывают патологические процессы в организме, чем наносят большой вред дефинитивному хозяину, а также могут служить воротами для инфекционных заболеваний.

Наиболее часто встречающимися видами гельминтов животных являются различные виды нематод, которые вызывают тяжелые заболевания и иногда с летальным исходом. Имагинальные формы нематод паразитируют в пищеварительном тракте, а личиночные стадии - в различных органах и тканях животных. Обычно встречается смешанная инвазия эндо- и эктопаразитами, чем усугубляется их патогенное действие на организм животных. При этом снижаются привесы, качество мясной продукции, а молодняк подвержен интенсивнее и болеет тяжелее, отмечается падеж.

Одной из актуальных проблем в ветеринарной фармакологии является создание лекарственной формы препарата, которая бы обладала высокой эффективностью с широким спектром действия и удобная для применения в производственных условиях. Это относится к антигельминтикам, назначаемым неприрученным животным (лошади табунного содержания, животные в заповедниках: зубры, олени, маралы, кабаны и др.) при паразитозах.

Препараты на основе макроцикличных лактонов очень востребованы в ветеринарии, как активные противопаразитарные средства в малых терапевтических дозах с широким спектром действия против эндо- и эктопаразитов, широко используемые в ветеринарной практике.

Авермектиновый продукт получают путем ферментации гриба Streptomyces avermityllis. Механизм действия заключается в том, что он стимулирует пресинаптическое выделение гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК)-нейромедиатора торможения. Подвергнутые воздействию ивермектина экто- и эндопаразиты утрачивают способность к центральному управлению мышечной деятельностью - происходит их паралич и гибель [1].

Разработано много лекарственных форм на основе авермектинов, они входят и в состав отечественных препаратов в форме пасты, инъекций, солевых брикетов, гелей и порошка (ивермек-1% инъекционный раствор ЗАО «Нита-Фарм»; паста Алезан - производство ООО НВЦ «Агроветзащита»; паста Эквисект - производство «Фармбиомед»; Абиктин-порошок ЗАО «Агроветсервис»). Импортные антигельминтные пасты: паста (Equalan), Эквалан Дуо (Equalan Duo), Интермектин Дуо паста (Intermedin Duo Paste, Канада), Бимектин паста (Bimectin Paste, Кембридж, Онтарио, Канада.), Эквест 2%-гель, ивермектин пурон для накожного применения и др.

Недостатком зарубежных и отечественных инъекционных форм на основе авермектинов является повышенная индивидуальная чувствительность некоторых животных, болезненность и припухлость на месте инъекции в течение 7-10 суток.

Примечание: При испытании инъекционных форм ивермектина ряд авторов отмечали побочное действие препарата. P.A. Karns, D.G. Luther (1984) отмечали у 366 из 3316 лошадей побочное действие, которое выражалось отеком вентральной брюшной стенки у 10% леченых лошадей. У 15 лошадей отмечали отек на месте инъекции, у 11 - отек конечностей, у 4 - отек глаз, у 3 - колики, у 2 - лихорадку и одна лошадь пала [18].

Лекарственные формы в виде паст на основе авермектинов, также имеют повышенную индивидуальную чувствительность, ими удобно дегельминтизировать прирученных животных, но высокая цена на препарат сдерживает массовые обработки из-за экономических соображений.

Накожными лекарственными формами на основе авермектинов (пурон) более удобно проводить лечебно-профилактические мероприятия, но имеют те же недостатки присущие авермектинам, животных приходится прогонять через раскол и наносить препарат вдоль позвоночного столба в повышенной дозе до 10 мл и на месте аппликации появляются покраснение и зуд. При этом отмечается большой расход препарата и дегельминтизацию надо проводить в ясную погоду без осадков.

Разработанные в ВНИИП им. К.И. Скрябина солевые брикеты с ивермектином имели позитивное решение только для диких жвачных животных (олени, косули, лоси), а кабаны, табунные лошади и лошади Пржевальского соль поедают плохо и, поэтому достаточного эффекта не получали.

В процессе работы с неприрученными лошадьми табунного содержания, а также с дикими животными в заповедниках отмечаются сложности, так при использовании препаратов в форме паст, инъекций или накожных форм (пурон), животные не подпускают к себе людей, приходится их фиксировать и вводить индивидуально принудительно с болезненной фиксацией, что приводит к стрессам, при этом нередки случаи нанесения травм операторам и самим животным и дегельминтизация большого количества животных очень трудоемкая работа.

С такими же проблемами сталкиваются ветеринарная служба в мараловодческих хозяйствах Алтайского края и на севере (Саха-Якутия), где развито промышленное коневодство табунного содержания. При проведении осенне-зимних лечебно-профилактических мероприятий применение препаратов в виде пасты, инъекционных и накожных форм из-за низкой температуры (до -50°С), когда препараты замерзают.

