СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НОВОКАИНА Российский патент 2020 года по МПК G01N33/15 

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к количественному определению новокаина, и может быть использовано в контрольно-аналитических лабораториях, биохимических лабораториях клиник и в практике химико-токсикологических лабораторий.

Предложен способ фотометрического или визуально-тестового определения новокаина (Коновалова О. Ю., Логинова Л. П. Особенности протекания индикаторной реакции на первичные ароматические амины в желатиновой пленке // Методы и объекты хим. анализа. 2008. Т. 3. №.2. С. 147-156), заключающийся в использовании индикаторных пленок, представляющих собой отвержденные желатиновые слои фотографических пленок «Микрат – 300», с последующей иммобилизацией реагента - п-диметиламинобензальдегида в присутствии додецилсульфата натрия и 2 М HCl. Устойчивый аналитический эффект (ярко-желтое окрашивание) обусловлен образованием основания Шиффа в массиве желатинового геля. Диапазон определяемых содержаний 71000 – 5430000 нг/мл с пределом определяемых содержаний 38000 нг/мл.

Однако, данный способ характеризуется очень низкой чувствительностью и, следовательно, недостаточной точностью определения микрограммовых количеств новокаина.

Известен также способ спектрофотометрического определения новокаина (Бакеева Р. Ф. и др. Использование наноструктурированных мицеллярных сред для модификации 5, 7-дихлор-4, 6-динитробензофуроксана при определении ароматических аминов // Вестник Казанского технологического университета. 2010. №. 10), заключающийся в прибавлении 2-кратного избытка хромогенного реагента 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана (ДХДНБФО) к определяемому веществу (соотношение молярных концентраций С_{ДХДНБФО} : С_{новокаина} = 2:1) в присутствии организованной (мицеллярной) системы для увеличения солюбилизации ДХДНБФО, в которой образуются смешанные мицеллы, включающей смесь неионного – оксиэтилированного нонилфенола (АФ_9-10) и анионного ПАВ – додецилсульфата натрия (ДДС) в соотношении α_АФ9-10 : α_ДДС = 0,75 : 0,25, а также смешанный растворитель: вода (90 % об.) – диметилсульфоксид (ДМСО) (10 % об.) с последующим фотометрированием продукта замещения ДХДНБФО новокаином (ДХДНБФОН) красно-оранжевого цвета (λ = 420 нм).

Оптимальной концентрацией ПАВ, обеспечивающей максимальную чувствительность определений новокаина, является С_ПАВ =4⋅10^-4 М (~ 4 величины ККМ), а оптимальный интервал значений рН - 2,5 – 4 ед. Предел определяемых содержаний составляет 300 нг/мл.

Недостатками данного способа являются использование малодоступного и дорогостоящего реагента и токсичного органического растворителя для приготовления его растворов. Также способ отличается недостаточно высокой чувствительностью.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ количественного определения новокаина (а.с. СССР №1529086, по кл. МПК G01N21/78, опуб. 15.12.1989), заключающийся в обработке пробы органическим реагентом – п-диметиламинокоричным альдегидом в этаноле (С = 4,5⋅10^-5 - 4,5⋅10^-4 М) в присутствии додецилсульфата натрия (С = 4⋅10^-3 - 4⋅10^-2 М) при рН среды 3-4 и дальнейшем фотометрировании полученного раствора. Диапазон определяемых содержаний составил 400 – 5600 нг/мл с пределом обнаружения 200 нг/мл.

Однако, способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью определения.

Технической проблемой является разработка способа количественного определения новокаина с применением смешанных мицелл неионного и анионного поверхностно-активного вещества (ПАВ).

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение чувствительности определения новокаина путем снижения предела его обнаружения.

Для достижения заявляемого результата в способе количественного определения новокаина, включающем обработку анализируемой пробы растворами органического реагента и додецилсульфата натрия, добавление цитратного буферного раствора, фотометрирование и определение содержания новокаина по градуировочной кривой, согласно изобретению, в качестве органического реагента используют водный раствор 4-диметиламинобензальдегида, полученный его диспергированием в растворе додецилсульфата натрия, добавляют полученную смесь 4-диметиламинобензальдегида и додецилсульфата натрия к анализируемой пробе в количестве 4 ⋅10^-4 - 2 ⋅ 10^-3 М и 3 ⋅ 10^-3 – 1,4 ⋅ 10^-2 М соответственно, а после добавления цитратного буферного раствора дополнительно к пробе добавляют водно-мицеллярный раствор Тритона Х-114 в количестве 2 ⋅ 10^-3 - 1 ⋅ 10^-2 М. и насыщенный раствор хлорида натрия в количестве 0,5 – 1,0 М, после чего отделяют центрифугированием мицеллярно-насыщенную фазу и разбавляют цитратным буферным раствором, при этом, раствор цитратного буфера используют с кислотностью 2,5 - 3,5.

