Штамм метилотрофных дрожжей PICHIA PASTORIS Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG, продуцирующий рекомбинантный человеческий трансферрин, содержащий аминокислотные замены N413D и N611D Российский патент 2020 года по МПК C12N1/19 C12N15/11 C12N15/81 

Описание патента на изобретение RU2723084C1

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению модифицированного рекомбинантного трансферрина человека, содержащего аминокислотные замены N413D и N611D (ТФР). Изобретение может быть использовано для получения бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих.

Объектом изобретения является штамм метилотрофных дрожжей Pichia Pastoris Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG, продуцирующий модифицированный рекомбинантный человеческий трансферрин, содержащий аминокислотные замены N413D и N611D.

Трансферрин является гликопротеином, связывающим железо, и его используемые концентрации в бессывороточной среде находятся в диапазоне 1-30 мкг/мл. Трансферрин взаимодействует с определенными рецепторами клеточной поверхности и играет важную роль в транспортировке железа через плазматическую мембрану [Bretscher, М.S. // Sci Am., 1985; Trowbridge, I.S. et al. // Proc Natl Acad Sci USA. 1981]. Белок имеет в своей структуре два высокоаффинных сайта связывания ионов Fe3+ [Barnes D. et al. // Cell 1980.]. Железо, проникающее в клетки за счет трансферрин-опосредованного эндоцитоза поддерживает обменные процессы и рост эукариотических клеток [Richardson, D.R. et al. // Cell Physiol. 1994.]. Также трансферрин может иметь дополнительные функции in vitro, такие как хелатирование вредных следовых металлов в культуральной среде. Добавление солей железа без хелатирующего агента может приводить к образованию свободных радикалов и токсическому воздействию на клетки. Кроме того, образование нерастворимых гидроксидов железа может сделать железо биологически недоступным. Таким образом, трансферрин является необходимым компонентом культуральных сред.

В настоящее время ряд коммерчески доступных бессывороточных уже содержат в своем составе рекомбинантный трансферрин, однако, абсолютное большинство содержит трансферрин, очищенный из сыворотки крови животных и человека. Однако, при получении ТФР таким образом существует риск его контаминации различными биологически активными инфекционными агентами, обусловленный сложностями их детекции и инактивации. Использование ростовых сред, содержащих в своем составе трансферрин сыворотки крови может, привести к дальнейшей контаминации подобными агентами получаемых фармацевтических белков. В связи с этим получение рекомбинантного трансферрина для последующего его использования в составе бессывороточных питательных сред представляется востребованным с точки зрения современных требований биобезопастности фармпрепаратов, применяемых для профилактики и лечения различных заболеваний человека.

Известен способ получения рекомбинантного ТФР в прокариотической системе Escherichia coll В случае бактериальных клеток Е. coli нуклеотидная последовательность трансферрина была клонирована под контролем taq-промотора. Уровень экспрессии ТФР достигал 60 мг/л [DeSmit М.Н. et al. // bit J Biochem Cell Biol. 1995].

Недостатком данного способа является накопление до 95% целевого белка в виде нерастворимых агрегатов, что может быть обусловлено сложной структурой трансферрина и большим количеством дисульфидных связей. Авторы не приводят уровень продукции функционально-активного ТФР.

Известны способы получения рекомбинантного ТФР клетками фибробластов почки сирийского хомячка (ВНК). Авторы показали, что уровень экспрессии ТФР составил 125 мг/л, однако полученный белок представлял из себя смесь гликозилированных форм 16 различных молекулярных масс. Мутации двух аспарагиновых остатков привели к уменьшению уровня экспрессии целевого белка до 25 мг/л, однако, наряду с гликозилированными формами, белок сохранял свою биологическую активность, сравнимую с таковой нативного белка [Mason А.В. et al. // Biochemistry. 1993]. Авторам [Mason А.В. et al. //Protein Expression Purif. 2001] удалость получить продуктивность 40 мг/л в случае рекомбинантного ТФР, содержащего последовательность шести гистидинов и 50 мг/л в случае негликозилированного ТФР.

Недостатками данных способов является гетерогенность целевого белка в случае гликозилированной формы или невысокий уровень экспрессии в случае негликозилированного ТФР наряду низкой производительностью, обусловленной медленными темпами роста культуры ВНК и высокими затратами на получение.

Известен способ получения трансгенного ТФР в Nicotiana tabacum (табак обыкновенный) и в Oryza sativa (рис посевной) в виде как полноразмерного так и фьюжн белка [Brandsma М.Е. et al. // Plant Biotechnol J. 2010; Zhang D. et al. // Protein Expr Purif. 2010], с содержанием целевого белка в 33.5 мг/кг свежих листьев и 10 г/кг сухих семян соответственно. Функциональная активность полученного белка подтверждалась обратимым связыванием железа in vitro. Помимо этого, полученный таким образом ТФР, проявляет бактериостатическую активность, поддерживает пролиферацию клеток в бессывороточной среде и эффективно интернализуется в клетки млекопитающих in vitro [Zhang D, et al. // BMC Biotechnol. 2012].

Недостатками данного способа является медленный темп роста трансгенных растений и трудоемкость процесса выделения целевого белка.

Известен способ получения рекомбинантного ТФР в дрожжах Saccharomyces cerevisiae.

Коллективу авторов [Finnis C.J. et al. //Microbial Cell Factories 2010] удалось получить уровень продукции более 2.2 г/л негликозилированной формы трансферрина, содержащей мутации N413Q и N611Q, в условиях культивирования в ферментере. Авторы использовали различные штаммы S. cerevisiae, содержащие эписомальные вектора на основе 2um дрожжевых плазмид, имеющих в своем составе последовательность ТФР вместе с различными сигнальными последовательностями под контролем PRB1 промотора, ADH1 терминатор и селективный LEU2 маркер. Исследователями также показано, что использование сигнальных последовательностей ЧСА и гибридной ЧСА-MFα-1 приводит к более высокому уровню экспрессии ТФР, однако в результате неполного или неспецифического процессинга лидерного пептида секретируемый белок представляет собой гетерогенную смесь. Секрецию корректно процессированного и гомогенного функционально активного ТФР обеспечивала только сигнальная последовательность инвертазы Suc2.

