СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ СОРТАЗЫ А Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 C12R1/445 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно: к технологии получения живых флуоресцентных микроорганизмов и может быть использовано в биотехнологии для поиска антимикробных препаратов, обладающих бактериостатическим или бактерицидным действием по отношению к различным штаммам бактерии Staphylococcus aureus (S. aureus).

Широкое распространение антибиотикоустойчивости у патогенных микроорганизмов является серьезной проблемой при лечении инфекционных заболеваний. Бактерии быстро приобретают устойчивость к новым антибиотикам, что делает антибиотикотерапию неэффективной. Кроме того, использование антибиотиков неселективно и наносит значительный урон полезной микрофлоре человека. В отличии от классических антибиотиков антимикробные вещества, ингибирующие сортазу А у золотистого стафилококка, не убивают бактерии, но значительно снижают их патогенность, что превращает эти патогенные бактерии в обычных безвредных симбионтов. Вещества ингибирующие сортазы крайне видоспецифичны, поэтому их применение не приводит к изменениям в полезной микрофлоре человека и животных. Считается, что к таким веществам у микроорганизмов не вырабатывается устойчивость, поэтому проблема возникающей резистентности также отпадает.

В патенте RU 2722627 C2 (28.06.2019 г., МПК C12N 1/21, C12N 15/63, C12R 1/445) немодифицированный белок GFP экспрессируется внутри клеток S. aureus, таким образом определяется влияние ингибиторных веществ на клетку в целом. Этот метод не может быть использован для поиска ингибиторов активности сортазы А в золотистом стафилококке, поскольку подавляет любой синтез GFP. При поиске ингибиторов сортазы необходимо различать клетки с разной степенью прикрепления молекул GFP.

В патенте CN 111007043 A (14.04.2020 г., МПК C12N 15/70; C12N 15/74; G01N 1/28; G01N 1/38; G01N 1/42; G01N 1/44; G01N 21/64) «МЕТОД ИЗМЕРЕНИЯ ИНТЕНСИВНОСТИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ EGFP, ОТОБРАЖАЕМОГО НА ПОВЕРХНОСТИ СТАФИЛОКОККА КАРНОЗУСА 10» белок EGFP с модификацией используется для определения степени дезинтеграции клеточной стенки, поскольку разрушение клеточной стенки высвобождает светящийся белок в буферный раствор ФСБ (фосфатно-солевой буфер). Таким образом, авторы патентуют использование свободного EGFP для определения степени разрушения ранее меченных клеток. Изобретение раскрывает способ измерения степени разрушения клеточных стенок Staphylococcus carnosus после их обработки жидким азотом. Последовательность LPXTG распознается сортазой А и после чего модифицированный EGFP присоединяется к клеточной стенке стафилококка. Степень высвобождения EGFP-LPXTG измеряют по флюоресценции свободного белка, растворенного в буферном растворе ФСБ. Принцип метода заключается в том, что специфическая последовательность в поверхностном дисплее Staphylococcus carnosus, так что якорная последовательность соединяется с поперечным мостиком клеточной стенки в виде амидных связей, а эффект поверхностного дисплея проявляется достигнуто. Клеточные стенки разрушают посредством измельчения в жидком азоте, слитый белок отделяют от клеточных стенок и растворяют в буферном растворе ФСБ, а интенсивность флуоресценции дисплейного белка EGFP отображают с помощью флуороспектрофотометра.

Однако в уровне техники и, в частности в выше процитированных источниках информации, не раскрыт принцип использовании GFP-LPGTG для определения влияния ингибиторов на специфичную активность сортазы А.

Задачей заявленного изобретения является создание системы тестирование анти-сортазной активности, позволяющей дать однозначный результат за сравнительно короткое время тестирования анти-сортазной активности.

Технический результат - повышение эффективности тестирование антимикробных веществ, действующих на сортазу и получение однозначного ответа о действии тестируемого вещества на сортазу.