Таким образом, весьма актуальным является разработка препарата с широким спектром антигельминтного действия, безопасного в применении путем вольного скармливания с кормом.

Близким аналогом к заявленному изобретению являются сама субстанция ивермектина в виде нерастворимого в воде порошка, который можно задавать в смеси с кормом. Недостатком субстанции является то, что препарат при пероральном применении до 50% в неизменном виде выводится из организма, загрязняя окружающую среду. Поэтому приходится увеличивать в 3 раза терапевтическую дозу препарата. К тому же, препарат малодоступен к тканевым нематодам, их личинкам и эктопаразитам.

Наиболее близкими аналогами является абиктин-порошок 2%, производитель Агрофарма. В состав препарата входят: спиртовой раствор ивермектина, спиртовой экстракт Рибав (иммуностимулятор), полиэтиленгликоль-400 и перлит (адсорбент). Недостатком его производства является сложный технологический процесс - этап растворения субстанции в спирте, затем смешивание компонентов и отстаивание на 14 часов, этап сушки и помол до получения порошка. Технология получения таких комплексов обладает рядом недостатков, к числу которых относятся использование растворителей, процессов растворения, нагревания, осаждения и пр., которые не только увеличивают продолжительность процесса получения целевых комплексов, но приводят к образованию большего количества отходов и могут приводить к процессам термодеструкции лабильных лекарственных веществ. В результате повышается его себестоимость. Для применения летучего и легковоспламеняемого продукта в виде этилового спирта с целью растворения действующего вещества авермектинового комплекса, необходимы особые условия и разрешение. Использование таких растворителей сильно ограничиваются правилами техники безопасности. Включение адсорбента в состав препарата уменьшает его эффективность.

Целью нашего изобретения является создание препарата для перорального применения в смеси с концентрированными кормами, как индивидуальным, так и групповым методом вольного вскармливания, обладающего высокой противопаразитарной активностью и широким спектром действия, нацеленного для лечения неприрученных домашних (табунные лошади) и диких животных в заповедниках.

Сущность разработки заключается в получении высокоэффективной лекарственной формы на основе ивермектина для дегельминтизации лошадей табунного содержания и диких животных в заповедниках при паразитозах вольным скармливанием в смеси с концентрированным кормом без контакта ветеринарных врачей или операторов, это единственный выход из сложившейся ситуации и востребовано практикой. Немаловажное значение имеет организация мероприятия при дегельминтизации большого количества животных, требующих больших физических и финансовых затрат.

Технический результат изобретения, заключается в повышении противопаразитарной эффективности средства за счет образования растворимого супрамолекулярного комплекса, который обеспечивает доставку препарата в организм паразита при питании, в следствие чего происходит блокировка нервной системы и углеводного обмена, вызывая его гибель.

Экономическая эффективность обеспечивается удобством применения препарата при обработке большого количества животных в 2 раза уменьшенной терапевтической дозе.

Препарат состоит из действующего вещества ивермектина и растворимых в воде полимеров: низкомолекулярного поливинилпирралидона марки 17 (ПВП-17) и арабиногалактана (АГ) в весовом соотношении: 2:49:49.

Поливинилпирролидон (ПВП) легко растворяется в воде и спирте, а также за счет образования водорастворимых комплексов улучшает растворимость и биологическую доступность химиотерапевтических средств [16, 17].

Арабиногалактан получают из лиственницы сибирской Larix sibirica и он представляет собой галактан содержащий полисахарид, является иммуномодулятором, стабилизатором. Обладает высокой мембранотропной активностью, обеспечивающей адресную доставку лекарственных средств, не только кишечным нематодам, но и их личинкам локализирующихся в разных органах и тканях. Таким образом, арабиногалактан можно использовать для повышения всасываемости лекарственных средств с низкой биологической доступностью [3, 11, 12].

Отличительная характеристика разработанной нами лекарственной формы антигельминтного препарата в виде порошка для индивидуального и группового применения в смеси с кормом состоит в том, что:

- инновационный препарат получен с применением механохимической нанотехнологии в виде супрамолекулярного комплекса на основе субстанции ивермектина в одну стадию без участия жидких фаз с использованием двух водорастворимых полимеров до образования частиц размером от 0,1 (70%) до 10 микрон. Представляет собой растворимый в воде порошок без вкуса с легко уловимым хвойным запахом. Данная механохимическая технология является безотходной.

- супрамолекулярный комплекс ивермектина (ДВ) с полимерными наполнителями (ПВП-17 и АГ) тщательно смешивается с концентрированным кормом и задается вольным вскармливанием индивидуально или групповым методом, что исключает трудоемкость работы при дегельминтизации, стрессы и травмирование животных и людей.