Другой коллектив авторов показал, что полученный в дрожжах S. cerevisiae негликозилированный ТФР может успешно применятся в составе бессывороточных ростовых сред [Sargent P.J. et al. // Biometals. 2006].

Недостатками данного способа является нестабильность используемых дрожжевых эписомальных плазмид, которая может приводить к уменьшению уровня продукции рекомбинантных белков в течение длительных культивационных процессов, особенно при промышленном производстве [Ruben Н. et al. // Yeast 2017; Ruben H. et al. // FEMS Yeast Research 2019; Ruben H. et al. // Appl Microbiol Biotechnol. 2017].

Известен способ получения функционально активного, корректно процессированного рекомбинантного ТФР в дрожжах Pichia pastoris [Mizutani K. et al. // Biosci Biotechnol Biochem 2010.]. Полученный белок имел два сайта гликозилирования с углеводными цепями, содержащими 12 и 6 маннозных остатков. Уровень экспрессии ТФР в условиях экспрессии в «богатой» среде, содержащей пептон, дрожжевой экстракт и дрожжевую азотную основу составил 30 мг/л.

Недостатками данного способа является невысокий уровень продукции ТФР. Присутствие в структуре ТФР гетерогенных олигосахаридных цепей ограничивает его использование в составе ростовых сред, поскольку это может привести к контаминации получаемых в них фармацевтических белков и, как следствие, нежелательными иммунными реалиями.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма метилотрофных дрожжей P. pastoris, секретирующий рекомбинантный сывороточный трансферрин, не содержащий N-гликозилирования, в культуральную среду на уровне 100 мг/л в условиях роста в минимальной солевой среде.

Ближайшим аналогом заявленного изобретения является публикация [Mizutani K. et al. // Biosci Biotechnol Biochem 2010.], в которой описано получение функционально активного, корректно процессированного рекомбинантного ТФР в дрожжах Pichia pastoris, секретирующих ТФР в культуральную среду на уровне 30 мг/л, которая принята в качестве прототипа.

Поставленная задача решается за счет:

увеличения числа копий кДНК гена ТФР, интегрированных в дрожжевой геном, за счет котрансформации штамма метилотрофных дрожжей P.pastoris экспрессионными генетическими конструкциями pPIC9GAPalpha-short_hTFNG и pGAPZalpha-short_hTFNG, каждая из которых содержит последовательность кДНК кодирующая модифицированный сывороточный трансферрин человека, содержащий мутации N413Q и N611Q,

использования нуклеотидной пре-последовательность alpha-short сигнального пептида альфа-фактора дрожжей Saccharomyces cerevisiae, что в ряде случаев может увеличивать уровень экспрессии рекомбинантных белков дрожжами P. pastoris [Zlobin А. et al. // Front Pharmacol. 2018],

культивирования клеток штамма-продуцента в минимальной солевой среде в условиях роста при высокой плотности в ферментере.

Обозначение «рР1С9» и «pGAPZ» в экспрессионных генетических конструкциях pPIC9GAPalpha-short_hTFNG и pGAPZalpha-short_hTFNG (Рис. 1А и Б) отражает содержание структурных элементов плазмидных ДНК pPIC9k и pGAPZaA ("Invitrogen", США) соответственно. Генетические конструкции pPIC9GAPalpha-short_hTFNG и pGAPZalpha-short_hTFNG содержат:

промотор гена глицерид-3-фосфат дегидрогеназы GAP дрожжей Pichia pastoris (указанные структурные признаки отражены во введенном обозначении «GAP»),

нуклеотидную пре-последовательность alpha-short сигнального пептида альфа-фактора дрожжей Saccharomyces cerevisiae, находящуюся в единой рамке считывания с кДНК гена модифицированного ТФР (N413Q и N611Q), что обеспечивает секрецию ТФР в культуральную среду (указанные структурные признаки отражены во введенном обозначении «alpha-short»),

нуклеотидную последовательность кДНК гена модифицированного трансферрина человека, кодирующую ТФР с аминокислотными заменами N413Q и N611Q, что обеспечивает продукцию белка, не содержащего N-гликозилирования (указанные структурные признаки отражены во введенном обозначении «hTFNG»),

нативный терминатор и сигнал полиаденилирования гена алкоголь оксид азы АОХ1 дрожжей Pichia pastoris,

точку начала репликации плазмид pUCori.

Помимо указанных нуклеотидных последовательностей экспрессионная генетическая конструкция pPIC9GAPalpha-short_hTFNG содержит:

последовательность гена bla, продукт которого обеспечивает устойчивость трансформантов E.coli к антибиотику ампициллин,

последовательность гена HIS4, продукт которого позволяет комплементировать ауксотрофность по гистидину у трансформантов дрожжей P. pastoris штамма GS115.

Помимо указанных выше нуклеотидных последовательностей экспрессионная генетическая конструкция pGAPZalpha-short_hTFNG содержит:

последовательность гена фактора элонгации 1 Saccharomyces cerevisiae TEF1, конститутивную синтетическую промоторную последовательность ЕМ7, последовательность гена блеомицина BleoR Streptoalloteichus hindustanus, продукт которого обеспечивает устойчивость трансформантов к антибиотику зеоцину,

3'-концевую последовательность гена цитохрома C1 CYC1 Saccharomyces cerevisiae.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение штамма метилотрофных дрожжей Pichia pastoris, секретирующих модифицированный ТФР в культуральную среду на уровне 100 мг/л в условиях роста в минимальной солевой среде.

Заявленное изобретение иллюстрируют следующими графическими материалами:

Рис. 1. Схема экспрессионных генетических конструкций pPIC9GAPalpha-short_hTFNG (А) и pGAPZalpha-short_hTFNG (Б).

Рис. 2. Вестерн-блот анализ аликвот культуральной среды. 1 - культуральная среда после культивирования клеток штамма Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG, 2 - культуральная среда после культивирования нетрансформированных клеток P.pastoris штамма GS115, 3 - препарат трансферрина человека, выделенный из плазмы крови «Sigma aldrich», США. Визуализацию проводили, используя поликлональные антитела козы к трансферрину человека и антивидовые антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена.

Рис. 3. Гистограмма значений результатов ИФА, отражающая уровень экспрессии ТФР клетками штамма Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG при культивировании в минимальной солевой среде в условиях роста при высокой плотности в ферментере. Визуализацию проводили, используя поликлональные антитела козы к трансферрину человека и антивидовые антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена.

