СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДСОРБИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИБРИОЗА ЛОСОСЕВЫХ РЫБ Российский патент 2020 года по МПК A61K39/02 C12N1/20 

Изобретение относится к ихтиопатологии и биотехнологии и может использоваться предприятиями биологической промышленности, микробиологическими лабораториями, биотехнологами для получения адсорбированной вакцины против вибриоза лососевых рыб.

Вибриоз - инфекционная болезнь лососевых, угрей и других видов рыб, вызываемая бактерией из семейства Vibrionaceae, рода Vibrio. В России вибриоз встречается у дикой рыбы, а также в лососевых и угревых хозяйствах, использующих для выращивания рыб морскую или солоноватую воду и расположенных в бассейнах Балтийского, Баренцева, Белого и дальневосточных морей. Заболевание протекает энзоотически, сопровождается массовой гибелью рыб и требует значительных затрат на оздоровление неблагополучных хозяйств.

Возникновению болезни способствуют высокая температура воды (выше 15°С), рН более 8,0, низкое содержание кислорода, загрязнение воды органическими веществами (БПК выше 2 мг/л) и азотными соединениями (содержание азота более 1 мг/л), хендлинг (ручные манипуляции). При выращивании в морских садках потери рыб от заболевания достигают 70-100% в условиях очень низкой эффективности химиотерапии.

Инфекция наносит значительные прямые экономические потери для ферм, но также влечет и косвенные затраты, связанные с недополучением биомассы, расходом комбикормов, а также снижением товарных качеств мяса рыб, вплоть до частичной или полной ветеринарно-санитарной выбраковки. У лососевых рыб вибриоз проявляется чаще в летний период, поражая рыб всех возрастов.

Уровень техники

Известен способ получения вакцины против вибриоза рыб путем культивирования микроорганизмов в жидкой питательной среде, при наблюдении за физико-химическими показателями в процессе роста культур, по истечении времени проводят инактивацию формалином (патент РФ №2284830, бюл. №28, опубл. 10.10.2006, МПК А61К 39/02). Данный способ мы взяли за прототип.

Вышеназванный способ получения вакцины против вибриоза рыб основан на технологии культивирования вибрионов (Vibrio anguillarum) штаммы №2 и VUR-19), включающей подготовку питательной среды для матровых расплодок штаммов, засев и контроль чистоты и типичности роста при проведении трех пассажей, культивирование в реакторе каждого штамма из расчета введения 5% к объему питательной среды, по истечению периода выращивания инактивация и гомогенизация, обеспечивающая получение однородной суспензии. Предложенная технология выращивания вибрионов в реакторе длится 36-48 часов при температуре 18-25°С и постоянном перемешивании, достигая при этом максимального числа клеток, находящихся в стационарной фазе роста. Противовибриозную вакцину готовят с концентрацией бактериальных клеток 80-100 млрд. м.кл./см³.

Недостатком данного способа является низкое качество конечного продукта, так как данная вакцина пригодна только для иммерсионного способа иммунизации. Использование препарата для отработанной в большинстве стран технологии внутрибрюшинной инъекции невозможно в связи с наличием в вакцине большого количества компонентов среды выращивания и формалина.

Данный способ позволяет получить бактерии, создающий у рыб иммунитет против неопределенного серотипа галофильных вибрионов, что также не гарантирует обеспечение защищенности организма гидробионтов от спектра циркулирующих в природе эпизоотических штаммов Listonella (vibrio) anguillarum с разными типами антигенных детерминант. Таким образом, технической проблемой является необходимость создания способа получения вакцины с высокой иммуногенной активностью, широким профилактическим спектром действия на септическую инфекцию рыб бактериальной этиологии.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом является вакцина, состоящая из активного вещества, которым является инактивированная суспензионная смесь галофильных вибрионов Listonella (Vibrio) anguillarum серотипа 01 (ВИЭВ АФ 3/4) и серотипа 02 (ВИЭВ ВБФ 07) и содержащая иммунопротектор - адъювант - гель гидроокись алюминия.