Технический результат выражается, в частности, в повышении биологической доступности, клинической эффективности, снижении побочных эффектов и токсичности за счет снижения терапевтической дозы, а также включения в состав препарата арабиногалактана, являющегося иммуномодулятором и обладающего гепатопротекторной, антимутагенной, митогенной, гастропротекторной активностью, обеспечивающей адресную доставку лекарственных средств. В результате повышается всасываемость лекарственного средства и расширяется спектр действия на тканевых гельминтов и личинок.

Перечисленные положительные признаки предлагаемого средства отвечают критерию «новизна» и позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию «существенные отличия».

Поставленная задача решается в получении супрамолекулярного комплекса на основе действующего вещества (ДВ) ивермектина (можно использовать другие действующие вещества на основе авермектинового ряда) в виде растворимого в воде порошка для лечения лошадей табунного содержания, а также диких животных в заповедниках в смеси с концентрированными кормами индивидуально или групповым методом. Любой антигельминтный препарат действует губительно на эндо- и эктопаразиты в организме животных, естественно, дефинитивный хозяин может иметь также временные негативные последствия, поэтому в качестве защиты организма животного от возможных побочных действий антигельминтика снижается терапевтическая доза его, при сохранении эффективности. Также использовали биологически активный полисахарид - отечественный арабиногалактан, получаемый из лиственницы сибирской Larix sibirica. В качестве вспомогательного вещества добавляли ПВП-17 низкомолекулярный.

Промышленная применимость заявляемого средства приводится в следующих примерах.

Для получения препарата использована инновационная механохимическая технология модификации ивермектина с помощью водорастворимых полимеров. Процесс механообработки проводили в валковой шаровой мельнице в капролоновом барабане измельчителе-активаторе LE-101 с регулируемой энергонапряженностью в течение 2 часов [2, 3].

Данная технология масштабируема и легко проектируется для промышленного применения путем подбора шаровой мельницы с регулируемой энергонапряженностью. В барабан загружаются исходные компоненты и металлические шары в рассчитанных пропорциях, проводится механообработка в течение 2 часов и выгружается, путем отделения от шаров с помощью сит, легко сыпучий порошок с размером частиц до 10 микрон, который представляет собой предлагаемое средство в виде супрамолекулярного комплекса с новыми физико-химическими свойства растворимостью в воде. Такой метод позволяет повысить биологическую доступность, клиническую и экономическую эффективность, снизить побочные эффекты за счет снижения терапевтической дозы, расширить спектр действия препарата.

Примеры конкретного выполнения

Опыт 1. Для определения растворимости комплекса в воде нами была использована методика, описанная в работе [3]. ИК-спектры комплексов измеряли методом нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) на инфракрасном фурье-спектрометре VERTEX 70v фирмы BRUKER (ФРГ) с использованием приставки НПВО GladyATR 50 фирмы PIKE (США) с алмазным рабочим элементом в области 4000-400 см^-1 со спектральным разрешением 4 см^-1 [4].

По результатам проведенных исследований установлено, что при совместной механообработке субстанции ивермектина с полимерами (ПВП-17, арабиногалактан) получаются комплексы, что подтверждено данными ИК-спектральных исследований и увеличением растворимости до 50 раз.

Опыт 2. Предварительное испытание эффективности препарата проводили на 22 жеребчиках, старше одного года при стойловом содержании в декабре. Для диагностики параскаридоза и стронгилятозов пищеварительного тракта проводили копроовоскопические исследования методом Фюллеборна с использованием раствора аммиачной селитры. Подсчет яиц в г/фекалий проводили в счетной камере ВИГИС. Для диагностики оксиуроза кусочки прозрачной клейкой ленты с отпечатками с перианальных складок переносили на предметное стекло и исследовали на наличие яиц оксиурид.

В результате все 22 жеребчика были инвазированы яйцами стронгилят при интенсивности 477,4 экз., 8 из них параскаридами - 547,1 и 11 - оксиурисами - 22,2 экз. в среднем в г/фек.

Подопытным животным препарат задавали индивидуально в смеси с кормом в дозе 0,1 мг/кг по ДВ (в расчете 10 мг на 100 кг массы животного, по препарату 1,0 мг/кг).

В результате повторного копроовоскопического исследования, через 7 и 14 суток после применения противопаразитарного комплекса ивермектина дозе 0,1 мг/кг по ДВ (10 мг/кг на 100 кг массы животного) яиц нематод пищеварительного тракта в фекалиях не обнаружили, в результате получена 100%-я эффективность против стронгилят, оксиурисов и параскарид.