Изобретение иллюстрируют следующими примерами.

ПРИМЕР 1

Создание генетических конструкций pPIC9GAPalpha-short_hTFNG и pGAPZalpha-short_hTFNG.

Фрагмент ДНК, содержащий нуклеотидную пре-последовательность alpha-short сигнального пептида альфа-фактора дрожжей Saccharomyces cerevisiae в единой рамке считывания с нуклеотидной последовательностью кДНК гена модифицированного трансферрина человека (N413Q и N611Q), амплифицируют методом ПЦР с плазмиды pNUTN6HishTFNG, («Addgene», США), с использованием набора перекрывающихся олигонуклеотидов:

(5') atcaattcgaaacgatgagatttccttcaatttttactgctg

(5') agatttccttcaatttttactgctgttttattcgcagcatcc

(5') gctgttttattcgcagcatccagcgcgctagctgtccctg

(5') cgcgctagctgtccctgataaaactgtgagatggtgtgc

(5') tattgtcgacctattaaggtctacggaaagtgcag

Полученный фрагмент ДНК клонируют в плазмидную ДНК pGAPZaA ("Invitrogen", США) с использованием эндонуклеаз рестрикции BstBI и SalI, с получением экспрессионной генетической конструкции pGAPZalpha-short_hTFNG (Рис. 1Б).

Плазмидную ДНК pPIC9 ("Invitrogen", США) последовательно обрабатывают эндонуклеазами рестрикции SphI и PciI, затем Т4 ДНК полимеразой и лигируют с элиминацией из исходной конструкции pPIC9 фрагмента 3'АОХ1 фрагмента. Далее в полученную генетическую конструкцию из полученной ранее генетической конструкции pGAPZalpha-short_hTFNG, переносят фрагмент ДНК, содержащий нуклеотидные последовательности GAP-промотора и пре-последовательность alpha-short в единой рамке считывания с нуклеотидной последовательностью кДНК гена модифицированного трансферрина человека (N413Q и N611Q) по сайтам рестрикции Bg1II и AgeI с элиминацией АОХ1 промотора, получая экспрессионную генетическую конструкцию pPIC9GAPalpha-short_hTFNG (Рис. 1А).

ПРИМЕР 2

Получение штамма-продуцента рекомбинантного модифицированного сывороточного трансферрина человека в дрожжах P. pastoris.

Плазмидную ДНК экспрессионных генетических конструкций pPIC9GAPalpha-short_hTFNG и pGAPZalpha-short_hTFNG линеаризуют эндонуклеазой рестрикции AvrII, и 1 мкг эквимолярной смеси фрагментов ДНК котрансформируют электрокомпетентные клетки P. pastoris штамма GS115 методом электропорации. Селекцию трансформантов проводят на минимальной среде RDB, содержащий антибиотик зеоцин. Для выбора клона с наибольшим уровнем секреции ТФР 95 случайно выбранных колоний переносят в индивидуальную лунку 96-луночного планшета в полную жидкую среду BMMG, рН=6.0 (20 г/л бактотриптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 50 мМ глюкоза, 100 mM калий-фосфатный буфер, рН=6.0, 13.4 г/л дрожжевой азотной основы, 1.6 мкМ биотин). Планшеты инкубируют 48 часов при 30°С при перемешивании. Далее проводят синхронизацию клонов, необходимую для последующего корректного сравнения экспрессии, которая зависит от стадии роста и плотности клеток. Для этого 20 мкл клеточной суспензии индивидуально переносят в 180 мкл свежей среды BMMG. Через 24 и 48 часов процедуру повторяют, и далее клоны оставляют для наработки целевого белка. По окончании экспрессии через 72 часа клетки удаляют центрифугированием, и клон-продуцент Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG с максимальным уровнем продукции отбирают, анализируя супернатант культуральной среды с помощью сэндвич-ИФА с использованием антител к трансферрину и антивидовых антител.

ПРИМЕР 3

Анализ уровня продукции модифицированного ТФР штаммом Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG при культивировании в минимальной солевой среде в условиях роста при высокой плотности в ферментере.

Анализ уровня экспрессии модифицированного ТФР полученным штаммом Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG проводят с использованием ферментационного аппарата с автоматическим регулированием рН 28%-ым раствором гидроксида аммония, скорость перемешивания 800 об/мин, расход воздуха 0.1-0.3 л/л×мин. Контроль уровня растворенного кислорода в среде осуществляют с помощью датчика растворенного кислорода. Пеногаситель добавляют автоматически по мере необходимости. Единичную колонию штамма Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG помещают в 100 мл среды YPD (20 г/л бактотриптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 50 мМ глюкоза) и инкубируют с интенсивным перемешиванием в течение 18 часов при 30°С до достижения OD600 10. Полученный инокулят засевают в ферментер, содержащий 900 мл солевого раствора BSM (26.7 мл/л 85% фосфорной кислоты, 0.93 г/л сульфата кальция, 18.2 г/л сульфата калия, 14.9 г/л сульфата магния семиводного, 4.13 г/л гидроксида калия, 40 г/л глицерина), 4.35 мл солевого стока РТМ1 (6.0 г/л сульфата меди пятиводного, 0.08 г/л йодида натрия, 3 г/л моногидрата сульфата марганца, 0.2 г/л молибдата натрия, 0.02 г/л борной кислоты, 0.5 г/л хлорида кобальта, 20.0 г/л хлорида цинка, 35.0 г/л соли Мора, 0.2 г/л биотина, 5 мл/л серной кислоты). Условия ферментации - рН среды 5.0, температура 30°С, уровень растворенного кислорода свыше 30%. Подрост культуры производят в течение 18-22 часов до увеличения уровня растворенного кислорода до 95%. Затем в культуру начинают подавать раствор глюкозы (550 г/л), содержащий 12 мл солевого стока РТМ1 и 2 г сульфата аммония на каждый литр раствора глюкозы, с постоянной скоростью 5 мл/час в течение первых 24 часов. Также в течение первых пяти часов с момента начала подачи раствора глюкозы изменяют значение рН до 6.5 и температуру культивирования снижают до 28°С. Далее скорость увеличивают до 8 мл/час еще на 24 часа, и далее скорость увеличивают до 12 мл/час. Культивирование продолжают в течение последующих 24 часов, поддерживая все параметры на заданном уровне.