Способ осуществляется следующим образом. Анализируемую пробу обрабатывают органическим реагентом, который с новокаином образует окрашенное в желтый цвет основание Шиффа. В качестве реагента выбран 4-диметиламинобензальдегид (ДМАБА) как один из наиболее селективных и доступных реагентов на первичные ариламины, плохо растворимых в воде, но хорошо в органических растворителях, альтернативой которым являются разбавленные водные растворы ПАВ с концентрацией выше критической концентрации мицеллообразования (ККМ).

Исходный раствор ДМАБА диспергируют в растворе одного из наиболее часто применяемых представителей анионных ПАВ - додецилсульфата натрия (ДДС), который увеличивает растворимость ДМАБА и стабилизирует его раствор, а также катализирует реакцию ДМАБА с новокаином.

После обработки пробы раствором ДМАБА, диспергированного в растворе ДДС, в количестве 4 ⋅10^-4 ≤ С_ДМАБА ≤ 2 ⋅10^-3 М и 3 ⋅ 10^-3 ≤ С_ДДС ≤ 1 ⋅10^-2 М, добавляют цитратный буферный раствор, поддерживающий постоянство рН (2,5 – 3,5) и способствующий максимальной стабилизации аналитической формы (основания Шиффа) и повышению сходимости результатов.

Далее к пробе добавляют Тритон Х-114 – наиболее часто применяемый представитель неионных ПАВ, удовлетворяющий требованиям, предъявляемым к таким ПАВ, для проведения экстракции на основе «точки помутнения» (cloud point extraction, CP), в количестве 2 ⋅ 10^-3 ≤ С ≤ 1 ⋅ 10^-2 М.

Важным отличительным свойством неионных ПАВ является способность их растворов подвергаться фазовому разделению при достижении температуры помутнения. При этом, гомогенный раствор разделяется на две фазы: водную, в которой неионногенное ПАВ (нПАВ) находится в концентрации ниже ККМ, и мицеллярную - обогащенную ПАВ. Температура в точке помутнения является важной характеристикой водных растворов нПАВ, зависит от многих факторов и достигает температур 20 – 25˚ С в присутствии добавок неорганических высаливателей, например NaCl.

Последний в количестве 0,5 – 1,0 М применяли для получения двухфазной системы с окрашенной в желтый цвет мицеллярно-насыщенной фазой, как наиболее доступный и дешевый высаливатель.

Полученные мицеллярные экстракты отделяют от водной фазы декантацией, разбавляют цитратным буферным раствором и фотометрируют при l = 1 см и λ_max = 469 нм.

Способ отличается комбинацией двух эффектов концентрирования в смешанных мицеллах ПАВ: псевдофазное концентрирование, осуществляемое анионным ПАВ (ДДС); концентрирование в мицеллярно-насыщенные фазы неионного ПАВ (Тритон Х-114), основанное на эффекте «cloud point» экстракции.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Для количественного определения новокаина в жидких лекарственных формах готовят исходный 1⋅ 10^-2 М раствор реагента - 4-диметиламинобензальдегида (ДМАБА) в 7 ⋅ 10^-2 М растворе анионного ПАВ додецилсульфата натрия (ДДС). Для этого навески 0,1490 г ДМАБА и 2,019 г ДДС помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют дистиллированную воду на 2/3 объема колбы, диспергируют компоненты смеси в ультразвуковой установке 5 – 10 минут. После осаждения пены ДДС доводят содержимое колбы дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают.

Построение градуировочного графика.

Точную навеску сухого препарата новокаина (гидрохлорида 2-диэтиламиноэтилового эфира п-аминобензойной кислоты) 0,0025 г помещают в мерную колбу на 25 мл и растворяют в дистиллированной воде при нагревании на водяной бане. Стандартный раствор содержит 100 мкг/мл новокаина (раствор А). Для получения раствора новокаина с концентрацией 10 мкг/мл (раствор Б) стандартный раствор разбавляют дистиллированной водой в 10 раз.