Опыт 3. Титрацию терапевтической дозы препарата проводили на 46 взрослых лошадях (2-4 лет) у того же частного предпринимателя отобранных по данным копроовоскопических исследований инвазированных стронгилятами, параскаридами и оксиурисами пищеварительного тракта, которых разделили по принципу аналогов на 5 групп. 1; 2 и 3-й группе по 10 животных в каждой, препарат задавали индивидуально в смеси с комбикормом соответственно в дозах: 0,05; 0,075; 0,1 мг/кг по ДВ, (по препарату (0,5; 0,75 и 1,0 мг/кг). Четвертой и 5-й группе, по (п=8 животных в каждой), давали субстанцию ивермектина для вторичного контроля в дозе 0,1 и 0,2 мг/кг по ДВ в смеси с комбикормом индивидуально. Животные в данном хозяйстве выпасаются круглый год, но на время проведения опыта лошади содержались по 8-10 животных в 5-ти загонах.

Учет эффективности комплекса ивермектина проводили методом «Критический тест», согласно Руководству, одобренному Всемирной Ассоциацией за прогресс ветеринарной паразитологии (1995 г).

После дачи препарата за животными проводили клинические наблюдения в течение 3-х суток.

Результаты определения терапевтической дозы супрамолекулярного комплекса ивермектин сведены в табл. 1 (прилож.).

Получена 100%-я эффективность препарата в дозе и 0,1 мг/кг по ДВ (по препарату 1,0 мг/кг) против стронгилят, параскарид и оксиурид.

В дозе 0,075 мг/кг против стронгилят и оксиурисов получена 100%-я, против параскарид 90,0% эффективность.

Препарат в дозе 0,05 мг/кг оказал 100%-ю эффективность, против оксиурид против параскарид - 50,0%, и против стронгилят - 70,0%-ю экстенсэффективность.

Субстанция ивермектина для контрольного сравнения в терапевтической дозе 0,2 мг/кг согласно инструкции по его применению оказала 100%-ю эффективность против оксиурид, против стронгилят и параскарид, соответственно 87,5%, при снижении яиц в г/фек. на 97,7 и 96,5%.

Ивермектин в 2 раза сниженной от терапевтической дозы 0,1 мг/кг для контроля оказал 50%-ю эффективность против оксиурисов, а против стронгилят и параскарид проявил низкую эффективность.

Минимальная доза 0,1 мг/кг по ДВ супрамолекулярного комплекса ивермектина, при которой получена высокая эффективность является терапевтической при индивидуальной однократной даче в смеси с кормом.

Доклинические исследование комплекса ивермектина проводили в соответствии с Методическими рекомендациями Фармакологического государственного комитета («Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» под общей редакцией чл.-корр. РАМН, проф. Р.У. Хабриева, Москва, 2005) [19].

Опыт 4. Острую пероральную токсичность при введении в желудок комплекса ивермектина и субстанции ивермектина для контроля в повышенных дозах на белых мышах и крысах живой массой 18 г и 160-180 г соответственно. На каждую дозу было использовано по 10 мышей и 6 крыс. Препарат вводили однократно с помощью желудочного зонда. В течение 14 суток проводили наблюдение за общим состоянием и поведением животных, возможной гибелью, а также проявлением симптомов интоксикации.

По результатам острой пероральной токсичности супрамолекулярного комплекса ивермектина выявлено, что LD₅₀ для мышей составляет: LD₅₀=(281,4-311,8-342,3); крысы: LD50=(315,5-355,3-395,5). Для субстанции ивермектина (мыши): LD50=(52,1-57,5-59,2), крысы: LD₅₀=(53,2-59,8-60,5). По оценке острой пероральной токсичности, супрамолекулярный комплекс ивермектина относится к 4 классу опасности, субстанция ивермектина к 3 классу, согласно ГОСТ 12.1.007-76, то есть токсичность супрамолекулярного комплекса снижена в 5 раз.

Опыт 5. Изучение параметров накожной токсичности проводили на 12 крысах массой 220-250 г. На каждую дозу использовали по 6 крыс. Супрамолекулярный комплекс и субстанцию ивермектина наносили в максимально возможной дозе на выстриженную шерсть в области спины площадью 6×6 см. Комплекс ивермектина наносили в виде суспензии в 22500 мг/кг по препарату, субстанцию 450 мг/кг.

В результате параметры острой накожной токсичности супрамолекулярного комплекса ивермектина на крысах дозе 22500 мг/кг (по ДВ 450 мг/кг) и субстанции ивермектина 450 мг/кг по ДВ оказалась максимально возможной для аппликации на кожу крысам. Падежа животных и побочных действий не наблюдали. Таким образом, LD₅₀ исследуемого препарата превышает испытанную дозу. Согласно ГОСТ 12.1.007-76 препарат относится к 4 классу опасности (вещества малоопасные) [2].