По окончании культивирования клетки удаляют центрифугированием, супернатант культуральной среды разводят фосфатно-солевым буфером (0,01М КH2PO4, 0,1 M NaCl) и анализируют с помощью электофоретического разделения в 10% ПААГе с последующим Вестерн-блот анализом (Рис. 2) и сэндвич-ИФА (Рис. 3) с использованием антител к трансферрину и антивидовых антител. Как можно видеть из рисунка 2, в среде после культивирования штамма Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG накапливается белок, обладающий сходной молекулярной массой с таковым в препарате ТФР, полученном из сыворотки крови и специфически взаимодействующий с моноклональными антителами к ТФР. В случае нетрансформированных клеток нетрансформированных клеток P.pastoris штамма GS115 подобный белок отсутствует. Содержание ТФР в культуральной среде методом сэндвич-ИФА (рис. 3) проводилось с использованием серии концентраций ТФР, выделенного из сыворотки крови («Sigma aldrich», США) и серии последовательных разведений супернатанта культуральной среды после культивирования штамма Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG. Полученные результаты свидетельствуют, что полученный штамм Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG продуцирует трансферрин человека на уровне 100 мг/л.

--->

Перечень последовательностей

<110> IBCh RAS

Bobik T.V., Popov R. Yu., Mokrushina Yu.A., Smirnov I.V., Gabibov A.G.

<120> ШТАММ МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ PICHIA PASTORIS Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ТРАНСФЕРРИН, СОДЕРЖАЩИЙ АМИНОКИСЛОТНЫЕ ЗАМЕНЫ N413D И N611D

<140> 2019128651/20(056395)

<141> 2019-09-12

<160> 2

<170> PatentIn 3.5.1

<210> 1

<211> 9319

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Recombinant plasmid pPIC9GAPalpha-short_hTFNG

