Способ количественного определения окадаиковой кислоты в морепродуктах Российский патент 2018 года по МПК G01N33/02 

Изобретение относится к пищевой промышленности, в частности к области оценки безопасности пищевой продукции, а именно к методам количественного определения содержания в морепродуктах окадаиковой кислоты (диарейный яд моллюсков), и может быть использовано в процессе экспертизы и государственного надзора за безопасностью морепродуктов.

Официально утвержденным способом определения окадаиковой кислоты в Российской Федерации является полуколичественный способ, приведенный в MP 01.016-07 Экспресс-определение окадаиковой кислоты в морепродуктах с помощью тест-системы "DSP-Check" производства фирмы Parapharm Laboratories Co., Ltd, Япония. В настоящее время производитель наборов прекратил выпуск наборов для иммуноферментного анализа окадаиковой кислоты, что делает использование его оригинального метода невозможным.

Актуальность разработки способа определения окадаиковой кислоты обусловлена необходимостью контроля морепродуктов на содержание в них окадаиковой кислоты с использованием современных методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее ВЭЖХ).

Классический способ количественного определения окадаиковой кислоты с использованием ВЭЖХ основан на дериватизации молекулы окадаиковой кислоты 9-антранилдиазометаном и использовании флуоресцентного детектора [DIN Е. N. 14524-2004 Foodstuffs-determination of okadaic acid in mussels-HPLC method with solid phase extraction clean-up, derivatization and fluorimetric detection. - 2004]. Однако указанный способ и его аналоги, основанные на использовании детекторов классических типов, обладают рядом неустранимых недостатков, связанных с необходимостью проведения дериватизации для каждого образца и использованием дериватизирующих агентов, обладающих низкой стабильностью и снижающих надежность измерений. В связи с этим особую актуальность приобретает разработка способов количественного определения окадаиковой кислоты с применением ВЭЖХ в сочетании с современными масс-спектрометрическими детекторами (далее ВЭЖХ-МС). Данная категория методов обладает достоинствами, связанными с высокой чувствительностью и селективностью масс-спектрометрической детекции, в сочетании с преимуществами, обеспечиваемыми хроматографическим разделением компонентов анализируемых смесей перед масс-спектрометрическим анализом при отсутствии необходимости использования дериватизации образцов. Заявленное изобретение относится к данной категории способов.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ, позволяющий проводить мониторинг содержания окадаиковой кислоты наряду с рядом других фикотоксинов в фильтратах морской воды и морепродуктах, заключающийся в гомогенизации материала, экстракции метанолом, центрифугировании, доведении до объема метанолом с последующей твердофазной экстракцией или без таковой с последующим хроматографическим разделением на хроматографической колонке Phenomenex Kinetex ХВ-С18 в градиентном режиме на основе воды и ацетонитрила с добавлением 2 мМ формиата аммония и 50 мМ муравьиной кислоты и масс-спектрометрическим анализом (в части окадаиковой кислоты) с источником ионизации электроспреем в отрицательном режиме масс-спектрометрической детекции с использованием для детектирования окадаиковой кислоты сигнала депротонированного иона [М-Н]^- либо его фрагментов. В качестве масс-спектрометрического детектора в способе используются масс-спектрометр типа «тройной квадруполь» ABSciexAPI 4000, квадруполь-времяпролетный масс-спектрометр Agilent 6550 iFunnelQToF либо гибридный тандемный масс-спектрометр высокого разрешения Thermo Fisher Scientific Exactive. Способ обеспечивает скрининг окадаиковой кислоты с пределом обнаружения от 1,67 до 14,3 мкг/кг в зависимости от используемого масс-спекрометрического детектора при максимально допустимом уровне содержания окадаиковой кислоты в моллюсках 160 мкг/кг [Zendong Z. et al. High resolution mass spectrometry for quantitative analysis and untargeted screening of algal toxins in mussels and passive samplers // Journal of Chromatography A. - 2015. - T. 1416. - C. 10-21].

