Штамм каллусной культуры клеток растения змееголовник дланевидный (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd.) под обозначением NEFU Dpalm-1 в условиях in vitro для получения биомассы клеток Российский патент 2021 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию штамма каллусных культур клеток растения змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.), и может быть использовано для получения биомассы каллусных клеток.

Штамм NEFU Dpalm-1 каллусных культур змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd.), полученный в условиях in vitro, идентифицирован и депонирован во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений (ВККК ВР) при Учреждении РАН Институт физиологии растений РАН, регистрационный номер 101.

Заявленное изобретение позволяет получить штамм каллусной культуры клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd.) из первичных каллусов листового происхождения. При этом получаемый штамм каллусной культуры клеток характеризуется стабильными ростовыми параметрами и может быть использован в фармацевтической промышленности для получения сырья, содержащего ценные биологически активные соединения (флавоноиды, фенольные соединения). Кроме того, для культивирования штамма каллусной культуры клеток отсутствует сезонная зависимость.

Культура клеток высших растений может служить альтернативным способом изготовления фитосырья для медицины, ветеринарии, парфюмерии и пищевой промышленности.

В ряде случаев биомасса клеток in vitro превосходит по свойствам полученную от природного или плантационного растения. Культура клеток также оказывается незаменимой в том случае, когда необходимо произвести сырье редких, исчезающих или тропических видов лекарственных растений (см. Решетников В.Н., Спиридович Е.В., Фоменко Т.И., Носов А.М. Растительная биотехнология - способ рационального использования биосинтетического потенциала в журнале Инженерный журнал: наука и инновации, издательство МГТУ им. Н.Э. Баумана (Москва), 2014, № 5 (135), С. 21-25).

Змееголовник дланевидный используют в тибетской медицине, якутской народной медицине, настой из надземной части и цветков применяют при язвенной болезни желудка, а в Средней Азии - при сердечной недостаточности, астении, болезнях желудка и как потогонное средство.

Известно, что на основе химических и спектральных работ из частей змееголовника дланевидного было выделено 23 соединения (фенилпропаноиды, кумарины, флавоноиды и тритерпены), среди которых впервые в роду Dracocephalum было обнаружено восемь соединений: сальвианоловая кислота B, кафтаровая кислота, цихоровая кислота, умбеллиферон, эскулетин, апигенин-7-O-β-D-глюкуронопиранозид, изорхоифолин и лютеолин-4'-O-β-D-глюкопиранозид (см. Olennikov D.N., Chirikova N.K., Okhlopkova Z.M., Zulfugarov I.S. Chemical composition and antioxidant activity of Tánara Ótó (Dracocephalum palmatum Stephan), a medicinal plant used by the North-Yakutian nomads. Molecules. 2013 Nov 14; 18(11):14105-21).

Известен способ получения каллусной культуры змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum (Steph.)) в условиях in vitro (см. RU №2718253, кл. C12N 5/04, опубл. 31.03.2020).

При этом в открытых источниках технические решения в области культивирования клеток D. palmatum (Steph.) не выявлены.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма каллусной культуры клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd.) с характерными морфологическими и ростовыми качествами и отсутствием сезонной зависимости их получения.

Поставленная задача решена тем, что получен штамм каллусных культур клеток Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd. в условиях in vitro.

Анализ признаков заявленного решения свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна», штамм каллусных культур клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd.) впервые получен в условиях in vitro.

Совокупность существенных признаков обеспечивает решение заявленной технической задачи, включая оптимизацию питательной среды, стабилизацию ростовых параметров и морфологических характеристик.

Штамм NEFU Dpalm-1 каллусной культуры клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd) идентифицирован и депонирован во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений (ВККК ВР) при Учреждении РАН Институт физиологии растений РАН, 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35, регистрационный номер 101.