Для достижения указанного технического результата предложен способ определения активности сортазы А, включающий добавление к культуре клеток золотистого стафилококка S. aureus выделенного и очищенного, которая узнается сортазой А, после чего сортаза А ковалентно присоединяет белок с указанными аминокислотами к клеточной стенке золотистого стафилококка S. aureus и клетки золотистого стафилококка S. aureus начинают флюоресцировать в диапазоне белка GFP, если сортаза активна, причем 5 мл указанной смеси клеток золотистого стафилококка S. aureus и белка GFP, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, отделяют и используют в качестве негативного контроля ингибиторной активности против сортазы А, причем в две другие порции по 5 мл смеси клеток золотистого стафилококка S. aureus и белка GFP, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, добавляют пептидный ингибитор LPRDA, или пептидомиметик KUD748 ((2R,3S,3aR,6aS)-2-(4-бромфенил)-5-((S)-1-(((S)-3-карбокси-1-(((S)-1-карбоксиэтил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-5-гуанидино-1-оксопентан-2-ил)-6а-метил-4,6-диоксооктагидропирроло[3,4-b]пиррол-3-карбоновая кислота), или пептидомиметик KUD146 (((S)-4-((((S)-1-карбоксил)амино)-3-((S)-2-((2R,3S,5S)-2-(4-фторфенил)-5-(метоксикарбонил)-1,5-диметилпирролидин-3-карбоксамидо)-5-гуанидинопентанамидо)-4-оксобутановая кислота)) в концентрации 10 мкг/мл, все порции смеси инкубируют в течение 10 часов, после инкубации клетки отмывают от белка GFP, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, фосфатно-солевым буфером, ресуспендируют и измеряют флюоресценцию суспензии клеток золотистого стафилококка S. aureus, обработанных пептидным ингибитором LPRDA, или KUD748, или KUD146, сравнивают флюоресценцию контроля и суспензии клеток золотистого стафилококка S. aureus, обработанных ингибитором LPRDA, или KUD748, или KUD146.

Для изучения активности сортазы и тестирования ее потенциальных ингибиторов были разработаны несколько различных подходов, основанных либо на использовании рекомбинантного фермента, либо на анализе связывания ингибиторов с бактериальными клетками, либо на основе эндогенного мечения бактериальных клеток. Инкубирование бактериальных клеток с флуоресцентным субстратом (например, Abz/Dnp), позволяет следить за степенью расщепления ферментом субстрата и закрепления флуорофора на пептидогликане бактериальной клетки. Поскольку в основе действия белка SrtA лежит способность к распознаванию мотива LPGTG (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1), можно создать систему для тестирования ингибиторов ее работы путем модификации последовательности флуоресцентных белков, добавляя к ним мотив, распознающийся сортазой А. В результате флуоресцентные белки будут пришиваться к поверхности клеток S. aureus и по уровню флюоресценции можно судить об эффективности протекания данного процесса. В данном решении предложена цельноклеточная тест-система для поиска ингибиторов сортазы А золотистого стафилококка, в основе которой лежит регистрация сигнала флуоресценции белка GFP слитого с последовательностью сигнала сортировки клеточной стенки LPGTG (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1), инкубируемого с клетками S. aureus штамма RN4220.

На фиг. 1 представлено измерении флюоресценции после инкубации клеток с белком GFP и GFP-LPGTG (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1).

На фиг. 2 - Секвенированная последовательность плазмиды pETGB1α:GFP-LPGTG, содержащий ген, кодирующий белок GFP-LPGTG (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1).

На фиг. 3 - Структура белка GFP-LPGTG (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1).

На фиг. 4 - Уровень флуоресценции клеток S. aureus RN4220 при добавлении белка GFP-LPGTG и ингибиторов (нумерация образцов приведена в Примере 4).

На фиг. 5 Уровень флуоресценции клеток S. aureus RN4220 при добавлении белка GFP-LPGTG и ингибиторов.

Для осуществления данного способа разработан генно-инженерный продукт флюоресцирующий белок GFP (green fluorescent protein) с последовательностью в пять аминокислотных остатков на С-конце белка LPGTG.

Первичная нуклеотидная последовательность модифицированного гена gfp, приведена на рисунке 2. Область, на 3'-конце модифицированного гена gfp, где добавлены дополнительные нуклеотиды, кодирующие аминокислоты сортазоспецифичного участка (LPGTG).

Структура белка GFP-LPGTG (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1) приведена на рисунке 3. Пептид LPGTG (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1) расположен на С-конце указанного белка.

Аминокислотная последовательность белка GFP-LPGTG (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1), красным выделены остатки гистидина облегчающие выделение белка из общей массы белков E.coli, зеленым цветом выделены аминокислотные остатки, узнаваемые сортазой А золотистого стафилококка.