<400> 1

agatctctgc tactctggtc ccaagtgaac caccttttgg accctattga ccggacctta 60

acttgccaaa cctaaacgct taatgcctca gacgttttaa tgcctctcaa cacctccaag 120

gttgctttct tgagcatgcc tactaggaac tttaacgaac tgtggggttg cagacagttt 180

caggcgtgtc ccgaccaata tggcctacta gactctctga aaaatcacag ttttccagta 240

gttccgatca aattaccatc gaaatggtcc cataaacgga catttgacat ccgttcctga 300

attatagtct tccaccgtgg atcatggtgt tccttttttt cccaaagaat atcagcatcc 360

cttaactacg ttaggtcagt gatgacaatg gaccaaattg ttgcaaggtt tttctttttc 420

tttcatcggc acatttcagc ctcacatgcg actattatcg atcaatgaaa tccatcaaga 480

ttgaaatctt aaaattgccc ctttcacttg acaggatcct tttttgtaga aatgtcttgg 540

tgtcctcgtc caatcaggta gccatctctg aaatatctgg ctccgttgca actccgaacg 600

acctgctggc aacgtaaaat tctccggggt aaaacttaaa tgtggagtaa tggaaccaga 660

aacgtctctt cccttctctc tccttccacc gcccgttacc gtccctagga aattttactc 720

tgctggagag cttcttctac ggcccccttg cagcaatgct cttcccagca ttacgttgcg 780

ggtaaaacgg aggtcgtgta cccgacctag cagcccaggg atggaaaagt cccggccgtc 840

gctggcaata atagcgggcg gacgcatgtc atgagattat tggaaaccac cagaatcgaa 900

tataaaaggc gaacaccttt cccaattttg gtttctcctg acccaaagac tttaaattta 960

atttatttgt ccctatttca atcaattgaa caactatcaa ttcgaaacga tgagatttcc 1020

ttcaattttt actgctgttt tattcgcagc atccagcgcg ctagctgtcc ctgataaaac 1080

tgtgagatgg tgtgcagtgt cggagcatga ggccactaag tgccagagtt tccgcgacca 1140

tatgaaaagc gtcattccat ccgatggtcc cagtgttgct tgtgtgaaga aagcctccta 1200

ccttgattgc atcagggcca ttgcggcaaa cgaagcggat gctgtgacac tggatgcagg 1260

tttggtgtat gatgcttacc tggctcccaa taacctgaag cctgtggtgg cagagttcta 1320

tgggtcaaaa gaggatccac agactttcta ttatgctgtt gctgtggtga agaaggatag 1380

tggcttccag atgaaccagc ttcgaggcaa gaagtcctgc cacacgggtc taggcaggtc 1440

cgctgggtgg aacatcccca taggcttact ttactgtgac ttacctgagc cacgtaaacc 1500

tcttgagaaa gcagtggcca atttcttctc gggcagctgt gccccttgtg cggatgggac 1560

ggacttcccc cagctgtgtc aactgtgtcc agggtgtggc tgctccaccc ttaaccaata 1620

cttcggctac tcgggagcct tcaagtgtct gaaggatggt gctggggatg tggcctttgt 1680

caagcactcg actatatttg agaacttggc aaacaaggct gacagggacc agtatgagct 1740

gctttgcctg gacaacaccc ggaagccggt agatgaatac aaggactgcc acttggccca 1800

ggtcccttct cataccgtcg tggcccgaag tatgggcggc aaggaggact tgatctggga 1860

gcttctcaac caggcccagg aacattttgg caaagacaaa tcaaaagaat tccaactatt 1920

cagctctcct catgggaagg acctgctgtt taaggactct gcccacgggt ttttaaaagt 1980

cccccccagg atggatgcca agatgtacct gggctatgag tatgtcactg ccatccggaa 2040

tctacgggaa ggcacatgcc cagaagcccc aacagatgaa tgcaagcctg tgaagtggtg 2100

tgcgctgagc caccacgaga ggctcaagtg tgatgagtgg agtgttaaca gtgtagggaa 2160

aatagagtgt gtatcagcag agaccaccga agactgcatc gccaagatca tgaatggaga 2220

agctgatgcc atgagcttgg atggagggtt tgtctacata gcgggcaagt gtggtctggt 2280

gcctgtcttg gcagaaaact acgataagag cgataattgt gaggatacac cagaggcagg 2340

gtattttgct gtagcagtgg tgaagaaatc agcttctgac ctcacctggg acaatctgaa 2400

aggcaagaag tcctgccata cggcagttgg cagaaccgct ggctggaaca tccccatggg 2460

cctgctctac aataagatca accactgcag atttgatgaa tttttcagtg aaggttgtgc 2520

ccctgggtct aagaaagact ccagtctctg taagctgtgt atgggctcag gcctaaacct 2580

gtgtgaaccc aacaacaaag agggatacta cggctacaca ggcgctttca ggtgtctggt 2640

tgagaaggga gatgtggcct ttgtgaaaca ccagactgtc ccacagaaca ctgggggaaa 2700

aaaccctgat ccatgggcta agaatctgaa tgaaaaagac tatgagttgc tgtgccttga 2760

tggtaccagg aaacctgtgg aggagtatgc gaactgccac ctggccagag ccccgaatca 2820

cgctgtggtc acacggaaag ataaggaagc ttgcgtccac aagatattac gtcaacagca 2880

gcacctattt ggaagcgacg taactgactg ctcgggcaac ttttgtttgt tccggtcgga 2940

aaccaaggac cttctgttca gagatgacac agtatgtttg gccaaacttc atgacagaaa 3000

cacatatgaa aaatacttag gagaagaata tgtcaaggct gttggtaacc tgagaaaatg 3060

ctccacctca tcactcctgg aagcctgcac tttccgtaga ccttaatagg tcgaccatca 3120

tcatcatcat cattgagttt gtagccttag acatgactgt tcctcagttc aagttgggca 3180

cttacgagaa gaccggtctt gctagattct aatcaagagg atgtcagaat gccatttgcc 3240

tgagagatgc aggcttcatt tttgatactt ttttatttgt aacctatata gtataggatt 3300

ttttttgtca ttttgtttct tctcgtacga gcttgctcct gatcagccta tctcgcagct 3360

gatgaatatc ttgtggtagg ggtttgggaa aatcattcga gtttgatgtt tttcttggta 3420

tttcccactc ctcttcagag tacagaagat taagtgagaa gttcgtttgt gcaagcttat 3480

cgataagctt taatgcggta gtttatcaca gttaaattgc taacgcagtc aggcaccgtg 3540

tatgaaatct aacaatgcgc tcatcgtcat cctcggcacc gtcaccctgg atgctgtagg 3600

cataggcttg gttatgccgg tactgccggg cctcttgcgg gatatcgtcc attccgacag 3660

catcgccagt cactatggcg tgctgctagc gctatatgcg ttgatgcaat ttctatgcgc 3720

acccgttctc ggagcactgt ccgaccgctt tggccgccgc ccagtcctgc tcgcttcgct 3780

acttggagcc actatcgact acgcgatcat ggcgaccaca cccgtcctgt ggatctatcg 3840

aatctaaatg taagttaaaa tctctaaata attaaataag tcccagtttc tccatacgaa 3900

ccttaacagc attgcggtga gcatctagac cttcaacagc agccagatcc atcactgctt 3960

ggccaatatg tttcagtccc tcaggagtta cgtcttgtga agtgatgaac ttctggaagg 4020

ttgcagtgtt aactccgctg tattgacggg catatccgta cgttggcaaa gtgtggttgg 4080

taccggagga gtaatctcca caactctctg gagagtaggc accaacaaac acagatccag 4140

cgtgttgtac ttgatcaaca taagaagaag cattctcgat ttgcaggatc aagtgttcag 4200

gagcgtactg attggacatt tccaaagcct gctcgtaggt tgcaaccgat agggttgtag 4260

agtgtgcaat acacttgcgt acaatttcaa cccttggcaa ctgcacagct tggttgtgaa 4320

cagcatcttc aattctggca agctccttgt ctgtcatatc gacagccaac agaatcacct 4380

gggaatcaat accatgttca gcttgagaca gaaggtctga ggcaacgaaa tctggatcag 4440

cgtatttatc agcaataact agaacttcag aaggcccagc aggcatgtca atactacaca 4500

gggctgatgt gtcattttga accatcatct tggcagcagt aacgaactgg tttcctggac 4560