Предлагаемый способ позволяет обеспечить точность конечных концентраций антигенов в целевом продукте, который не содержит консервантов и балластных компонентов среды, что обеспечивает хорошую переносимость организмом рыб при интраперитонеальном введении. Включение в состав адсорбирующего адъюванта позволяет снижать дозу антигена при увеличении протективного действия готовой вакцины до 24 месяцев.

Предложенный способ заключается в следующем:

Для осуществления способа применяется управляемый периодический процесс глубинного культивирования отобранных производственных штаммов галофильных вибрионов, вакцина, изготовленная по предлагаемому способу, содержит активное вещество и целевую добавку. Основным составляющим активного вещества является инактивированная суспензионная смесь галофильных вибрионов Listonella (Vibrio) anguillarum серотипа 01 (ВИЭВ АФ 3/4) и серотипа 02 (ВИЭВ ВБФ 07) выращенных в бульоне Хоттингера с содержанием 10% морской воды (соленость 3,3%) и аминного азота не менее 180 мг % параллельно друг другу в ферментере до максимального уровня накопления микробных клеток в среде роста, в дальнейшем проводится убивка микробной массы с контролем полноты инактивации, отмывка клеток вибрионов от компонентов среды и формалина.

Отдельные емкости с бактериальной массой каждого штамма инактивируют формалином до значений 0,37% и подвергают 3-х кратному переосаждению центрифугированием антигенов в 0,15 М фосфатно-солевом буфере рН 7.6 (стандартного состава), для избавления от консерванта и балластных компонентов. Полученные антигены каждого серотипа с концентрацией 1,25×10⁹ м.кл./см³ берутся в смеси в равном соотношении, с учетом общей конечной концентрации 2,5×10⁹ м.кл./см³, в качестве адъюванта - гидроокись алюминия (6%-ный гель) в объеме 12% от общего объема с последующим диспергированием на роторной установке в течение 30 минут.

Все этапы подготовки ведутся в асептических условиях, чтобы конечный продукт отвечал ряду требований: стерилен, отсутствие консервантов (формалина), безвреден, активен. Предложенные приемы позволили впервые разработать препарат, обладающий иммуногенностью длительного действия, что в целом повышает качество целевого продукта при возможностях технологического производства как в лабораторных, так и в промышленных условиях.

Адсорбированная вакцина против вибриоза лососевых рыб представляет собой жидкость светло-кремового цвета, при хранении образуется рыхлый белый осадок, легко разбивающийся в гомогенную взвесь при встряхивании. Препарат сохраняет стабильность и активность при температуре 2-8°С в течение 6 месяцев.

В отличие от прототипа получение вакцины по предложенному способу сокращает основное время культивирования вибрионов практически в 2 раза, значительно уменьшает количество применения антигенов, снижая нагрузку на иммунную систему организма рыб и увеличивает экономическую эффективность. Сравнительный анализ заявляемого способа получения вакцины и прототипа свидетельствует, что применяемые подходы повышают качество целевого продукта посредством увеличения иммуногенной активности, безвредности препарата. Это достигается за счет совершенствования технологии производства и масс-культивирования Listonella (Vibrio) anguillarum серотипов 01, 02.

Осуществление изобретения иллюстрируется следующими примерами промежуточного изготовления антигенов и получения целевого продукта:

