Биосенсор на основе клеток Staphylococcus aureus, стабильно продуцирующих зеленый флуоресцентный белок, для проведения ультравысокопроизводительного скрининга Российский патент 2020 года по МПК C12N1/21 C12N15/63 C12R1/445 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно: к технологии получения живых флуоресцентных микроорганизмов и может быть использовано в биотехнологии для поиска антимикробных препаратов, обладающих бактериостатическим или бактерицидным действием по отношению к различным штаммам бактерии Staphylococcus aureus.

Общая схема поиска микроорганизмов способных подавлять рост или элиминировать патогенные бактерии заключается в следующем:

1) На начальном этапе имеется бактерия-патоген - «таргет», для которой поставлена задача поиска штамма микроорганизма - «эффектор», способного продуцировать вещества (антимикробные пептиды, низкомолекулярные вещества) обладающие антимикробными свойствами.

2) Далее, с использованием технологии микрофлюидики и оригинальных микрофлюидных чипов собственного производства, проводится инкапсулирование пары «таргет»-«эффектор». Для регистрации антимикробной активности вводятся специальные флуоресцентные маркеры: (i) внутриклеточный флуоресцентный белок - для наблюдения за бактерией «таргетом», (ii) - флуоресцентный краситель - для идентификации живых клеток микроорганизмов и (iii) - флуоресцентный краситель для определения количества клеток бактерии «таргета» «на входе».

3) После инкубации при выбранных условиях проводится отбор «позитивных» инкапсулированных пар с использованием стандартного клеточного сортера (FACS Arialll или аналог) и подобранных условиях сортинга.

4) Полученные в результате отбора инкапсулированные пары анализируются методами NGS-секвенирования и масс-спектрометрии в режимах без и после культивации в стандартных условиях. Проводится биоинформатический анализ и определяются штаммы микроорганизмов и веществ, осуществляющих антимикробное действие.

Основным аналитическим сигналом, позволяющим дискриминировать инкапсулированные пары и провести их отбор с использованием клеточного цитофлуориметра-сортера (FACS), является флуоресценция. Таким образом, необходимо обеспечить флуоресцентный маркер, который с одной стороны позволит определить наличие бактерии в капле, с другой стороны будет коррелировать с количеством бактериальных клеток в капле, что позволит оценить их размножение. Наиболее простым решение этой задачи является введение ДНК-кодируемого флуоресцентного маркера. В качестве такого маркера нами был выбран зеленый флуоресцентный белок - GFP. Мы предполагаем, что отобранные рекомбинантные штаммы бактерий-патогенов будут выступать в качестве биосенсора антибиотической активности в каждой конкретной капле. При этом, если в каплю микрофлюидной двойной эмульсии попадает бактерия-эффектор, ингибирующая рост таргета своими метаболитами, таргет погибает и капля будет обладать низким уровнем флуоресценции GFP.

В качестве таргетных микроорганизмов выбран Staphylococcus aureus.

Staphylococcus aureus является одним из наиболее широко распространенных патогенов, вызывающих внутрибольничные инфекции, зачастую, обладает устойчивостью к антибиотикам (MRSA), что, в свою очередь, представляет большую угрозу для здоровья и жизни пациентов. Более 30% населения являются хроническими носителями S. aureus, кроме того было показано, что S. aureus может рассматриваться как внутриклеточный патоген, что в свою очередь может обуславливать его персистенцию в организме. С точки зрения патогенеза, S. aureus является одной из наиболее частых причин бактериемии, инфекционного эндокардита, инфекционных заболеваний кожи и мягких тканей. Ввиду высокой распространенности, а также способности развивать устойчивость к действию различных антибиотиков S. aureus был выбран в качестве основной мишени для поиска бактерий, ингибирующих его рост.

Для создания биосенсора на основе Staphylococcus aureus был выбран широко доступный штамм NCTC 8325 и экспрессионная векторная плазмида pALC 1420. Экспрессия GFP в векторе pALC1420 происходит под конститутивным sari промотором, что позволяет получать стабильную продукцию флуоресцентного белка.

Поставленная задача решается за счет создания штамма-продуцента на основе штамма Staphylococcus aureus NCTC 8325, трансформированного экспрессионной векторной плазмидой pALC1420, содержащей нуклеотидные последовательности конститутивного промотера sari, гена зеленого флуоресцентного белка GFP, гена cat устойчивости к хлорамфеникола, обеспечивающей стабильную внутриклеточную продукцию зеленого флуоресцентного белка GFP.

Изобретение иллюстрируют следующими графическими материалами:

Рис. 1. Использование бактериальных биосенсоров на основе штаммов клеток-бактерий-патогенов (таргетов). Таргеты, экспрессирующие GFP обозначены зеленым, эффекторы - серым, метаболиты эффекторов и мертвые таргеты - красным.

Рис. 2. Анализ секвенирования плазмидных ДНК клонов S. aureus/GFP.

Рис. 3. Анализ флуоресценции капель двойной эмульсии, содержащих биосенсор.