Для создания конструкции на основе белка GFP были разработаны праймеры для сайт-направленно го мутагенеза, содержащие мотив LPGTG (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1), распознаваемый сортазой А. Были использованы следующие праймеры, изготовленные компанией ЗАО «Евроген»:

Пример 1

Культуру S. aureus штамма NCTC 8325 выращивали в течении 15 часов и инокулировали до конечной плотности ОП590=0,1 в 20 мл свежей среды LB, содержащей белок GFP-LPGTG (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1) в концентрации 0,1 мг/мл. Пять мл среды отделяли и использовали в качестве негативного контроля ингибиторной активности против сортазы А. В две другие порции по 5 мл указанной смеси клеток золотистого стафилококка S. aureus и белка GFP, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, добавляли пептидный ингибитор LPRDA, или пептидомиметик KUD748 ((2R,3S,3aR,6aS)-2-(4-бромфенил)-5-((S)-1-(((S)-3-карбокси-1-(((S)-1-карбоксиэтил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-5-гуанидино-1-оксопентан-2-ил)-6а-метил-4,6-диоксооктагидропирроло[3,4-b]пиррол-3-карбоновая кислота), или пептидомиметик KUD146 (((S)-4-((((S)-1-карбоксиэтил)амино)-3-((S)-2-((2R,3S,5S)-2-(4-фторфенил)-5-(метоксикарбонил)-1,5-диметилпирролидин-3-карбоксамидо)-5 гуанидинопентанамидо)-4-оксобутановая кислота)) в концентрации 10 мкг/мл. Все варианты инкубировали в течение 10 часов при 37°С. Далее клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 5 минут и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ). Клетки ресуспендировали в 2 мл ФСБ, распределяли по 200 мкл по 8 лункам планшета и измеряли флюоресценцию (при возбуждении Ех=485 нм) на 520 нм. При статистически значимой разнице (неперекрывающиеся интервалы стандартного отклонения) негативного контроля и всех остальных вариантов вещества считали ингибиторными для сортазы A S. aureus.

Пример 2

Качество очищенного белка GFP- LPGTG (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1) для определения активности сортазы А в живой клетке золотистого стафилококка определяли по сравнению с немодифицированным GFP. Для этого 500 мкл культуры золотистого стафилококка, выращенной в среде LB при 37°С в течение 17 часов, переносили в мини-пробирку типа «эппендорф» и центрифугировали на миницентрифуге MiniSpin (Eppendorf, ФРГ) со скоростью 4000 об/мин в течение пяти минут. Супернатант удаляли, а клетки ресуспендировали в 500 мкл свежей среды LB. К культуре клеток добавляли очищенный белок GFP-LPGTG (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1) и инкубировали в течение 10 часов. После инкубации клетки центрифугировали на миницентрифуге MiniSpin (Eppendorf, ФРГ) со скоростью 4000 об/мин в течение пяти минут, супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в 500 мкл ФСБ. После чего клетки опять центрифугировали на миницентрифуге MiniSpin (Eppendorf, ФРГ) со скоростью 4000 об/мин в течение пяти минут, супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в 500 мкл свежего ФСБ, для удаления несвязавшегося с клетками белка GFP- LPGTG. Флюоресценцию суспензии клеток измеряли (рис. 1) на многорежимном микропланшетном ридере Varioskan™ LUX (Thermo Scientific, США). Те же самые манипуляции проводили для исходного белка GFP.

Пример 3

Культуру клеток S. aureus RN4220 выращивали в среде LB без добавления антибиотиков в течении 17 часов при постоянной температуре 37°С и покачивании 180 об/мин. Полученные клетки были разведены до OD595=0,1 о.е.

Работа тест-системы основана на применении флуоресцентного белка GFP с добавленным к его последовательности мотивом LPGTG (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1), распознающимся сортазой А золотистого стафилококка. В результате, при инкубировании такого белка с культурой клеток S. aureus флуоресцентный белок пришивается к мембране и последующей отмывкой клеток от не связавшегося белка получаются флуоресцирующие клетки S. aureus. Если при инкубации добавлять ингибиторы сортазы А, то уровень флуоресценции должен снижаться так как GFP с LPGTG (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1) довеском не будет пришиваться сортазой А.