Пример 1. Полученные матровые расплодки штаммов галофильных вибрионов серотипа 01 (ВИЭВ АФ 3/4) и серотипа 02 (ВИЭВ ВБФ 07), проверенные на чистоту и типичность вносят в ферментер из расчета 10% к объему питательной среды и активно перемешивают с регулировкой оборотов мешалки. Выращивание вибрионов проводят в жидкой питательной среде с содержанием 10% морской воды и аминного азота не менее 180 мг%. Культивирование проводят при температуре 25°С в течение 22 часов. В течение всего процесса рН среды регулируют на уровне 7,6, аэрацию р О₂ 35% от насыщения кислородом воздуха, концентрацию глюкозы до 0,3%. Каждый штамм выращивают отдельно, полученную микробную массу инактивируют формалином в течение 18 часов при температуре 37°С до конечной концентрации 0,37% к общему объему при постоянном перемешивании. Полноту инактивации определяют по отсутствию роста микроорганизмов на питательных средах типа триптозо-соевый агар и бульон, тиогликолевая среда, агар Сабуро, ДДА и TCBS. Оптическую концентрацию клеток определяют спектрофотометрическим методом по калибровочной кривой.

Максимальный уровень накопления микробных клеток в среде роста при данном режиме составил 18×10⁹ м.кл./см³.

Пример 2. Полученные матровые расплодки штаммов галофильных вибрионов серотипа 01 (ВИЭВ АФ 3/4) и серотипа 02 (ВИЭВ ВБФ 07), проверенные на чистоту и типичность вносят в ферментер из расчета 10% к объему питательной среды и активно перемешивают с регулировкой оборотов мешалки. Выращивание вибрионов проводят в жидкой питательной среде с содержанием 10% морской воды и аминного азота не менее 180 мг%. Культивирование проводят при температуре 25°С в течение 24 часов. В течение всего процесса рН среды регулируют на уровне 7,7, аэрацию р О₂ 35% от насыщения кислородом воздуха, концентрацию глюкозы до 0,4%. Каждый штамм выращивают отдельно, полученную микробную массу инактивируют формалином в течение 18 часов при температуре 37°С до конечной концентрации 0,37% к общему объему при постоянном перемешивании. Полноту инактивации определяют по отсутствию роста микроорганизмов на питательных средах типа триптозо-соевый агар и бульон, тиогликолевая среда, агар Сабуро, ДДА и TCBS. Оптическую концентрацию клеток определяют спектрофотометрическим методом по калибровочной кривой.

Максимальный уровень накопления микробных клеток в среде роста при данном режиме составил 20×10⁹ м.кл./см³.

Пример 3. Полученные матровые расплодки штаммов галофильных вибрионов серотипа 01 (ВИЭВ АФ 3/4) и серотипа 02 (ВИЭВ ВБФ 07), проверенные на чистоту и типичность вносят в ферментер из расчета 10% к объему питательной среды и активно перемешивают с регулировкой оборотов мешалки. Выращивание вибрионов проводят в жидкой питательной среде с содержанием 10% морской воды и аминного азота не менее 180 мг%. Культивирование проводят при температуре 25°С в течение 26 часов. В течение всего процесса рН среды регулируют на уровне 7,8, аэрацию р О₂ 35% от насыщения кислородом воздуха, концентрацию глюкозы до 0,5%. Каждый штамм выращивают отдельно, полученную микробную массу инактивируют формалином в течение 18 часов при температуре 37°С до конечной концентрации 0,37% к общему объему при постоянном перемешивании. Полноту инактивации определяют по отсутствию роста микроорганизмов на питательных средах типа триптозо-соевый агар и бульон, тиогликолевая среда, агар Сабуро, ДДА и TCBS. Оптическую концентрацию клеток определяют спектрофотометрическим методом по калибровочной кривой.

Максимальный уровень накопления микробных клеток в среде роста при данном режиме составил 24×10⁹ м.кл./см³.