Опыт 6. Изучение местно-раздражающего действия супрамолекулярного комплекса ивермектина и субстанции проводили на 12 крысах живой массой по 260 г. На выстриженную область спины площадью 6×6 см острым концом инъекционной иглы наносили продольные царапины, затем 6 крысам 1-й группы наносили комплекс ивермектина, а 2-й (п=6 крысам) субстанцию ивермектина в тех же дозах, как и при острой накожной токсичности.

Было отмечено, что целостность кожного покрова, где наносили царапины не была нарушена, эластичность сохранена, гиперемия отсутствовала, через месяц выстриженный шерстный покров восстановился, что дало основание утверждать об отсутствии раздражающих свойств супрамолекулярного комплекса ивермектина и его субстанции при однократном нанесении на кожу.

Опыт 7. Раздражающее действие препарата на слизистую глаза. Опыт проводили на 6 крысах массой 220-250 гр. Препарат обильно наносили однократно в конъюнктивальный мешок глаза крысы, затем на 1 минуту прижимали слезно-носовой канал у внутреннего угла глаза. В течение месяца проводили наблюдение за прозрачностью роговицы и состоянием слизистой оболочки глаза с целью выявления возможной гиперемии и отека слизистой оболочки глаз, повреждение сосудов склеры и роговицы.

Оценку раздражающего действия по степени гиперемии и отека, а также количеству выделений проводили по балльной системе A. Majda и K. Chuscielska.

В результате изучения раздражающего действия на слизистую оболочку глаза в течение 3 часов после интраконъюнктивального введения препарата у всех 6 крыс не наблюдали гиперемию конъюнктивы правого глаза, соответствующая 1 баллу по шкале A. Majda, K. Chrusaielska. Через сутки после введения какие-либо патологические изменения слизистой оболочки отсутствовали. Наблюдения проводились в течение месяца. Таким образом, можно утверждать, что препарат оказывает умеренное местно-раздражающее действие на глаза животных, оцениваемое в 1 балл.

Опыт 8. Иммунотоксические свойств нового противопаразитарного препарата - супрамолекулярного комплекса ивермектина

Исследования проводили в виварии ВНИИП. Проведено 2 опыта на 80 мышах-самцах линии СВА ×С57 BL/6 массой 18-20 г с целью определения влияния нового противопаразитарного препарата на гуморальный и клеточный иммунный ответ.

Тестируемый антгельминтный препарат для группового скармливания применяют в дозе 0,15 мг/кг, при индивидуальном способе введения терапевтическая доза (ТД) составляет 0,1 мг/кг.

Испытуемый препарат мышам (20 гол.) вводили в дозе 0,1 мг/кг (1ТД) внутрижелудочно однократно, другим опытным животным (20 гол.) - в десятикратной дозе 10 мг/кг (10ТД), третьей группе мышей (20 гол.) вводили субстанцию ДВ (ивермектин) в десятикратной дозе (10ТД).

Контрольным животным (20 гол.) вводили водопроводную воду в объеме 0,2 мл. Одновременно с введением препарата мышей всех групп (80 гол.) внутрибрюшинно иммунизировали в объеме 0,5 мл 3%-ной взвесью эритроцитов барана (ЭБ тест-антиген).

Определение уровня агглютининов (РГА). Влияние препарата на антителообразование определяли в реакции агглютинации на 40 мышах (4 группы по 10 гол.). Титр антител в сыворотке крови определяли 7-е сутки после иммунизации мышей ЭБ в микроварианте прямой реакции гемагглютинации (РГА) с использованием 96-ти луночных планшетов для иммунологических исследований. Титр антител выражали в виде log2 числа. Для сравнения выраженности иммунного ответа в опыте и контроле определяли индекс действия препарата (ИД), который представляет собой отношение титра антител в опыте к величине титра антител в контроле: ИД - 0,7 и ниже - супрессивный эффект; - 1,3 и выше - стимулирующий эффект.

Реакция гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ). Влияние на Т-клеточный иммунитет «invivo» оценивали у мышей по выраженности реакции ГЗТ к эритроцитам барана (ЭБ). Мышей внутрибрюшинноиммунизировали 3% взвесью ЭБ (сенсибилизирующее введение - 0,5 мл) и внутрижелудочно вводили испытуемый препарат в двух дозах. На 5 сутки вводили разрешающую дозу ЭБ - 15% взвесь в объеме 0,02 мл в подушечки правых лап, в контрлатеральную лапу вводили 0,9% раствор NaCl в таком же объеме. По изменению массы лап через 24 часа определяли индекс реакции для каждого животного, вычисляемый по формуле:

Определение индекса реакции (ИР) проводили по формуле: [(0-К): К] × 100%. Взвешивание производили на торсионных весах ВТ - 500 мг с ценой деления 1 мг.

Реакцию гиперчувствительности замедленного типа и реакцию агглютинации проводили согласно методикам постановки РГЗТ и РГА (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005) [19].

Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики с помощью простого сравнения средних по двухстороннему t-критерию Стьюдента с использованием программы STUDENT 200 MicrosoftExcel.

Результаты влияния супрамолекулярного комплекса ивермектина на гуморальный иммунный ответ. Для доклинического изучения иммунотоксических параметров у новых лекарственных средств, обычно используют антигены различной природы, реакцию на которые лекарственное средство может изменять. Нативные эритроциты барана (ЭБ) являются тимусзависимым антигеном неинфекционной природы, который обычно используют в иммунологических исследованиях [8, 9, 14, 17, 20].

Реакция основана на способности агглютининов, содержащихся в сыворотке крови иммунизированных ЭБ животных, «склеивать» ЭБ, используемые для иммунизации. Через 7 суток после иммунизации (7-10 суток - пик выработки антител) у опытных и контрольных животных отбирали пробы крови, получали сыворотку и тестировали ее в реакции гемагглютинации. Результаты настоящего опыта представлены в таблице 2 (прилож.).

При изучении влияния тестируемого препарата на антителопродукцию у мышей установлены достоверные различия по уровню гуморального ответа только на введение десятикратной дозы субстанции - 6,33±0,37 и 7,44±0,24 (log₂) в контроле (соответственно t=2,35, Р≤0,05 при _{t крит.} 2,12). Титры антител у мышей, получивших испытуемый препарат в 1ТД, были на уровне 7,22±0,22 (log₂) и практически не отличались от показателей контрольных животных (t=0,63). Десятикратно увеличенная доза комплексного препарата также привела к снижению титров агглютининов в крови опытных мышей до 6,55±0,53 (log₂) при t=l,43 (P≤0,05 при _{t крит.} 2,12).

Индекс действия препарата составлял при 1ТД - 0,97, а при десятикратно увеличенной дозе - 0,88 и 0,85, что говорит о снижении титров антител у экспериментальных животных при введении десятикратно увеличенной дозы, и, особенно, субстанции.

Влияние супрамолекулярного комплекса ивермектина на клеточный иммунный ответ. Воспроизведение реакции гиперчувствительности замедленного типа дает представление о функциональной активности лимфоцитов Т-ряда, т.е. подразумевается влияние на клеточный иммунный ответ. Предварительное введение мышам эритроцитов барана вызывает образование антигенспецифических Т-лимфоцитов. При разрешающем введении этого антигена стимулированные Т-лимфоциты специфически взаимодействуют с ними и выделяют ряд цитокинов (5, 6, 7). Результаты сведены в табл. 3 (прилож.)

Установлено, что препарат в испытанных дозах вызывают индукцию ГЗТ у мышей, т.е. местную воспалительную реакцию, которая обусловлена инфильтрацией клетками очага воспаления. В результате проведенных исследований установлено, что у контрольных мышей, которым препарат не вводили, сдвиг индекса реакции ГЗТ составил 8,99±1,78%.

Интенсивность синтеза и секреции лимфоцитами факторов клеточного иммунитета соответствует степени выраженности воспалительной реакции в месте введения разрешающей дозы антигена (ЭБ) и характеризует активность популяции иммунокомпетентных клеток, ответственных за проявление реакции гиперчувствительности замедленного типа. Препарат может влиять на цифровые показатели этой реакции в ту или иную сторону в зависимости от своих свойств. У животных первой группы воспалительная реакция на ЭБ по степени проявления, практически не отличалась от показателей животных контрольной группы, и сдвиг индекса реакции был на уровне 7,87±1,14%. У мышей, получивших препарат и субстанцию в десятикратной дозе, этот показатель был ниже, чем у животных первой и контрольной групп и составил соответственно 6,55±1,24 (t=l,07) 5,41±0,64% (t=2,03) и и при Р≤0,05 t_крит.=2,16.

Введение в состав препарата арабиногалактана - водорастворимого полисахарида, выделяемого из лиственницы сибирской, способствует нивелированию негативного влияния ивермектина в комплексном препарате на организм животных.

Таким образом, новый противопаразитарный препарат супрамолекулярный комплекс ивермектина при введении мышам в терапевтической дозе 0,1 мг/кг не проявил отрицательного воздействия на выработку антител к ЭБ, и не подавлял клеточный иммунный ответ. При введении десятикратно увеличенной дозы 10 мг/кг, и, особенно ДВ (ивермектин) прослеживается тенденция к снижению выраженности РГА и РГЗТ, т.е. проявляется негативное влияние на организм мышей, снижая антителопродукцию и тормозя индукцию гиперчувствительности замедленного типа, тем самым снижает интенсивность реакции на тимусзависимый антиген - ЭБ.

Введение в состав препарата арабиногалактана способствует нивелированию негативного влияния ДВ (ивермектин) в комплексном препарате на организм животных.