Для проведения эксперимента были приготовлены следующие образцы:

1) Контроль: (500 мкл) + GFP (90 мкг),

2) S. aureus (500 мкл) + GFP-LPGTG (90 мкг),

3) S. aureus (500 мкл) + GFP -LPGTG (90 мкг) + LPRDA (180 мкг),

4) S. aureus (500 мкл) + GFP -LPGTG (90 мкг) + LPRDA (360 мкг),

5) S. aureus (500 мкл) + GFP -LPGTG (90 мкг) + KUD748 (180 мкг),

6) S. aureus (500 мкл) + GFP -LPGTG (90 мкг) + KUD748 (360 мкг),

7) S. aureus (500 мкл) + GFP -LPGTG (90 мкг) + KUD146 (180 мкг),

8) S. aureus (500 мкл) + GFP -LPGTG (90 мкг) + KUD146 (360 мкг),

9) S. aureus (500 мкл) + GFP (180 мкг),

10) S. aureus (500 мкл) + GFP -LPGTG (180 мкг),

11) S. aureus (500 мкл) + GFP -LPGTG (180 мкг) + KUD748 (360 мкг),

12) S. aureus (500 мкл) + GFP -LPGTG (180 мкг) + KUD146 (360 мкг).

Образцы инкубировались в течении 10 часов при 37°С и покачивании 180 об/мин. Далее клетки были осаждены центрифугирование в течении 5 минут при 5000 об/мин и ресуспендированы в 1000 мкл буфера А (20 мМ HEPES-KOH рН 7.5, 100 мМ NH4Cl, 21 мМ MgOAc, 1 мМ EDTA, 1 мМ DTT). Эта процедура была выполнена 3 раза для удаления не связавшихся с клеточной мембраной белков GFP или GFP-LPGTG. Осажденные после трех промывок клетки были ресуспендированы в 50 мкл буфера А. Данные были получены на многорежимном микропланшетном ридере Varioskan™ LUX (Thermo Scientific). Для снижения уровня ошибки каждый образец вносился в три разные лунки планшета регистрация данных проводилась в двух повторностях. Измерения производились при ширине полосы возбуждения (excitation bandwidth) 12 нм и 5 нм.

Пример 4

Для тестирования потенциальных ингибиторов были приготовлены следующие образцы:

1) Контроль: (500 мкл) + GFP (90 мкг),

2) S. aureus (500 мкл) + GFP-LPGTG (90 мкг),

3) S. aureus (500 мкл) + GFP -LPGTG (90 мкг) + LPRDA (180 мкг),

4) S. aureus (500 мкл) + GFP -LPGTG (90 мкг) + LPRDA (360 мкг),

5) S. aureus (500 мкл) + GFP -LPGTG (90 мкг) + KUD748 (180 мкг),

6) S. aureus (500 мкл) + GFP -LPGTG (90 мкг) + KUD748 (360 мкг),

7) S. aureus (500 мкл) + GFP -LPGTG (90 мкг) + KUD146 (180 мкг),

8) S. aureus (500 мкл) + GFP -LPGTG (90 мкг) + KUD146 (360 мкг).

Образцы инкубировались в течении 10 часов при 37°С. Далее клетки были осаждены центрифугированием в течение 5 минут при 5000 об/мин и ресуспендированы в 500 мкл ФСБ. Эта процедура была выполнена 2 раза для удаления не связавшихся с клеточной мембраной белков GFP или GFP-LPGTG (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1). Осажденные после двух промывок клетки были ресуспендированы в 500 мкл ФСБ. 200 мкл клеточной суспензии обработанных клеток стафилококка золотистого помещали в лунки планшета. Измерения флуоресценции проводили в многорежимном микропланшетном ридере Varioskan™ LUX (Thermo Scientific, США). Для снижения уровня ошибки каждый образец вносился в три разные лунки планшета регистрация данных проводилась в двух повторностях. Возбуждение белка GFP производили при длине волны 395 нм, а детекция флюоресценции производилась при 508 нм.

Так же, как и в третьем примере добавление GFP-LPGTG к клеткам золотистого стафилококка статистически достоверно увеличивало флюоресценцию бактериальной суспензии по сравнению с добавлением GFP.

На фиг. 4 и 5 отражен уровень флуоресценции клеток S. aureus RN4220 при добавлении белка GFP-LPGTG (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1) и ингибиторов.

Из представленных выше данных можно сделать вывод, что добавление ингибитора LPRDA при инкубировании клеток S. aureus с GFP-LPGTG (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1) приводит к снижению уровня флуоресценции до уровня значений контроля, при этом увеличение его количества сопутствуется снижением уровня флюоресценции, что подтверждает действенность данного ингибитора.

Стоит отметить, что ингибитор LPRDA демонстрировал большую эффективность, по сравнению с KUD748 и KUD146. Ингибитор KUD748 так же демонстрировал большую эффективность, чем ингибитор KUD146.