Пример 4. Полученные матровые расплодки штаммов галофильных вибрионов серотипа 01 (ВИЭВ АФ 3/4) и серотипа 02 (ВИЭВ ВБФ 07), проверенные на чистоту и типичность вносят в ферментер из расчета 10% к объему питательной среды и активно перемешивают с регулировкой оборотов мешалки. Выращивание вибрионов проводят в жидкой питательной среде с содержанием 10% морской воды и аминного азота не менее 180 мг%. Культивирование проводят при температуре 25°С в течение 28 часов. В течение всего процесса рН среды регулируют на уровне 7,8, аэрацию р О₂ 35% от насыщения кислородом воздуха, концентрацию глюкозы до 0,6%. Каждый штамм выращивают отдельно, полученную микробную массу инактивируют формалином в течение 18 часов при температуре 37°С до конечной концентрации 0,37% к общему объему при постоянном перемешивании. Полноту инактивации определяют по отсутствию роста микроорганизмов на питательных средах типа триптозо-соевый агар и бульон, тиогликолевая среда, агар Сабуро, ДДА и TCBS. Оптическую концентрацию клеток определяют спектрофотометрическим методом по калибровочной кривой.

Максимальный уровень накопления микробных клеток в среде роста при данном режиме составил 24×10⁹ м.кл./см³.

Данные, полученные при различных режимах культивирования вибрионов свидетельствуют о технологически верном подходе решения задачи, что позволяет, согласно примерам 1-4, в короткие сроки стабильно получать жизнеспособные клетки от 18 до 24×10⁹ м.кл. /см³. Из апробированных вариантов наиболее оптимальным представляется применяемый в примере 3, так как прослеживается баланс между временем, введенными дополнительно питательными веществами и конечным уровнем накопления микробных клеток, составившим максимально возможное 24×10⁹ м.кл./см³. Применение режимов согласно примерам 1, 2 не позволяет достичь высоких значений выхода продукта, либо при прочих равных как в примере 4, требуется увеличение времени и расхода раствора глюкозы.

Для получения целевого продукта формализованные клетки подвергают трехкратному осаждению центрифугированием при 8500 g в течение 45 минут, и ресуспендированию в стерильном растворе 0,15 М фосфатно-солевого буфера рН 7,6 для удаления консерванта и балластных компонентов среды. Для изготовления трех серий вакцины антигены из штаммов вибрионов серотипов 01 и 02, полученные по примеру 3, смешивают в равном соотношении с концентрациями 500 млн/см³; 1,25 млрд/см³; 2,5 млрд/см³ с учетом конечной общей концентрации 1,0×10⁹ м.кл./см³; 2,5×10⁹ м.кл./см³; 5×10⁹ м.кл./см³. К полученной суспензии добавляют стерильный 6%-ный гель гидроокиси аллюминия в объеме 12% с дальнейшим диспергированием на роторной установке в течение 30 минут, последующей фильтрацией и фасовкой. Готовая вакцина должна отвечать требованиям: стерильна, отсутствие посторонних примесей и консервантов, безвредна, иммуногенна, по внешнему виду - жидкость светло-кремового цвета с рыхлым осадком, легко разбивающимся при встряхивании в гомогенную взвесь.

Иммунологическую активность вакцины против вибриоза рыб серий 1-2 проверяли на радужной форели массой 200-250 г по результатам учета уровня специфических антител на протяжении 24 месяцев наблюдений и прямого заражения летальной дозой смеси вирулентных штаммов Listonella (Vibrio) anguillarum серотипов 01 и 02 через 300 градусо-дней после однократной внутрибрюшинной инъекции в дозе 0,1 см³. Полученные результаты показали, что к указанному сроку у лососевых рыб при температуре содержания выше 8°С формируются специфические защитные антитела, максимальнее ТАА 1:2048 - группа привитая вакциной серии 2 и 3 (общая концентрация антигенов 2,5×10⁹ м.кл./см³; 5×10⁹ м.кл./см³). В опытах заражения определена сохранность рыб для обеих серий вакцины. Тестирование препарата серии 1 выявило менее активный иммунный ответ: ТАА 1:256-1:1024, сохранность - 75% радужной форели.

В результате изучения эффективности экспериментальных серий вакцины определена оптимальная прививочная доза 2,5×10⁹ м.кл./см³, обеспечивающая длительную напряженность иммунитета при ТАА 1:1024-1:2048 в течение 24 месяцев и сохранность до 97% рыб.

