СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЙЕССОТОКСИНОВ В МОЛЛЮСКАХ Российский патент 2020 года по МПК G01N33/02 

Изобретение относится к пищевой промышленности, в частности к области оценки безопасности пищевой продукции, а именно к методам количественного определения содержания в моллюсках липотропных фикотоксинов-йессотоксинов и может быть использовано в процессе экспертизы и государственного надзора за безопасностью морепродуктов.

Официально утвержденного способа определения йессотоксинов в моллюсках в Российской Федерации в настоящее время нет.

Международное законодательство, разработанное в 1970-х годах для определения йессотоксинов в моллюсках, предусматривает использование биологических тестов. Эти тесты проводятся на мышах, крысах или морских свинках. Однако имеющиеся различия протоколов проведения испытания, низкие специфичность и чувствительность этих методов не дают возможности точного определения количества йессотоксинов в образцах моллюсков. В международной практике для анализа йессотоксинов в морепродуктах используется также иммуноферментный метод, который является полуколичественным, что затрудняет проведение экспертизы и надзорных мероприятий за безопасностью морепродуктов [Technical paper on Toxicity Equivalency Factors for Marine Biotoxins Associated with Bivalve Molluscs, FAO/WHO, 2016].

Актуальность количественного определения йессотоксинов обусловлена необходимостью контроля моллюсков на содержание в них фикотоксинов, в том числе йессотоксинов с использованием современных методов высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрической детекцией (далее ВЭЖХ-МС).

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является утвержденный в Европейском Союзе способ анализа липотропных фикотоксинов по отрицательному иону [М-Н]^-, в том числе йессотоксинов, в молюсках. Этот способ заключаются в гомогенизации материала, экстракции йессотоксина метиловым спиртом, хроматографическом разделении на хроматографической колонке в градиентном режиме на основе воды и ацетонитрила, с добавлением 2 мМ формиата аммония и 50 мМ муравьиной кислоты и последующем масс-спектрометрическом анализе с источником ионизации электроспреем в отрицательном режиме с дальнейшей масс-спектрометрической детекцией. [«EU-Harmonised standard operating procedure for determination of lipophilic marine biotoxins in mollusks by LC-MS/MS», EN 16204:2012 IDT]. Недостатком способа является то, что использование в градиенте растворителей в качестве компонента В раствора ацетонитрила с формиатом аммония не позволяет проводить полного разделения йессотоксинов и других фракций, содержащихся в исследуемом образце моллюсков. Кроме того, при этом способе не установлены условия хроматографирования для различных липотропных фикотоксинов. Различия режимов хроматографирования, определяемые операторами при проведении анализов в различных лабораториях, могут стать причиной системной ошибки при анализе моллюсков на наличие йессотоксинов.

Техническим результатом предлагаемого способа является возможность полного разделения йессотоксинов и других фракций, содержащихся в исследуемом образце моллюсков, достижение большей степени воспроизводимости и стабильности получаемых результатов, количественное определение йессотоксинов, входящих в группу липофильных фикотоксинов, в отрицательном режиме ионизации по иону [М-Н]^-.

Указанный технический результат достигается тем, что для экстракции йессотоксина используют метиловый спирт СН₃ОН, затем проводят хроматографический анализ с использованием ВЭЖХ-МС системы Agilent 1200 HPLC Systemc с хроматографической колонкой «AgilentZORBAXSB-С18 4.6×150 mm 5 μm» длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненной обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18, зернением 5 мкм при температуре хроматографической колонки 40°С, причем в качестве градиента подвижной фазы используют смесь растворителей, включающую компонент А: раствор - 0,1% муравьиной кислоты в воде, и компонент В: 1-пропанол С₃Н₇ОН.