Таким образом, с помощью разработанного способа тестирования ингибиторов сортазы А было показано, что олигопептид LPRDA и пептидомиметик KUD748 эффективно ингибируют связывание флуоресцентного белка GFP-LPGTG с сортазой А золотистого стафилококка.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="GFP-LPGTG.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2024-04-26">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode></IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-04-04</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>2024100359/20(000649)</ApplicantFileReference

>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки «Федеральный исследовательский центр

Казанский научный центр Российской академии наук</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal State Budgetary Institution of Science

Federal Research Center Kazan Scientific Center of Russian Academy of

Sciences</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

СОРТАЗЫ А</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>1</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>326</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..326</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Staphylococcus

aureus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>PEPTIDE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>321..325</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>lptgt peptide recognized by sortase

A</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>PEPTIDE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>3..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>six histidine residues to use for

affinity chromatography purification</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MKHHHHHHPMKQYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGV

DGEWTYDDATKTFTVTEGSGSGSENLYFQGAMGKVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGD

ATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFGYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNY

KTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSV

QLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKLPGTG</I

NSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу определения активности сортазы А, включающему добавление к культуре клеток золотистого стафилококка S. aureus выделенного и очищенного белка GFP-LPGTG с дополнительной последовательностью на C-конце белка LPGTG, которая узнается сортазой А, после чего сортаза А ковалентно присоединяет белок с указанными аминокислотными остатками к клеточной стенке золотистого стафилококка S. aureus и клетки золотистого стафилококка S. aureus начинают флюоресцировать в диапазоне белка GFP, если сортаза активна. Причем 5 мл указанной смеси отделяют и используют в качестве негативного контроля ингибиторной активности против сортазы А, а в две другие порции по 5 мл смеси добавляют ингибитор LPRDA, или KUD748, или KUD146. Все порции смеси инкубируют, клетки отмывают от белка GFP-LPGTG, ресуспендируют и измеряют флюоресценцию суспензии клеток золотистого стафилококка S. aureus, обработанных ингибитором LPRDA, или KUD748, или KUD146. Сравнивают флюоресценцию контроля и суспензии клеток золотистого стафилококка S. aureus, обработанных ингибитором LPRDA, или KUD748, или KUD146. Изобретение обеспечивает повышение эффективности тестирования антимикробных веществ, действующих на сортазу, и получение однозначного ответа о действии тестируемого вещества на сортазу А золотистого стафилококка. 5 ил., 4 пр.

Способ определения активности сортазы А, включающий добавление к культуре клеток золотистого стафилококка S. aureus выделенного и очищенного белка GFP, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, которая узнается сортазой А, после чего сортаза А ковалентно присоединяет белок с указанными аминокислотами к клеточной стенке золотистого стафилококка S. aureus и клетки золотистого стафилококка S. aureus начинают флюоресцировать в диапазоне белка GFP, если сортаза активна, причем 5 мл указанной смеси клеток золотистого стафилококка S. aureus и белка GFP, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, отделяют и используют в качестве негативного контроля ингибиторной активности против сортазы А, причем в две другие порции по 5 мл смеси клеток золотистого стафилококка S. aureus и белка GFP, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, добавляют пептидный ингибитор LPRDA, или пептидомиметик KUD748 ((2R3S,3aR,6aS)-2-(4-бромфенил)-5-((S)-1-(((S)-3-карбокси-1-(((S)-1-карбоксиэтил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-5-гуанидино-1-оксопентан-2-ил)-6а-метил-4,6-диоксооктагидропирроло[3,4-b]пиррол-3-карбоновая кислота), или пептидомиметик KUD146 (((S)-4-((((S)-l-арбоксиэтил)амино)-3-((S)-2-((2R,3S,5S)-2-(4-фторфенил)-5-(метоксикарбонил)-1,5-диметилпирролидин-3-карбоксамидо)-5-гуанидинопентанамидо)-4-оксобутановая кислота)) в концентрации 10 мкг/мл, все порции смеси инкубируют в течение 10 часов, после инкубации клетки отмывают от белка GFP, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, фосфатно-солевым буфером, ресуспендируют и измеряют флюоресценцию суспензии клеток золотистого стафилококка S. aureus, обработанных пептидным ингибитором LPRDA, или KUD748, или KUD146, сравнивают флюоресценцию контроля и суспензии клеток золотистого стафилококка S. aureus, обработанных ингибитором LPRDA, или KUD748, или KUD146.