Для построения градуировочной характеристики в 10 мерных колб емкостью V_общ = 25 мл помещают отмеренные объемы 0,095 (0,95 мкг/мл); 0,2 (2 мкг/мл); 0,5 (5 мкг/мл); 1,0 (10 мкг/мл) мл раствора Б, а также 0,3 (30 мкг/мл); 0,5 (50 мкг/мл); 0,7 (70 мкг/ мл); 0,9 (90 мкг/мл); 1,1 (110 мкг/мл); 1,3 (130 мкг/мл) раствора А, в каждую колбу добавляют по 2,5 мл 1 ⋅ 10^-2 М раствора ДМАБА, приготовленного в 7 ⋅ 10^-2 М растворе ДДС. После этого доводят объем в каждой колбе до 15 - 20 мл цитратным буферным раствором с рН = 2,5 – 3,5 и перемешивают. В течение 1 минуты при комнатной температуре наблюдают развитие ярко-желтого окрашивания растворов, характерное продукту взаимодействия новокаина с ДМАБА. Далее в каждую колбу добавляют 2,5 мл 4 ⋅ 10^-2 М раствора неионного ПАВ – Тритона Х – 114, перемешивают, вносят 5 мл 20 % - ного раствора NaCl, доводят до метки буферным раствором и снова перемешивают. Наблюдают помутнение системы. Полученные гомогенные растворы помещают в центрифугу на 5 минут (число оборотов n = 3000) для ускорения образования мицеллярной фазы. После центрифугирования наблюдают образование двухфазной системы с окрашенной в ярко-желтый цвет мицеллярно-насыщенной фазой, локализующейся в нижней части расслаивающейся системы. При фотометрическом детектировании полученные мицеллярные экстракты отделяют от водной фазы декантацией, разбавляют цитратным буферным раствором (рН = 2,5 – 3,5) в соотношении 1 часть мицеллярно-насыщенной фазы и 4 части буферного раствора и измеряют оптическую плотность полученного окрашенного раствора с помощью спектрофотометра Shimadzu UV – 1800 в кювете с l = 1 см при длине волны 469 нм относительно цитратного буферного раствора. Подчинение интенсивности поглощения окрашенных растворов закону Бугера – Ламберта – Бера находятся в пределах концентраций 0,038 – 4,8 мкг/мл.

Пример 2.

Для количественного определения новокаина в ампульных 0,5% -ных растворах для инъекций готовят рабочий раствор, содержащий 100 мкг/мл, путем разбавления 0,5%-ного раствора новокаина дистиллированной водой.

Вносят 0,3 мл приготовленного раствора в колбу вместимостью 25 мл, добавляют по 2,5 мл 1 ⋅ 10^-2 М раствора ДМАБА, приготовленного в 7 ⋅ 10^-2 М растворе ДДС, доводят объем в колбе до 15 - 20 мл цитратным буферным раствором с рН = 2,5 – 3,5 и перемешивают. Далее в колбу добавляют 2,5 мл 4 ⋅ 10^-2 М раствора Тритона Х – 114, перемешивают, вносят 5 мл 20 % - ного раствора NaCl, доводят до метки буферным раствором и перемешивают. Полученные гомогенные растворы помещают в центрифугу на 5 минут (число оборотов n = 3000) для ускорения образования мицеллярной фазы. Полученные мицеллярные фазы фотометрируют аналогично примеру 1. Определение новокаина проводят по вышеописанной градуировочной характеристике.

Результаты определения приведены в таблице 1. Анализ данных, представленных в табл. 1, позволяет заключить, что предлагаемый способ определения новокаина отличается хорошей воспроизводимостью и правильностью.

Установлены оптимальные концентрации в реакционной системе: ДМАБА и ДДС (табл. 2), Тритона Х-114 (табл. 4), NaCl (табл. 5), а также оптимальный интервал рН (табл. 3). Последовательность проводимых операций аналогично примеру 2.

Как видно из табл. 2, введение в реакционную смесь 1,5 – 5,0 мл 1 ⋅ 10^-2 М раствора ДМАБА, диспергированного в 7 ⋅ 10^-2 М растворе ДДС, позволяет достигать наименьших ошибок определения новокаина не превышающих 7 - 8 %. Таким образом, оптимальные концентрации в реакционной смеси ДМАБА и ДДС составляют соответственно 4 ⋅ 10^-4 ≤ С ≤ 2 ⋅ 10^-3 М и 3 ⋅ 10^-3 ≤ С ≤ 1,4 ⋅ 10^-2 М.