Опыт 9. Испытание эффективности супрамолекулярного комплекса ивермектина при нематодозах пищеварительного тракта лошадей в условиях производства. Испытание комплекса на основе ивермектина проводили с декабря 2018 по январь 2019 г. на ферме частного предпринимателя по разведению лошадей.

Для испытания комплекса ивермектина в дозе 0,1 и 0,15 мг/кг было подобраны 2 табуна (2 косяка с лидирующими жеребцами) на 47 и 54 животных разных возрастов и пола, которые выпасались круглый год.

Для диагностики параскаридоза и стронгилят пищеварительного тракта было отобрано по 25 проб свежих фекалий с каждого косяка лошадей. Копроовоскопию проводили методом Фюллеборна с использованием раствора аммиачной селитры. Подсчет яиц в г/фекалий проводили в счетной камере ВИГИС.

Перед тем, как проводить дегельминтизацию, косяки лошадей под утро загоняли в загон с кормушками и в течении 2-х суток кормили их комбикормом для привыкания к корму и на 3 сутки провели дегельминтизацию комплексом ивермектина. Первой группе из 47 животных, препарат давали групповым методом вольным вскармливанием в смеси с комбикормом в дозе 0,1 мг/кг по ДВ (в расчете 10 мг на 100 кг массы животного, по препарату 1,0 мг/кг) и второй (п=54) -0,15 мг/кг по ДВ (15 мг на 100 кг массы животного, по препарату 1,5 мг/кг). Препарат рассчитывали в среднем на живую массу 500 кг.

Для определения эффективности препарата через 2 недели после дегельминтизации, снова отбирали по 25 проб фекалий с каждой группы и исследовали также, как при отборе животных в опыт.

Учет эффективности комплекса ивермектина проводили методом "Критический тест". После дачи препарата за животными проводили клинические наблюдения в течение 3-х суток.

В результате применения препарата в смеси с кормом групповым способом в условиях производства в дозе 0,1 мг/кг против стронгилят получена 100%-я эффективность и 80,0%-я экстенсэффективность против параскарид. Препарат в дозе 0,15 мг/кг проявил 100%-ю эффективность против кишечных нематод. Побочных действий после дегельминтизации нами не отмечены.

Заключение. С применением инновационной механохимической технологии получен супрамолекулярный комплекс, состоящий из действующего вещества ивермектина и растворимых в воде полимеров: низкомолекулярного поливинилпирролидона марки 17 (ПВП-17) и арабиногалактана (АГ) при следующем соотношении компонентов, масс. %: 2:49:49, который представляет собой тонкодисперсный легко сыпучий порошок с размером частиц от 0,1 до 10 микрон.

По результатам проведенных ИК-спектральных исследований установлено, что у полученного супрамолекулярного комплекса, растворимость увеличилась в 50 раз. В полученном комплексе повышается биологическая доступность, клиническая и экономическая эффективность, снижаются побочные эффекты за счет снижения терапевтической дозы, расширяется спектр действия препарата на тканевых личинок гельминтов.

По данным доклинических токсикологических исследований установлено, что супрамолекулярный комплекс по параметрам острой пероральной и накожной токсичности относится к 4 классу опасности, согласно ГОСТ 12.1.007-76, то есть токсичность супрамолекулярного комплекса снижена в 5 раз по сравнению с субстанцией ивермектина. Не отмечены раздражающие действия супрамолекулярного комплекса ивермектина и его субстанции при однократном нанесении на кожу. Препарат оказывает кратковременное механическое местно-раздражающее действие на глаза животных, оцениваемое в 1 балл.

Новый противопаразитарный препарат - супрамолекулярный комплекс ивермектина при введении мышам в терапевтической дозе 0,1 мг/кг не проявил отрицательного воздействия на выработку антител к ЭБ, и не подавлял клеточный иммунный ответ. Введение в состав препарата арабиногалактана являющегося иммуномодулятором способствует нивелированию негативного влияния ДВ (ивермектин) в комплексном препарате на организм животных.

Установлена минимальная терапевтическая доза 0,1 мг/кг по ДВ (1,0 мг/кг по препарату) супрамолекулярного комплекса ивермектина, при которой получена высокая эффективность против нематод (параскариды, стронгилята, оксиурисы) пищеварительного тракта при индивидуальной однократной даче в смеси с кормом.

В результате применения препарата вольным скармливанием в смеси с комбикормом групповым способом в условиях производства в дозе 0,15 мг/кг получена 100%-ю эффективность против кишечных нематод. Побочных действий после дегельминтизации не отмечены.

Литература.

1. Архипов И.А. Антигельминтики: фармакология и применение. М.: РАСХН, 2009. 406 с.

2. Архипов И.А., Халиков С.С., Душкин А.В., Варламова А.И., Мусаев М.Б. и др. Супрамолекулярные комплексы антигельминтных препаратов, получение свойства//Монография (ISBN 978-5-904798-54-3) ВНИИП им. К.И. Скрябина, 2017 - с. 90.