caaatatttt gtcacactta ggaacagttt ctgttccgta agccatagca gctactgcct 4620

gggcgcctcc tgctagcacg atacacttag caccaacctt gtgggcaacg tagatgactt 4680

ctggggtaag ggtaccatcc ttcttaggtg gagatgcaaa aacaatttct ttgcaaccag 4740

caactttggc aggaacaccc agcatcaggg aagtggaagg cagaattgcg gttccaccag 4800

gaatatagag gccaactttc tcaataggtc ttgcaaaacg agagcagact acaccagggc 4860

aagtctcaac ttgcaacgtc tccgttagtt gagcttcatg gaatttcctg acgttatcta 4920

tagagagatc aatggctctc ttaacgttat ctggcaattg cataagttcc tctgggaaag 4980

gagcttctaa cacaggtgtc ttcaaagcga ctccatcaaa cttggcagtt agttctaaaa 5040

gggctttgtc accattttga cgaacattgt cgacaattgg tttgactaat tccataatct 5100

gttccgtttt ctggatagga cgacgaaggg catcttcaat ttcttgtgag gaggccttag 5160

aaacgtcaat tttgcacaat tcaatacgac cttcagaagg gacttcttta ggtttggatt 5220

cttctttagg ttgttccttg gtgtatcctg gcttggcatc tcctttcctt ctagtgacct 5280

ttagggactt catatccagg tttctctcca cctcgtccaa cgtcacaccg tacttggcac 5340

atctaactaa tgcaaaataa aataagtcag cacattccca ggctatatct tccttggatt 5400

tagcttctgc aagttcatca gcttcctccc taattttagc gttcaacaaa acttcgtcgt 5460

caaataaccg tttggtataa gaaccttctg gagcattgct cttacgatcc cacaaggtgg 5520

cttccatggc tctaagaccc tttgattggc caaaacagga agtgcgttcc aagtgacaga 5580

aaccaacacc tgtttgttca accacaaatt tcaagcagtc tccatcacaa tccaattcga 5640

tacccagcaa cttttgagtt gctccagatg tagcaccttt ataccacaaa ccgtgacgac 5700

gagattggta gactccagtt tgtgtcctta tagcctccgg aatagacttt ttggacgagt 5760

acaccaggcc caacgagtaa ttagaagagt cagccaccaa agtagtgaat agaccatcgg 5820

ggcggtcagt agtcaaagac gccaacaaaa tttcactgac agggaacttt ttgacatctt 5880

cagaaagttc gtattcagta gtcaattgcc gagcatcaat aatggggatt ataccagaag 5940

caacagtgga agtcacatct accaactttg cggtctcaga aaaagcataa acagttctac 6000

taccgccatt agtgaaactt ttcaaatcgc ccagtggaga agaaaaaggc acagcgatac 6060

tagcattagc gggcaaggat gcaactttat caaccagggt cctatagata accctagcgc 6120

ctgggatcat cctttggaca actctttctg ccaaatctag gtccaaaatc acttcattga 6180

taccattatt gtacaacttg agcaagttgt cgatcagctc ctcaaattgg tcctctgtaa 6240

cggatgactc aacttgcaca ttaacttgaa gctcagtcga ttgagtgaac ttgatcaggt 6300

tgtgcagctg gtcagcagca tagggaaaca cggcttttcc taccaaactc aaggaattat 6360

caaactctgc aacacttgcg tatgcaggta gcaagggaaa tgtcatactt gaagtcggac 6420

agtgagtgta gtcttgagaa attctgaagc cgtattttta ttatcagtga gtcagtcatc 6480

aggagatcct ctacgccgga cgcatcgtgg ccgacctgca gggggggggg gggcgctgag 6540

gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc ccatcatcca 6600

gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac cagttggtga 6660

ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc gtgatctgat 6720

ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc aagtcagcgt 6780

aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact catcgagcat 6840

caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg 6900

tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta 6960

tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa 7020

aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa 7080

aagcttatgc atttctttcc agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa 7140

atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac 7200

gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac 7260

tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc 7320

tgttttcccc atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 7380

gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 7440

tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 7500

cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 7560

ttcgggaagc gtggcgcttt ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 7620

cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 7680

atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 7740

agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 7800

gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 7860

gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 7920

tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 7980

agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 8040

gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 8100

aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 8160

aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 8220

ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 8280

gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 8340

aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 8400

ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 8460

tgctgcaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 8520

ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 8580

cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 8640

agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 8700

gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 8760

gtcaacacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 8820

acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 8880

acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 8940

agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 9000

aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 9060

gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 9120

tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa 9180

aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct tcaagaatta attctcatgt ttgacagctt 9240

atcatcgata agctgactca tgttggtatt gtgaaataga cgcagatcgg gaacactgaa 9300

aaataacagt tattattcg 9319

<210> 2

<211> 5389

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Recombinant plasmid pGAPZalpha-short_hTFNG