ОПИСАНИЕ СПОСОБА

Для осуществления способа проводят следующие действия: приготовление калибровочных стандартов для построения градуировочной кривой, подготовка проб стандартов, построение градуировочной кривой, подготовка проб образцов, хроматографирование с детектированием в отрицательном режиме ионизации электроспрея по иону по иону [М-Н]^- с соотношением масса/заряд 1141,4465±0,025 а.е.м (проверочный ион [MNa-2Н]^- с соотношением масса/заряд 1163,4279±0,025 а.е.м.) с дальнейшей регистрацией хроматограмм, построение градуировочной кривой, определение по градуировочной кривой содержания йессотоксинов в образцах.

Для приготовления калибровочных стандартов мясо моллюска, не содержащего йессотоксин в пределах обнаружения метода, гомогенизируют, добавляют исходные растворы йессотоксина в метаноле с перемешиванием 1 мин. на перемешивающем устройстве типа «вортекс», выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин, повторно перемешивают 1 мин. с последующим замораживанием. Для построения градуировочной кривой необходимо не менее 5 контрольных точек.

Для осуществления пробоподготовки навеску калибровочного стандарта или навеску мяса моллюсков 0,2 г помещают в пластиковую пробирку, добавляют 0,8 см³ метилового спирта, перемешивают 1 мин. на перемешивающем устройстве типа «вортекс», выдерживают 20 мин. при комнатной температуре для осаждения белков, центрифугируют 15 мин. при ускорении не менее 12000 g. Аликвоту экстракта объемом 0,15 см³ с помощью пипеточного дозатора помещают в эпиндорф емкостью 2 см³ и добавляют 1,35 см³ 82% раствора метилового спирта. Затем пробу центрифугируют в течение 15 минут с относительным центробежным ускорением 12000 g. Аликвоту экстракта объемом 0,5 см³ с помощью пипеточного дозатора помещают в хроматографическую виалу.

Для осуществления хроматографического анализа используют ВЭЖХ-МС систему Agilent 1200 HPLC Systemc с хроматографической колонкой «AgilentZORBAXSB-C18 4.6×150 mm 5 μm» длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненной обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18, зернением 5 мкм, температура хроматографической колонки 40°С. В качестве градиента подвижной фазы используют смесь растворителей, включающую компонент А: раствор - 0,1% муравьиной кислоты в воде, и компонент В: 1-пропанол С₃Н₇ОН.

Для осуществления масс-спектрометрической детекции используют подключенный к выходу из хроматографической колонки масс-спектрометр высокого разрешения Thermo Scientific Orbitrap Elite. Параметры масс-спектрометрического детектора:

Диапазон сканирования: 450-1400 а.е.м:

Resolution (разрешение) 60000;

Spray Voltage (напряжение на капилляре электроспрея) 2.5 кВ;

SheathGas (скорость потока основного газа) 50;

AuxiliaryGas (скорость истока вспомогательного газа) 10;

Capillary Temperature (температура капилляра интерфейса) 250°С;

HeaterTemperature (температура испарителя) 300°С;

Source fragmentation (потенциал фрагментации в источнике) 20,

Скорость потока элюента - 0,6 см³;

объем вводимой пробы - 0,003 см³,

режим элюирования (градиентный).

Построение градуировочной кривой проводится по площади хроматографических пиков стандартного образца йессотоксина на хроматограмме выбранного иона, построенной по соотношению масса/заряд ионов [М-Н]^- или [MNa-2Н]^- (1141,4465 или 1163,4279 а.е.м. соответственно) с шириной окна 0,050 а.е.м. Зависимость квадратичная, взвешивание 1/Х.

Нижний предел количественного определения йессотоксина при использовании предлагаемого способа составляет 0,53 мг/кг. Ошибка измерения не более 15%. Пределы и точность определения йессотоксинов, достаточны для целей экспертизы и государственного надзора за безопасностью моллюсков (3,75 мг/кг).

Пример 1

Количественное определение йессотоксинов в мясе мидий с использованием в качестве градиента подвижной фазы смеси растворителей, включающей компонент A: раствор 0,1%. муравьиной кислоты в воде, и компонент В: 1-прспанол.