Предлагаемое изобретение состоит в том, что за основу взяты 30-дневные первичные каллусы листового происхождения, индуцированные из асептических проростков in vitro, полученных из семян северо-восточной популяции (Оймяконский район Республики Саха (Якутия) («Полюс Холода»)) змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd.).

Заявленное решение иллюстрируется чертежом, где на фигуре показана графическая схема динамики роста каллусной культуры клеток D.palmatum при выращивании в стеклянных чашках Петри диаметром 90 мм (см. фигуру).

Для получения первичного каллуса в качестве экспланта были использованы листья, полученные из стерильных проростков растения. Листовые экспланты, полученные из проростков, помещают в питательную среду Мурасиге-Скуга (МС) c кинетином в концентрации 1 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д) в концентрации 1 мг/л на стеклянные чашки Петри. При этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели. Через 4 недели культивирования первичные каллусные культуры пересаживают на другую питательную среду. Состав питательной среды представлен в таблице 1.

Таким образом, получен штамм каллусной культуры клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd.) из первичных каллусов листового происхождения. В процессе культивирования определены ростовые и морфологические характеристики. Полученные данные позволяют отнести штамм к хорошо растущим каллусным культурам клеток высших растений (см. кривую роста на фигуре и параметры роста в таблице 2).

Культивирование проводили в темноте, при 26±1°С, влажности помещения 70±5%, в стеклянных чашках Петри с диаметром 90 мм. При этом цикл субкультивирования составлял 30 суток. При пересеве каллусной культуры использовали ¼ полученной биомассы.

Штамм каллусной культуры клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd.) обладает следующими признаками: среднеплотный, неоднородный, оводненный, неморфогенный, беловатый каллус со светло бежевым оттенком и с темными участками. Содержит паренхимные небольшие клетки округлой формы.

Таким образом, заявленное решение позволяет получить штамм каллусной культуры клеток из первичных каллусов листового происхождения. При этом штамм каллусной культуры клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd.) характеризуется стабильными ростовыми параметрами с отсутствием сезонной зависимости при культивировании.

Таблица 1

Состав питательной среды

Компоненты Содержание, в мг/л NH₄NO₃ 33000 KNO₃ 38000 CaCl₂x2H₂O 8800 MgSO₄x7H₂O 7400 KH₂PO₄ 3400 KI 166 H₃BO₃ 1240 MnSO₄x4H₂O 4460 ZnSO₄x7H₂O 1720 Na₂MoO₄x2H₂O 50 CuSO₄x5H₂O 5 CoCl₂x6H₂O 5 FeSO₄x7H₂O 5560 Na-ЭДТА 7460 Мезоинозит 100 Гидролизат казеина 500 Тиамин 100 Пиридоксин 100 Никотиновая кислота 100 Сахароза 30000 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 1 6-бензиламинопурин 1 1-нафтилуксусная кислота 1 Вода 1000 мл Агар 12000

Таблица 2

Ростовые характеристики каллусных культур змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd.)

Показатель I (индекс скорости роста) μ, сут (удельная скорость роста) М мах (увеличение веса) в г Сырая биомасса 11,91 0,15 5,11 Сухая биомасса 20,10 0,01 0,37

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм NEFU Dpalm-1 каллусных культур змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd.), полученный в условиях in vitro, идентифицированный и депонированный во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений (ВККК ВР) при Учреждении РАН Институт физиологии растений РАН, регистрационный номер 101. Штамм используется для получения биомассы клеток Dracocephalum palmatum Steph. и характеризуется стабильными ростовыми параметрами и отличительными признаками: среднеплотный, неоднородный, оводненный, неморфогенный, беловатый со светло-бежевым оттенком и с темными участками, кроме того, содержит паренхимные небольшие клетки округлой формы. Заявленное изобретение может быть использовано в фармацевтической промышленности для получения сырья, содержащего ценные биологически активные соединения (флавоноиды, фенольные соединения). 1 ил., 2 табл.

Штамм каллусных культур клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd.), регистрационный номер ВККК ВР 101, для получения биомассы клеток.