Недостатком способа является то, что для анализа окадаиковой кислоты используется отрицательный режим масс-спектрометрической детекции, в то время как для значительного количества фикотоксинов необходим положительный режим детекции. На масс-спектрометрометрических детекторах с отсутствием технической возможности быстрого переключения между положительным и отрицательным режимами (например, приборах высокого разрешения серии Thermo Scientific Orbitrap) это несоответствие между используемыми режимами приводит к невозможности надежного количественного определения окадаиковой кислоты. Причиной использования отрицательного режима, по-видимому, является то, что в силу особенностей структуры окадаиковой кислоты из стандартно используемых в количественном ВЭЖХ-МС при ионизации электроспреем ионов (МН⁺ и [М-Н]) только ионотрицательного режима [М-Н]^- обладает и достаточной интенсивностью и хорошей воспроизводимостью для осуществления анализа, а использование иона MNa⁺ является нежелательным в связи с тем, что существует прямая зависимость его интенсивности от содержания натрия, что снижает надежность метода.

Техническим результатом предлагаемого способа является возможность количественного определения окадаиковой кислоты в положительном режиме ионизации с высокой степенью надежности при обеспечении чувствительности и воспроизводимости, достаточных для экспертизы и государственного надзора за безопасностью морепродуктов.

Указанный технический результат достигается тем, что проводят хроматографирование с детектированием в положительном режиме ионизации электроспрея по ионам [МН-Н2O]⁺, [МН-2Н2O]⁺, [МН-3Н₂O]⁺, обладающим высокой интенсивностью (Рисунок 1), построением градуировочной кривой с регистрацией хроматограмм, определением по градуировочной кривой содержания окадаиковой кислоты в образцах.

ОПИСАНИЕ СПОСОБА

Для осуществления способа проводятся следующие действия: приготовление калибровочных стандартов для построения градуировочной кривой, пробоподготовка стандартов, построение градуировочной кривой, пробоподготовка образцов, хроматографирование с детектированием в положительном режиме ионизации электроспрея по ионам [МН-Н2O]⁺, [МН-2Н2O]⁺ и [МН-3Н2O]⁺ с регистрацией хроматограмм, построение градуировочной кривой, определение по градуировочной кривой содержания окадаиковой кислоты в образцах.

Для приготовления калибровочных стандартов мясо моллюска, не содержащего окадаиковую кислоту в пределах обнаружения метода, гомогенизируют, добавляют исходные растворы окадаиковой кислоты в метаноле из расчета 10 мкл на каждые 990 мкг образца с перемешиванием 1 мин на перемешивающем устройстве типа «вортекс», выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин, повторно перемешивают 1 мин с последующим замораживанием при температуре -18°С или -20°С. Исходные растворы окадаиковой кислоты в метаноле концентрацией от 64 мкг/мл до 0,5 мкг/мл готовят последовательным двукратным разбавлением и соответствуют содержанию окадаиковой кислоты в калибровочных стандартах от 5 до 640 мкг/кг. Для построения градуировочной кривой необходимо не менее 6 контрольных точек.

Для осуществления пробоподготовки навеску калибровочного стандарта или образца 200 мг помещают в пластиковую пробирку, добавляют 800 мкл 80%-го раствора метанола в воде, перемешивают 1 мин на перемешивающем устройстве типа «вортекс», выдерживают 20 мин при комнатной температуре для осаждения белков, центрифугируют 15 мин при ускорении не менее 12000 g, отбирают 500 мкл супернатанта в хроматографическую виалу.

Для осуществления хроматографического анализа используют ВЭЖХ систему Agilent 1200 HPLC System с хроматографической колонкой Macherey-Nagel Nucleodur С18 4.6×250mm 5um, температура хроматографической колонки 40°С, скорость потока 800 мкл/мин, фаза А: 0,1% раствор муравьиной кислоты в воде, фаза В: ацетонитрил градиент: 65%В ≥ 100%В за 5 мин; 100%В 3 мин; 100%В ≥ 65%В за 1 мин, время анализа 16 мин, объем вкола 20 мкл.

Для осуществления масс-спектрометрической детекции используют подключенный к выходу из хроматографической колонки масс-спектрометр высокого разрешения Thermo Scientific Orbitrap Elite. Параметры масс-спектрометрического детектора: режим анализа положительных ионов, диапазон сканирования: 700-900 а.е.м., Resolution (разрешение) 240000, Spray Voltage (напряжение на капилляре электроспрея) 5.5 кВ, Sheath Gas (скорость потока основного газа) 50, Auxiliary Gas (скорость потока вспомогательного газа) 10, Capillary Temperature (температура капилляра интерфейса) 250°С, Heater Temperature (температура испарителя) 500°С, Source Fragmentation (потенциал фрагментации в источнике) 20.