<400> 2

agatctctgc tactctggtc ccaagtgaac caccttttgg accctattga ccggacctta 60

acttgccaaa cctaaacgct taatgcctca gacgttttaa tgcctctcaa cacctccaag 120

gttgctttct tgagcatgcc tactaggaac tttaacgaac tgtggggttg cagacagttt 180

caggcgtgtc ccgaccaata tggcctacta gactctctga aaaatcacag ttttccagta 240

gttccgatca aattaccatc gaaatggtcc cataaacgga catttgacat ccgttcctga 300

attatagtct tccaccgtgg atcatggtgt tccttttttt cccaaagaat atcagcatcc 360

cttaactacg ttaggtcagt gatgacaatg gaccaaattg ttgcaaggtt tttctttttc 420

tttcatcggc acatttcagc ctcacatgcg actattatcg atcaatgaaa tccatcaaga 480

ttgaaatctt aaaattgccc ctttcacttg acaggatcct tttttgtaga aatgtcttgg 540

tgtcctcgtc caatcaggta gccatctctg aaatatctgg ctccgttgca actccgaacg 600

acctgctggc aacgtaaaat tctccggggt aaaacttaaa tgtggagtaa tggaaccaga 660

aacgtctctt cccttctctc tccttccacc gcccgttacc gtccctagga aattttactc 720

tgctggagag cttcttctac ggcccccttg cagcaatgct cttcccagca ttacgttgcg 780

ggtaaaacgg aggtcgtgta cccgacctag cagcccaggg atggaaaagt cccggccgtc 840

gctggcaata atagcgggcg gacgcatgtc atgagattat tggaaaccac cagaatcgaa 900

tataaaaggc gaacaccttt cccaattttg gtttctcctg acccaaagac tttaaattta 960

atttatttgt ccctatttca atcaattgaa caactatcaa ttcgaaacga tgagatttcc 1020

ttcaattttt actgctgttt tattcgcagc atccagcgcg ctagctgtcc ctgataaaac 1080

tgtgagatgg tgtgcagtgt cggagcatga ggccactaag tgccagagtt tccgcgacca 1140

tatgaaaagc gtcattccat ccgatggtcc cagtgttgct tgtgtgaaga aagcctccta 1200

ccttgattgc atcagggcca ttgcggcaaa cgaagcggat gctgtgacac tggatgcagg 1260

tttggtgtat gatgcttacc tggctcccaa taacctgaag cctgtggtgg cagagttcta 1320

tgggtcaaaa gaggatccac agactttcta ttatgctgtt gctgtggtga agaaggatag 1380

tggcttccag atgaaccagc ttcgaggcaa gaagtcctgc cacacgggtc taggcaggtc 1440

cgctgggtgg aacatcccca taggcttact ttactgtgac ttacctgagc cacgtaaacc 1500

tcttgagaaa gcagtggcca atttcttctc gggcagctgt gccccttgtg cggatgggac 1560

ggacttcccc cagctgtgtc aactgtgtcc agggtgtggc tgctccaccc ttaaccaata 1620

cttcggctac tcgggagcct tcaagtgtct gaaggatggt gctggggatg tggcctttgt 1680

caagcactcg actatatttg agaacttggc aaacaaggct gacagggacc agtatgagct 1740

gctttgcctg gacaacaccc ggaagccggt agatgaatac aaggactgcc acttggccca 1800

ggtcccttct cataccgtcg tggcccgaag tatgggcggc aaggaggact tgatctggga 1860

gcttctcaac caggcccagg aacattttgg caaagacaaa tcaaaagaat tccaactatt 1920

cagctctcct catgggaagg acctgctgtt taaggactct gcccacgggt ttttaaaagt 1980

cccccccagg atggatgcca agatgtacct gggctatgag tatgtcactg ccatccggaa 2040

tctacgggaa ggcacatgcc cagaagcccc aacagatgaa tgcaagcctg tgaagtggtg 2100

tgcgctgagc caccacgaga ggctcaagtg tgatgagtgg agtgttaaca gtgtagggaa 2160

aatagagtgt gtatcagcag agaccaccga agactgcatc gccaagatca tgaatggaga 2220

agctgatgcc atgagcttgg atggagggtt tgtctacata gcgggcaagt gtggtctggt 2280

gcctgtcttg gcagaaaact acgataagag cgataattgt gaggatacac cagaggcagg 2340

gtattttgct gtagcagtgg tgaagaaatc agcttctgac ctcacctggg acaatctgaa 2400

aggcaagaag tcctgccata cggcagttgg cagaaccgct ggctggaaca tccccatggg 2460

cctgctctac aataagatca accactgcag atttgatgaa tttttcagtg aaggttgtgc 2520

ccctgggtct aagaaagact ccagtctctg taagctgtgt atgggctcag gcctaaacct 2580

gtgtgaaccc aacaacaaag agggatacta cggctacaca ggcgctttca ggtgtctggt 2640

tgagaaggga gatgtggcct ttgtgaaaca ccagactgtc ccacagaaca ctgggggaaa 2700

aaaccctgat ccatgggcta agaatctgaa tgaaaaagac tatgagttgc tgtgccttga 2760

tggtaccagg aaacctgtgg aggagtatgc gaactgccac ctggccagag ccccgaatca 2820

cgctgtggtc acacggaaag ataaggaagc ttgcgtccac aagatattac gtcaacagca 2880

gcacctattt ggaagcgacg taactgactg ctcgggcaac ttttgtttgt tccggtcgga 2940

aaccaaggac cttctgttca gagatgacac agtatgtttg gccaaacttc atgacagaaa 3000

cacatatgaa aaatacttag gagaagaata tgtcaaggct gttggtaacc tgagaaaatg 3060

ctccacctca tcactcctgg aagcctgcac tttccgtaga ccttaatagg tcgaccatca 3120

tcatcatcat cattgagttt gtagccttag acatgactgt tcctcagttc aagttgggca 3180

cttacgagaa gaccggtctt gctagattct aatcaagagg atgtcagaat gccatttgcc 3240

tgagagatgc aggcttcatt tttgatactt ttttatttgt aacctatata gtataggatt 3300

ttttttgtca ttttgtttct tctcgtacga gcttgctcct gatcagccta tctcgcagct 3360

gatgaatatc ttgtggtagg ggtttgggaa aatcattcga gtttgatgtt tttcttggta 3420

tttcccactc ctcttcagag tacagaagat taagtgagac cttcgtttgt gcggatcccc 3480

cacacaccat agcttcaaaa tgtttctact ccttttttac tcttccagat tttctcggac 3540

tccgcgcatc gccgtaccac ttcaaaacac ccaagcacag catactaaat tttccctctt 3600

tcttcctcta gggtgtcgtt aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa aaaagagacc 3660