Зависимость результатов определения новокаина от рН представлены в табл.3. Оптимальный интервал рН, создаваемый цитратными буферными растворами, составил 2,5 – 3,5.

Как следует из табл. 4, ошибка определения новокаина минимальна в интервале концентраций неионного ПАВ (Тритона Х – 114) 2 ⋅ 10^-3 ≤ С ≤ 1 ⋅ 10^-2 М.

Данные табл. 5 свидетельствуют о том, что в интервале концентраций 0,5 – 1,0 М высаливателя NaCl достигается наименьшая ошибка определения новокаина.

Установлены границы определяемых содержаний новокаина (l = 1 см), которые представлены в табл. 6, в интервале концентраций 0,95 – 120 мкг/ 25 мл (38 – 4800 нг/мл) с погрешностью, не превышающей 7 %, в отличие от прототипа, в котором диапазон определяемых содержаний составляет 400 – 5600 нг/мл.

Таблица 1 Определение содержания новокаина в ампулах 0,5 % - ного раствора новокаина (С_{ДМАБА / ДДС} = 2,5 мл 1 ⋅ 10^-2 / 7 ⋅ 10^-2 М, V_общ = 25 мл, рН = 2,5,
l = 1 см, λ_max = 469 нм) № п/п Введено, мкг/мл Найдено, мкг/мл Погрешность, % 1 30,0 28,6 4,7 2 30,0 31,5 5,0 3 30,0 28,8 4,0 4 30,0 28,2 6,0 5 30,0 31,7 5,7 6 30,0 31,9 6,3 7 30,0 28,5 5,0

Таблица 2 Определение содержания новокаина при различной концентрации
ДМАБА и ДДС (V_общ = 25 мл, l = 1 см) Исходный раствор 1 ⋅ 10^-2 М ДМАБА в 7 ⋅ 10^-2 М ДДС Новокаин Погрешность, % Примечание Добавлено, мл С_ДМАБА, М С_ДДС, М Взято, мкг/мл Найдено, мкг/мл 0,5 2 ⋅ 10^-4 1,4 ⋅ 10^-3 1,00 1,32 32 1,0 4 ⋅ 10^-4 2,8 ⋅ 10^-3 1,00 1,08 8,0 Область наименьших ошибок 1,5 6 ⋅ 10^-4 4,2 ⋅ 10^-3 1,00 0,94 6,0 2,0 8 ⋅ 10^-4 5,6 ⋅ 10^-3 1,00 0,95 5,0 2,5 1 ⋅ 10^-3 7,0 ⋅ 10^-3 1,00 1,04 4,0 3,0 1,2 ⋅ 10^-3 8,4 ⋅ 10^-3 1,00 1,05 5,0 3,5 1,4 ⋅ 10^-3 9,8 ⋅ 10^-3 1,00 1,06 6,0 4,0 1,6 ⋅ 10^-3 1,1 ⋅ 10^-2 1,00 0,91 7,0 5,0 2 ⋅ 10^-3 1,4 ⋅ 10^-2 1,00 0,92 8,0 10,0 4 ⋅ 10^-3 2,8 ⋅ 10^-2 1,00 0,81 19

Таблица 3 Зависимость предела обнаружения новокаина от рН среды
(С_{ДМАБА / ДДС} = 2,5 мл 1 ⋅ 10^-2 / 7 ⋅ 10^-2 М, V_общ = 25 мл, l = 1 см) рН среды Новокаин Погрешность, % Примечание Взято, мкг/мл Найдено, мкг/мл 1,5 1,00 1,20 20 - 2,5 1,00 0,96 4,0 Область наименьших ошибок 3,5 1,00 0,94 6,0 4,5 1,00 1,03 10 - 5,5 1,00 0,85 15 - 6,5 1,00 1,19 19 -