Построение градуировочной кривой проводится по площади хроматографических пиков стандартного образца окадаиковой кислоты на хроматограмме EIC (хроматограмма выбранного иона), построенной по соотношению масса/заряд ионов [МН-Н2O]⁺, или [МН-2Н2O]⁺, или [МН-3Н2O]⁺ (787,4624, или 769,4521, или 751,4414 а.е.м. соответственно) с шириной окна 0,050 а.е.м. Зависимость квадратичная, взвешивание 1/Х.

Нижний предел количественного определения окадаиковой кислоты при использовании предлагаемого способа составляет 5-20 мкг/кг в зависимости от используемого иона. Ошибка измерения не более 15%.

Пример 1.

Количественное определение окадаиковой кислоты в мясе устрицы с использованием иона [МН-2Н2O]⁺:

Для приготовления калибровочных стандартов мясо моллюска, не содержащего окадаиковую кислоту в пределах обнаружения метода, гомогенизируют, добавляют исходные растворы окадаиковой кислоты в метаноле из расчета 10 мкл на каждые 990 мкг образца с перемешиванием 1 мин на перемешивающем устройстве типа «вортекс», выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин, повторно перемешивают 1 мин с последующим замораживанием при температуре -18°С или -20°С. Исходные растворы окадаиковой кислоты в метаноле концентрацией от 64 мкг/мл до 0,5 мкг/мл готовят последовательным двукратным разбавлением и соответствуют содержанию окадаиковой кислоты в калибровочных стандартах от 5 до 640 мкг/кг. Для построения градуировочной кривой необходимо не менее 6 контрольных точек.

Для осуществления пробоподготовки навеску калибровочного стандарта или образца 200 мг помещают в пластиковую пробирку, добавляют 800 мкл 80% раствора метанола в воде, перемешивают 1 мин на перемешивающем устройстве типа «вортекс», выдерживают 20 мин при комнатной температуре для осаждения белков, центрифугируют 15 мин при ускорении не менее 12000 g, отбирают 500 мкл супернатанта в хроматографическую виалу.

Для осуществления хроматографического анализа используют ВЭЖХ систему Agilent 1200 HPLC System с хроматографической колонкой Macherey-Nagel Nucleodur C18 4.6×250mm 5um, температура хроматографической колонки 40°С, скорость потока 800 мкл/мин, фаза А: 0,1% раствор муравьиной кислоты в воде, фаза В: ацетонитрил градиент: 65%В ≥ 100%В за 5 мин; 100%В 3 мин; 100%В ≥ 65%В за 1 мин, время анализа 16 мин, объем вкола 20 мкл.

Для осуществления масс-спектрометрической детекции используют подключенный к выходу из хроматографической колонки масс-спектрометр высокого разрешения Thermo Scientific Orbitrap Elite. Параметры масс-спектрометрического детектора: режим анализа положительных ионов, диапазон сканирования: 700-900 а.е.м., Resolution (разрешение) 240000, Spray Voltage (напряжение на капилляре электроспрея) 5.5 кВ, Sheath Gas (скорость потока основного газа) 50, Auxiliary Gas (скорость потока вспомогательного газа) 10, Capillary Temperature (температура капилляра интерфейса) 250°С, Heater Temperature (температура испарителя) 500°С, Source Fragmentation (потенциал фрагментации в источнике) 20.

Построение градуировочной кривой проводится по площади хроматографических пиков стандартного образца окадаиковой кислоты на хроматограмме EIC (хроматограмма выбранного иона), построенной по соотношению масса/заряд иона [МН-2Н2O]⁺ 769,4521 а.е.м. с шириной окна 0,050 а.е.м. Зависимость квадратичная, взвешивание 1/Х.

Результаты проведения количественного определения окадаиковой кислоты предлагаемым способом следующие: нижний предел количественного определения окадаиковой кислоты 20 мкг/кг, ошибка измерения не более 15%, корреляция калибровочной кривой R2=0,9998 в диапазоне концентраций калибровочных образцов 20-640 мкг/кг. (Рисунок 2).

Пример 2

Количественное определение окадаиковой кислоты в мясе устрицы с использованием иона [МН-3Н2O]⁺:

Приготовление калибровочных стандартов для построения градуировочной кривой, пробоподготовка и регистрация хроматограммы, как в примере 1.

Построение градуировочной кривой проводится по площади хроматографических пиков стандартного образца окадаиковой кислоты на хроматограмме EIC (хроматограмма выбранного иона), построенной по соотношению масса/заряд иона [МН-2Н2O]⁺ 751,4414 а.е.м. с шириной окна 0,050 а.е.м. Зависимость квадратичная, взвешивание 1/Х.