gcctcgtttc tttttcttcg tcgaaaaagg caataaaaat ttttatcacg tttctttttc 3720

ttgaaatttt tttttttagt ttttttctct ttcagtgacc tccattgata tttaagttaa 3780

taaacggtct tcaatttctc aagtttcagt ttcatttttc ttgttctatt acaacttttt 3840

ttacttcttg ttcattagaa agaaagcata gcaatctaat ctaaggggcg gtgttgacaa 3900

ttaatcatcg gcatagtata tcggcatagt ataatacgac aaggtgagga actaaaccat 3960

ggccaagttg accagtgccg ttccggtgct caccgcgcgc gacgtcgccg gagcggtcga 4020

gttctggacc gaccggctcg ggttctcccg ggacttcgtg gaggacgact tcgccggtgt 4080

ggtccgggac gacgtgaccc tgttcatcag cgcggtccag gaccaggtgg tgccggacaa 4140

caccctggcc tgggtgtggg tgcgcggcct ggacgagctg tacgccgagt ggtcggaggt 4200

cgtgtccacg aacttccggg acgcctccgg gccggccatg accgagatcg gcgagcagcc 4260

gtgggggcgg gagttcgccc tgcgcgaccc ggccggcaac tgcgtgcact tcgtggccga 4320

ggagcaggac tgacacgtcc gacggcggcc cacgggtccc aggcctcgga gatccgtccc 4380

ccttttcctt tgtcgatatc atgtaattag ttatgtcacg cttacattca cgccctcccc 4440

ccacatccgc tctaaccgaa aaggaaggag ttagacaacc tgaagtctag gtccctattt 4500

atttttttat agttatgtta gtattaagaa cgttatttat atttcaaatt tttctttttt 4560

ttctgtacag acgcgtgtac gcatgtaaca ttatactgaa aaccttgctt gagaaggttt 4620

tgggacgctc gaaggcttta atttgcaagc tggagaccaa catgtgagca aaaggccagc 4680

aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 4740

ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 4800

aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 4860

cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct 4920

cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 4980

aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 5040

cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 5100

ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 5160

ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 5220

gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 5280

agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 5340

acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatc 5389

<---

Похожие патенты RU2723084C1

название год авторы номер документа
Штамм метилотрофных дрожжей Pichia pastoris Yst-HSA-PDI1, продуцирующий рекомбинантный человеческий сывороточный альбумин 2019
  • Бобик Татьяна Владимировна
  • Мокрушина Юлиана Анатольевна
  • Смирнов Иван Витальевич
  • Габибов Александр Габибович
RU2733423C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ ДРОЖЖЕВЫХ ШТАММОВ 2020
  • Бобик Татьяна Владимировна
  • Габибов Александр Габибович
  • Костин Никита Николаевич
  • Мокрушина Юлиана Анатольевна
  • Скрябин Георгий Андреевич
  • Смирнов Иван Витальевич
RU2770894C1
Рекомбинантная плазмидная ДНК pPDGFB, кодирующая полипептид со свойствами фактора роста тромбоцитов-ВВ человека, и рекомбинантный штамм метилотрофных дрожжей Pichia pastoris - продуцент полипептида со свойствами фактора роста тромбоцитов-ВВ человека 2017
  • Герасимов Андрей Сергеевич
  • Литвинец Сергей Геннадьевич
RU2668828C1
ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Pichia pastoris Х-33/2albumin ДЛЯ СЕКРЕЦИИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АЛЬБУМИНА 2005
  • Новиков Дмитрий Викторович
  • Первушкин Петр Михайлович
  • Новиков Виктор Владимирович
RU2306333C2
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCPBH ДЛЯ БИОСИНТЕЗА ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ Б ЧЕЛОВЕКА, И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ PICHIA PASTORIS - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ Б ЧЕЛОВЕКА 2011
  • Пескова Елена Борисовна
RU2531524C2
ШТАММ ДРОЖЖЕЙ PICHIA PASTORIS 2-2 - ПРОДУЦЕНТ ТРОМБОЦИТАРНОГО ФАКТОРА РОСТА ЧЕЛОВЕКА (PDGF-BB) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБОЦИТАРНОГО ФАКТОРА РОСТА ЧЕЛОВЕКА 2005
  • Игонин Антон Алексеевич
  • Пальцева Екатерина Михайловна
  • Уваров Валентин Юрьевич
  • Иванов Алексей Алексеевич
  • Соловьев Валерий Владимирович
  • Акатов Владимир Семенович
  • Прусакова Ольга Вадимовна
  • Белецкий Игорь Петрович
RU2290434C1
СПОСОБ СНИЖЕНИЯ СТЕПЕНИ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ БЕЛКОВ, СПОСОБЫ И БЕЛКИ 2010
  • Говиндаппа Нагарай
  • Каноджа Комаль
  • Венкатесан Кришнамурти
  • Дэйв Нитеш
  • Патале Мукеш Бабуаппа
  • Тивари Санджей
  • Састри Кедарнат Н.
  • Айер Хариш
RU2575607C2
ПРЕПАРАТ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2006
  • Воробьев Андрей Иванович
  • Мирошников Анатолий Иванович
  • Габибов Александр Габибович
  • Воробьев Иван Иванович
  • Костромина Татьяна Ивановна
  • Пономаренко Наталья Александровна
  • Бобик Татьяна Владимировна
  • Ажигирова Мария Алексеевна
  • Карякин Александр Владимирович
  • Коротаев Геннадий Константинович
RU2337966C2
Рекомбинантная плазмидная ДНК pFGF2, кодирующая полипептид со свойствами основного фактора роста фибробластов человека, и рекомбинантный штамм метилотрофных дрожжей Pichia pastoris - продуцент полипептида со свойствами основного фактора роста фибробластов человека 2021
  • Герасимов Андрей Сергеевич
  • Мистерова Анна-Анастасия Викторовна
RU2804544C2
МОЛЕКУЛА ДНК ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ, СТИМУЛИРУЕМОЙ СОЛЯМИ ЖЕЛЧИ ЛИПАЗЫ (BSSL) 1996
  • Гоутам Дас
RU2157847C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 723 084 C1

Реферат патента 2020 года Штамм метилотрофных дрожжей PICHIA PASTORIS Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG, продуцирующий рекомбинантный человеческий трансферрин, содержащий аминокислотные замены N413D и N611D

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению модифицированного рекомбинантного трансферрина человека, содержащего аминокислотные замены N413D и N611D (ТФР). Изобретение может быть использовано для получения бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. Изобретение представляет собой полученный на основе штамма GS115 метилотрофных дрожжей P. pastoris штамм-продуцент Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG, содержащий в своем геноме интегрированные экспрессионные генетические конструкци pPIC9GAPalpha-short_hTFNG и pGAPZalpha-short_hTFNG, каждая из которых содержит последовательность кДНК, кодирующую пре-последовательность сигнального пептида alpha-short, позволяющего секретировать ТФР в культуральную среду, в единой рамке считывания с нуклеотидной последовательностью кДНК гена модифицированного сывороточного трансферрина человека (N413Q и N611Q). Изобретение позволяет получить рекомбинантный человеческий сывороточный трансферрин, не содержащий N-гликозилирования, в эукариотической системе экспрессии метилотрофных дрожжей P. pastoris с уровнем продукции на уровне 100 мг/л в условиях роста в минимальной солевой среде в ферментере. 3 ил., 3 пр.

Формула изобретения RU 2 723 084 C1

Штамм-продуцент Yst-pPIC9pGAPZalpha-short_hTFNG, полученный на основе клеток дрожжей штамма GS115 Pichia pastoris путем котрансформации экспрессионных генетических конструкций pPIC9GAPalpha-short_hTFNG и pGAPZalpha-short_hTFNG, содержащих нуклеотидные последовательности GAP промотора гена глицерид-3-фосфат дегидрогеназы, нативного терминатора и сигнала полиаденилирования АОХ1 гена алкогольгидрогеназы I и пре-последовательность alpha-short в единой рамке считывания с нуклеотидной последовательностью кДНК гена модифицированного трансферрина человека (N413Q и N611Q), и секретирующий рекомбинантный модифицированный трансферрин человека в культуральную среду.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2020 года RU2723084C1

MIZUTANI K et al
Structural and functional characterization of recombinant human serum transferrin secreted from Pichia pastoris, Biosci Biotechnol Biochem
Приспособление для суммирования отрезков прямых линий 1923
  • Иванцов Г.П.
SU2010A1
Приспособление для суммирования отрезков прямых линий 1923
  • Иванцов Г.П.
SU2010A1
FINNIS CJ High-level production of animal-free recombinant transferrin from saccharomyces cerevisiae, Microb Cell Fact
Приспособление для суммирования отрезков прямых линий 1923
  • Иванцов Г.П.
SU2010A1

RU 2 723 084 C1

Авторы

Бобик Татьяна Владимировна

Попов Роман Юрьевич

Мокрушина Юлиана Анатольевна

Смирнов Иван Витальевич

Габибов Александр Габибович

Даты

2020-06-08Публикация

2019-09-12Подача