Для приготовления калибровочных стандартов мясо мидий, не содержащее йессотоксин в пределах обнаружения метода, гомогенизируют, добавляют исходные растворы йессотоксина в метаноле с перемешиванием 1 мин. на перемешивающем устройстве типа «вортекс», выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин, повторно перемешивают 1 мин. с последующим замораживанием. Для построения градуировочной кривой необходимо не менее 5 контрольных точек.

Для осуществления пробоподготовки навеску калибровочного стандарта или навеску мяса мидий 0,2 г помещают в пластиковую пробирку, добавляют 0,8 см³ метилового спирта, перемешивают 1 мин. на перемешивающем устройстве типа «вортекс», выдерживают 20 мин. при комнатной температуре для осаждения белков, центрифугируют 15 мин. при ускорении не менее 12000 g. Аликвоту экстракта объемом 0,15 см³ с помощью пипеточного дозатора помещают в эпиндорф емкостью 2 см³ и добавляют 1,35 см³ 82% раствора метилового спирта. Затем пробу центрифугируют в течение 15 минут с относительным центробежным ускорением 12000 g. Аликвоту экстракта объемом 0,5 см³ с помощью пипеточного дозатора помещают в хроматографическую виалу.

Для осуществления хроматографического анализа используют ВЭЖХ-МС систему Agilent 1200 HPLCSystem с хроматографической колонкой Macherey-Nagel Nucleodur С18 4.6×250mm 5 μm, температура хроматографической колонки 40°С, компонент А: 0,1% раствор муравьиной кислоты в воде, компонент В: 1-пропанол. Объем вкола 0,003 см³. Время проведения анализа 20 мин.Режим элюирования указан в таблице.

Для осуществления масс-спектрометрической детекции используют подключенный к выходу из хроматографической колонкимасс-спектрометр высокого разрешения Thermo Scientific Orbitrap Elite. Параметры масс-спектрометрического детектора:

Диапазон сканирования: 450-1400 а.е.м;

Resolution (разрешение) 60000;

Spray Voltage (напряжение на капилляре электроспрея) 2.5 кВ;

SheathGas (скорость потока основного газа) 50;

AuxiliaryGas (скорость потока вспомогательного газа) 10;

Capillary Temperature (температура капилляра интерфейса) 250°С;

HeaterTemperature (температура испарителя) 300°С;

Source Fragmentation (потенциал фрагментации в источнике) 20;

Скорость потока элюента - 0,6 см³;

Объем вводимой пробы - 0,003 см³,

Режим элюирования (градиентный).

Построение градуировочной кривой проводится по площади хроматографических пиков стандартного образца йессотоксина на хроматограмме выбранного иона, построенной по соотношению масса/заряд ионов [М-Н]^- или [MNa-2H]^- (1141,4465 или 1163,4279 а.е.м. соответственно) с шириной окна 0,050 а.е.м. Зависимость квадратичная, взвешивание 1/Х. Нижний предел количественного определения йессотоксина при использовании предлагаемого способа составляет 0,53 мг/кг. Ошибка измерения не более 15%.

Концентрация йессотоксина в образце мяса мидий - 0,5 мг/кг. Время удерживания образца (RT) 6,88 мин.

Результаты:

Площадь пика (АА) на хроматограмме 19194, что соответствует содержанию йессотоксина в образце мяса мидий 0,5 мг/кг ± 15%.(фиг. 1).

Пример 2

Количественное определение йессотоксинов в мясе устриц с использованием в качестве градиента подвижной фазы смеси растворителей, включающей компонент А: раствор - 0,1% муравьиной кислоты в воде, и компонент В: 1-пропанол

Приготовление калибровочных стандартов для построения градуировочной кривой, пробоподготовка, оборудование и режимы проведения хроматографического анализа и построение градуировочной кривой и регистрация хроматограммы, нижний предел количественного определения йессотоксина, ошибка измерения как в примере 1.