Результаты проведения количественного определения окадаиковой кислоты предлагаемым способом следующие: нижний предел количественного определения окадаиковой кислоты менее 5 мкг/кг, ошибка измерения не более 15%, корреляция калибровочной кривой R2=0,9999 в диапазоне концентраций калибровочных образцов 5-640 мкг/кг (Рисунок 3).

Пример 3.

Количественное определение окадаиковой кислоты в мясе устрицы с использованием иона [МН-Н2O]⁺:

Приготовление калибровочных стандартов для построения градуировочной кривой, пробоподготовка и регистрация хроматограммы, как в примере 1.

Построение градуировочной кривой проводится по площади хроматографических пиков стандартного образца окадаиковой кислоты на хроматограмме EIC (хроматограмма выбранного иона), построенной по соотношению масса/заряд иона [МН-2Н2O]⁺ 787,4624 а.е.м. с шириной окна 0,050 а.е.м. Зависимость квадратичная, взвешивание 1/Х.

Результаты проведения количественного определения окадаиковой кислоты предлагаемым способом следующие: нижний предел количественного определения окадаиковой кислоты менее 5 мкг/кг, ошибка измерения не более 15%, корреляция калибровочной кривой R2=0,9996 в диапазоне концентраций калибровочных образцов 5-640 мкг/кг (Рисунок 4).

В результате осуществления предлагаемого Способа количественного определения окадаиковой кислоты в морепродуктах обеспечивается нижний предел количественного определения окадаиковой кислоты в мясе устрицы в количестве от 5 мкг/кг до 20 мкг/кг, что достаточно для целей количественного анализа на предмет соответствия образцов морепродуктов гигиеническим нормам по максимально допустимому уровню содержания окадаиковой кислоты (не более 160 мкг на килограмм продукта).

Положительным эффектом предлагаемого способа является то, что способ обладает высокой чувствительностью (нижний предел обнаружения от 5 мкг/кг до 20 мкг/кг окадаиковой кислоты) и воспроизводимостью, что обеспечивает пределы количественного определения окадаиковой кислоты, достаточные для целей экспертизы и государственного надзора за безопасностью морепродуктов (максимально допустимый уровень содержания окадаиковой кислоты в морепродуктах - не более 160 мкг/кг).

Изобретение относится к оценке безопасности пищевой продукции, а именно к методу количественного определения содержания окадаиковой кислоты (диарейного токсина моллюсков) в морепродуктах методом ВЭЖХ-МС с использованием жидкостного хроматографа Agilent 1200 HPLC System и масс-спектрометра высокого разрешения Thermo Scientific Orbitrap Elite. Для этого морепродукт гомогенизируют, добавляют водный раствор метанола, а затем центрифугируют и отбирают супернатант, содержащий экстракт окадаиковой кислоты. Состав экстракта определяют хроматографически на колонке С18 в градиентном режиме с элюентами А (0,1% раствор муравьиной кислоты в воде) и В (ацетонитрил) и регистрацией хроматограмм. Детектирование окадаиковой кислоты проводят ионизацией электроспреем в положительном режиме масс-спектрометра по интенсивности иона [МН-Н2O]⁺, или [МН-2Н2O]⁺, или [МН-3Н2O]⁺. Для количественного определения содержания окадаиковой кислоты в образцах используют градуировочную кривую. Нижний интервал определения составляет от 5 до 20 мкг/кг при ошибке измерения не более 15%. Изобретение обеспечивает количественное определение окадаиковой кислоты в морепродуктах для проведения экспертизы и государственного надзора за безопасностью пищевых продуктов. 4 ил., 3 пр.

Способ количественного определения окадаиковой кислоты в морепродуктах, заключающийся в гомогенизации продукта, экстракции окадаиковой кислоты, добавлении водного раствора метанола, центрифугировании, отборе супернатанта и его анализе методом ВЭЖХ-МС с разделением на хроматографической колонке С18 в градиентном режиме с элюентами и масс-спектрометрическим детектированием окадаиковой кислоты с ионизации электроспреем с калибровкой методом внешнего стандарта, отличающийся тем, что хроматографирование с детектированием проводятся в положительном режиме масс-спектрометра, измерения проводят по интенсивности иона [МН-Н2O]⁺, или [МН-2Н2O]⁺, или [МН-3Н2O]⁺ с регистрацией хроматограмм, построением градуировочной кривой, определением по градуировочной кривой содержания окадаиковой кислоты в образцах.