3. Беленкий М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта //Изд. Мед. Литературы, Ленинград, 1963. - с.

4. Душкин А.В., Метелева Е.С., Чистяченко Ю.С., Халиков С.С.// Фунд. исслед. - 2013. - №1. - часть 3. - С. 741-749.

5. Kelbysheva Е., Telegina L., Strelkova Т., Ezernitskaya М., Nosova Е., Borisov Yu., Lokshin В., Loim N. Spectroscopic Studies of Photochemical Transformations of Cymantrenylquinazolinone Derivatives//European Journal of Inorganic Chemistry, 2018, №18, P. 1945-1952.

6. Иванова A.C., Мастернак Т.Б., Мартынов А.И. Принципы изучения иммунотоксического действия фармакологических препаратов //Токсикологический вестник. - 2010. - №5 (104). - с. 26-31.

7. Колесникова О.П., Смирнов П.И. Испытание иммуноактивных свойств цидектина, аверсктина и ивомека на интактных мышах invitro и в культуре invitro// Вестник Новосибирского ГАУ. - 2009. - №10. - с. 31-34.

8. Методические рекомендации по доклиническому изучению репродуктивной токсичности фармакологических средств, одобренные фармакологическим комитетом Минздрава России (протокол №8 от 3 июля 1997) и утвержденные Минздравом России 18 декабря 1997.

9. Мастернак Т.Б., Малкина Е.Ю., Ларин А.С. и др. Протективное действие ряда иммуномодуляторов и их влияние на активность макрофагов // Иммунология - 1998. - №1. - с. 33-36.

10. Мамыкова О.И. Оценка иммунобиологического статуса животных после дегельминтизации и пути его коррекции//Автореф. дисс. … канд. вет. наук. - М.: ВИГИС, 1989. - 21 с.

11. Медведь Л.И., Каган Ю.С., Спыну Е.И. // Вестник Всес. хим. о-ва им. Менделеева. - 1968. - Т. 13, №3. - С. 263-271

12. Медведева Е.Н., Бабкин В.А. и др. Арабиногалактан лиственницы - свойства и перспективы использования //Химия растительного сырья. 2003. №1. С. 27.

13. Медведева С.А., Александрова Г.П., Сайботалов М.Ю. Арабиногалактан лиственницы сибирской - природный иммуномодулятор // Материалы 5 Междунар. съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». СПб.; Петродворец. - 2001. - с. 104-105.

14. Петров Р.В., Чередеев А.И. Т- и В - лимфоциты // Успехи современной биологии. - 1974. - Т. 77, №1 - с. 90-105.

15. Пономарь С.И. Влияние антигельминтиков в терапевтических дозах на иммунобиологическую реактивность поросят при нематодозах //Бюлл. ВИГИС. - 1990. - Вып. 43. - с. 31-34.

16. http://arabinogalactan.ru/catalog/svojstva.

17. Источник: http://www.neboleem.net/propilenglikol.php.

18. http://dommedika.com/farmakology/93.html Dommedika].

19. Р.А. Karns, D.G. Luther. Эффективность ивермектина при нематодозах лoшaдeй//dommedika.com>farmakology/93.html.

20. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ - М., 2005. - с. 501-514.

21. Germolec D.R. Sensitivity and productivity in immunotoxicity testing: immune endpoints and disease resistsnce //Toxicol Lett. - 2004 Apr 1. - Vol. 149 (l-3). - p. 109-114.

Приложение

Изобретение относится к области сельского хозяйства и представляет собой средство для лечения и профилактики животных при паразитозах вольным вскармливанием, включающее низкомолекулярный поливинилпирролидон-17, арабиногалактан из лиственницы сибирской Larix sibirica и ивермектин при следующем соотношении компонентов, масс. %: поливинилпирролидон-17 - 49, арабиногалактан - 49, ивермектин - 2,0, представляющее собой супрамолекулярный комплекс в виде тонкодисперсного порошка с размером частиц от 0.1 до 10 микрон. Заявленное изобретение позволяет повысить биологическую доступность, клиническую эффективность, снизить побочные эффекты за счет снижения терапевтической дозы, расширить спектр действия препарата. 3 табл., 9 пр.

Средство для лечения и профилактики животных при паразитозах вольным вскармливанием, включающее низкомолекулярный поливинилпирролидон-17, арабиногалактан из лиственницы сибирской Larix sibirica и ивермектин при следующем соотношении компонентов, масс. %: поливинилпирролидон-17 - 49, арабиногалактан - 49, ивермектин - 2,0, представляющее собой супрамолекулярный комплекс в виде тонкодисперсного порошка с размером частиц от 0.1 до 10 микрон.