Таблица 4 Определение содержания новокаина при различной концентрации
Тритона Х-114 (С_{ДМАБА / ДДС} = 2,5 мл 1 ⋅ 10^-2 / 7 ⋅ 10^-2 М, V_общ = 25 мл, l = 1 см) Тритон Х-114 Новокаин Погрешность, % Примечание Добавлено
4 ⋅ 10^-2 М , мл С_раб, М Взято, мкг/мл Найдено, мкг/мл 0,5 0,8 ⋅ 10^-3 1,00 1,13 13 - 1,5 2,4 ⋅ 10^-3 1,00 1,05 5,0 Область наименьших ошибок 2,5 4,0 ⋅ 10^-3 1,00 0,97 3,0 3,5 5,6 ⋅ 10^-3 1,00 0,96 4,0 4,5 7,2 ⋅ 10^-3 1,00 0,95 5,0 5,5 8,8 ⋅ 10^-3 1,00 1,06 6,0 6,5 1,0 ⋅ 10^-2 1,00 0,93 7,0 7,5 1,2 ⋅ 10^-2 1,00 1,20 20 -

Таблица 5 Определение содержания новокаина при различной концентрации
NaCl (С_{ДМАБА / ДДС} = 2,5 мл 1 ⋅ 10^-2 / 7 ⋅ 10^-2 М, V_общ = 25 мл, l = 1 см) NaCl Новокаин Погрешность, % Примечание Добавлено
3,45 М , мл С_раб, М Взято, мкг/мл Найдено, мкг/мл 3,1 0,4 1,00 1,32 32 - 3,4 0,5 1,00 1,08 8,0 Область наименьших ошибок 4,4 0,6 1,00 0,94 6,0 5,0 0,7 1,00 0,96 4,0 5,6 0,8 1,00 1,05 5,0 6,3 0,9 1,00 0,95 5,0 7,5 1,0 1,00 1,06 6,0 8,1 1,1 1,00 1,20 20 -

Таблица 6 Установление границ определяемых содержаний новокаина
(С_{ДМАБА / ДДС} = 2,5 мл 1 ⋅ 10^-2 / 7 ⋅ 10^-2 М, V_общ = 25 мл, рН = 2,5, l = 1 см) Введено, мкг/мл Найдено, мкг/мл Погрешность, % Примечание 0,500 0,610 22 - 0,950 0,920 3,2 Область наименьших ошибок 5,00 5,20 4,0 25,0 23,5 6,0 55,0 51,5 6,4 120 112 6,7 130 105 19 -

Таким образом, заявляемый способ позволяет повысить чувствительность определения новокаина путем снижения предела его обнаружения.

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к количественному определению новокаина. Предложен способ количественного определения новокаина, включающий обработку анализируемой пробы растворами органического реагента и додецилсульфата натрия, добавление цитратного буферного раствора, фотометрирование и определение содержания новокаина по градуировочной кривой, отличающийся тем, что в качестве органического реагента используют водный раствор 4-диметиламинобензальдегида, полученный его диспергированием в растворе додецилсульфата натрия, добавляют полученную смесь 4-диметиламинобензальдегида и додецилсульфата натрия к анализируемой пробе в количестве 4⋅10^-4 - 2⋅10^-3 М и 3⋅10^-3 - 1,4⋅10^-2 М соответственно, а после добавления цитратного буферного раствора дополнительно к пробе добавляют водно-мицеллярный раствор Тритона Х-114 в количестве 2⋅10^-3 - 1⋅10^-2 М и насыщенный раствор хлорида натрия в количестве 0,5-1,0 М, после чего отделяют центрифугированием мицеллярно-насыщенную фазу и разбавляют цитратным буферным раствором, при этом раствор цитратного буфера используют с кислотностью 2,5-3,5. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности определения новокаина путем снижения предела его обнаружения. 6 табл., 2 пр.

Способ количественного определения новокаина, включающий обработку анализируемой пробы растворами органического реагента и додецилсульфата натрия, добавление цитратного буферного раствора, фотометрирование и определение содержания новокаина по градуировочной кривой, отличающийся тем, что в качестве органического реагента используют водный раствор 4-диметиламинобензальдегида, полученный его диспергированием в растворе додецилсульфата натрия, добавляют полученную смесь 4-диметиламинобензальдегида и додецилсульфата натрия к анализируемой пробе в количестве 4⋅10^-4 - 2⋅10^-3 М и 3⋅10^-3 - 1,4⋅10^-2 М соответственно, а после добавления цитратного буферного раствора дополнительно к пробе добавляют водно-мицеллярный раствор Тритона Х-114 в количестве 2⋅10^-3 - 1⋅10^-2 М и насыщенный раствор хлорида натрия в количестве 0,5-1,0 М, после чего отделяют центрифугированием мицеллярно-насыщенную фазу и разбавляют цитратным буферным раствором, при этом раствор цитратного буфера используют с кислотностью 2,5-3,5.