Концентрация йессотоксина в образце мяса устриц - 3,0 мг/кг. Время удерживания образца (RT) 6,88 мин.

Результаты:

Площадь пика (АА) 116421, что соответствует содержанию йессотоксина в образце мяса устриц 3,0 мг/кг ± 15%.(фиг. 2).

Пример 3

Количественное определение йессотоксинов в мясе гребешков с использованием в качестве градиента подвижной фазы смеси растворителей, включающей компонент А: раствор - 0,1% муравьиной кислоты в воде, и компонент В: 1-пропанол.

Приготовление калибровочных стандартов для построения градуировочной кривой, пробоподготовка, оборудование и режимы проведения хроматографического анализа и построение градуировочной кривой и регистрация хроматограммы, нижний предел количественного определения йессотоксина, ошибка измерения как в примере 1.

Концентрация йессотоксина в образце мяса гребешков - 6,0 мг/кг. Время удерживания образца (RT) 6,90 мин.

Результаты:

Площадь пика (АА) 233943, что соответствует содержанию йессотоксина в образце мяса гребешков 6,0 мг/кг ± 15%.(фиг. 3).

Положительным эффектом предлагаемого способа является то, что способ обеспечивает высокую степень специфичности и точности при проведении анализа различных видов моллюсков на содержание йессотоксинов. Элюирование йессотоксинов на хроматографической колонке с использованием в качестве компонента В 1-пропанол(а)обеспечивает полное разделение йессотоксина от имеющихся в исследуемом образце моллюсков примесей, в том числе других липофильных фикотоксинов - окадаиковой кислоты, азаспирацидов и др. Нижний предел количественного определения йессотоксина при использовании предлагаемого способа составляет 0,53 мг/кг. Пределы количественного определения йессотоксинов, достаточные для целей экспертизы и государственного надзора за безопасностью морепродуктов (3,75 мг/кг).

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к количественному определению содержания в моллюсках йессотоксинов, максимально допустимый уровень содержания йессотоксинов в моллюсках - не более 3,75 мг/кг. Для этого проводят количественное определение йессотоксинов методом ВЭЖХ-МС с использованием системы на основе жидкостного хроматографа Agilent 1200 HPLC System и масс-спектрометра высокого разрешения Thermo Scientific Orbitrap Elite. Для проведения анализа образцы продукта гомогенизируют, экстрагируют метиловым спиртом и его хроматографируют на колонке Agilent ZORBAX SB-С18 в градиентном режиме с использованием в качестве компонентов А (0,1% раствор муравьиной кислоты в воде) и В (1-пропанол) и масс-спектрометрическим детектированием йессотоксинов с ионизацией электроспреем в отрицательном режиме по иону [М-Н]^- (проверочный ион [MNa-2H]^-). Нижний предел количественного определения йессотоксинов при использовании предлагаемого способа составляет 0,53 мг/кг при ошибке измерения не более 15%. Изобретение обеспечивает оценку безопасности пищевой продукции и может быть использовано при экспертизе и государственном надзоре за безопасностью морепродуктов. 3 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ количественного определения йессотоксинов в моллюсках, заключающийся в гомогенизации продукта, экстракции йессотоксинов с добавлением метилового спирта и их анализе методом ВЭЖХ-МС с разделением на хроматографической колонке С18 и масс-спектрометрическим детектированием йессотоксина с ионизацией электроспреем в отрицательном режиме по иону [М-Н]^- (проверочный ион [MNa-2H]^-) с калибровкой методом внешнего стандарта, отличающийся тем, что используют хроматографическую колонку Agilent ZORBAX SB-C18 4.6×150 мм 5 мкм при температуре 40°С в градиентном режиме элюирования в подвижной фазе, включающей компонент А - 0.1% раствор муравьиной кислоты в воде и компонент В - 1-пропанол С₃Н₇ОН, в качестве детектора используют масс-спектрометр высокого разрешения; нижний предел количественного определения йессотоксина составляет 0,53 мг/кг образца.