Использование меньших концентраций, а также увеличение антигенной нагрузки вдвое приводило к снижению уровня защиты или сопоставимым результатам, что экономически нецелесообразно и увеличивает прессинг на организм чужеродных биомолекул.

Как показали результаты исследований, предлагаемый способ изготовления вакцины и условия применения позволяют получать целевой продукт высокого качества, что снижает до минимума материальный ущерб, наносимый вибриозом лососевых рыб и нивелирует риски потерь в течение двух лет с отказом от применения химиотерапевтических препаратов.

Исходя из повсеместного распространения галофильных вибринов в морской среде, предсказуемой заболеваемости и массовой потери рыбы прослеживается необходимость внедрения поголовной прививочной иммунизации, что определяет актуальность способа получения адсорбированной вакцины против вибриоза лососевых рыб и применение препарата с существенным экономическим эффектом.

Изобретение относится к биотехнологии и ихтиопатологии и может использоваться для получения адсорбированной вакцины против вибриоза лососевых рыб. Применяется управляемый периодический процесс глубинного культивирования отобранных производственных штаммов галофильных вибрионов. Основной составляющей активного вещества вакцины является инактивированная суспензионная смесь галофильных вибрионов Listonella (Vibrio) anguillarum серотипа 01 ВИЭВ АФ 3/4 и серотипа 02 ВИЭВ ВБФ 07, выращенных по отдельности в бульоне Хоттингера с содержанием 10% морской воды, соленость 3,3%, и аминного азота не менее 180% мг при температуре 25°С, в течение 26 ч, рН 7,8, рО₂ - 35% от насыщения кислородом воздуха, параллельно друг другу, до максимального уровня накопления микробных клеток в среде роста. Полученную микробную массу обрабатывают формалином до конечной концентрации 0,37%, затем подвергают 3-кратному переосаждению центрифугированием антигенов в 0,15 М фосфатно-солевом буфере рН 7,6, для избавления от консерванта и балластных компонентов. Полученные антигены каждого серотипа с концентрацией 1,25×10⁹ м.кл./см³ берут в равном соотношении, с учетом общей конечной концентрации 2,5×10⁹ м.кл./см³ в смеси, в качестве адъюванта - гидроокись алюминия в виде 6%-ного геля в объеме 12% от общего объема с последующим диспергированием на роторной установке. Способ позволяет получить препарат, обладающий длительной иммуногенностью, что в целом повышает качество целевого продукта. 4 пр.

Способ получения адсорбированной вакцины против вибриоза лососевых рыб, включающий получение матровых расплодок штаммов вибрионов на бульоне Хоттингера, культивирование в ферментере, инактивацию выращенных культур формалином, отличающийся тем, что для получения вакцины используют штаммы галофильных вибрионов разных серотипов: Listonella (Vibrio) anguillarum серотипа 01 ВИЭВ АФ 3/4 и серотипа 02 ВИЭВ ВБФ 07, которые культивируют отдельно, но параллельно друг другу, глубинное культивирование проводят в жидкой питательной среде с содержанием 10% морской воды, соленость 3,3%, и аминного азота не менее 180% мг при температуре 25°С в течение 26 часов, рН среды регулируют на уровне 7,8; аэрацию рO₂ - 35% от насыщения кислородом воздуха, концентрацию глюкозы до 0,5%, выход вибрионов при этом составляет 24×10⁹ м.кл./см³, инактивированные микробные клетки каждого штамма подвергают 3-кратному переосаждению центрифугированием антигенов в 0,15 М фосфатно-солевом буфере рН 7,6 и в дальнейшем объединяют в равных соотношениях объемов с концентрацией 1,25×10⁹ м.кл./см³ каждого, заключающим этапом вводится целевая добавка, содержащая иммунопротектор - адсорбирующий адъювант - 6%-ный гель гидроокиси алюминия в объеме 12% от общего объема с последующим диспергированием на роторной установке в течение 30 минут.