Изобретение иллюстрируют следующими примерами. ПРИМЕР 1

Создание биосенсора на основе клеток Staphylococcus aureus.

Трансформацию проводили стандартным методом электропорации. Для этого 1 мкг плазмидной ДНК смешивали со 100 мкл электрокомпетентных клеток Staphylococcus aureus NCTC 8325 и проводили электропорацию при напряжении 2.1 кВ/см, сопротивлении 100 Ом, емкость 25 мкФ. Полученную смесь инкубировали в 1 мл свежей среды SOB с 50 мМ глюкозы в течение 30 минут при 37°С и высевали на две чашки Петри с 10 мкг/мл хлорамфеникола в количестве 100 и 900 мкл. Через 10-16 часов при инкубации в термостате при 37°С обнаружили появление единичных колоний салатового цвета ввиду внутриклеточной продукции GFP под конститутивным промотором sari. Все колонии имели схожий уровень зеленой флуоресценции. Эффективность трансформации составила 3.3×103 колоний/мкг.

ПРИМЕР 2

Анализ флуоресценции биосенсора.

Клетки S. aureus культивировали в среде 2YT с 10 мкг/мл хлорамфеникола в случае. Культивацию проводили в колбе при 37°С при 250 об/мин. достижения логарифмической фазы роста (4-6 часов). Полученные суспензии клеток промывали 3 раза средой для кокультивации (0.16% триптона, 0.1% дрожжевого экстракта, 0.05% NaCl, 0.5% глицерина, 0.67% YNB и 1 мМ ИПТГ), после чего подвергались фильтрации с использованием клеточных сит с размером пор 40 мкм (Greiner Bio-One, Германия) и разводились до 0.1 ОЕ600 (λ=10). Клетки подвергались инкапсуляции с использованием 60 мкм чипов. Полученная эмульсия инкубировалась в течение 48 часов при 25°С. Капли были отобраны с использованием клеточного сортера FACSAria III (BD, США). Выбор популяции капель двойной эмульсии осуществлялся с использованием светорассеяния и фоновой флуоресценции субстрата или ростовой среды.

Приложение 1.

Нуклеотдная последовательность плазмидной ДНК S. aureus/GFP, участок относящийся к флуоресцентному белку.

Приложение 1.

Нуклеотдная последовательность плазмидной ДНК S. aureus/GFP, участок относящийся к флуоресцентному белку.

--->

Перечень последовательностей

<110> IBCh RAS

Gabibov A.G., Smirnov I.V., Terekhov S.S.

<120> БИОСЕНСОР НА ОСНОВЕ КЛЕТОК STAPHYLOCOCCUS AUREUS, СТАБИЛЬНО ПРОДУЦИРУЮЩИХ ЗЕЛЕНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК, ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ УЛЬТРАВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО СКРИНИНГА

<140> 2017146640/10(079672)

<141> 2017-12-28

<160> 1

<170> PatentIn 3.5.1

<210> 1

<211> 760

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Sequenced recombinant S.aureus/GFP region

<400> 1

atccccgggt accggtagaa aaaatgagta aaggagaaga acttttcact ggagttgtcc 60

caattcttgt tgaattagat ggtgatgtta atgggcacaa attttctgtc agtggagagg 120

gtgaaggtga tgcaacatac ggaaaactta cccttaaatt tatttgcact actggaaaac 180

tacctgttcc atggccaaca cttgtcacta ctttctctta tggtgttcaa tgcttttccc 240

gttatccgga tcatatgaaa cggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg 300

tacaggaacg cactatatct ttcaaagatg acgggaacta caagacgcgt gctgaagtca 360

agtttgaagg tgataccctt gttaatcgta tcgagttaaa aggtattgat tttaaagaag 420

atggaaacat tctcggacac aaactcgagt acaactataa ctcacacaat gtatacatca 480

cggcagacaa acaaaagaat ggaatcaaag ctaacttcaa aattcgccac aacattgaag 540

atggatccgt tcaactagca gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg 600

tccttttacc agacaaccat tacctgtcga cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg 660

aaaagcgtga ccacatggtc cttcttgagt ttgtaactgc tgctgggatt acacatggca 720

tggatgagct ctacaaataa tgaattccaa ctgagcgccg 760

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм-продуцент на основе штамма Staphylococcus aureus NCTC 8325, трансформированного экспрессионной векторной плазмидой pALC1420, содержащей нуклеотидные последовательности конститутивного промотера sar1, гена зеленого флуоресцентного белка GFP, гена cat устойчивости к хлорамфениколу. Изобретение обеспечивает стабильную внутриклеточную продукцию зеленого флуоресцентного белка GFP. 3 ил., 2 пр.

Штамм Staphylococcus aureus, обеспечивающий стабильную внутриклеточную продукцию зеленого флуоресцентного белка GFP и полученный трансформацией Staphylococcus aureus NCTC 8325 экспрессионной векторной плазмидой pALC1420, содержащей нуклеотидные последовательности конститутивного промотера sar1, гена зеленого флуоресцентного белка GFP, гена cat устойчивости к хлорамфениколу.